Molecular and Cellular Biology of Cytokines, pages 191-196
© 1990 Wiley-Liss, Inc.
I N T E R N A L I Z A T I O N OF I L - 1 I S REQUIRED FOR I L - 2 GENE A C T I V A - T I O N I N E L 4 THYMOMA C E L L S .
W. F a l k , M.P. A l b r e c h t , K. S t r i c k e r , * E . S e r f l i n g , a n d P.H. K r a m m e r .
I n s t i t u t e f o r I m m u n o l o g y a n d G e n e t i c s , D K F Z , D- 6 9 0 0 H e i d e l b e r g , F R G , a n d I n s t i t u t e f o r V i r o l o g y a n d I m m u n o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f W ü r z b u r g , D - 8 7 0 0 W ü r z b u r g , FRG
INTRODUCTION
S e c r e t i o n o f I L - 2 a n d e x p r e s s i o n o f h i g h a f f i n i t y I L - 2R a r e r e q u i r e d f o r p r o l i f e r a t i o n o f T c e l l s u p o n m i t o g e n o r a n t i g e n s t i m u l a t i o n . T h e c y t o k i n e I L - 1 p l a y s a k e y r o l e i n i n d u c t i o n o f t h e s e p r o c e s s e s . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t I L - 1 i n d u c e s I L - 2 e x p r e s s i o n b y n o r m a l a n d n e o p l a s t i c T h e l p e r c e l l s a f t e r s t i m u l a t i o n . ( F a r r a r e t a l . , 1 9 8 0 ; K a - s a h a r a e t a l . , 1 9 8 5 ) A l s o , I L - 1 i n d u c e s I L - 2 R e x p r e s s i o n o n a h e l p e r T c e l l a f t e r s t i m u l a t i o n o f t h e a n t i g e n r e c e p t o r
( K a y e e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d o n m u r i n e t h y m o c y t e s i n t h e p r e - s e n c e o f I L - 2 (Männel e t a l . , 1 9 8 5 ) . S i m i l a r e f f e c t s c a n b e o b s e r v e d w i t h s e l e c t e d s u b c l o n e s o f E L 4 t h y m o m a c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f PMA ( L o w e n t h a l e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e mode o f a c t i o n o f I L - 1 i s n o t k n o w n . I L - 1 s t i m u l a t e s cAMP a c c u m u l a - t i o n p o i n t i n g t o a n i n v o l v e m e m t o f a G p r o t e i n ( C h e d i d e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e r e i s c o n f l i c t i n g e v i d e n c e w i t h r e s p e c t t o t h e P K C p a t h w a y . A l s o , i t w a s r e p o r t e d r e c e n t l y t h a t I L - 1 a c t i v a t e s t h e n u c l e a r f a c t o r KB ( O s b o r n e t a l . , 1 9 8 9 ) .
L i k e many o t h e r g r o w t h f a c t o r s I L - 1 i s r a p i d l y i n t e r - n a l i z e d a n d i t s t r a n s p o r t t o t h e n u c l e u s w a s r e p o r t e d b y M i z e l e t a l . ( 1 9 8 7 ) . W h e t h e r i n t e r n a l i z a t i o n o f I L - 1 i s r e - q u i r e d f o r a r e s p o n s e t o I L - 1 w a s n o t k n o w n . B y s e l e c t i o n o f t w o v a r i a n t s o f E L 4 t h a t d i f f e r i n t h e i r I L - 1 r e s p o n s i - v e n e s s we s h o w i n t h i s r e p o r t t h a t I L - 1 i n t e r n a l i z a t i o n c o r r e l a t e s w i t h I L - 1 r e s p o n s i v e n e s s a n d t h a t a s a c o n s e - q u e n c e t h e I L - 2 p r o m o t e r i s a c t i v a t e d .
METHODS
T h e s e l e c t i o n o f E L 4 s u b c l o n e s a n d t h e m e a s u r e m e n t o f I L - 2 s e c r e t i o n a n d I L - 2 R e x p r e s s i o n w e r e d e s c r i b e d b y v o n H o e g e n e t a l . ( 1 9 8 9 )
C r o s s l i n k i n g o f t h e I L - 1 R w i t h l a b e l e d I L - 1 a n d PAGE w a s d o n e a s d e s c r i b e d ( v o n H o e g e n e t a l . , 1 9 8 9 ) . I n t e r n a l i - z a t i o n a n d s e p a r a t i o n o f membrane a n d c y t o p l a s m a a s s o c i a t e d I L - 1 w a s d e s c r i b e d ( V o n H o e g e n e t a l . , 1 9 8 9 ) .
N o r t h e r n a n a l y s i s a n d t h e p r o b e s u s e d w e r e d e s c r i b e d b y F a l k e t a l . ( 1 9 8 9 ) . T r a n s f e c t i o n o f E L 4 w a s d o n e b y t h e DEAE d e x t r a n m e t h o d . C a t a c t i v i t y w a s m e a s u r e d 4 8 h a f t e r t r a n s f e c t i o n b y c o n v e n t i o n a l m e t h o d s . T h e c o n s t r u c t i o n o f t h e p l a s m i d s u s e d f o r t r a n s f e c t i o n w a s d e s c r i b e d b y S e r f - l i n g e t a l . ( 1 9 8 9 ) .
R E S U L T S AND D I S C U S S I O N .
I n a n a t t e m p t t o d e t e r m i n e w h e t h e r I L - 1 i n t e r n a l i z a - t i o n w a s r e q u i r e d f o r a c t i v i t y o f I L - 1 o n T c e l l s s u b c l o n e s o f E L 4 t h a t d i f f e r e d i n t h e i r r e s p o n s e t o I L - 1 w e r e s e l e c - t e d b y l i m i t i n g d i l u t i o n . T h e p a r a m e t e r s u s e d f o r d i s t i n c - t i o n o f t h e c l o n e s w e r e t h e p r o d u c t i o n o f I L - 2 p r o t e i n i n t h e c e l l s u p e r n a t a n t a n d t h e e x p r e s s i o n o f t h e I L - 2 R o n t h e c e l l s u r f a c e . One s e l e c t e d s u b c l o n e , E L 4 5 D 3 , r e s p o n d e d t o I L - 1 w h e r e a s t h e o t h e r o n e , E L 4 D 6 / 7 6 , s h o w e d n o I L - 1 r e - s p o n s e . T h e c e l l s w e r e s t i m u l a t e d w i t h e i t h e r PMA o r w i t h PMA + I L - 1 . T h e r a t i o s o f PMA + I L - l / P M A ( S I ) s t i m u l a t i o n w i t h r e s p e c t t o b o t h p a r a m e t e r s w e r e d e t e r m i n e d . T h e S I f o r I L - 2 R w a s 5.8 f o r E L 4 5D3 a n d 1.0 f o r E L 4 D 6 / 7 6 . C o r r e s p o n - d i n g l y , t h e S I f o r I L - 2 w a s 3.2 f o r E L 4 5D3 a n d 1.0 f o r E L 4 D 6 / 7 6 . T o a s c e r t a i n t h a t t h i s d i f f e r e n c e i n r e s p o n s i v e n - e s s w a s n o t s i m p l y d u e t o a l a c k o f I L - 1 R i n t h e n o n r e s p o n - s i v e c l o n e E L 4 D 6 / 7 6 I L - 1 R b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s w e r e a n a l y z e d b y S c a t c h a r d a n a l y s i s . No d i f f e r e n c e w a s f o u n d b e t w e e n t h e t w o c l o n e s ( K d = 1 . 2 - 2 . 5 x l O "1 0, 2 3 0 0 - 2 4 0 0 r e c e p - t o r s / c e l l ) . C r o s s l i n k i n g o f t h e r e c e p t o r w i t h i t s l a b e l l e d l i g a n d a n d PAGE a l s o r e v e a l e d n o d i f f e r e n c e i n m o l e c u î ^ x m a s s ( 8 5 k D ) . B o t h c l o n e s r e s p o n d e d t o PMA w i t h p r o d u c t i o n o f I L - 2 a n d e x p r e s s i o n o f I L - 2 R s u g g e s t i n g n o m a j o r d i f f e - r e n c e i n t h e PKC p a t h w a y . l t w a s s h o w n t h a t i n I L - 1 r e - s p o n s i v e c e l l s I L - 1 i s i n t e r n a l i z e d a n d t r a n s p o r t e d t o t h e n u c l e a r m e m b r a n e ( M i z e l e t a l . , 1 9 8 7 ) . T o i n v e s t i g a t e w h e - t h e r t h e d e f e c t o f E L 4 D 6 / 7 6 w o u l d b e b a s e d o n i t s i n c a -
I t was c l e a r f r o m t h i s a n d s i m i l a r e x p e r i m e n t s t h a t t h e a d d i t i o n o f I L - 1 t o t h e r e a c t i o n d i d n o t r e s u l t i n a s h i f t e d p r o d u c t i o n o f IL-2mRNA. T h e e f f e c t o f I L - 1 was t o i n c r e a s e t h e a m o u n t o f IL-2mRNA a t a g i v e n t i m e a f t e r s t i - m u l a t i o n . I n e x p e r i m e n t s a i m e d a t d e t e r m i n i n g t h e h a l f l i f e o f t h i s mRNA we c o u l d a l s o f i n d no d i f f e r e n c e d u e t o t h e e f f e c t o f I L - 1 . T h e m o s t r e a s o n a b l e e x p l a n a t i o n o f t h e s e d a t a was t h a t I L - 1 d i d n o t a f f e c t p o s t t r a n s c r i p t i o n a l e v e n t s i n E L 4 5D3. The i n c r e a s e i n IL-2mRNA c o u l d t h e r e f o r e b e e x p l a i n e d b e s t b y t h e a s s u m p t i o n t h a t I L - 1 e x e r t e d i t s e f f e c t o n t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o f t h e I L - 2 g e n e . We t h e r e f o r e d e c i d e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f I L - 1 o n t h e m o u s e I L - 2 p r o m o t e r . V a r i o u s c o n s t r u c t s w e r e p r e p a r e d t h a t a l l c o n t a i n e d t h e CAT r e p o r t e r g e n e i n c l u d i n g t h e T k p r o m o - t e r . D i f f e r e n t s e g m e n t s o f t h e m o u s e I L - 2 p r o m o t e r w e r e c l o n e d 5' o f t h e T k p r o m o t e r i n t h e s e c o n s t r u c t s . p I L C A T 0 c o n t a i n e d t h e s e g m e n t f r o m -7 t o - 2 0 0 0 , p I L C A T 1 c o n t a i n e d t h e s e g m e n t f r o m -7 t o - 4 8 3 , a n d p I L C A T 2/1+ c o n t a i n e d t h e s e g m e n t f r o m -7 t o - 2 9 3 . The p o s i t i v e c o n t r o l f o r t r a n s f e c - t i o n was p T k C A T 21A c o n t a i n i n g t h e MSV e n h a n c e r , t h e n e g a - t i v e c o n t r o l was p B L C A T 2 c o n t a i n i n g no e n h a n c e r ( S e r f l i n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e s e c o n s t r u c t s w e r e u s e d t o t r a n s f e c t t h e I L - 1 r e s p o n s i v e c e l l E L 4 5D3 b y t h e DEAE d e x t r a n m e t h o d . 4 8 h a f t e r t r a n s f e c t i o n t h e c e l l s w e r e s t i m u l a t e d w i t h I L - 1 o r PMA a l o n e o r w i t h t h e c o m b i n a t i o n o f t h e 2 r e a g e n t s . A f - t e r o v e r n i g h t s t i m u l a t i o n t h e s u p e r n a t a n t s w e r e r e m o v e d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t h e I L - 2 p r o d u c e d . The c e l l p e l l e t was l y s e d t o d e t e r m i n e t h e CAT a c t i v i t y .
T A B L E 1. I L - 1 a c t i v a t e s t h e m o u s e I L - 2 p r o m o t e r i n t r a n s - f e c t e d E L 4 5D3
P l a s m i d - I L - 1 PMA P M A + I L - 1 S I
C a t
S I I L - 2
p T k C a t 2 1 A 12 13.5 1 8 . 1 18.7 1.03 4.0
p B L C a t 2 <1 <1 1.0 1.0 1.0 3.5
p I L C a t O 1.4 2.8 8.1 13.6 1.7 5.0
p I L C a t l 1 <1 5.3 9.7 1.8 3.0
p I L C a t 2 / l + 1 <1 5.0 1 2 . 1 2.4 5.2
T h e n u m b e r s d e p i c t % a c e t y l a t i o n . T h e y r e p r e s e n t t h e mean o f 4 e x p e r i m e n t s . B o l d n u m b e r s r e p r e s e n t s t i m u l a t i o n i n d e x
( S I ) . S I e q u a l s P M A + I L - 1 / PMA s t i m u l a t i o n . S I f o r I L - 2 d e -
t e r m i n a t i o n i s t h e r a t i o o f t h e u n i t s I L - 2 p r o d u c e d u n d e r t h e r e s p e c t i v e c o n d i t i o n s . E L 4 5D3 c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h t h e g i v e n p l a s m i d s a n d s t i m u l a t e d a f t e r 4 8 h w i t h t h e g i v e n s t i m u l i .
T h e T a b l e s h o w s t h a t I L - 1 a c t i v a t e s t h e I L - 2 p r o m o t e r . A l l t r a n s f e c t e d c e l l s r e s p o n d e d t o I L - 1 w i t h i n c r e a s e d I L - 2 p r o d u c t i o n i r r e s p e c t i v e o f t h e p l a s m i d u s e d s h o w i n g t h a t n o p l a s m i d i n t e r f e r e d w i t h i n d u c t i o n o f t h e e n d o g e n o u s I L - 2 g e n e a n d t h a t t h e t r a n s f e c t i o n s h a d no t o x i c e f f e c t o n t h e c e l l s . T h e p o s i t i v e c o n t r o l p T k C A T 21A c o n f e r r e d c o n s t i t u - t i v e e x p r e s s i o n w h e r e a s t h e n e g a t i v e c o n t r o l p B L C A T 2 c o n - f e r r e d no s i g n i f i c a n t CAT e x p r e s s i o n w h e t h e r o r n o t t h e c e l l s w e r e s t i m u l a t e d . A l l p l a s m i d s t h a t c o n t a i n e d s e g m e n t s o f t h e I L - 2 p r o m o t e r s h o w e d s t i m u l a t i o n - d e p e n d e n t CAT a n d I L - 2 e x p r e s s i o n . I n a l l c a s e s t h i s e x p r e s s i o n was e n h a n c e d b y I L - 1 . T h e s m a l l e s t f r a g m e n t ( i n p l a s m i d p I L C A T 2/1+) s t i l l c o n t a i n e d a n e l e m e n t o f t h e I L - 2 p r o m o t e r r e a c t i v e t o I L - 1 .
I n s u m m a r y , we d e d u c e f r o m t h e a b o v e d a t a t h e f o l - l o w i n g h y p o t h e s i s . I n t e r a c t i o n o f I L - 1 w i t h i t s r e c e p t o r i s n o t s u f f i c i e n t f o r i n d u c t i o n o f a r e s p o n s e . I L - 1 n e e d s t o b e i n t e r n a l i z e d a n d may t h e n i n t e r a c t w i t h a n u c l e a r r e c e p - t o r s i m i l a r t o t h e a c t i o n o f s t e r o i d h o r m o n s . T h e i n t e r a c - t i o n o f I L - 1 w i t h i t s n u c l e a r r e c e p t o r l e e d s t o t h e a c t i v a - t i o n o f I L - 1 s p e c i f i c n u c l e a r b i n d i n g p r o t e i n s w h i c h i n t u r n a c t i v a t e t h e I L - 2 p r o m o t e r r e s u l t i n g i n t h e p r o c u t i o n o f IL-2mRNA.
R E F E R E N C E S
C h e d i d M, S h i r a k a w a F, N a y l o r P, M i z e l S B ( 1 9 8 9 ) . S i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y f o r I L - 1 . I n v o l v e m e n t o f a p e r t u s s i s t o x i n s e n s i t i v e G T P - b i n d i n g p r o t e i n i n t h e a c t i v a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e . J I m m u n o l . 1 4 2 : 4 3 0 1 - 4 3 0 6 .
F a l k W, Männel D N, D a r j e s H, K r a m m e r P K ( 1 9 8 9 ) . I L - 1 i n - d u c e s h i g h a f f i n i t y I L - 2 r e c e p t o r e x p r e s s i o n o f CD4~8"
t h y m o c y t e s . J . I m m u n o l . 1 4 3 : 5 1 3 - 5 1 7 .
F a r r a r J J , M i z e l S B, F u l l e r - F a r r a r J , F a r r a r W L , H i l f i - k e r M L ( 1 9 8 0 ) . M a c r o p h a g e i n d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f h e l - p e r T c e l l s . I . P r o d u c t i o n o f i n t e r l e u k i n 2. J . I m m u n o l . 1 2 5 : 7 9 3 - 7 9 8 .
K a s a h a r a T, M u k a i d a N, H a t a k e Kf M o t o y o s h i K, K a w a i T, S h i o r i - N a d a n o K ( 1 9 8 5 ) . I n t e r l e u k i n 1 ( I L 1) d e p e n d e n t
p a b i l i t y t o i n t e r n a l i z e I L - 1 c e l l s o f t h e t w o c l o n e s w e r e i n c u b a t e d w i t h l a b e l e d I L - 1 a t 37°C a n d t h e k i n e t i c s o f c y - t o s o l - a s s o c i a t e d I L - 1 w a s d e t e r m i n e d . We f o u n d t h a t E L 4 5D3 i n t e r n a l i z e d I L - 1 r e a c h i n g p l a t e a u l e v e l s w i t h i n 3 h w h e - r e a s E L 4 D 6 / 7 6 d i d n o t i n t e r n a l i z e a n y I L - 1 i n t o t h e c y t o - s o l . ( V o n H o e g e n e t a l . , 1 9 8 9 ) We c o n c l u d e d f r o m t h e s e d a t a t h a t i n t e r n a l i z a t i o n o f I L - 1 i s a p r e r e q u i s i t e f o r a r e - s p o n s e t o I L - 1 . T h i s i n t e r p r e t a t i o n w a s s u p p o r t e d b y t h e f a c t t h a t c h l o r o q u i n e a t a c o n c e n t r a t i o n o f 10 A*g/ml i n - h i b i t e d t h e I L - 1 i n d u c e d i n c r e a s e i n I L - 2 p r o d u c t i o n b y 6 8 . 5 % a t a c e l l c o n c e n t r a t i o n o f 5 x l 05/ w e l l a n d b y 4 2 % a t a c e l l c o n c e n t r a t i o n o f 1 06/ w e l l .
T h e n e x t q u e s t i o n w a s w h e t h e r I L - 1 h a d i t s e f f e c t o n t h e l e v e l o f t r a n s l a t i o n o r t r a n s c r i p t i o n . T o t h i s e n d t h e I L - 2 mRNA l e v e l s w e r e m o n i t o r e d a t d i f f e r e n t t i m e s a f t e r s t i m u l a t i o n w i t h e i t h e r PMA o r PMA + I L - 1 . ( S t i m u l a t i o n w i t h I L - 1 a l o n e d i d n e v e r h a v e a n y e f f e c t o n I L - 2 p r o d u c - t i o n ) . T o t a l RNA w a s p r e p a r e d a n d e l e c t r o p h o r e s e d i n a 1%
a g a r o s e g e l u n d e r d e n a t u r i n g c o n d i t i o n s a n d t h e N o r t h e r n b l o t w a s p r o b e d w i t h a p r o b e s p e c i f i c f o r I L - 2 .
1 2 3 4 5 6
F i g u r e 1. K i n e t i c s o f IL-2mRNA p r o d u c t i o n . E L 4 5D3 c e l l s w e r e s t i m u l a t e d w i t h PMA ( l a n e s 1, 3, 5) o r w i t h PMA + I L - 1
( l a n e s 2, 4, 6 ) . R N A f r o m s t i m u l a t e d c e l l s w a s p r e p a r e d a f - t e r 8 h ( l a n e s 1, 2 ) ; 2 4 h ( l a n e s 3, 4 ) ; a n d a f t e r 4 8 h ( l a n e s 5, 6 ) . T h e N o r t h e r n b l o t w a s p r o b e d w i t h a n I L - 2 p r o b e .
l y m p h o k i n e p r o d u c t i o n b y human l e u k e m i c T c e l l l i n e HSB.2 s u b c l o n e s . J . I m m u n o l . 1 3 4 : 1 6 8 2 - 1 6 8 9 .
K a y e J , G i l l i s S, M i z e l S B, S h e v a c h E M, M a l e k T R, D i n a - r e l l o C Af L a c h m a n n L B, J a n e w a y C A ( 1 9 8 4 ) . G r o w t h o f a c l o n e d h e l p e r T c e l l l i n e i n d u c e d b y a m o n o c l o n a l a n t i - b o d y s p e c i f i c f o r t h e a n t i g e n r e c e p t o r : i n t e r l e u k i n 1 i s r e q u i r e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f r e c e p t o r s f o r i n t e r l e u k i n 2. J . I m m u n o l . 1 3 3 : 1 3 3 9 - 1 3 4 5 .
L o w e n t h a l J W, C e r r o t i n i J C, M a c D o n a l d H R ( 1 9 8 6 ) . I n t e r - l e u k i n 1 d e p e n d e n t i n d u c t i o n o f b o t h i n t e r l e u k i n 2 s e c r e - t i o n a n d i n t e r l e u k i n 2 r e c e p t o r e x p r e s s i o n b y t h y m o m a c e l l s . J . I m m u n o l . 1 3 7 : 1 2 2 6 - 1 2 3 1 .
M ä n n e l D N, M i z e l S B, D i a m a n t s t e i n T, F a l k W ( 1 9 8 5 ) . I n - d u c t i o n o f i n t e r l e u k i n 2 r e s p o n s i v e n e s s i n t h y m o c y t e s b y s y n e r g i s t i c a c t i o n o f i n t e r l e u k i n 1 a n d i n t e r l e u k i n 2.
J . I m m u n o l . 1 3 4 : 3 1 0 8 - 3 1 1 0 .
M i z e l S B, K i l i a n P L , L e w i s J C, P a g a n e l l i K A, C h i z z o n i t e R A ( 1 9 8 7 ) . T h e i n t e r l e u k i n 1 r e c e p t o r . D y n a m i c s o f i n - t e r l e u k i n 1 b i n d i n g a n d i n t e r n a l i z a t i o n i n T c e l l s a n d f i b r o b l a s t s . J . I m m u n o l . 1 3 8 : 2 9 0 6 - 2 9 1 2 .
O s b o r n L , K u n k e l S, N a b e l G J ( 1 9 8 9 ) . Tumor n e c r o s i s f a c t o r a a n d i n t e r l e u k i n 1 s t i m u l a t e t h e human i m m u n o d e f i c i e n c y v i r u s e n h a n c e r b y a c t i v a t i o n o f t h e n u c l e a r f a c t o r «B.
P r o c . N a t l . A c a d . S e i . USA 8 6 : 2 3 3 6 - 2 3 4 0 .
S e r f l i n g E , Bathelmäs R, P f e u f f e r I , S c h e n k B, Z a r i u s S, S w o b o d a R, M e r c u r i o F, K a r i n M ( 1 9 8 9 ) U b i q u i t o u s a n d l y m - p h o c y t e s p e c i f i c f a c t o r s a r e i n v o l v e d i n t h e i n d u c t i o n o f t h e m o u s e i n t e r l e u k i n 2 g e n e i n T l y m p h o c y t e s . EMBO J . 8:
4 6 5 - 4 7 3 .
V o n H o e g e n I , F a l k W, K o j o u h a r o f f G, K r a m m e r P K ( 1 9 8 9 ) . I n t e r n a l i z a t i o n o f i n t e r l e u k i n 1 ( I L 1 ) c o r r e l a t e s w i t h I L 1 - i n d u c e d I L 2 r e c e p t o r e x p r e s s i o n a n d I L 2 s e c r e t i o n o f E L 4 t h y m o m a c e l l s . E u r . J . I m m u n o l . 1 9 : 3 2 9 - 3 3 4 .
ACKNOWLEDGEMENT:
We t h a n k H e i d i D a r j e s f o r e x p e r t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .
