der Medizinischen Hochschule Hannover
V ASOPROTEKTION DURCH MK2-D EFIZIENZ : U NTERSUCHUNGEN IN MURINEN M ODELLEN DER
MECHANISCHEN UND METABOLISCHEN
E NDOTHELSCHÄDIGUNG
D ISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Johann von Felden aus Oldenburg
Hannover 2013
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 22.10.2013
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Christopher Baum
Betreuer der Arbeit: PD Dr. med. Udo Bavendiek Referent: Prof. Dr. med. Jan Kielstein
Korreferent: Prof. Dr. rer. nat. Matthias Gaestel Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2013
Prüfungsausschussmitglieder:
PD Dr. Jens Gottlieb
Prof. Dr. Klaus Otto
Prof. Dr. Martin Sauer
Meinen Eltern
I. Inhaltsverzeichnis
I. Inhaltsverzeichnis ... I II. Abkürzungsverzeichnis ... IV
1. Einleitung ... 8
1.1. Hintergrund der Untersuchungen... 8
1.1.1. Bedeutung und Funktion des Endothels...8
1.1.2. MAPKAP Kinase 2 (MK2) ...10
1.2. Zielstellung der Untersuchungen ... 13
1.3. Hypothesen ... 13
2. Material und Methoden... 14
2.1. Material ... 14
2.1.1. Zellkulturmedien, Zusätze und weiteres...14
2.1.2. Reagenzien, Detergenzien und Stimulanzien...15
2.1.3. Puffer und Lösungen ...16
2.1.4. Antikörper ...18
2.1.5. Verbrauchsmaterialien...18
2.2. Geräte... 19
2.3. Methoden ... 21
2.3.1. Mauszucht...21
2.3.2. Endotheliale Regenerationsversuche in vivo und Evans Blue Färbung ...21
2.3.3. Isolation primärer Endothelzellen aus der Maus ...23
2.3.4. Immunfluoreszenzfärbungen muriner Endothelzellen ...24
2.3.5. Zellkulturbedingungen...26
2.3.6. Proliferationsversuche mit Alamar Blue ...26
2.3.7. Proliferationsversuche mit BrdU...27
2.3.8. Regenerationsversuche mit primären murinen Endothelzellen in vitro...28
2.3.9. Gewinnen von Proteinlysaten ...30
2.3.10. Gelelektrophorese und Western Blotting...31
2.3.11. Fütterung der Mäuse ...32
2.3.12. Analyse von systolischem Blutdruck und Herzfrequenz...33
2.3.13. Bestimmung von Körper- und Organgewicht ...34
2.3.14. Glukose- und Insulintoleranztestungen ...34
2.3.15. Vasorelaxationsversuche mit murinen Aortenringen ...35
2.3.16. Statistik ...38
3. Ergebnisse ... 39
3.1. Bedeutung der MK2 für die endotheliale Regeneration nach Gefäßverletzung... 39
3.1.1. MK2-Defizienz steigert die Reendothelialisierung nach Gefäßverletzung in vivo...39
3.1.2. MK2-Defizienz steigert die Zellproliferation in Endothelzellen...40
3.1.3. Regeneration MK2-defizienter Endothelzellen in vitro...41
3.1.4. MK2-Defizienz steigert proliferative Zellzyklusmarker der G1- Phase in Endothelzellen ...44
3.1.5. Zusammenfassung der Ergebnisse ...45
3.2. Bedeutung der MK2 für die Endothelfunktion in einem murinen Modell des Diabetes mellitus Typ 2 ... 46
3.2.1. Studienaufbau...46
3.2.2. Körpergewicht und Vitalzeichen ...46
3.2.3. Glukosestoffwechsel in WT- und MK2KO-Mäusen im murinen Modell des Diabetes mellitus Typ 2 ...49
3.2.4. Organgewichte von WT- und MK2KO-Mäusen nach Fütterung einer regulären und einer diabetogenen (HFD) Diät...51
3.2.5. Analyse der Endothel-abhängigen und –unabhängigen Vasorelaxation in WT- und MK2KO-Mäusen nach Fütterung einer regulären (Chow) und diabetogenen (HFD) Diät...53
3.2.6. Einfluss einer pharmakologischen Hemmung der NO Synthase (NOS) und der induzierbaren NOS (iNOS) auf die PE-induzierte Vasokonstriktion in WT und MK2KO nach regulärer und diabetogener Diät...60
3.2.7. Insulinabhängige Vasorelaxation in WT- und MK2KO-Mäusen...62
3.2.8. Zusammenfassung der Ergebnisse ...64
4. Diskussion ... 65
4.1. Bedeutung der MK2 für die endotheliale Regeneration nach Gefäßverletzung... 65
4.1.1. Die MK2 reguliert die Reendothelialisierung, Proliferation und
Migration von Endothelzellen...65
4.1.2. MK2 beeinflusst die Expression von Cyclin D1 und phospho-Rb während der Zellproliferation ...66
4.2. Bedeutung der MK2 für die endotheliale Funktion und unter diabetogenem Stress... 70
4.2.1. Metabolischer Einfluss einer MK2-Defizienz unter diabetogener Diät...70
4.2.2. MK2 beeinflusst möglicherweise über eine gesteigerte, vaskuläre Bioverfügbarkeit von NO den Vasotonus und den Blutdruck....72
5. Zusammenfassung... 79
6. Literaturverzeichnis ... 81
7. Anhang ... 91
7.1. Veröffentlichungen ... 91
7.2. Danksagungen ... 93
7.3. Curriculum vitae... 95
7.4. Erklärung ... 97
II. Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
A. Arteria
Ach Acetylcholin
ADP Adenosindiphosphat
anti-BrdU-POD anti-BrdU Peroxidase gekoppelter Antikörper ARE engl. AU (Adenin/Uridin)-rich elements
ATP Adenosintriphosphat
BrdU 5-Bromo-2'-Deoxyuridin
BSA bovines Serumalbumin
bzw. beziehungsweise
C Celcius
C57BL/6J genetischer Hintergrund der verwendeten Mausstämme
Ca / Mg Calcium / Magnesium
ca. circa
CaCl2 Kalziumchlorid
CapZ-IP F-actin capping protein Z-interacting protein
CD 144 Cluster of Differentiation 144 (vascular-endothelial Cadherin)
Cdc Cell cycle division
Cdk Cyclin-dependent kinase
Chk Checkpointkinase
Cip/Kip Cdk2 interacting protein / kinase inhibitor protein
CO2 Kohlenstoffdioxid
COX Cyclooxygenase
CRP C-reaktives Protein
DMEM / F-12 Dulbecco's Modified Eagle Medium, Nutrient Mixture F-12 DNS Desoxyribonukleinsäure (engl. DNA: desoxyribonucleic acid) EC 50 mittlere effektive Konzentration
ECGS-H Endothelial Cell Growth Supplement – Heparin EDCF Endothelium-derived constricting factor
EDHF Endothelium-derived hyperpolarization factor EDRF Endothelium-derived relaxing factor
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EF2 Elongation Factor 2
EGM Endothelial Growth Medium, Wachstums-Medium
ELISA Enzyme-linked-Immunosorbant Assay
eNOS Endotheliale NO Synthase, NOS III ERK extracellular signal-regulated kinase
FCS fetal calf serum
FELASA Federation of European Laboratory Animal Society Association
G Erdschwerebeschleunigung
g, g/g KG, g/kg, kg Gramm, Gramm / Gramm Körpergewicht, Gramm / Kilo- gramm, Kilogramm
G0-Phase Ruhephase
G1-Phase Wachstumsphase, präsynthetisch, postmitotisch G2-Phase Wachstumsphase, postsynthetisch, prämitotisch
GLUT Glukose Transporter
Hank’s BSS Hank’s balanced salt solution
HDM2 human double minute 2 protein
HFD hochfetthaltige Diät bzw. Fütterung
HSP Hitzeschockprotein
IC50 Mittlere inhibierende Konzentration ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 IL-1, IL-6, IL-8 Interleukin-1, -6, -8
INK Inhibitors of CDK4
iNOS induzierbare NO Synthase
KCl Kaliumchlorid
KH2PO4 Kaliumphosphat
l, ml, µl Liter, Milliliter, Mikroliter
LDL, ox-LDL low density lipoprotein, oxidiertes LDL
LM Lichtmikroskop
L-NMMA NG-Monomethyl-L-Arginin
Log Logarhythmus
LPS Lipopolysaccharid
LSP1 Lymphozytenspezifisches Protein 1
m, cm, mm, µm, nm Meter, Zentimeter, Millimeter, Mikrometer, Nanometer M, mM, µM Mol, Millimol, Mikromol
MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein 1 MgSO4 x 7H2O Magnesiumsulfat-Heptahydrat
min. Minuten
MK2, MK3, MK5 MAPKAPK, mitogen-activated protein kinase-acivated protein kinase
MK2KO MK2-Defizienz
MKK 3/6 mitogen-activated protein kinase kinase 3/6
mm2 Quadratmillimeter
mmol/l Millimol / Liter
mN Millinewton
mRNA messenger ribonucleic acid
n.s. nicht signifikant
Na2HPO4 x 2H2O Natriumphosphat-Dihydrat
NaCl Natriumchlorid
NaF Natriumfluorid
NaHCO3 Natriumhydrogenkarbonat
NES Nuclear Export Signal
NLS Nuclear Localisation Signal
nNOS Neuronale NO Synthase
NO Stickstoffmonoxid
NOS NO Synthase
O2 Sauerstoff
p16-Arc p16 subunit of the seven-member actin related protein-2/3 complex
p27Kip1 Protein 27 Kinase Inhibitor Protein
p38-MAP-Kinase p38 mitogen-activated protein kinase
p53 Protein 53
PBS Phosphate buffered saline
PDE1, PDE4A5 Phosphodiesterase 1, -4A5
PE Phenylephrin
PKG Proteinkinase G
p-Rb phospho-Retinoblastoma Protein
PTA perkutane transluminale Angioplastie
PVDF Polyvinyliden-difluorid
Redox Potential Reduktions-Oxidationspotential
RIPA Puffer Radioimmunoprecipitations Assay Puffer
ROS Reactive Oxygen Spezies
rpm rounds per minute
SDS Natriumlaurylsulfat
SEM Standard Error of Mean
sGC soluble Guanycyclase
SNP sodium-nitroprussid, Natrium-Nitroprussid
S-Phase Synthesephase
Std. Stunden
TBS Tris buffered saline
TBST Tris buffered saline plus Tween-20
TEMED Tetramethylethylendiamin
TNF- Tumor Nekrose Faktor-
TTP Tristetrapolin
U, mU Units, milliunits
uPA Urokinase Plasminogenaktivator
VCAM-1 Vascular Cellular Adhesion Molecule-1
vs. versus
W Wochen
WB Western Blot
WT Wildtyp, Kontrollen
1. Einleitung
1.1. Hintergrund der Untersuchungen
1.1.1. Bedeutung und Funktion des Endothels
Kardiovaskuläre Erkrankungen wie die koronare Herzkrankheit, der akute Myokardin- farkt und die Herzinsuffizienz bedingen weltweit eine sehr hohe Morbidität und Morta- lität. Dabei ist die koronare Herzkrankheit weiterhin die häufigste Todesursache weltweit (1-2). Als entscheidende Risikofaktoren zählen u.a. Diabetes mellitus, Niko- tinkonsum, arterieller Hypertonus und Dyslipidämie.
Das Endothel spielt eine tragende Rolle in der Aufrechterhaltung der vaskulären Ho- möostase. Es bildet eine natürliche Barriere zwischen zirkulierendem Blut und der Gefäßwand und besitzt mehrere modulierende Funktionen. Es beeinflusst über die Freisetzung von Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren und vasoaktiven Me- diatoren die glatte Gefäßmuskulatur und den Vasotonus, sowie über Adhäsionsmo- leküle die Einwanderung von Entzündungszellen. Zudem ist es maßgeblich an der Thrombozytenaggregation beteiligt (3-4). An der Reparatur eines mechanisch ent- standenen Endotheldefekts (z.B. nach Koronarangioplastie) und zur Wiedererlan- gung der Integrität sind Zellproliferation, Zellmigration und die Rekrutierung endothe- lialer Progenitorzellen beteiligt (5-8).
Furchgott et al. haben in den 80er Jahren eine vom Endothel gebildete, vasorelaxie- rende Substanz entdeckt, welche auf die glatte Gefäßmuskulatur wirkt und dabei maßgeblich den Vasotonus beeinflusst (9). Es handelte sich hierbei um Stickstoff- monoxid (NO). NO wirkt über den so genannten L-Arginin / NO / cGMP Signalweg.
Es wird im Gefäßsystem vorwiegend von der endothelialen NO Synthase (eNOS, NOS III) aus L-Arginin unter Abspaltung von L-Citrullin bereitgestellt. Außerdem wird es durch die neuronale NO-Synthase (nNOS, NOS I) und die induzierbare NO- Synthase (iNOS, NOS II) produziert. Als bedeutende Induktoren für die NO Synthese gelten rezeptorvermittelte Agonisten wie Acetylcholin, Bradykinin, ATP (Adeno- sintriphosphat) und Insulin sowie Scher- und Dehnungskräfte an der Gefäßwand. Als kleinstes endogen gebildetes bioaktives Molekül kann NO leicht in das umliegende Gewebe und ins Blut diffundieren. In glatten Gefäßmuskelzellen aktiviert es die lösli- che Guanylylzyklase (sGC), welche über die Produktion von zyklischem Guanylyl-
(PKG), aktiviert und schließlich über eine Regulation der intrazellulären Kalziumkon- zentration zu einer Vasorelaxation führt (10-13).
Neben NO gibt es noch viele weitere vasorelaxierende Faktoren und auch den Vaso- tonus steigernde Substanzen, u.a. Endothelin-1 und Prostacycline, die vom Endothel produziert werden. Die Cyclooxygenasen-1/-2 (COX-1/-2) spielen dabei eine Rolle bei der Bildung von vasokontrahierenden Mediatoren (Prostanoide wie Prostacyclin (PGI2), Thromboxan A2 etc.) und reaktiver Sauerstoffspezies. Als Substrat dient der COX-1/-2 Arachidonsäure, welche durch die Phospholipase A2 aus der Zellmembran gelöst wird. Der Hauptstimulus ist dabei eine erhöhte, intrazelluläre Calciumkonzent- ration in den Endothelzellen, welche rezeptorvermittelt z.B. durch Adenosin- diphosphat (ADP) oder über muscarinerge Rezeptoren durch Acetylcholin hervorge- rufen wird. Acetylcholin kann also sowohl die NO-Produktion als auch die Produktion vasokontrahierender Mediatoren stimulieren. Im gesunden Gefäßsystem überwiegt allerdings der vasorelaxierende Effekt von NO. Letztendlich besitzt das Endothel also eine entscheidende Regulatorfunktion bei der Aufrechterhaltung des vasotonen Gleichgewichts (14-15).
Ein Hinweis für eine endotheliale Dysfunktion kann eine gestörte Endothel-abhängige Vasorelaxation auf Acetylcholin (ACh) sein, welches die eNOS zur NO-Produktion stimuliert. Unterbleibt nach Stimulation mit ACh eine adäquate Vasorelaxation, so ist die endotheliale NO-Synthese gestört, und man kann von einer Endothelschädigung bzw. einer endothelialen Dysfunktion ausgehen. Ursächlich hierfür ist vermutlich eine erhöhte Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), sogenannter oxidativer Stress, welcher u.a. bei Diabetes mellitus, Adipositas und Nikotinkonsum erhöht ist und zu arterieller Hypertonie führen kann (16-17). Als Quelle dient u.a. die Nikotinamid Ade- nin Dinukleotid Phosphat (NADPH) Oxidase, welche Superoxide (O2-) bildet, die mit NO reagieren und so zu einem NO-Verlust und der Bildung von Peroxynitrit (OONO-) führen. Peroxynitrit oxidiert außerdem Sapropterin (5,6,7,8-Tetrahydrobiopterin, BH4), einen für die Funktionserhaltung der eNOS essentiellen Kofaktor. Wegen der verrin- gerten BH4 Level produziert die eNOS daraufhin selbst O2-. Diesen Vorgang be- zeichnet man als eNOS-Entkopplung (18-19). Angiotensin II scheint ebenfalls eine Schlüsselrolle in der Entstehung von endothelialen ROS zu spielen (20).
Der Verlust der Vasorelaxation wird zunehmend auch als Indikator für weitere Mal- funktionen des Endothels verstanden. So besitzt das NO selbst auch antithromboti- sche und antiinflammatorische Eigenschaften. Neben einem erhöhten Vasotonus
kommt es deswegen bei einer Endothelschädigung auch zu einer vermehrten Leuko- zyteninfiltration in die Gefäßwand und zu einer tendenziell prothrombogenen Grund- situation (20-22). Der NO-Signalweg wird dabei als entscheidender Regulator der kardiovaskulären Homöostase angesehen und ein Verlust der NO-Bioverfügbarkeit ist mit der endothelialen Dysfunktion der meisten kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert (15). So wird die endotheliale Dysfunktion auch als entscheidender initialer Schritt in der Entstehung der Atherosklerose angesehen, welche die Ursache für die koronare Herzerkrankung darstellt und weiterhin die häufigste Todesursache weltweit ist (1-2, 16-17).
1.1.2. MAPKAP Kinase 2 (MK2)
Beschreibung der MAPKAP Kinase 2 (MK2)
Die ubiquitär exprimierte Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-aktivierte Protein- kinase 2 (MAPKAPK2, MK2) ist ein direktes Substrat der Stress-aktivierten p38/- MAP-Kinase (23). Sie wird bei Zytokinstimulation und zellulärem Stress durch Phosphorylierung an den Aminosäuren Threonin 222 und Threonin 334 (human) bzw. Threonin 207 und Threonin 319 (murin) aktiviert (23). Die humane MK2 besitzt am Threonin 338 eine weitere (vermutlich Auto-) Phosphorylierungstelle (24). MK2 und p38 bilden in inaktiver Form einen stabilen Protein Komplex, welcher durch ein nukleäres Lokalisationssignal (engl. nuclear lokalisation signal, NLS) im Nukleus lo- kalisiert ist (25-26). Eine Phosphorylierung von MK2 an der Phosphorylierungsstelle Threonin 334 durch die aktivierte p38, welche selbst durch vorgeschaltete Kinasen wie z.B. MKK3/6 phosphoryliert wird, führt zu einer Konformationsänderung der MK2 mit resultierender Freilegung des C-terminalen nukleären Exportsignals (engl. nuc- lear export signal, NES). Dies führt zu einer Translokation vom aktivierten phospho- p38 / phospho-MK2 Komplex ins Zytosol (27-28).
Neben der MK2 sind noch weitere MKs beschrieben. Während die MK3 ähnliches Verhalten bezüglich Struktur und Aktivierung zeigt, hat die MK5 (1998 zuerst als p38- regulated / -activated kinase, PRAK beschrieben) nur eine regulierende Phosphory- lierungsstelle (Threonin 182), die neben der p38- und vor allem der p38- Untereinheit zusätzlich von der ERK (engl. extracellular signal-related kinase) akti- viert wird(23, 29).
MAPKAP Kinase 2 (MK2): Regulator inflammatorischer Prozesse
Eine Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) führt MK2-abhängig zu einer erhöhten Produktion pro-inflammatorischer Zytokine wie Interleukin 6 (IL-6) und Tumor Nekro- se Faktor (TNF) (28, 30-31). Dies wird auf post-transkriptionaler Ebene durch Be- einflussung von Tristetraprolin (TTP) reguliert, welches in inaktiver Form an soge- nannte AU (Adenin/Uridin)-rich elements (ARE) in 3’ untranslatierten Regionen der mRNA (engl. messenger ribonucleic acid) bindet und damit zu einer Degradierung der mRNA des Zielgens führt. Durch MK2 phosphoryliert, bildet TTP einen Komplex mit dem 14-3-3 Protein und verliert damit seine degradierende Wirkung auf die mRNA. TTP-Phosphorylierung durch MK2 resultiert also in einer post- transkriptionalen Stabilisierung der mRNA und somit in einer erhöhten Proteinsyn- these des Zielproteins (23, 32-34).Es ist bisher eine große Anzahl an ARE-mRNAs beschrieben worden, deren Stabilität zum Großteil über den p38-MAPK Signalweg reguliert wird (35). Explizit von MK2 stabilisiert werden u.a. folgende mRNAs: TNF (34), COX-2 (36), uPA (urokinase Plasminogenaktivator) (37), IL-6 (30) und IL-8 (23, 38).
Des Weiteren phosphoryliert die MK2 die 5-Lipooxygenase (5-LO) und erhöht damit die Aktivität der 5-LO, welche ebenfalls eine inflammatorische Funktion besitzt (39).
MAPKAP Kinase 2 (MK2): Einfluss auf Aktinremodeling, Zytoskelett und Zellmigrati- on
Die MK2 führt zu einer stress-abhängigen Phosphorylierung des humanen Hitze- schock Proteins HSP27 und des murinen Hitzeschockproteins HSP25 (40), welche neben Funktionen in der Aktinpolymerisierung auch Chaperon Eigenschaften besit- zen (41). Weitere Substrate von MK2, die im Aktinremodeling und im Aufbau des Zy- toskeletts eine Rolle spielen, sind: LSP1 (Lymphozyten spezifisches Protein 1) (42), CapZ-IP (engl. F-actin capping protein Z-interacting protein) (43), p16-Arc (engl. p16 subunit of the seven-member actin related protein-2/3 complex) (44), Vimentin (45) und B-crystallin (46).
Über diese vielfachen Angriffspunkte hat die MK2, vor allem über Effekte auf die Ak- tinpolymerisierung, regulatorische Einflussmöglichkeiten auf die Zellmigration. In neutrophilen Granulozyten und glatten Gefäßmuskelzellen ist der Einfluss des p38- MAP-Kinase / MK2 / HSP Signalweges auf die Migration dieser Zellen bereits be- schrieben. So führt eine Hemmung zu einer verminderten Migrationsfähigkeit dieser
Zellen (47-48). Erst kürzlich konnte dies durch unsere Arbeitsgruppe auch in Endo- thelzellen nachgewiesen werden (49). Außerdem konnte in Endothelzellen gezeigt werden, dass VEGF-A MK2-abhängig zu einer Aktivierung der LIM Kinase 1 führt und darüber ebenfalls Aktinremodeling und Zellmigration beeinflusst (50).
MAPKAP Kinase 2 (MK2): Einfluss auf den Zellzyklus
Die MK2 phosphoryliert bei UV-Strahlen-induzierter Schädigung der DNS (Desoxyri- bonukleinsäure) die Proteinphosphatasen Cdc25B (engl. cell division cycle 25B) und Cdc25C mit verzögerter S-Phasen Progression und Arrest am G2/M Übergang des Zellzyklus (51). Zusätzlich wird die Ubiquitin Ligase HDM2 (engl. human double mi- nute 2 protein), welche durch Aktivierung die Degradierung vom tumorsupprimieren- den Transkriptionsfaktor p53 steigert, durch die MK2 phosphoryliert (52). Damit hat die MK2 Zellzyklus-regulierende Eigenschaften und kann neben Chk1 und Chk2 (Checkpointkinasen) als weitere Kontrollkinase des Zellzyklus diskutiert werden (53).
Erst kürzlich konnte in Fibroblasten ein gegensätzlicher Einfluss der p38-MAP- Kinase auf den Zellzyklus gezeigt werden. Mitogene Stimuli führen dabei zu einer transienten Aktivierung der p38-MAP-Kinase mit nachfolgender Aktivierung von Cyc- lin D1 und Retinoblastoma Protein und Durchlaufen des G1/S Übergangs. Zelluläre Stressoren, in diesem Fall Anisomycin, führten dagegen zu einer stärkeren Aktivie- rung der p38-MAP-Kinase mit nachgeschalteter Aktivierung der MK2 und daraus re- sultierendem Zellzyklusarrest (54).
MAPKAP Kinase 2 (MK2): Einfluss auf die endotheliale Funktion
Bisher gibt es nur wenige Untersuchungen, die sich mit der funktionellen Rolle der MK2 für die Endothelfunktion beschäftigen. Es gibt einige Untersuchungen, welche die p38-MAP-Kinase in Verbindung mit dem L-Arginin / NO / cGMP Signalweg, reak- tiven Sauerstoffspezies (ROS) und der endothelialen Funktion bringen. So konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation mit Angiotensin II über die p38-MAP-Kinase zur Bildung von ROS und einer endothelialen Dysfunktion führt und dies durch eine Inhibition der p38-MAP-Kinase verringert werden kann (55-58). Zuletzt konnte aller- dings gezeigt werden, dass Angiotensin II vermittelte vaskuläre Antworten wie Blut- druckanstieg und die Bildung von ROS ebenfalls MK2 vermittelt sind und in MK2- defizienten Mäusen verringert sind bzw. ausbleiben (59). Außerdem konnte eine
cGMP-abhängige Aktivierung von MK2 durch den NO-Donor Natrium-Nitroprussid (SNP) in Kardiomyozyten gezeigt werden (60).
1.2. Zielstellung der Untersuchungen
Wie ausgeführt, beeinflusst die MK2 über Inflammation, Zellmigration und Zellprolife- ration zentrale Prozesse der vaskulären Biologie und Regeneration und könnte mög- licherweise auch Einfluss auf Mechanismen der endothelialen Funktion und Regene- ration besitzen.
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird daher die funktionelle Rolle der MK2 auf die Regeneration nach mechanischer Endothelverletzung untersucht. Hierzu wird bei MK2-defizienten Mäusen elektrisch ein definierter Endothelschaden an der Arteria carotis communis gesetzt und die endotheliale Regeneration mittels Evans Blue Fär- bung untersucht. In vitro folgen Proliferations- und Migrationsassays sowie protein- biochemische Analysen relevanter Kinasen und Marker der G1-Phase und des G1/S- Übergangs des Zellzyklus (Retinoblastoma-Protein, Cyclin D1 und p27Kip1) in MK2- defizienten Endothelzellen.
Bisher gibt es keine Untersuchungen, die einen direkten Einfluss des MK2- Signalweges auf die endotheliale Funktion zeigen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wird daher im Mausmodell die funktionelle Rolle der MK2 in der Entstehung einer endothelialen Dysfunktion bei Diabetes mellitus Typ 2 unter Verwendung MK2- defizienter Mäuse untersucht. Hierzu wird ein metabolisches Stressmodell gewählt, welches durch eine diabetogene, hoch-fetthaltige Diät (HFD) in MK2-defizienten Mäusen einen Diabetes mellitus Typ 2 simuliert. Die endotheliale Funktion wird in diesem Modell durch Untersuchungen der endothel-abhängigen Vasorelaxation ex vivo mittels Vasorelaxationsexperimenten an explantierten Aortenringen untersucht.
Außerdem erfolgen Analysen zu Körper- und Organgewicht, sowie zum Glukose- stoffwechsel.
1.3. Hypothesen
Folgende Hypothesen werden in der vorliegenden Dissertationsschrift untersucht:
1. Die MK2 besitzt eine funktionelle Rolle in der endothelialen Regeneration nach mechanischer Endothelverletzung.
2. Die MK2 besitzt eine funktionelle Rolle in der Entstehung einer endothelialen Dys- funktion in einem murinen Modell des Diabetes mellitus Typ 2.
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Zellkulturmedien, Zusätze und weiteres
Konzentration Firma Katalog # Zellkulturmedien
Wachstums-Medium
DMEM/F-12 500ml Invitrogen # 21041
ECGS-H (Endothelial Cell Growth Supplement - Heparin)
2ml Promocell #C-30120
Fetales Calf Serum (FCS) 20% PAA # A15-151
Penicillin / Streptomycin 0,5% Invitrogen # 15140
FCS-Medium
DMEM/F-12 500ml Invitrogen # 21041
Fetales Calf Serum (FCS) 10% PAA # A15-151
Penicillin / Streptomycin 0,5% Invitrogen # 15140
Hungermedium
DMEM/F-12 500ml Invitrogen # 21041
Fetales Calf Serum (FCS) 0,5% PAA # A15-151
Penicillin / Streptomycin 0,5% Invitrogen # 15140
Puffer
PBS (1x) 500ml PAA # H15-002
Hank's BSS + Ca/Mg 500ml PAA # H15-008
Hank's BSS ohne Ca/Mg 500ml PAA # H15-009
Zusätze / weiteres
Trypsin 10x Invitrogen # 15400-054
Fibronectin, human BD # 356008
2.1.2. Reagenzien, Detergenzien und Stimulanzien
Firma Katalog #
1400W, iNOS Inhibitor Alexis # 270 073 M005
Acetylcholin Sigma # A6625
Acrylamide Mix, 30%ig BioRad # 161-0158
Alamar Blue Invitrogen # DAL1025
Ammonium Persulfat Sigma # A3678-100g
BioRad Protein Assay BioRad # 500-0006
BSA (Bovines Serumalbumin) Sigma # A9418
Dispase II Roche # 04942078001
EDTA Roth # 8043.1
Glucose Sigma # G7528
Glycerin Roth # 3790.2
Glycin Roth # HN07.3
Insulin, human (Actrapid®) NovoNodisk
Kaliumchlorid (KCl) Sigma # P5405
Kaliumphosphat (KH2PO4) Sigma # P5655
Kalziumchlorid (CaCl2) Sigma # C5670
L-NMMA (NG-Monomethyl-L-Arginin), NOS In- hibitor
Sigma # M7033
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 x 7H2O) Sigma # M5921
Methanol J.T. Baker # 8045
Milchpulver Roth # T145.2
Natriumbikarbonat (NaHCO3) Sigma # S5761
Natriumchlorid (NaCl) Sigma # S5886
Natriumfluorid (NaF) Sigma # S6776
Natrium-Nitroprussid (SNP) Sigma # 31444
Natriumphosphat Dihydrat (Na2HPO4 x 2H2O) Sigma # 30435
Natrium-Vanadate Sigma # S6508
Phenylephrin Sigma # P6126
Precision Plus Protein Standards, Dual Color BioRad # 161-0374
Protease Inhibitor Tabletten Roche # 11836170001
RotiLoad I, 4x-konz. Roth # K929.1
Natriumlaurylsulfat (SDS) Roth # 4360.2
TEMED Sigma # T2,250-0
Tris Ultra Roth # 5429.3
Triton X-100 Roth # 3051.2
Tween-20 Sigma # P2287
Western Lightning ECL Perkin Elmer # NEL 104001EA
2.1.3. Puffer und Lösungen
RIPA Konzentration
Tris Ultra 2,42 g/l
EDTA 0,892 g/l
Triton X-100 10 ml/l
Glycerin 100 ml/l
SDS 1 g/l
NaF 2 g/l
Na2HPO4 x 2H2O 1,42 g/l
Desoxycholat 10 g/l
Lysepuffer für phospho-Proteine Konzentration
RIPA 90 %
Protease Inhibitor Tabletten 10 %
Vanadate 0,1mM
10% SDS Polyacrylamid-Gel Konzentration Konzentration Trenngel Sammelgel
Aqua dest. 0,4 ml/ml 0,675 ml/ml
Acrylamide Mix, 30%ig 0,33 ml/ml 0,1675 ml/ml
Tris pH=8,8, 1,5 M 0,25 ml/ml
Tris pH=6,8, 1,0 M 0,125 ml/ml
SDS, 10%ig 10 µl/ml 10 µl/ml
Ammonium Persulfat, 10%ig 10 µl/ml 10 µl/ml
TEMED 0, 4 µl/ml 1 µl/ml
Laufpuffer (10x) Konzentration
Tris Ultra 30 g/l
Glycin 144 g/l
SDS 10 g/l
ad Aqua dest. 1000 ml
Transferpuffer Towbin (1x) Konzentration
Tris Ultra 3,03 g/l
Glycin 14,4 g/l
Methanol 200 ml/l
ad Aqua dest. 1000 ml
TBS (10x) Konzentration
Tris Ultra 24,2 g/l
NaCl 84 g/l
ad Aqua dest 1000 ml
pH = 7,6 mit HCl titrieren
Waschpuffer TBST (1x)
TBS 1x
Tween-20 0,1 %
Blockmedium Trockenmilch (5%)
Milchpulver, fettfrei 5 % w/v
TBST 1x
BSA (5%)
Bovines Serumalbumin 5 % w/v
TBST 1x
Krebs Puffer / Organbad Endkonzentration
KH2PO4 0,1608 g/l 1,18 mM
CaCl2 0,2775 g/l 2,5 mM
NaHCO3 2,1003 g/l 25 mM
NaCl 6,9544 g/l 119 mM
KCl 0,3504 g/l 4,7 mM
MgSO4 x 7H2O 0,2884 g/l 1,17 mM
Glucose 1,9818 g/l 11 mM
ad Aqua dest.
unter Carbogenbegasung (5% CO2 in O2)
2.1.4. Antikörper
Antikörper gegen Quelle Firma Katalog #
-Tubulin Maus Oncogene # CP07-200UG
CD31 (PECAM-1) Ratte BD Pharmingen # 558068
CD 144 (VE Cadherin) Ratte BD Pharmingen # 555289
Cyclin D1 Maus Cell Signaling
Technology
# 2926
Dyneal beads M450, anti- Ratte
Schaaf Dyneal/Invitrogen # 110.35
HRP-konjugierter Antikörper, anti-Maus
Schaaf Amersham # NA931V
HRP-konjugierter Antikörper, anti-Kaninchen
Esel Amersham # NA934V
p27Kip1 Kaninchen Cell Signaling
Technology
# 2552
Phospho-Retinoblastoma Protein
Kaninchen Cell Signaling Technology
# 9308
Sekundärantikörper Alexa Fluor® 488 anti-Ratte
Ziege Invitrogen # A11006
2.1.5. Verbrauchsmaterialien
Größe Firma Katalog #
Amersham Hybon-P PVDF Membran
GE Healthcare # NG0512
Amersham Hyperfilm ECL 18 x 24 cm GE Healthcare #28906837 Cell Proliferation ELISA,
BrdU (colorimetric)
Roche # 11647229001
Extra Thick Blot Paper XL 18,5 x 19 cm BioRad # 1703969
Pipetman P1000N 100 - 1000 µl Gilson # F144566
Pipetman P200N 20 - 200 µl Gilson # F144565
Pipetman P20N 2 - 20 µl Gilson # F144563
Pipetman P2N 0,5 - 2 µl Gilson # F144561
Pipett-Boy acu Intern. Bioscience # 155000
Pipettenspitzen, blau bis 1000 µl Sarstedt # 70.762 Pipettenspitzen, blau, sero-
logisch
bis 5 ml Sarstedt # 86.1253.001
Pipettenspitzen, gelb bis 200 µl Sarstedt # 70.760.002 Pipettenspitzen, gelb, sero-
logisch
bis 1 ml Sarstedt # 86.1251.001
Pipettenspitzen, orange, se- rologisch
bis 10 ml Sarstedt # 86.1254.001
Pipettenspitzen, rot, serolo- gisch
bis 25 ml Sarstedt # 86.1685.001
Pipettenspitzen, weiß 0,1 – 10 µl Gilson # F161631 Pipettenspitzen, weiß, lang 0,5 – 200 µl Roth # Y419.1
Reagiergefäße,1,5ml 1,5 ml Sarstedt # 72.690.001
Reagiergefäße,15 ml 15 ml BD Falcon # 352097
Reagiergefäße,50 ml 50 ml BD Falcon # 352070
Versuchsplatten, 24 Well 206 mm² TPP # TPP92424
Versuchsplatten, 6 Well 935 mm² TPP # TPP92406
Versuchsplatten, 96 Well 35 mm² TPP # TPP92097
Zellkulturflaschen 25 cm² nunc # 156367
Zellkulturflaschen 75 cm² nunc # 156499
Zellschaber, flexibel Sarstedt # 83.1830
Zellsieb 40 µm BD # 352340
Zellsieb 70 µm BD # 352350
2.2. Geräte
Gerät Typ / Modell Firma Katalog #
4-Kammersystem Multiwire Myograph System
610M, Version 2.2 Danish Myo Technology
6 Tube Magnetic Stand Ambion # AM10055
AxioVision Software 4 Carl Zeiss
Bench Type HSP 12 Kendro # 40307926
Bipolarer Mikroregulator ICC50 ERBE-
Elektromedizin BP 2000 Blood Pressure
Analysis Systems
Visitech Systems Inc.
Kühlzentrifuge 5415R Eppendorf
Lichtmikroskop mit Kamera von Leica
Olympus # CKX31
Mini Trans-Blot Elektrophorese Kammer
BioRad # 170-3930
Onetouch Ultra Blood glucose meter
LifeScan
Thermomixer compact Eppendorf
Trans Blot SD Semi-dry BioRad # 170-3940
Vortexmixer SA7 Stuart
Wasserbad 1002 GFL #1002
Zellkulturinkubator MCO-20AIC Sanyo # 40100761
Zentrifuge Multifuge 1s Herques
Zentrifuge 5415D Eppendorf
2.3. Methoden
2.3.1. Mauszucht
Es werden Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J, WT) und MK2-defiziente Mäuse (B6.129- Mapkap2tm1Mgl, MK2KO) verwendet. Beide Genotypen besitzen den gemeinsamen genetischen Hintergrund C57BL/6J und sind mindestens 10 Generationen zurückge- kreuzt. MK2-defiziente Mäuse (MK2KO) wurden von Prof. Dr. M. Gaestel des Insti- tuts für Physiologische Chemie der Medizinischen Hochschule Hannover zur Verfü- gung gestellt (30).
Ein 40-stündiger Kurs zur Tierversuchsberechtigung nach FELASA Kategorie B (engl. Federation of European Laboratory Animal Science Association) wurde vor Beginn der Versuchsarbeiten am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover (Prof. Dr. H. J. Hedrich) erfolgreich abgeschlossen.
Die Mäuse wurden unter artgerechten Bedingungen (max. fünf Tiere pro Käfig, S1 Tierhaltung, Futter und Wasser ad libitum) unter herkömmlicher Zuchtdiät bei kontrol- lierten Licht- und Temperaturverhältnissen gehalten.
2.3.2. Endotheliale Regenerationsversuche in vivo und Evans Blue Färbung Um die endotheliale Regeneration zu untersuchen, haben wir als Verletzungsmodell ein elektrisches Denudationsmodell gewählt, welches bereits von Carmeliet et al.
beschrieben und von Brouchet et al. (61-62) modifiziert wurde. Genehmigt wurden die Versuche vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Le- bensmittelsicherheit unter der Tierversuchsnummer 11/0420.
Die Endothelverletzung wurde an der Arteria carotis communis durchgeführt. Hierzu wurden 10 – 12 Wochen alte Wildtyp-Mäuse (WT, n=6) und MK2-defiziente Mäuse (MK2KO, n=9) aus eigener Zucht mit intraperitonealer Injektion von Ketamin (400mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (5mg/kg Körpergewicht) anästhesiert und a- nalgesiert. Die Narkosetiefe wurde während des Eingriffes über die Kontrolle der A- tem- und Herzfrequenz sowie das Fehlen des Flexorreflexes überprüft.
Die linksseitige Arteria carotis communis wurde mittels Mittellinieninzision freigelegt.
Es erfolgte eine elektrische Verletzung mit einem bipolarem Mikroregulator (ICC50, ERBE-Elektromedizin GmbH, Tübingen, Deutschland, 1mm breite Pinzettenspitzen) mit 2 Watt für 2 Sekunden über eine Strecke von 4 mm proximal der Karotisbifurkati- on. Nach Eingriff und Narkose wurden die Tiere in einem beheizten Inkubator (28°C)
überwacht. Um eine Nahrungszufuhr zu gewährleisten, wurden in der postoperativen Phase Wasser und Futter auf dem Käfigboden positioniert. Die Tiere wurden nach dem Eingriff täglich bezüglich ihres Wohlbefindens bzw. potentieller Beschwerden kontrolliert. Dazu wurde ein von van Griensven et al. (63) beschriebenes Score- System verwendet. Postoperativ erfolgte eine Analgesie mit Metamizol (200mg/kg Körpergewicht) sowie eine Flüssigkeitssubstitution mit 1ml 0,9%iges Natriumchlorid zweimal täglich subkutan.
Drei Tage nach der elektrischen Verletzung wurde die Reendothelialisierung evalu- iert. Dazu wurden 50µl 5%ige Evans Blau Lösung über den linken Ventrikel injiziert, die Arteria carotis communis unter oben erwähnter Narkose entnommen und mittels Mikroskop fotografiert. Die reendothelialisierte Fläche wurde aus der Differenz der gefärbten Fläche und der initial verletzten Fläche mittels computer-assistierter Morphometrie (ImageJ, NIH, Bethesda, MD) berechnet und als verschlossener De- fekt in Prozent angegeben.
Der operative Teil des Versuches wurde von Herrn Piyushkumar Kapopara (Klinik für Kardiologie und Angiologie der Medizinischen Hochschule Hannover) durchgeführt.
Abbildung 1: Elektrisches Verletzungsmodell der A. carotis communis. Schematische Darstellung der Verletzungsfläche und repräsentatives Präparat der verletzten A. caro- tis communis nach Evans Blue Färbung (blau).
2.3.3. Isolation primärer Endothelzellen aus der Maus
Für die Isolation wurden Wildtyp-Mäuse (WT) und MK2-defiziente Mäuse (MK2KO) aus eigener Zucht genutzt. Die Tiere waren 14 bis 18 Wochen alt und wurden nach intraperitonealer Anästhesie mit Ketamin (400mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (5mg/kg Körpergewicht) mit zervikaler Dislokation getötet. Nach Hautdesinfektion mit Sterillium wurden die Lungen von 4 Mäusen mit gleichem Geschlecht mittels Sterno- tomie entnommen und gepoolt. Nach einer manuellen Reinigung von Fett- und über- schüssigem Bindegewebe wurden die Lungen mit einem Skalpell fein zerkleinert. Als nächstes wurde das Lungengewebe durch ein 40 µM Zellsiebs mit Hank´s BSS ohne Ca/Mg gewaschen und danach zur Dissoziation der Endothelzellen aus dem Zellver- bund in Dispase II (Roche, 100U in 20ml Hank´s BSS ohne Ca/Mg) bei 37° Celsius eine Stunde unter gleichmäßigem Schwenken inkubiert. Durch manuelles Re- suspendieren wurde die Zellsuspension weitestgehend homogenisiert und dann durch ein 70 µM Zellsieb in 10% FCS-haltiges DMEM/F-12 Medium (Invitrogen) filt- riert. Durch das Serum wurde die Verdauungsreaktion gestoppt. Nach zweimaligem Zentrifugieren bei 290g für je 5 min. wurde die Zellsuspension dann mit 25 µl sheep anti-rat dyneal beads (Invitrogen), welche vorher mit 5µl rat anti-mouse CD 144 Anti- körper (BD Pharmingen) gecoatet wurden, 30 min. bei Raumtemperatur unter gleichmäßiger Rotation inkubiert. Danach erfolgte die Zellseparation mittels eines Magneten (Ambion) für viermal 2 min. Als Waschpuffer diente dabei Hank´s BSS oh- ne Ca/Mg plus 0,5% bovines Serumalbumin (BSA). Die Zellen wurden als Passage 0 mit Wachstums-Medium im 24-Well Format auf Fibronectin ausgesät. Nach 24 Stun- den wurden durch den ersten Mediumwechsel nicht adhärente Zellen abgewaschen.
Weiter wurde das Wachstums-Medium im zweitägigen Rhythmus gewechselt.
Die primäre Zellkultur wurde beim ersten Passagieren mit Anti-CD 144 gecoateten dyneal beads wie oben beschrieben nachgereinigt und in der weiteren Kultivierung im Verhältnis 1:4 bis 1:5 passagiert. Dazu wurden die adhärenten Zellen kurz mit 0,05% Trypsin / EDTA (Invitrogen) bei 37° Celsius inkub iert. Für die Versuche wur- den die Zellen in Passage zwei bis drei ausgesät.
Das Wachstums-Medium war wie folgt zusammengesetzt: DMEM/F-12 (Invitrogen), 20% fetales Kalbserum (FCS, hitzeinaktiviert, PAA), 0,4% Endothelzell Wachstums- zusatz mit Heparin (ECGS-H, Promocell) und 0,5% Antibiotika (Penicil- lin/Streptomycin, Gibco/Invitrogen).
Abbildung 2a zeigt repräsentative Aufnahmen der Zellkultur im Lichtmikroskop bei 5- facher Vergrößerung. Es ist das endothelzellspezifische Kopfsteinmuster (cobble stone pattern) zu sehen.
2.3.4. Immunfluoreszenzfärbungen muriner Endothelzellen
Die Endothelzellen wurden auf einerm Mikroskopdeckglas in einer 6-well-Platte auf Fibronectin ausgesät. Der konfluente Zellrasen wurde zunächst zweimal mit PBS gewaschen und danach mit 4% Paraformaldehyd / PBS für 10 min. bei Raumtempe- ratur fixiert. Danach folgte dreimaliges Waschen mit PBS. Zum Blocken unspezifi- scher Bindungsstellen wurden die Zellen mit einer Blockierungslösung (1% BSA / PBS) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Absaugen folgte die Inkubation mit dem Primärantikörper CD31 (PECAM-1, Platelet endothelial cell ad- hesion molecule, 1:200, BD Pharmingen) über Nacht bei 4° C. Die Zellen wurden daraufhin dreimal mit PBS gewaschen und mit dem Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 (1:500 in PBS, Invitrogen) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden erneut dreimal in PBS gewaschen, bevor sie mit dem Fluoreszenz- farbstoff DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol, 300nM in PBS) für 10 min. bei Raum- temperatur in Dunkelheit inkubiert wurden. DAPI bindet an Adenin- und Thymin- reiche DNS Abschnitte und stellt damit den Zellkern dar. Schließlich wurden die Zel- len noch jeweils einmal mit PBS und destilliertem Wasser gewaschen, bevor eine Fluoreszenzverstärkerlösung (DAKO) hinzugefügt wurde und Aufnahmen mittels Fluoreszenzmikroskop gemacht wurden (Abbildung 2b).
Als Negativkontrolle dienten Endothelzellen bei denen die Immunfluoreszenzfärbung ohne den Primärantikörper CD31 durchgeführt wurde (Abbildung 2c).
Abbildung 2: Repräsentative Aufnahmen der Endothelzellkultur. A, 5-fache Vergröße- rung im Lichtmikroskop: typisches Kopfsteinmuster (cobble stone pattern). B, 40- fache Vergrößerung der Immunfluoreszenzfärbung mit dem endothelzell-spezifischen Oberflächenmarker CD31 (grün) und der Zellkernmarkierung mittels DAPI (blau) und C, der Negativkontrolle ohne Primärantikörper (DAPI, blau).
2.3.5. Zellkulturbedingungen
Die murinen Endothelzellen wurden in Zellkulturflaschen oder auf Versuchsplatten in einem Zellkulturinkubator der Firma Sanyo bei 37° Cel sius, 95% O2 und 5% CO2 kul- tiviert. Die Zellkulturmedien wurden vor dem Wechsel in einem Wasserbad der Firma GFL auf 37° Celsius erhitzt. Mediumwechsel erfolgte unt er sterilen Bedingungen un- ter einer Sicherheitswerkbank der Firma Heraeus mit laminarem Luftzug. Nähere Zu- sammensetzung der Kultur- und Versuchsmedien siehe 2.1.1.
2.3.6. Proliferationsversuche mit Alamar Blue
Alamar Blue wurde von der Firma Invitrogen erworben. Es kann schadlos in die Zel- len diffundieren und besitzt ein höheres Redox-Potential als die Zytochrome der E- lektronentransportkette. So wird es bei der Energiebereitstellung durch den Elektro- nentransport, wie er bei der Proliferation stattfindet, reduziert, ohne diesen Vorgang selbst zu beeinflussen. Dabei ändert es seine photometrischen Eigenschaften und ist damit ein geeigneter Marker für die Zellproliferation (Angaben des Herstellers, (64)).
Alamar Blue wurde neben anderen Zellreihen bereits an glatten Gefäßmuskelzellen getestet (65). Proliferationsanalysen mit Alamar Blue geben im Vergleich mit der viel verbreiteten 3[H]-Thymidin Inkorporationsanalyse ähnlich zuverlässige und reprodu- zierbare Ergebnisse und zeigen sogar methodische Vorteile. So handelt es sich um ein nicht-radioaktives, nicht-toxisches Verfahren, welches eine große Anzahl an Pro- ben ermöglicht und sogar noch weitere Analysen der Zellen zulässt (66-67).
Die Versuche wurden im 96-Well Format als vierfach Ansatz für jede Bedingung durchgeführt. Zunächst erfolgten Pilotversuche, um ein optimales Verhältnis zwi- schen Zelldichte und Zeitpunkt der Messung mit möglichst linearem Wachstumsver- halten der Zellen zu erhalten. Die Endothelzellen wurden mit 1000 Zellen pro Well auf Fibronectin-beschichtete 96-Well Versuchsplatten (dies entspricht ~28,5 Zellen pro mm²) in 150µl Wachstums-Medium ausgesät und über Nacht in Wachstums- Medium inkubiert. Um alle Zellen in die gleiche Zellzyklusphase zu bringen, wurden sie vor der Stimulation für vier Stunden auf 150µl 0,5% FCS-haltiges DMEM/F-12 (Invitrogen) gesetzt. Die Stimulation erfolgte jeweils mit 150µl Wachstums-Medium, 10% FCS-haltigem DMEM/F-12. Die Stimulationsmedien enthielten 10% Alamar Blue.
Zu Beginn des Versuchs und nach 24 Stunden wurden 100µl Überstand im Photo- meter bei 570nm und 600nm analysiert.
Mit folgender Gleichung wurde der Anteil an reduziertem Alamar Blue berechnet:
Anteil an reduziertem = (O2 x A1) - (O1 x A2) x 100 Alamar Blue (%) (R1 x N2) - (R2 x N1)
wobei gilt:
O1 sei der molare Extinktionskoeffizient (E) vom oxidierten Alamar Blue bei 570nm = 80586,
O2 sei E vom oxidierten Alamar Blue bei 600nm = 117216, R1 sei E vom reduzierten Alamar Blue bei 570nm = 155677, R2 sei E vom reduzierten Alamar Blue (rot) bei 600nm = 14652, A1 sei die Absorption der Probe bei 570nm,
A2 sei die Absorption der Probe bei 600nm,
N1 sei die Absorption der Negativkontrolle (Medium plus Alamar Blue ohne Zellen) bei 570nm,
N2 sei die Absorption der Negativkontrolle (Medium plus Alamar Blue ohne Zellen) bei 600nm.
Die Ergebnisse sind als x-fache Zunahme des reduzierten Alamar Blue nach 24 Stunden gegenüber dem Ausgangswert dargestellt. Die Ausgangswerte sind dabei auf 1 gesetzt.
2.3.7. Proliferationsversuche mit BrdU
Das Cell Proliferation ELISA BrdU (Colorimetric) Kit wurde von der Firma Roche er- worben. Es folgt dem Prinzip der herkömmlichen [3H]-Thymidin Inkorperationsanaly- se. BrdU (5-Bromo-2'-Deoxyuridin) wird in das replizierende Genom proliferierender Zellen anstelle von Thymidin eingebaut und kann mittels Enzym-linked Immunosor- bant Assay (ELISA) quantitativ erfasst werden. BrdU ist im Gegensatz zu [3H]- Thymidin allerdings nicht radioaktiv markiert. Das eingebaute BrdU wird durch einen Peroxidase-gekoppelten anti-BrdU-Antikörper detektiert und nach Zugabe des Sub- strats über eine Farbreaktion dargestellt. Die quantitative Analyse erfolgt in einem herkömmlichen Photometer (Angaben des Herstellers, (68)).
Die Versuche wurden im 96-Well Format durchgeführt. Zunächst erfolgten Pilotver- suche um ein optimales Verhältnis zwischen Zelldichte und Zeitpunkt der Messung
mit möglichst linearem Wachstumsverhalten der Zellen zu erhalten. Die Endothelzel- len wurden mit 10.000 Zellen pro Well auf Fibronectin-beschichtete 96-Well Ver- suchsplatten in 100µl Wachstums-Medium ausgesät und für 24 Stunden unter Wachstums-Medium inkubiert. Um alle Zellen in die gleiche Zellzyklusphase zu brin- gen, wurden sie vor der Stimulation für vier Stunden auf 100µl 0,5% FCS-haltiges DMEM/F-12 (Invitrogen) gesetzt. Die Stimulation erfolgte jeweils mit 100µl Wachs- tums-Medium bzw. 10% FCS-haltigem DMEM/F-12 für weitere 24 Stunden. Drei Stunden vor Ende der Stimulationszeit wurde dem Medium 10µl BrdU Reagenz mit einer Endkonzentration von 10µM hinzugeführt. Nach Ende der Stimulationszeit wur- de der Überstand abgesaugt und die DNS mittels 200 µl/Well FixDenat Lösung für 30 min. bei Raumtemperatur denaturiert. Nach Absaugen der Lösung wurden 100 µl/Well des anti-BrdU-POD Komplexes (anti-BrdU Antikörper mit Peroxidase gekop- pelt) auf die Zellen gegeben und für 90 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Zellen dreimal mit 200 – 300 µl/Well PBS (1x) gewaschen, bevor 100 µl/Well Substratlösung auf die Zellen gegeben wurde und für ca. 20 min. bei Raum- temperatur inkubiert wurde. Die photometrische Analyse bei 370 nm und 492 nm Wellenlänge erfolgte dreimal in 5 min. Zeitintervallen.
Als Leer- bzw. Hintergrundkontrollen dienten:
Leerkontrolle Hintergrundkontrolle
Stimulationsmedium 100 µl -
Zellen in Medium - 100 µl
BrdU 10 µl -
Anti-BrdU-POD 100 µl 100 µl
2.3.8. Regenerationsversuche mit primären murinen Endothelzellen in vitro Die Versuche wurden im 6-Well Format mit einer konfluenten Kultur muriner Endo- thelzellen in 2 ml Medium durchgeführt. Alle Bedingungen erfolgten als vierfach- Ansatz, wobei in zwei Wells jeweils zwei parallel verlaufende Defekte gesetzt wur- den.
Für die Defektsetzung im Zellrasen wurden ein Zellscraper der Firma Sarstedt so zugeschnitten, dass mit zuverlässiger Reproduzierbarkeit zwei Defekte mit je ~2,5
mm Breite entstehen. Vor jeder Defektsetzung wurde der Zellscraper in reinem Etha- nol desinfiziert.
Die konfluenten Zellen wurden zunächst mit 0,5%-FCS haltigem DMEM/F-12 (In- vitrogen) für 4 Stunden gehungert. Um Verunreinigung mit abgelösten Zellen zu ver- meiden, wurde das Medium erst nach Setzen des Defekts in die Stimulationsbedin- gungen gewechselt. Diese waren Wachstums-Medium (EGM) bzw. FCS-Medium (10% Fetal Calf Serum in DMEM/F-12, FCS).
Direkt nach der Stimulation sowie 24, 48 und 72 Stunden später wurde der gesetzte Defekt mit einem Lichtmikroskop (Zeiss) in 10-facher Vergrößerung im Phasenkon- trast fotografiert (Leica) und mit der Software Axiovision 4 wie folgt ausgewertet (sie- he Abbildung 3). Die Defektzone im Gesichtsfeld wurde auf eine Länge von 2 mm durch Markierungen begrenzt und mit dem Kursor abgefahren. Die Defektfläche wur- de von der Software berechnet und hatte eine Ausgangsgröße von ca. 4,73 ± 0,04 mm2. Um sicher zu stellen, dass jeweils die gleiche Defektregion analysiert wird, wurde senkrecht zum Defekt eine Filzstiftmarkierung gesetzt, an welcher jedes Foto ausgerichtet wurde (oberer Bildrand).
Mit dieser Methode ist es möglich, zuverlässig denselben Defektbereich in einer Zeitabhängigkeit zu analysieren.
Abbildung 3: Regenerationsversuch in vitro, zeitlicher Verlauf. Lichtmikroskopische Aufnahmen in 10-facher Vergößerung mit Axiovision ausgewertet.
2.3.9. Gewinnen von Proteinlysaten
Verwendete Puffer / Lösungen (siehe 2.1.3):
- Lysepuffer für Phospho-Proteine
Proteinisolation aus kultivierten murinen Endothelzellen
Alle Versuche zur Gewinnung von Proteinlysaten für proteinbiochemische Analysen mit Western Blotting wurden im 6-Well Format durchgeführt. Die Zellen wurden bei Versuchsende auf Eis mit 1 ml eiskaltem PBS gewaschen und dann in 100 µl Lyse- puffer für Phospho-Proteine mit Hilfe eines beweglichen Zellschabers (Sarstedt) un- ter leichtem Druck vom Boden der Versuchsplatte gelöst, in vorgekühlte 1,5 ml Rea- giergefäße überführt, in flüssigem Stickstoff schock gefroren und bei -80° Celsius gelagert. Bevor eine quantitative Proteinbestimmung nach herkömmlichem Bradford
min., 4° Celsius) von nukleären Bestandteilen getrennt. Das Sediment wurde verwor- fen. Die photometrische Analyse des Überstandes erfolgte nach Zugabe des Indika- tors als zweifacher Ansatz mit einem Photometer. Zur Berechnung der Proteinkon- zentration diente eine Standardreihe mit bovinem Serumalbumin (BSA).
2.3.10. Gelelektrophorese und Western Blotting Verwendete Puffer / Lösungen (siehe 2.1.3):
- 10% SDS Polyacrylamid-Gel - Laufpuffer (1x)
- Transferpuffer nach Towbin (1x) - Waschpuffer TBST (1x)
- Blockmedium Trockenmilch (5%)
Western Blotting ist eine biochemische Analyse mittels spezifischer Antikörper zum quantitativen Nachweis von Proteinen (70). Der schematische Ablauf ist in Abbildung 4 dargestellt. Gleiche Proteinmengen (je nach Versuch zwischen 25 und 40 µg) von Zelllysaten wurden mit reduzierendem Beladungspuffer RotiLoad (1:4, Roth) aufge- kocht, auf ein 10% SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen und durch Elektrophorese (Mini Trans-Blot Kammer, BioRad) der Größe nach aufgetrennt (25mA pro Gel) (71).
Die Proteine wurden danach mit einem Trans Blot SD Semi-dry (BioRad) auf eine Polyvinyliden-difluorid Membran (Amershan PVDF, GE Healthcare) geblottet (0,2A pro Gel für eine Stunde bei Raumtemperatur). Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran wurden danach eine Stunde in 5% fettfreier Trockenmilch (in TBST) ge- blockt. Nach dreimaligem Waschen in TBST wurde die Membran über Nacht mit dem Primärantikörper (Konzentration und Diluent nach Herstellerangaben) bei 4° Celsius unter leichtem Schwenken inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit TBST folgte die Inkubation mit Horse-Raddish- Peroxidase-(HRP)-gekoppeltem Sekundärantikörper für 90 min. bei Raumtempera- tur. Vor dem Entwickeln mit Western Lightning Chemiluminescent Reagent Plus (Perkin Elmer) wurde die Membran je nach zu erwartender Signalstärke unterschied- lich lang gewaschen: dreimal fünf Minuten bei starkem Signal (z.B. -Tubulin), bzw.
zweimal zehn und dreimal fünf Minuten bei schwachem Signal (z.B. phospho- Retinoblastoma Protein). Für einen Reblot (weitere Analyse oder Beladungskontrolle) wurde die Membran nach dem Entwickeln dreimal kurz in TBST gewaschen, erneut
in 5% fettfreier Trockenmilch für eine Stunde bei Raumtemperatur geblockt, dreimal in TBST gewaschen und mit einem weiteren Primärantikörper über Nacht bei 4° Cel- sius unter leichtem Schwenken inkubiert. Die weiteren Schritte erfolgten analog zu den bisher beschriebenen. Als Beladungskontrolle diente -Tubulin. Wenn nicht an- ders angegeben, wurde dreimal fünf Minuten in TBST gewaschen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Western Blots. A, Gelelektrophorese und Proteintransfer. B, Proteindetektion mittels antikörpervermittelter Chemilumineszenz- reaktion (modifiziert nach (72-73)).
2.3.11. Fütterung der Mäuse
Um die funktionelle Rolle einer MK2-Defizienz auf die vaskuläre Funktion unter dia- betogenem Stress zu untersuchen, haben wir uns bewusst für eine diätetische Induk- tion der diabetogenen Stoffwechsellage entschlossen. Das Modell sollte einen Diabe- tes mellitus Typ 2 mit relativem Insulinmangel und Hyperglykämie simulieren und keinen absoluten Insulinmangel, wie er bei den gängigen Diabetesmodellen mittels transgener Mutation oder toxischer Pankreasschädigung durch z.B. Streptozotocin vorliegt. Durch die diätetische Induktion wird unserer Meinung nach die Pathogenese des Diabetes mellitus Typ 2 am ehesten nachgestellt, außerdem kommt es unter ei- ner hoch-fetthaltigen Diät (HFD) zu Begleiterscheinungen wie Adipositas und Dysli-
a.
b.
pidämie, welche im klinischen Alltag häufig mit einem Diabetes mellitus Typ 2 verge- sellschaftet sind.
Es wurden jeweils acht 11 bis 13 Wochen alte, männliche Wildtyp-Mäuse (WT) bzw.
MK2-defiziente Mäuse (MK2KO) 24 Wochen unter hoch-fetthaltiger Diät mit 60%
Fettanteil (HFD, Abdiets, Niederlande) artgerecht gehalten (kontrollierte Licht- und Temperaturverhältnisse, vier Tiere pro Käfig, S1 Tierhaltung, Futter und Wasser ad libitum). Als Kontrollfütterung diente die herkömmliche Zuchtdiät (Normaldiät, Chow).
Zu Beginn und zum Ende der Fütterung wurden das Körpergewicht, der systolische Blutdruck, die Herzfrequenz und der Blutzuckerspiegel gemessen. Als weitere End- punkte wurden Glukose- und Insulintoleranztestungen sowie Vasorelaxationsversu- che durchgeführt.
2.3.12. Analyse von systolischem Blutdruck und Herzfrequenz
Der systolische Blutdruck und die Herzfrequenz von männlichen Wildtyp-Mäusen (WT) bzw. MK2-defizienten Mäusen (MK2KO) wurde mittels Tailcuff Plethys- mography mit BP 2000 Blood Pressure Analysis Systems der Firma Visitech Sys- tems Inc. (NC, USA) gemessen (siehe Abbildung 5). Jede Messung bestand aus drei Vorlaufmessungen und zehn Hauptmessungen, wobei nur die Hauptmessungen sta- tistisch erfasst wurden. Dieser Durchgang wurde zu Beginn der Studie an verschie- denen Tagen insgesamt zwei- bis dreimal wiederholt bis einheitliche Blutdruckwerte eine Gewöhnung der Tiere an die Prozedur implizierten. Die darauf folgende Mes- sung wurde dann in die Analyse aufgenommen. Bei Ende der Studie wurden die Mäuse als adaptiert angesehen und keine Gewöhnungsmessungen durchgeführt, wobei die Messung ebenfalls aus drei Vorlaufmessungen und zehn Hauptmessun- gen bestand. Die Basalwerte für systolischen Blutdruck und Herzfrequenz wurden mit jeweils 16 Mäusen pro Genotyp (WT bzw. MK2KO) im Alter von 11-13 Wochen erhoben. Die Analysen zum Ende der Fütterungsstudie wurden mit jeweils acht Mäu- sen pro Gruppe (WT Chow, WT HFD, MK2KO Chow, MK2KO HFD) im Alter von ca.
35 Wochen durchgeführt.
Abbildung 5: BP 2000 Blood Pressure Analysis Systems (Visitech Systems, USA) (74).
2.3.13. Bestimmung von Körper- und Organgewicht
Zu Beginn der Fütterungsstudie wurde bei jeweils 16 männlichen Wildtyp-Mäusen (WT) bzw. MK2-defizienten Mäusen (MK2KO) im Alter von ca. 11 bis 13 Wochen das Körpergewicht bestimmt.
Zum Ende der Fütterungsstudie wurde bei jeweils sieben bis acht Tieren pro Gruppe (WT Chow, WT HFD, MK2KO Chow, MK2KO HFD) das Körpergewicht und nach Tö- tung mit zervikaler Dislokation das Organgewicht von Leber, Nieren und linkem Ventrikel bestimmt. Zur Gewichtsanalyse des linken Ventrikels wurden die Vorhöfe und der rechte Ventrikel entfernt.
2.3.14. Glukose- und Insulintoleranztestungen
Zum Ende der Fütterung wurden bei jeweils acht 35 – 37 Wochen alten, männlichen Wildtyp-Mäusen (WT) bzw. MK2-defizienten Mäusen (MK2KO) nach 24-wöchiger hochfetthaltiger Diät (HFD) Glukose- und Insulintoleranztestungen durchgeführt. Au- ßerdem wurde zu Beginn der Fütterungsstudie bei jeweils 16 11 – 13 Wochen alten, männlichen Wildtyp-Mäusen (WT) bzw. MK2-defizienten Mäusen (MK2KO) die Nüch- tern-Blutglukosekonzentration bestimmt.
Die Mäuse wurden vier Stunden vor der Glukose- bzw. Insulintoleranztestung nüch- tern gelassen. Für den Glukosetoleranztest wurde ihnen 1,25 g/kg Glukose intraperi- toneal injiziert. Die Blutglukosekonzentrationen wurden vor sowie 15, 30, 60 und 120 min. nach der Injektion mittels Onetouch Ultra Blood glucose meter (LifeScan) aus einer Schwanzvene bestimmt. Für den Insulintoleranztest wurde den Mäusen 0,6 U/kg Insulin intraperitoneal injiziert. Die Blutglukosekonzentrationen wurden wie oben beschrieben vor sowie 15, 30, 45, 60 und 90 min. nach der Injektion bestimmt.
Diese Experimente wurden größtenteils von Herrn Jan Freark de Boer (Hanze Uni- versität Groningen, Arbeitsgruppe Prof. U. J. F. Tietge) durchgeführt.
2.3.15. Vasorelaxationsversuche mit murinen Aortenringen Verwendete Puffer / Lösungen (siehe 2.1.3):
- Krebs Puffer
Es wurden jeweils sieben 35 bis 37 Wochen alte Wildtyp-Mäuse (WT) bzw. MK2- defiziente Mäuse (MK2KO) nach lebenslanger Normaldiät (Chow) bzw. 24-wöchiger hoch-fetthaltiger Diät (HFD) untersucht.
Für die Vasorelaxationsversuche wurde die Aorta unter Isoflurannarkose (2%) ent- nommen, in eiskaltem PBS von adhärentem Fett freipräpariert und in ca. 2 mm lange Ringe geschnitten. Zur Analyse wurde das 4-Kammersystem Multiwire Myograph System, Model 610M (Version 2.2) der Firma Danish Myo Technology genutzt (siehe Abbildung 6). Alle Untersuchungen wurden in 5 ml Krebs Puffer bei 37° C und 95%
O2 plus 5% CO2 (Carbogen) durchgeführt.
Abbildung 6: Multiwire Myograph System, Model 610M (Danish Myo Technology, Dä- nemark) (75).
Vordehnung der Aortenringe auf 90mmHg
Um eine einheitliche physiologische Vorspannung der Ringe von 90 mmHg zu ge- währleisten, wurde zunächst eine Abhängigkeit zwischen Wandspannung und Ge- fäßumfang bzw. Wandspannung und Abstand der Pins hergestellt. Nach der Präpa- ration wurden die Ringe zunächst für 20 min. in 5 ml Krebs Puffer und Carbogen in-
kubiert, bevor sie jeweils sukzessive 100 µm gedehnt wurden bis eine Maximalkraft von 20 mN vorlag. Daraus wurde ein exponentielles Verhältnis zwischen Wandspan- nung T [mN/mm] und Gefäßumfang L [µm] hergestellt.
L = (+2)*d+2S T = F/2*l T = c*e^(a*L)
wobei gilt:
d sei der Durchmesser eines Pins (40 µm),
S sei der Abstand der Pins / Einstellung des Positioners in µm, F sei die aufgezeichnete Kraft in mN,
l sei die Länge des Aortenrings in mm, c und a seien Konstanten.
Über folgende Formeln wurde über den Gefäßumfang L der nötige Abstand des Po- sitioners für einen Gefäßdruck von 90 mmHg errechnet:
P = 2*T/(0,133*L), L = a*S+b,
wobei gilt:
P sei der Druck in mmHg,
T sei die Wandspannung in mN/mm, L sei der Gefäßumfang in µm,
S sei der Abstand der Pins / Einstellung des Positioners in µm, a und b seien Konstanten der Geradengleichung.
Die Aortenringe wurden entsprechend eines Druckes von 90 mmHg vorgedehnt, einmal mit Krebs Puffer gewaschen und für 30 min. ruhen gelassen, bevor die Kon- striktions- und Relaxationsversuche begonnen wurden.
Bestimmung der Maximalkonstriktion auf Kaliumchlorid (KCl)
Zur Bestimmung der Maximalkonstriktion wurden die Aortenringe für 15 min. mit 60 mM Kaliumchlorid (KCl) stimuliert. Danach erfolgte mehrmaliges Waschen mit jeweils 5 ml Krebs Puffer und eine 30-minütige Ruhephase.
Alle weiteren Konstriktions- bzw. Relaxationsversuche wurden als zweifacher Ansatz durchgeführt.
Vasokonstriktion auf Phenylephrin (PE)
Die Ringe wurden in halblogarithmischen Schritten mit Phenylephrin (PE) Konzentra- tionen von 10-9 bis 10-5 M stimuliert. Die Konzentration wurde jeweils nach Erreichen eines Plateaus gesteigert. Als Positivkontrolle wurde im Anschluss für 5 min. mit 60 mM KCl stimuliert. Danach wurde wiederholt mit 5 ml Krebs Puffer gewaschen bis die Ausgangsspannung erreicht wurde. Es folgte eine 30-minütige Ruhephase.
Endothel-abhängige und -unabhängige Vasorelaxation
Für die Endothel-abhängige Vasorelaxation wurden die Aortenringe mit 7 µM PE bis zum Erreichen eines Plateaus vorkontrahiert und danach mit Konzentrationen von 10-9 bis 10-5 M Acetylcholin (ACh) relaxiert. Die Konzentration wurde jeweils bei Er- reichen eines Plateaus schrittweise halblogarithmisch gesteigert.
Zur Analyse der Endothel-unbhängigen Vasorelaxation wurden die Aortenringe mit 7 µM PE vorkontrahiert und nach Erreichen eines Plateaus mit Natrium-Nitroprussid (SNP), einem Stickstoffmonoxid- (NO) Donor, relaxiert. Dazu wurde die Konzentrati- on bei Erreichen eines Plateaus in halblogarithmischen Schritten von 10-10 bis 10-5 M erhöht.
Einfluss des NO Synthase (NOS) Inhibitors NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA), des inuduzierbare NOS (iNOS) Inhibitors 1400W und von Insulin auf den Vasotonus Um die basale Aktivität der NO Synthase (NOS) indirekt zu untersuchen, wurden die Ringe zunächst mit 7 µM PE vorkontrahiert bis ein Plateau erreicht wurde und da- nach mit 1 mM NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA, Calbiochem, Cat. #475886) in- kubiert. L-NMMA konkurriert mit dem Substrat L-Arginin an der Bindungsstelle der NOS und hemmt dadurch selektiv alle drei Isoformen der NOS (76). Dies resultiert in einer gesenkten NO-Produktion. Aus der Zunahme der Vasokonstriktion nach Gabe von L-NMMA kann indirekt auf die NO-Produktion und die NOS Aktivität geschlossen
