Untersuchung von Varianten in der kodierenden sowie angrenzenden Sequenz von Adipositas-relevanten Genen

Aus dem Institut für Experimentelle Pädiatrische Endokrinologie

der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Untersuchung von Varianten in der kodierenden sowie

angrenzenden Sequenz von Adipositas-relevanten Genen

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor rerum medicarum (Dr. rer. medic.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät

Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Jessica Mühlhaus (geb. Grothe)

aus Berlin

Gutachter: 1. Prof. Dr. med. A. Grüters-Kieslich

2. Prof. Dr. med. T. Schöneberg

3. Prof. Dr. Dr. med. D. Führer-Sakel

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Seite Verzeichnis der Abkürzungen ... III

1. Abstract ... 1

2. Einleitung ... 2

2.1 Adipositas als wachsendes Gesundheitsproblem ... 2

2.2 Genetische Prädisposition für Adipositas ... 2

2.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) ... 3

2.3.1 Gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR) ... 4

2.3.2 Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) ... 4

3. Zielstellung ... 5

3.1 Untersuchung von Single-Nukleotid-Polymorphismen in der kodierenden sowie nicht kodierenden Sequenz des GIPR ... 6

3.2 Bewertung von Assoziationssignalen häufiger Genvarianten am Beispiel des MC4R ... 7

3.3 Untersuchung von Adipositas-relevanten Genvarianten im MC4R im Hinblick auf eine mögliche Abstammungsidentität oder einen Mutationshotspot ... 7

3.4 Untersuchung von möglichen pharmakologischen Therapieansätzen zur Wiederherstellung der Rezeptorfunktion - exemplarisch an Nonsense- Mutationen im MC4R ... 7

4. Methoden ... 8

4.1 Analyse von Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) ... 8

4.2 Statistische Auswertung und Haplotypanalyse ... 9

5. Ergebnisse... 10

5.1 Die untersuchten SNPs im Bereich des GIPR zeigen keine Assoziation mit Adipositas, jedoch eine Assoziation mit erhöhtem HOMA-IR. ... 10

5.2 SNP-Haplotypen außerhalb des kodierenden Bereichs des MC4R sind mit erhöhtem BMI assoziiert, unabhängig von möglichen MC4R-Mutationen. ... 11

5.3 „Cryptic relatedness“ beeinflusst die Auswertung von Fall-Kontroll-Studien. .. 11

5.4 Das häufige Auftreten der europäischen Doppelmutationen im MC4R [p.Tyr35Stop;c.110 A>T] und p.[Val103Ile;Ser127Leu] basiert auf einem „Common-Founder-Effekt“. ... 12

Inhaltsverzeichnis II

5.5 Aminoglykosid-vermitteltes Überlesen von Nonsense-Mutationen im MC4R

bewirkt die Wiederherstellung funktioneller Rezeptoreigenschaften. ... 14

6. Diskussion ... 14

6.1 Bedeutung und Interpretation von Adipositas-assoziierten SNPs im Umfeld Adipositas-relvanter Gene ... 14

6.2 Bewertung von Genomweiten Assoziationsstudien vor dem Hintergrund synthetischer Assoziation ... 16

6.3 Einfluss von Populationsstrukturen wie „cryptic relatedness“ auf Assoziationsstudien ... 17

6.4 Therapeutische Intervention bei Nonsense-Mutationen im MC4R ... 17

6.5 Schlussbetrachtung ... 19

7. Literaturverzeichnis ... 20

8. Anteilserklärung ... 31

9. Druckexemplare der ausgewählten Publikationen ... 33

10. Curriculum Vitae ... 36

11. Publikationsliste ... 37

12. Selbständigkeitserklärung ... 40

Verzeichnis der Abkürzungen III

Verzeichnis der Abkürzungen

Abkürzung Bedeutung

AgRP agouti-related peptide

BMI Body-Mass-Index

cAMP cyclic adenosine monophosphate (Zyklisches

Adenosinmonophosphat)

CART cocaine and amphetamine-related transcript

CF cystische Fibrose

COS-7 Nierenzellen der grünen Meerkatze Cercopithicus aethiops

DMD Duchenne muscular dystrophy (Muskeldystrophie vom Typ

Duchenne)

EDTA Ethylendiamintetraazetat

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

FTO fat mass and obesity related locus

GIP gastric inhibitory polypetide, auch: glucose-dependent

insulinotropic peptide

GIPR gastric inhibitory polypetide receptor, auch: glucose-dependent insulinotropic peptide receptor

GIPR gastric inhibitory polypetide receptor, auch: glucose-dependent insulinotropic peptide receptor (Gen)

GPCR G-protein-coupled receptor (G-Protein-gekoppelter

Rezeptor)

GWAS genome-wide association study (genomweite

Assoziationsstudie)

HOMA-IR homeostatic model assessment of insulin resistance

kb Kilobasen

LD linkage disequilibrium (Kopplungsungleichgewicht)

LepR Leptin-Rezeptor (Gen) MALDI-TOF

MS

Matrix-assisted laser desorption/ionisation time of flight mass-spectrometry

MC4R melanocortin 4 receptor (Melanocortin-4-Rezeptor)

MC4R melanocortin 4 receptor (Melanocortin-4-Rezeptor) (Gen)

NPY Neuropeptid Y

Ob Leptin (Gen)

PC1 Prohormone convertase-1 (Gen)

POMC pro-opiomelanocortin (Gen)

rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)

SNP Single-Nukleotid-Polymorphismus

1. Abstract 1

1. Abstract

Im Rahmen von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) wurden bisher 32 Genorte identifiziert, für die eine Assoziation mit Adipositas nachgewiesen werden konnte, darunter MC4R (Melanocortin-4-Rezeptor) und GIPR (gastric inhibitory polypeptide receptor). Der MC4R ist an der hypothalamischen Gewichtsregulation und der GIPR an der Insulinsekretion in Reaktion auf orale Aufnahme glukosehaltiger Nahrung beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden genetische Varianten (Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) und Mutationen) in der kodierenden sowie angrenzenden Sequenz dieser beiden Gene im Hinblick auf folgende Aspekte untersucht: a) auf ihren Einfluss auf das Auftreten von Adipositas sowie möglichen Komorbiditäten, b) auf die Bedeutung positiver Assoziationssignale, c) auf ihre Verbreitung und d) auf mögliche zukünftige Therapieansätze.

Für die von uns analysierten SNPs im Bereich des GIPR konnte keine Assoziation mit Adipositas bestätigt werden, jedoch zeigte sich eine Assoziation mit erhöhten HOMA-IR-Werten (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance). Für den MC4R konnte ein SNP-Haplotyp identifiziert werden, der mit erhöhtem BMI assoziiert ist. Diese Assoziation ist unabhängig von möglichen MC4R-Mutationen im kodierenden Bereich. Zusätzlich konnten wir erste Hinweise auf einen Haplotyp feststellen, der sowohl zwischen übergewichtigen MC4R-Mutationsträgern und Nichtträgern, als auch zwischen Trägern funktionell relevanter und nicht relevanter Mutationen unterscheidet. Dabei wurde der Einfluss von „cryptic relatedness“ deutlich, da eine größere Anzahl an Studienteilnehmern Träger der häufigen europäischen Doppelmutation [p.Tyr35Stop; c.110 C>T] war. Eine zusätzliche Haplotypanalyse bei den Familien der Doppelmutationsträger und unabhängigen Kontroll-Trios ergab, dass ein „Common-Founder-Effekt“ als sehr wahrscheinlich angenommen werden kann.

Da MC4R-Nonsense-Mutationen wie die [p.Tyr35Stop; c.110 C>T] in der Regel mit schwerer, frühmanifester Adipositas einhergehen, wurde schließlich die Möglichkeit eines pharmakologischen Therapieansatzes untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Aminoglykosid-vermittelte Überleseeffekt bei MC4R-Nonsense-Mutationen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren eine (teilweise) Wiederherstellung der Proteinexpression bzw. Rezeptorfunktion bewirkt. In Zukunft sind weitere Analysen, auch im Hinblick auf polygene Effekte notwendig, um die Zusammenhänge bei genetisch bedingter Adipositas zu verstehen und um weitere Diagnosemethoden und Therapieansätze entwickeln zu können.

2. Einleitung 2

2. Einleitung

2.1 Adipositas als wachsendes Gesundheitsproblem

Adipositas ist durch eine über die Maßen hohe Anreicherung von Körperfett charakterisiert, wodurch die Gesundheit stark beeinträchtigen werden kann (World Health Organization, 2011). Während Adipositas bei Erwachsenen über den sogenannten Body Mass Index (BMI = Gewicht in kg / (Größe in cm)²) bestimmt wird (World Health Organization, 2011), gibt es für Kinder und Jugendlichen eine eigene Einteilung über Perzentilen, beruhend auf einem Referenzsystem, das auf Datensätze zu Körpergröße und Gewicht in verschiedenen Alters- und Geschlechtsgruppen sowie Ethnien zurückgeht (Kromeyer-Hauschild et al., 2001, Rosario et al., 2010). Adipositas

gilt heute aufgrund der daraus resultierenden Folgeerkrankungen wie

Stoffwechselstörungen (Diabetes mellitus, Dyslipidämie), Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Muskel-Skelett-Erkrankungen (z.B. Osteoarthritis) und bestimmte Krebsformen (Brust-, Gebärmutter-, Darmkrebs) als ständig wachsendes globales Gesundheitsproblem (World Health Organization, 2011).

2.2 Genetische Prädisposition für Adipositas

Adipositas ist eine multifaktorielle Erkrankung, die neben Umweltfaktoren (z.B. Stress, Bewegungsmangel und dem erleichterten Zugriff auf hochkalorische Nahrungsmittel) bei Erwachsenen zu ca. 50 bis 85 % (Stunkard et al., 1986, Allison et al., 1996, Maes et al., 1997, Bulik et al., 2003) und bei Kindern zu bis zu 77 % (Wardle et al., 2008) durch genetische Faktoren bestimmt wird.

Bei genetischer Betrachtungsweise wird zwischen monogener und polygener Adipositas unterschieden (Hinney et al., 2010, Russo et al., 2010). Monogene Adipositas wird durch einen Hauptgendefekt ausgelöst, während bei polygener Adipositas häufige Genvarianten an mehreren Genorten für die Entwicklung von Adipositas verantwortlich gemacht werden. Zu den Hauptgendefekten zählen seltene Mutationen in einzelnen Genen wie zum Beispiel MC4R (Melanocortin-4-Rezeptor) (Yeo et al., 1998), POMC (pro-opiomelanocortin) (Krude et al., 2003, Farooqi et al., 2002), PC1 (prohormone convertase-1) (Jackson et al., 1997), Ob (Leptin) (Montague et al., 1997) und LepR (Leptin-Rezeptor) (Clement et al., 1998), die schon im heterozygoten Status zu adipösen Phänotypen führen können (Hinney et al., 2010). Polygene Adipositas basiert auf dem gleichzeitigen Vorhandensein von häufigen Varianten in mehreren Genen, die

2. Einleitung 3

einzeln geringe Effekte auf die Gewichtsregulation haben. Man geht jedoch davon aus, dass sie in der Summe den größten Anteil an der genetischen Variation der humanen Gewichtsregulation haben (Hinney & Hebebrand, 2008).

Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) basieren auf Daten zu über 30 Millionen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) im menschlichen Genom (National Center for Biotechnology Information, 2011) und haben ein hohes Potential für die Aufdeckung geringer Geneffekte. Bis heute wurden im Rahmen von GWAS 32 Loci im humanen Genom identifiziert, für die eine Assoziation mit Adipositas bestätigt werden konnte. Auf diese Weise konnten diverse polygene Varianten mit reproduzierbarem Effekt auf das Körpergewicht identifiziert werden, darunter SNPs in der Genregion des FTO (fat mass and obesity related locus) und des MC4R (Speliotes et al., 2010). Im Bereich des MC4R zeigten unter anderem die SNPs rs17782313 (Loos et al., 2008), rs17700633 (Loos et al., 2008) und rs12970134 (Chambers et al., 2008) positive Assoziationssignale mit erhöhtem BMI. Der Polymorphismus rs2229616 (p.Val103Ile) in der kodierenden Region des MC4R konnte als erste protektive Variante gegen Adipositas identifiziert werden (Geller et al., 2004). Für viele Gene ist die Funktion und Rolle für die Gewichtsregulation jedoch noch weitestgehend ungeklärt.

2.3 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs)

Der Fokus dieser Arbeit liegt auf zwei Genen, die für den MC4R bzw. den GIPR (gastric inhibitory polypetide receptor, auch: glucose-dependent insulinotropic peptide receptor) kodieren. Sie gehören der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an und sind durch sieben Transmembranhelices, drei intrazellulären und drei extrazellulären Schleifen sowie einen extrazellulären N-Terminus und einen intrazellulären C-Terminus charakterisiert.

GPCRs spielen eine zentrale Rolle bei diversen physiologischen Funktionen im menschlichen Organismus, sodass bis heute mehr als 30 humane Erkrankungen bekannt sind, die monogen durch Mutationen in GPCRs bedingt sind (Schöneberg et al., 2004). 5 - 10 % der bekannten krankheitsbedingenden Mutationen in GPCRs sind sogenannte Nonsense-Mutationen (Schöneberg et al., 2004), bei denen es zu einem vorzeitigen Stopp-Codon und damit vorzeitigen Abbruch der Proteintranslation kommt.

In diesem Zusammenhang stellen Nonsense-Mutationen im MC4R ein

2. Einleitung 4

2.3.1 Gastric inhibitory polypeptide receptor (GIPR)

Der GIPR gehört der Klasse B der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an und aktiviert den Adenylat-Cyclase-Weg über Gαs-Kopplung. Der Rezeptor wird auf Chromosom 19q13.2 - 13.3 in 14 Exons kodiert (Usdin et al., 1993, Yamada et al., 1995, Volz et al., 1995) und wird in vielen Geweben exprimiert, verstärkt aber in den Beta-Zellen des Pankreas und den Adipozyten (Yip et al., 1998). Er bindet das Inkretin GIP (gastric inhibitory polypetide, auch: glucose-dependent insulinotropic peptide), welches von den K-Zellen des Duodenums in Reaktion auf die orale Aufnahme größerer Mengen glukose- und lipidreicher Nahrung ausgeschüttet wird. GIP löst in den Beta-Zellen die Insulin-Sekretion aus und fördert deren Zellteilung und Zellüberleben (Yip & Wolfe, 2000). In Adipozyten bewirkt GIP die Aufnahme von Fettsäuren, allerdings sind die genauen molekularen Mechanismen noch weitgehend ungeklärt (Getty-Kaushik et al., 2006, Kieffer, 2003).

Der GIPR ist an einem breiten Spektrum physiologischer Antworten auf die Aufnahme und Verfügbarkeit von Nährstoffen beteiligt (McIntosh et al., 2009). Studien haben gezeigt, dass dem GIPR eine Bedeutung für die Glukose-Homöostase (Saxena et al., 2010, Yip & Wolfe, 2000) und für Symptome des metabolischen Syndroms (Nitz et al., 2007) zuzuschreiben ist. Zusätzlich wird für den GIPR eine Beteiligung an der Regulation von Körpergewicht und damit eine Bedeutung für Adipositas vermutet. So konnten für SNPs in der umliegenden, nicht kodierenden Sequenz des GIPR positive Assoziationssignale mit erhöhtem BMI (Vogel et al., 2009, Speliotes et al., 2010) ermittelt werden, und GIPR-Knockout-Mäuse zeigen sich unter „High-fat“-Diät resistent gegenüber Diät-induzierter Adipositas (Miyawaki et al., 2002). Somit ist das für den GIPR kodierende Gen ein interessanter Kandidat bei der Untersuchung von Adipositas und damit einhergehenden Folgeerkrankungen.

2.3.2 Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R)

Bei dem MC4R handelt es sich um einen GPCR der Klasse A, der in nur einem Exon auf Chromosom 18q21.3 kodiert ist und über Gαs-Kopplung signalisiert (Tao, 2010). Der MC4R wird unter anderem im Hypothalamus exprimiert und ist wesentlicher Bestandteil des Leptin-Melanocortin-Signalweges und somit wesentlich an der hypothalamischen Appetitregulation beteiligt (Lee, 2009).

Mutationen im MC4R können zu frühmanifester Adipositas führen, was den MC4R zu einem Ansatzpunkt für mögliche weitere Behandlungsmethoden von genetisch

3. Zielstellung 5

bedingter Adipositas macht. Bei MC4R-Nonsense-Mutationen bewirken

Punktmutationen durch einen Basenaustausch im genetischen Code die Entstehung eines vorzeitigen Stopp-Codons (TAG, TAA oder TGA), was zu einem frühzeitigen Abbruch der Proteintranslation und somit zu einem verkürzten, nicht funktionsfähigen Rezeptorprotein führt.

Im MC4R-Gen sind mittlerweile insgesamt acht Nonsense-Mutationen bekannt. Das Aminogylkosid-vermittelte Überlesen von Nonsense-Mutationen in anderen Genen wurde bereits erfolgreich in vitro und in Mausmodellen gezeigt, wobei die Expression funktionsfähiger Proteine erfolgte (Keeling et al., 2001, Wilschanski et al., 2003, Sangkuhl et al., 2004, Howard et al., 1996, Burke & Mogg, 1985, Davies et al., 1964). Dabei beruht das Prinzip auf der Absenkung der Translationsgenauigkeit an den Ribosomen durch Bindung des Aminoglykosids an der 18S rRNA eukaryotischer Zellen. Dadurch kommt es zu einer erhöhten Überleserate des Stopp-Codons und somit zur Unterdrückung der Translationsterminierung (Salas-Marco & Bedwell, 2005, Zingman et al., 2007). Klinische Studien zur Überleseeigenschaft von Aminoglykosiden wurden bereits erfolgreich an Patienten mit zum Beispiel Cystischer Fibrose (Wilschanski et al., 2003), Muskeldystrophie vom Typ Duchenne (Malik et al., 2010) und Hailey-Hailey-Syndrom (Kellermayer et al., 2006) durchgeführt. Eine bis 2008 vollständige Liste aller klinischen Studien mit Aminoglykosiden ist bei Linde et al. aufgeführt (Linde & Kerem, 2008). Untersuchungen zur Überleseeffizienz von Nonsense-Mutationen im MC4R unter Gabe von Aminoglykosiden stellen eine Neuheit dar und bislang sind noch keine Studien bekannt, die Aminoglykoside als Therapieansatz für Adipositas untersucht haben.

3. Zielstellung

Seit Langem sind Positionen im humanen Genom bekannt, die mit monogener oder polygener Adipositas assoziiert sind. Im Fokus dieser Arbeit steht die Untersuchung genetische Varianten (Mutationen und SNPs) in der umgebenden nicht kodierenden Sequenz sowie innerhalb zwei prominenter Adipositas-relevanter Gene, MC4R und GIPR. Die Varianten sollen im Hinblick auf verschiedene Aspekte beleuchtet werden. Die Untersuchung soll zunächst in Bezug auf polygene Effekte hervorgerufen durch häufige Varianten (SNPs) und SNP-Haplotypen im Bereich des GIPR sowie MC4R erfolgen und schließlich auf der Ebene monogener Adipositas mit Fokus auf Mutationen

3. Zielstellung 6

im MC4R. In Abbildung 1 sind die Zusammenhänge und Untersuchungsstrukturen dieser Arbeit schematisch dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Übersicht zu den im Rahmen der Arbeit untersuchten Strukturen und deren Zusammenhänge. Schwarze Pfeile repräsentieren bereits bekannte

Zusammenhänge. Blaue Pfeile repräsentieren die Zusammenhänge, die im Rahmen der Arbeit untersucht werden sollen.

Folgende Untersuchungsschwerpunkte liegen dieser Arbeit zugrunde:

3.1 Untersuchung von Single-Nukleotid-Polymorphismen in der kodierenden sowie nicht kodierenden Sequenz des GIPR

Am Beispiel des GIPR soll der Einfluss häufiger genetischer Varianten auf Adipositas und mögliche Komorbiditäten untersucht werden. Die Bedeutung bereits bekannter SNPs, die außerhalb des kodierenden Bereiches des GIPR lokalisiert sind, ist jedoch noch weitgehend unklar. Der GIPR ist an der Regulation von Körpergewicht (Miyawaki et al., 2002) und Glukose-Homöostase (Saxena et al., 2010, Yip & Wolfe, 2000) beteiligt. Ziel war es somit, eine mögliche Assoziation von SNPs im Bereich des GIPR mit Adipositas zu überprüfen. Da Insulinresistenz und eine gestörte Glukosetoleranz

Varianten in der kodierenden sowie angrenzenden

Sequenz von Adipositas-relevanten Genen

seltene Genvarianten: Mutationen

häufige Genvarianten: Single-Nukleotid-Polymorphismen

(SNPs)

im MC4R in der (nicht) kodierenden Sequenz von MC4R und GIPR

Assoziation mit Adipositas Assoziation mit möglichen Komorbiditäten von Adipositas Abstammungs-hintergrund von Doppelmutationen Therapie-möglichkeiten MC4R: [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] MC4R: p.[Val103Ile; Ser127Leu] MC4R: Nonsense-Mutationen MC4R Untersuchungs-gegenstand untersuchte Genorte Untersuchungs-schwerpunkte Fokus GIPR SNP-Haplotypen einzelne SNPs

3. Zielstellung 7

typische Begleiterscheinungen von Adipositas darstellen (Kieffer, 2003), soll zusätzlich der Zusammenhang zwischen GIPR-SNPs und Insulinresistenz untersucht werden.

3.2 Bewertung von Assoziationssignalen häufiger Genvarianten am Beispiel des

MC4R

Bisher ist es noch weitgehend ungeklärt, in wieweit einzelne bekannte Varianten in umgebenden, nicht kodierenden Bereichen von Genen tatsächlich auf diese Gene hinweisen, Teil eines Signals sind, das von mehreren Varianten hervorgerufen wird, oder für sich alleine typische anthropometrische Merkmale für Adipositas wie BMI oder Hüftumfang beeinflussen. Ein Ziel dieser Arbeit war somit, exemplarisch am Beispiel des MC4R SNPs in der umgebenden, nicht kodierenden Sequenz mit Mutationen innerhalb des MC4R in Beziehung zu setzten und ihre Bedeutung im Hinblick auf eine Assoziation mit Adipositas zu bewerten.

3.3 Untersuchung von Adipositas-relevanten Genvarianten im MC4R im Hinblick auf eine mögliche Abstammungsidentität oder einen Mutationshotspot

Bei den Doppelmutationen [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] (Hinney et al., 1999) und p.[Val103Ile; Ser127Leu] (Valli-Jaakola et al., 2004) handelt es sich um häufig auftretende MC4R-Mutationen, die zum (teilweisen) Funktionsverlust des Rezeptors führen und mit frühmanifester Adipositas assoziiert sind. Doppelmutationen, bei denen sich die beiden Mutationen auf einem Allel befinden, machen eine gemeinsame Abstammungsidentität wahrscheinlich. Daher ist eine Zielstellung der Arbeit, am Beispiel der MC4R-Doppelmutationen [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] und p.[Val103Ile;

Ser127Leu] Entstehungsursprünge von Doppelmutationen und mögliche

Verwandtschaftsmuster zu untersuchen.

3.4 Untersuchung von möglichen pharmakologischen Therapieansätzen zur Wiederherstellung der Rezeptorfunktion - exemplarisch an Nonsense-Mutationen im MC4R

GPCRs sind zu bis zu 60 % Angriffspunkt pharmakologischer Interventionen (Schöneberg et al., 2004). Mutationen in GPCRs können nicht nur Aufschluss über

Struktur und Funktion geben, sondern auch Ansatzpunkte für neue

Behandlungsmethoden darstellen. So ist ein Ziel, durch Mutationen beeinträchtigte GPCRs wie den MC4R in ihrer Funktion wiederherzustellen. Als Vorarbeiten wurden

4. Methoden 8

innerhalb der Arbeitsgruppe bereits drei MC4R-Nonsense-Mutationen (p.Trp16Stop; [p.Tyr35Stop; c.110 A>T]; p.Glu61Stop) im Hinblick auf die Überleseeffizienz durch Aminoglykoside betrachtet. In dieser Arbeit soll eine vierte Nonsense-Mutation im MC4R (p.Gln307Stop) auf die Wiederherstellung der Rezeptorfunktionen durch Aminoglykoside untersucht und den anderen drei Mutationen gegenübergestellt werden.

4. Methoden

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neben diversen molekularbiologischen

Standardmethoden projektbezogene Methoden einschließlich funktioneller Assays angewandt, die in den jeweiligen Publikationen beschrieben sind (Sauber, Grothe et al., 2010, Scherag, Jarick, Grothe et al., 2010, Brumm*, Mühlhaus* et al., 2011). Im Folgenden soll kurz auf einige spezielle projektbezogene Methoden eingegangen werden.

4.1 Analyse von Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNP)

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Verfahren zur Multiplex-Analyse von SNPs genutzt:

 Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometrie unter Anwendung des iPLEX® Gold-Assays (Sequenom, San Diego, USA)

 SNapShotTM-Verfahren unter Anwendung des ABI PRISM® SNapShotTM Multiplex Kits (Applied Biosystems, Carlsbad, USA)

Beide Verfahren gehen von einem mittels PCR amplifizierten DNA-Fragment als Ausgangsprodukt aus, das den zu analysierenden SNP beinhaltet.

Das Verfahren der MALDI-TOF Massenspektrometrie ermöglicht die gleichzeitige Analyse von bis zu 40 SNPs in einem Reaktionsansatz (Multiplex). Im Rahmen der iPLEX-Reaktion werden die jeweiligen Einzelstränge nach der Abbruchreaktion massenmodifiziert und dann in der MALDI-TOF Massenspektrometrie über ihre molekulargewichtsbedingte Flugzeit im elektrischen Feld allelspezifisch unterschieden (Oeth et al., 2005, Pusch et al., 2002).

Das SNapShotTM-Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung von bis zu zehn verschiedenen SNP-Positionen in einem Reaktionsansatz unter Verwendung des ABI

4. Methoden 9

PRISM® SNapShotTM Multiplex Kits (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Das Grundprinzip beruht hier auf der Unterscheidung der entsprechenden SNP-Positionen über allelspezifische Farbmarkierung der Extensionsprodukte (Applied Biosystems, 2005).

4.2 Statistische Auswertung und Haplotypanalyse

Ein Großteil der statistischen Analysen (vgl. Abschnitt 5.2 und 5.3) wurde im Rahmen des NGFN-Netzwerkes mit Kooperationspartnern aus Essen durchgeführt. Die Analysen sind in den jeweiligen Veröffentlichungen beschrieben. Statistische Auswertung und Darstellung der Zellkulturexperimente erfolgte mittels GraphPad Prism 4 und 5 (GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA).

Ein Teil der in dieser Arbeit durchgeführten statistischen Analysen beruht auf der Bestimmung von Haplotypen und deren Assoziation mit Adipositas (vgl. Abschnitt 5.2, 5.3 und 5.4). Unter einem Haplotyp versteht man einen bestimmten Satz Allele (z.B. aus polymorphen DNA-Markern wie SNPs) auf einem Chromosom oder Chromosomenabschnitt (The International HapMap Consortium, 2003).

Die Analyse von Haplotypen im Rahmen der Untersuchung auf eine mögliche Abstammungsidentität wurde anhand von Familientrios durchgeführt. Hierzu habe ich die Familienmitglieder im Hinblick auf bestimmte SNP-Positionen genotypisiert. Anschließend habe ich die jeweiligen Basenpositionen des Kindes mit denen der Eltern verglichen und darüber eine Zuordnung zu dem jeweiligen Allel von Mutter bzw. Vater vollzogen (vgl. Abbildung 2).

5. Ergebnisse 10

Abbildung 2: Beispielhafte, schematische Darstellung der Bestimmung von Haplotypen über Familientrios. Die Familienmitglieder wurden jeweils im Hinblick auf die zu

untersuchenden SNPs genotypisiert (hier mit vier Beispielen angegeben). Die Haplotypen wurden schließlich über den Vergleich der Allelverteilung beim Kind mit der Allelverteilung der Eltern bestimmt. Farbige Markierungen symbolisieren die Zugehörigkeit zu dem jeweiligen Haplotyp. Das Kind ist demnach Träger der Haplotypen H1 (blau) und H2 (rot), die Eltern besitzen jeweils noch einen zusätzlichen Haplotyp (Mutter: H3 (grün); Vater: H4 (gelb)). A. Stammbaum und Genotyp-Verteilung eines Familientrios bestehend aus Vater, Mutter, Tochter; B. Familientrio mit markierten Allelen des Kindes, jeweils von Vater und Mutter; C. Familientrio mit ergänzter Markierung zusätzlicher Haplotypen bei Mutter und Vater; D. Sämtliche mögliche Haplotypen (H1-H4), die über dieses Familientrio detektiert werden konnten.

5. Ergebnisse

Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt und in drei ausgewählten Publikationen veröffentlicht, auf die im Einzelnen hingewiesen wird.

5.1 Die untersuchten SNPs im Bereich des GIPR zeigen keine Assoziation mit Adipositas, jedoch eine Assoziation mit erhöhtem HOMA-IR.

[ Publikation 1: Sauber, J., Grothe, J. et al. (2010): Association of variants in gastric inhibitory polypeptide receptor gene with impaired glucose homeostasis in obese

children and adolescents from Berlin. European Journal of Endocrinology 163:259-264.] Es konnte keine Assoziation zwischen erhöhtem BMI und jeweils einem der drei betrachteten GIPR-SNPs (rs811428, rs230382, 1800437) festgestellt werden. Jedoch

rs1943228 AG AG rs7228573 TT CC rs7240064 TC TC rs8087065 GT GT rs1943228 AA rs7228573 CT rs7240064 CC rs8087065 TT rs1943228 AG AG rs7228573 TT CC rs7240064 TC TC rs8087065 GT GT rs1943228 AA rs7228573 CT rs7240064 CC rs8087065 TT

A

B

C

D

5. Ergebnisse 11

konnte eine signifikante Assoziation zwischen dem SNP rs1800437 (in Exon 12) und einem erhöhten HOMA-IR (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance) Level (p < 0,001) ermittelt werden. Dies bestätigt den GIPR als einen möglichen Kadidaten für die Ursache gestörter Glukose-Homöostase.

5.2 SNP-Haplotypen außerhalb des kodierenden Bereichs des MC4R sind mit erhöhtem BMI assoziiert, unabhängig von möglichen MC4R-Mutationen.

[ Publikation 2: Scherag, A., Jarick, I., Grothe, J. et al. (2010). Investigation of a Genome Wide Association Signal for Obesity: Synthetic Association and Haplotype Analyses at the Melanocortin 4 Receptor Gene Locus. PLoS One 5:e13967.]

Bei der Analyse von 78 SNPs in der nicht kodierenden Sequenz um den MC4R hat der SNP rs12970134 die höchste Assoziation mit Adipositas gezeigt (p = 0.004). Er liegt im Kopplungsungleichgewicht (LD, linkage disequilibrium) mit dem schon zuvor beschriebenen SNP rs17782313 (Loos et al., 2008). Konditionale Analysen haben sieben weitere SNPs offenbart, die unabhängige Assoziationssignale liefern. Aus diesen insgesamt acht SNPs (ausgenommen rs17782313, da dieser kein unabhängiges Signal liefert) konnten drei Haplotypen (bestehend aus jeweils zwei SNPs) mit dem geringsten p-Wert ermittelt und in 363 unabhängigen, übergewichtigen Trios bestätigt werden. Der Haplotyp aus rs12970134 und rs1943229 umschließt die kodierende Region des MC4R und liefert das höchste relative Risiko für Adipositas. Die Einbeziehung von kodierenden Varianten im MC4R-Gen zeigte keinen Einfluss auf die Effektstärke dieses Haplotyps und schließt somit eine synthetische Assoziation aus.

5.3 „Cryptic relatedness“ beeinflusst die Auswertung von Fall-Kontroll-Studien.

[Mühlhaus, J. et al. (2011): Do common variants separate between obese melanocortin 4 receptor gene mutation carriers and non-carriers? The impact of cryptic relatedness. Obesity Facts. (submitted)]

Zur Feststellung eines Haplotyps, der zwischen funktionell relevanten und nicht relevanten MC4R-Mutationsträgern unterscheidet, wurden Haplotypanalysen basierend auf 28 SNPs in übergewichtigen MC4R-Mutationsträgern (62 Individuen) und Nichtträgern (28 Individuen) durchgeführt, in die insgesamt 25 verschiedene MC4R-Mutationen einbezogen wurden. Diese MC4R-Mutationen wurden aufgrund ihrer funktionellen Charakterisierung drei verschiedenen Kategorien zugeordnet: a) „wie Wildtyp“, b)

5. Ergebnisse 12 „teilweiser Funktionsverlust“ und c) „kompletter Funktionsverlust“. Haplotypanalysen unter Einbeziehung sämtlicher zur Verfügung stehender Mutationsträger zeigten einen SNP-Haplotyp 3’ von MC4R (rs17782313, rs12958350, rs17066829), der zwischen Trägern und Nichtträgern von MC4R-Mutationen sowie zwischen funktionell relevanten (Kategorie c) „kompletter Funktionsverlust“) und nicht relevanten Mutationen (Kategorie a) „wie Wildtyp“) unterscheidet. Sensitivitätsanalysen, bei denen jeweils nur ein Mutationsträger pro Mutation in die Rechnung einbezogen wurde, konnten dieses Ergebnis jedoch nicht bestätigen. Dies zeigt den Einfluss von „cryptic relatedness“, d.h. den Einfluss von möglichen verborgenen (fernen) Verwandtschaftsverhältnissen. So beinhaltete die Kategorie c) „kompletter Funktionsverlust“ eine große Anzahl an Trägern der MC4R-Mutation [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] (17 von 25 Patienten), für die ein gemeinsamer Vorfahre als sehr wahrscheinlich angenommen werden kann. Ebenso ist für die Träger der Mutation p.Thr112Met, die in der Kategorie a) „wie Wildtyp“ in

Mehrzahl vertreten sind (10 von 19 Patienten), ein Verwandtschaftsverhältnis

anzunehmen. Die Einflüsse von möglichen unterschwelligen

Verwandtschaftsbeziehungen stellen somit einen wesentlichen Faktor dar, der bei Haplotyp-basierten Fall-Kontroll-Studien und bei der Zusammenführung von Datensätzen aus GWAS und Resequenzierungen in die Auswertung mit einbezogen werden muss.

5.4 Das häufige Auftreten der europäischen Doppelmutationen im MC4R

[p.Tyr35Stop;c.110 A>T] und p.[Val103Ile;Ser127Leu] basiert auf einem

„Common-Founder-Effekt“.

[Mühlhaus, J. et al. (2011): Obesity Relevant Melanocortin 4 Receptor Gene Variants: Mutational Hotspot or Identical by Descent? (in preparation)]

Zur Untersuchung von möglichen Abstammungsidentitäten der beiden MC4R-Doppelmutationen [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] und p.[Val103Ile;Ser127Leu] wurden insgesamt 30 SNPs in der umgebenden, nicht kodierenden Sequenz des MC4R-Gens (28 SNPs 40 Kilobasen (kb) 5‘ bis 60 kb 3‘; zusätzlich: rs17782313 ca. 188 kb und rs17700633 ca. 110 kb 3‘ vom MC4R-Gen) in Familientrios europäischer Herkunft (normal- und übergewichtig) genotypisiert. Mit Hilfe dieser Daten habe ich mögliche vorhandene Haplotypen (bestehend aus 13 SNPs) wie im Methodenteil schematisch dargestellt (vgl. Abbildung 2) ermittelt, sowohl für die Kontrolltrios als auch für die

5. Ergebnisse 13

Träger der Doppelmutationen und deren Familien. Insgesamt konnte ich 11 unterschiedliche Haplotypen (vgl. Tabelle 1) ermitteln, wobei sich ein Haplotyp mit einer Frequenz von 71,3 % als „Haupthaplotyp“ herausgestellt hat. Die europäische Doppelmutation [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] liegt auf dem Haupthaplotyp H1, womit eine gemeinsame Abstammungsidentität als sehr wahrscheinlich angesehen werden kann. Träger der Doppelmutation p.[Val103Ile;Ser127Leu] haben hingegen den seltenen Haplotyp H7 gemeinsam, womit auch hier ein gemeinsamer Vorfahre als sehr wahrscheinlich anzunehmen ist.

Tabelle 1: Auflistung aller durch Genotypisierung und Haplotypanalyse in den Kontroll- und Patienten-Trios ermittelten Haplotypen. Die Haplotypanalyse erfolgte über Kontrolltrios

wie im Methodenteil dargestellt. Die Position beschreibt die SNP-Position auf Chromosom 18q21.3 (dbSNP (Sherry et al., 2001) genome build 36.3). Die Haplotypen H1 - H10 wurden in normal- und übergewichtigen Familientrios europäischer Herkunft ermittelt, wobei H1 mit einer Frequenz von 71,3 % als Haupthaplotyp und vermutlich ältester Haplotyp anzusehen ist. H11 wurde zusätzlich in der Familie eines Trägers der MC4R-Mutation [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] ermittelt. Die MC4R-Mutation [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] liegt auf einem Haplotyp mit H1 (gelb), die Mutation p.[Val103Ile;Ser127Leu] liegt auf einem Haplotyp mit H7 (blau).

Position * SNP H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 56187483 rs8093815 G A A A G A A A A G G 56188413 rs35748167 G G G G G G C G G G G 56191604 rs17066842 G G G G G G A G G G G 56204183 rs8091237 C G G G C C C G C G C 56206768 rs7228573 C T T T T C T T T C T 56210509 rs7240064 C T T C C T C C C C C 56210914 rs1943228 A G G A A G A A A A A 56211106 rs17773774 C A A C C A C C C C C 56211541 rs8087065 T G G T T G T T T G T 56214080 rs17773792 T G G T T G T T T G T 56215839 rs17066879 A T T A A T A A A A A 56216588 rs17066883 G A A G G G A A A G A 56223516 rs17066892 C T C T T C T T T T T Frequenz in den Kontroll-Trios [%] 71.3 11.4 4.0 3.0 2.0 1.5 1.0 1.0 1.5 3.5 0,0 ** * Position MC4R auf Chromosom 18q21.3: 5618954 - 56190981

** nicht in den Kontrollen detektiert, aber in einem Träger der Doppelmutation [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] (Allel vom Vater des Patienten)

5. Ergebnisse 14

5.5 Aminoglykosid-vermitteltes Überlesen von Nonsense-Mutationen im MC4R bewirkt die Wiederherstellung funktioneller Rezeptoreigenschaften.

[Publikation 3: Brumm, H.*, Mühlhaus, J.* et al. (2011): Rescue of Melanocortin 4 Receptor (MC4R) Nonsense Mutations by Aminoglycoside-Mediated Read-Through. Obesity (Silver Spring), 7 july [Epub ahead of print]; * gleichberechtigte Erstautoren] Anhand von funktionellen Assays zur Proteinexpression und Rezeptorsignalisierung konnten wir einen Überleseeffekt bei Nonsense-Mutationen im MC4R-Gen unter Vermittlung von Aminoglykosiden detektieren. Die Wiederherstellung der funktionellen Rezeptoreigenschaften ist dabei abhängig von vier verschiedenen Faktoren: a) der Triplett-Sequenz des Stopp-Codons, b) der das Stopp-Codon umgebenden Sequenz, c) der Position der Nonsense-Mutation innerhalb des Rezeptors und d) von den applizierten Aminoglykosiden und den verwendeten MC4R-Liganden. Nachfolgend sind die Sequenz des jeweiligen Stopp-Codons sowie die für die Überleseeffizienz wichtige Sequenzposition +1 in Klammern angegeben. Funktionelle Rezeptoreigenschaften konnten wiedererlangt werden für die im N-Terminus befindlichen Nonsense-Mutationen p.Trp16Stop (TGA A) und p.Tyr35Stop (TAA T). Die Rezeptorfunktion konnte bei der im C-Terminus befindlichen Mutation p.Gln307Stop (TAA G) nur in geringem Maße wieder hergestellt werden, während bei der MC4R-Mutation p.Glu61Stop (TAG A), die sich in

der ersten Transmembranhelix befindet, keine bzw. nur sehr geringe

Rezeptorsignalisierung messbar war.

Die Wiederherstellung eines kompletten Rezeptorproteins bei der MC4R-Nonsense-Mutation p.Trp16Stop nach Zugabe des Aminoglykosids G418 konnte ich mittels Fluoreszenzmarkierung und mit Hilfe konfokaler Lasermikroskopie nachweisen. Die Fluoreszenzerkennung zeigt außerdem die Lokalisierung der exprimierten Rezeptoren in der Zellmembran, die mit der des Wildtyp-Rezeptors vergleichbar ist.

6. Diskussion

6.1 Bedeutung und Interpretation von Adipositas-assoziierten SNPs im Umfeld Adipositas-relvanter Gene

In den letzten Jahren haben sich GWAS zu einer gängigen Methode für die Identifizierung von krankheitsverursachenden genetischen Faktoren entwickelt, die es

6. Diskussion 15

ermöglichen, das gesamte humane Genom mit Hilfe von Hochdurchsatz-Methoden in mehreren Tausend Individuen zu untersuchen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir Ergebnisse aus vorangegangenen genomweiten Assoziationsstudien teilweise bestätigen: So bestehen Assoziationen zwischen SNPs (sowie Haplotypen aus diesen) in der umgebenden, nicht kodierenden Sequenz des MC4R mit Adipositas (Scherag, Jarick, Grothe et al., 2010, Mühlhaus et al., 2011). Für den GIPR konnten wir, im Gegensatz zum MC4R, keine Assoziation mit erhöhtem BMI bestätigen, jedoch konnten wir eine Assoziation zwischen dem GIPR-SNP rs1800437 und einem erhöhten HOMA-IR-Wert ermitteln (Sauber, Grothe et al., 2010). Damit konnten wir die Ergebnisse anderer Studien bestätigen, die dem GIPR eine Bedeutung für die Glukose-Homöostase (Saxena et al., 2010) zuschreiben. Gestörte Glukosetoleranz und Insulinresistenz als Komorbiditäten von Adipositas sowie GIPR-Knockout-Mausmodelle (Miyawaki et al., 2002) und Assoziationsstudien (Vogel et al., 2009, Speliotes et al., 2010) deuten weiterhin auf eine Rolle des GIPR bei der Ausprägung von Adipositas hin. Der GIPR stellt somit nach wie vor einen möglichen Ansatzpunkt für therapeutische Interventionen bei der Behandlung von Übergewicht dar (Kieffer, 2003, Fulurija et al., 2008).

Außerdem bestätigen unsere Ergebnisse, dass regulatorische Elemente oftmals in größerer Entfernung vom eigentlichen Gen auftreten können (Yang et al., 2011). So konnten wir zeigen, dass die beiden SNPs rs12970134 und rs17782313, die in 154 kb bzw. 188 kb Entfernung vom MC4R liegen und bereits in vorangegangenen Studien eine Assoziation mit Adipositas zeigten (Chambers et al., 2008, Loos et al., 2008), zum jeweiligen Haplotyp gehören, der ein Assoziationssignal mit erhöhtem BMI zeigt (Scherag, Jarick, Grothe et al., 2010, Mühlhaus et al., 2011). Die Untersuchung von Haplotypen im Gegensatz zu einzelnen SNPs war sinnvoll, da insgesamt davon ausgegangen wird, dass SNP-Haplotypen ein stärkeres Assoziationssignal liefern als einzelne SNPs (Schaid, 2004).

Zur weiteren Klärung der Rolle des GIPR im Zusammenhang mit Adipositas sind somit zusätzlich Analysen auch im Hinblick auf mögliche Haplotypen und polygene Effekte in der umgebenden Sequenz des GIPR-Gens nötig.

6. Diskussion 16

6.2 Bewertung von Genomweiten Assoziationsstudien vor dem Hintergrund synthetischer Assoziation

In Bezug auf Adipositas konnten bisher insgesamt 32 verschiedene Genorte über SNPs identifiziert werden, für die positive genetische Assoziationssignale mit BMI-Variabilität und Adipositas bestätigt werden konnten (Speliotes et al., 2010). Jedoch können bis heute erst 1,5 % der interindividuellen BMI-Varianz erklärt werden (Speliotes et al., 2010), während auf der Grundlage von Zwillings- und Adoptionsstudien ein Anteil von bis zu 85 % vermutet wird (Allison et al., 1996, Maes et al., 1997, Stunkard et al., 1986, Bulik et al., 2003). Diese geringe Prozentzahl könnte teilweise darauf zurückzuführen sein, dass in GWAS nur häufige Varianten erfasst werden, da das Grundprinzip auf der Annahme der sogenannten „common diesease - common variant“-Hypothese basiert. Diese besagt, dass bei vielen häufigen Erkrankungen („common diseases“) die genetischen Einflüsse teilweise auf eine limitierte Anzahl häufiger allelischer Varianten („common variants“) zurückzuführen sind, die in der Bevölkerung mit einer Frequenz von 1 % bis 5 % auftreten (Pearson & Manolio, 2008, Collins et al., 1997). Die Folge ist, dass viele seltene Varianten (Frequenz < 1 %), die ebenfalls krankheitsfördernd sein können, nicht erfasst werden. Das „1000-Genome-Projekt“ wird in Zukunft helfen, neue Varianten mit geringerer Frequenz zu identifizieren (The 1000 Genomes Project Consortium, 2010).

Eine Alternative bei der Interpretation von GWAS stellt das Modell der „synthetischen Assoziation“ dar, welches das Problem der geringen Effektstärke der in GWAS bisher betrachteten Varianten auszugleichen versucht. Dabei besteht die Grundannahme darin, dass Assoziationssignale von häufigen SNPs außerhalb der kodierenden Sequenz eines Gens das Resultat einer Kombination aus häufigen Varianten mit seltenen kodierenden Mutationen ist (Robinson, 2010, Dickson et al., 2010). Ausgehend von Haplotypanalysen von SNP-Varianten in der umgebenden, nicht kodierenden Sequenz des MC4R konnten wir dieses Modell für den MC4R jedoch nicht bestätigen, da das Assoziationssignal der Haplotypen nicht durch seltene kodierende Varianten innerhalb des MC4R beeinflusst wurde (Scherag, Jarick, Grothe et al., 2010). Zusätzlich konnten wir in einer weiteren Analyse keine SNP-Haplotypen identifizieren, von denen eindeutig auf (funktionell relevante) Mutationen innerhalb des kodierenden Bereiches des MC4R geschlossen werden könnte (Mühlhaus et al., 2011). Das Modell der synthetischen Assoziation scheint somit für den MC4R keine Anwendung zu finden, was die Bedeutung von MC4R-SNPs im Rahmen polygener Adipositas bestätigt. Für

6. Diskussion 17

die klinische Routine bedeutet das außerdem, dass zur Feststellung einer MC4R-Störung bei adipösen Patienten, die Analyse einer eng begrenzten Anzahl an SNPs keine Alternative zu einem Mutationsscreening des gesamten Rezeptors darstellt (Mühlhaus et al., 2011).

6.3 Einfluss von Populationsstrukturen wie „cryptic relatedness“ auf

Assoziationsstudien

Das Phänomen der „cryptic relatedness“ stellt ein weiteres Problem dar, das wir im Rahmen dieser Arbeit aufzeigen konnten und das bei der Bewertung von GWAS- und Assoziationsdaten berücksichtigt werden muss. „Cryptic relatedness“ bedeutet, dass ein (entferntes) Verwandtschaftsverhältnis zwischen den untersuchten Individuen der Fall- und Kontrollgruppe besteht, das während der Untersuchung unentdeckt bleibt, das Ergebnis jedoch beeinflussen kann (Voight & Pritchard, 2005). Yang et al. postulieren, dass ungefähr 0,09 % der phänotypischen Varianz des BMI in GWAS auf „cryptic relatedness“ zurückzuführen sei, wobei diese Zahl stark abhängig von der Datenstruktur der Studie sei (Yang et al., 2011). In unserer Analyse zur Aufdeckung einer Assoziation von SNP-Haplotypen mit funktionell relevanten MC4R-Mutationen (vgl. Abschnitt 5.3) waren die beiden Mutationen p.Thr112Met (in der Kategorie a) „wie Wildtyp“ mit 10 von

19 Patienten) und [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] (in Kategorie c) „kompletter Funktionsverlust“ mit 17 von 25 Patienten) in ihrer jeweiligen Kategorie in der Mehrzahl vertreten (Mühlhaus et al., 2011). Für die Doppelmutation [p.Tyr35Stop; c.110 A>T] konnte ich einen „Common-Founder-Effekt“ über eine weitere Haplotypanalyse als sehr wahrscheinlich bestätigen (vgl. Abschnitt 5.4). Diese Ergebnisse sind nicht nur bei der Bewertung von GWAS- und Assoziationsdaten von Bedeutung. Resequenzierungen von vielversprechenden Regionen, die positive Assoziationssignale in GWAS geliefert haben, können zur Aufdeckung weiterer seltener Varianten führen (Manolio, 2010) und damit zur Identifikation weiterer erblicher Faktoren, die an der phänotypischen Varianz des BMI beteiligt sind. Dabei sind jedoch stets unterschwellige Populationsstrukturen zu berücksichtigen, um eine Verfälschung der Ergebnisse auszuschließen.

6.4 Therapeutische Intervention bei Nonsense-Mutationen im MC4R

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass unter Vermittlung durch Aminoglykoside sowohl die Proteinexpression als auch die funktionelle Signalisierung von verkürzten MC4R-Proteinen in vitro wieder hergestellt werden kann (Brumm*,

6. Diskussion 18

Mühlhaus* et al., 2011). Für eine Übertragung auf den humanen Organismus und für Therapieansätze bei Adipositas infolge von MC4R-Nonsense-Mutationen müssen jedoch verschiedene zusätzliche Faktoren beachtet werden:

Ein Problem stellt die in der Regel hohe Toxizität von Aminoglykosiden dar. Aminoglykoside zeigen in eukaryotischen Zellen eine geringere Effektivität, weshalb ihre Dosierung bei der Behandlung von Nonsense-Mutationen 10 - 15 mal höher ist als bei Verwendung als Antibiotikum (Zingman et al., 2007). So sind das im Rahmen unserer Untersuchungen verwendete Aminoglykosid G418 sowie Gentamicin in höherer Dosierung und über einen längeren Anwendungszeitraum stark toxisch und können zu Nebenwirkungen wie Gehör- und Nierenschäden führen (Hainrichson et al., 2008). Eine vielversprechende Alternative der letzten Jahre stellte daher das Aminoglykosid PTC124 (Ataluren) dar. PTC124 ist ein oral verabreichbares bioverfügbares Mittel, das sich durch besonders geringe Toxizität auszeichnet (Hirawat et al., 2007, Welch et al., 2007) und in ersten klinischen Versuchen über 12 Wochen bei Patienten mit cystischer Fibrose keine offensichtlichen Nebenwirkungen zeigte (Wilschanski et al., 2011). Die tatsächliche Wirksamkeit von PTC124 ist jedoch in den verschiedenen Studien noch widersprüchlich (Kerem et al., 2008, Pichavant et al., 2011, Welch et al., 2007). Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir die Wirksamkeit von PTC124 in vitro nicht bestätigen (Brumm*, Mühlhaus* et al., 2011).

Des Weiteren zeigen Aminoglykoside in den einzelnen Patienten sehr unterschiedliche Wirkung. Eine Studie verzeichnet zum Beispiel Erfolge in der Behandlung von Patienten mit cystischer Fibrose mit Gentamicin (Wilschanski et al., 2003), während die Patienten in einer anderen Studie nicht auf die Therapie ansprechen (Clancy et al., 2007). Diese unterschiedlichen Wirkungsgrade könnten auf die Menge des vorhandenen Nonsense-Transkripts, das das Angriffsziel der Aminoglykoside darstellt, zurückzuführen sein (Linde et al., 2007). Somit bestimmt die vorhandene Menge an mRNA die potentielle Wirksamkeit der Behandlung mit Aminoglykosiden bei den einzelnen Patienten mit (Linde & Kerem, 2008). Allerdings können auch geringe Mengen an funktionellem Protein die jeweiligen Symptome mildern und somit therapeutische Erfolge zeigen (Kellermayer, 2006).

Schließlich stellt die Art der Applikation eine Hürde dar. Da der MC4R sich im Hypothalamus befindet, muss eine Darreichungsform gefunden werden, die in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Unter normalen Bedingungen überwinden Aminoglykoside die Blut-Hirn-Schranke in vernachlässigbar geringem Umfang (Barling

6. Diskussion 19

& Selkon, 1978, Keeling & Bedwell, 2005, Strausbaugh & Brinker, 1983). Daher sind weitere Untersuchungen zum Beispiel in Maus-Modellen nötig, um eine Wirksamkeit von Aminoglykosiden bei der Behandlung von Adipositas bedingt durch MC4R-Nonsense-Mutationen zu überprüfen.

6.5 Schlussbetrachtung

GWAS der letzten Jahre haben dazu beigetragen, ein besseres und umfangreicheres Verständnis für die komplexen Zusammenhänge der Gewichtsregulation zu erlangen und weisen auf Gene wie MC4R und GIPR als Adipositas-assoziiert hin. Wir konnten zeigen, dass ein SNP im Bereich des GIPR mit einer gestörten Glukose-Homöostase, einer häufigen Komorbidität von Adipositas, assoziiert ist. Damit stellt der GIPR weiterhin einen möglichen Ansatzpunkt für therapeutische Interventionen bei der Behandlung von Adipositas und deren Folgeerkrankungen dar. Unsere Untersuchungen der umgebenden Sequenz des MC4R haben SNP-Haplotypen identifiziert, die Bereiche von bis zu 188 kb entfernt vom MC4R einschließen und mit Adipositas assoziiert sind. Außerdem konnten wir die Bedeutung von Phänomenen wie „synthetische Assoziation“ und „cryptic relatedness“ aufgrund möglicher „Common-Founder-Effekte“ für die Bewertung von Assoziationsanalysen aufzeigen.

Für die klinische Praxis haben unsere Ergebnisse zur synthetischen Assoziation gezeigt, dass sich ein genaues Mutationsscreening für den MC4R nicht durch eine Haplotypbestimmung einiger weniger nicht kodierender SNPs ersetzen lässt. Für die Bewertung von GWAS-Daten müssen unterschwellig vorhandene Populationsstrukturen wie „cryptic relatedness“ berücksichtigt werden, um eine Verfälschung der Ergebnisse auszuschließen.

Schließlich konnten wir in vitro vielversprechende Therapieansätze bei Adipositas bedingt durch Nonsense-Mutationen im MC4R nachweisen. Weiterführende Studien an Mausmodellen werden zeigen, inwieweit unsere Ergebnisse längerfristig Anwendung für die pharmakologische Intervention bei Adipositas finden werden. Für die Zukunft sind weitere Analysen auch im Hinblick auf polygene Effekte nötig, um weitere Zusammenhänge zu verstehen und neue Diagnose- und Behandlungsmethoden bei genetisch bedingter Adipositas entwickeln zu können.

7. Literaturverzeichnis 20

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