diskreten Analyzer-System enzymatische Methode von in und -

Lab.med. 8: 365-372 (1984)

Zur Bestimmung von Kreatinin in Blut und Urin - Eine enzymatische Methode

mit Jaffe-Indikatorreaktion im diskreten Analyzer-System

H. Fritze, E. Henkel, A. Delbrück

Institut für Klinische Chemie II der Medizinischen Hochschule Hannover, Zentrum Laboratoriumsmedizin

Zusammenfassung:

Es wird eine Methode zur Bestimmung von Kreatinin in Körperflüssigkeiten vorgestellt bei der das Enzym Kreatininase und die Jäffe-Reaktion als Indikator-Verfahren angewandt werden. Die Methode verbindet die Spezif/tat des enzymatischen Tests mit der Empfindlichkeit der Jaffe-Reaktion. Eine Enteiweißung der Probe ist nicht erforderlich. Das Verfahren wird auf ein diskretes Analyzer-System adaptiert und zeigt sehr gute Übereinstimmung im Vergleich zu einem enzymatischen und einem chromatographischen Verfahren hinsicht- lich Spezifität und Richtigkeit Die Ergebnisse zweier modifizierter Jaffe-Tests liegen im Vergleich stets höher als das vorgestellte enzymatische Verfahren mit Jaffe-Indikatorreaktion. Dies ist auf unspezifische Nebenreaktionen im Jaffa-Verfahren zurückzuführen. Sichtbare Hämolyse und Bilirubinkonzentrationen oberhalb von 100 / stören den Test. Die Reagenzienkosten sind gegenüber der vollenzymatischen Methode erheblich gesenkt worden. Die beschriebene Methode erfüllt die Voraussetzungen für ein zuverläs- siges, praktikables und kostengünstiges Routineverfahren zur Bestimmung von Kreatinin.

Schlüsselwörter:

Kreatinin enzymatisch - Jaffe-Reaktion - Greiner Selective Analyzer G 300 und G 400 Summary:

A method for the determination ofcreatinine in biological fluids is described^t where the enzyme Creatininase in connection with the indicator-reaction according to Jaffe are used.

Deproteinization is not necessary. The method is adapted to a discrete analyzersystem and shows good correlation in comparison with enzymatic and the HPLC method concerning specificity and accuracy. The results'of the modified Jaffe-methods are slightly higher than those from the presented combined enzymatic procedure with Jaffe-reaction. This is causedby unspecific compounds interfering with the Jaffe-procedure.

Hemolysis and bilirubin-concentrations higher than 100 / interfere with the reaction. The reagent- costs are considerably Iower in comparison to the enzymatic method. The described procedure fulfills the condition for a reliable, specific, practical and economical method for the determination ofcreatinine.

Keywords:

Creatinine enzymatically - Jaffe-reaction - Selective Analyzer Greiner G 300 and G 400

Einleitung jedoch zeitlich und technisch zu aufwendig, um in der Routine angewendet zu werden.

Die klassische Jaffe-Reaktion mit alkalischer Pikratlö- Ähn|jches ilt für die Hochdruckflüssigkeitschromatogra- sung (1) bildet .mmer noch die Grundlage der häufigsten ^{hje |hf} Jrd ejne hohe Zuverlässigk|^it beigemessen, da Routmemethoden zur Bestimmung von Kreatmm m Se- Störfaktoren nicht bekannt sind und die Wiederfindung rum, Plasma und Urm. Auch die Emfuhrung der enzymati- ^$ehr . |n der Praxjs jst die Hochdruckflüssigkeits- sehen Analyse konnte die Jaffe-Reaktion aus Kosten- ^chror;^atograp^hj^{e jedo}ch ebenfalls zu aufwendig (7, 8).

gründen nicht verdrangen. So nimmt man weiter m Kaut

daß zahlreiche Chromogene („Pseudokreatinine") mit Als methodische Alternative zur Jaffe-Reaktion sind en- Jaffe-Reagenz unspezifische Nebenreaktionen eingehen zymatische Verfahren hinsichtlich ihrer Spezifität auch und bei allen methodischen Varianten der Jaffe-Reaktion in der Routine anerkannt. Das Enzym der Wahl ist die eine mehr oder minder ausgeprägte Abweichung zu hö- Kreatinin-amidohydrolase (EC 3.5.2.-), nachfolgend heren Werten vorliegt (2). Kreatininase genannt. Für die Routine entwickelten Berg-

A 1 , „. . , . , ,, .,.,.. .^u meyeretal. eine vollenzymatische Endpunktmethode, bei Als Jaffe-Methode mit der geringsten Unspez.f.tat gilt de, nach Ab|auf VQn Hj|fs. und ,ndikatorreaktionen der das Verfahren nach Adsorption an Füller-Erde mit Ent- Umsatz von NADH gemessen wird (9).

ei weißung (3, 4). In einer vereinfachten Form wurde es

als Referenzmethode vorgeschlagen und hat Eingang in Moss et al. (10) empfehlen eine kinetische Methode, der die D IN-Vorschriften gefunden (5, 6). Die Methode war dasselbe Reaktionsschema zugrunde liegt. In Vergleichs-

Lab.med. 8:365(1984) 365

Untersuchungen zeigt der enzymatische Test hohe Spezi- fität, ohne jedoch im Normbereich aufgrund der relativ niedrigen Extinktionsdifferenz die Präzision der Jaffo- Methode zu erreichen (11),

Daher entwickelte Schmid (12) ein Verfahren, das die Spezifität des enzymatischen Tests mit der Empfindlich- keit der Jaffo-Reaktion verband. In Proben, die mit und ohne Kreatininase behandelt worden waren, bestimmte er den Krealiningehalt mit einem modifizierten Jaffo-Test.

Es ergab sich jedoch keine Korrelation der Ergebnisse mit den bisher gebräuchlichen Verfahren. Löhberg (13) konnte zeigen, daß die mangelnde Übereinstimmung bei Schmid auf den Einfluß von serumeigenem Kreatin zu- rückzuführen ist, und empfahl eine manuelle Endpunkt- methode, bei der das Kreatin laufend dem Gleichgewicht entzogen wird.

Auch Masson et al. (14) beobachteten den Störeinfluß von Kreatin und schlugen eine weitere Modifikation vor, das gebildete Kreatin aus dem Gleichgewicht zu entfer- nen. Küffer et al. (15) zeigten für diesen Test eine Anwen- dung auf einem Greiner-Analyzer. Aufgrund der Ergeb- nisse der letzten Arbeiten ließ sich erwarten, daß unter Berücksichtigung der Störgröße Kreatin ein für den Rou- tineeinsatz geeignetes spezifisches Verfahren zur Bestim- mung von Kreatinin entwickelt werden kann, das mit Hilfe eines käuflichen Tests in weitgehend konfektionierter Form durchgeführt werden kann.

Aufgrund von Voruntersuchungen konnte gezeigt wer- den, daß in einem dreistufigen Vorgehen nach dem ange- gebenen Reaktionsprinzip die Störgröße Kreatin ausge- schaltet werden kann, indem in einer Vorinkubation ein vollständiger enzymatischer Umsatz des serumeigenen Kreatins durch Kreatinkinase und angeschlossener enzy- matischer Hilfsreaktion erfolgen kann.

In der zweiten Phase läuft die spezifische Reaktion zum Abbau des Kreatinins zum Kreatin, das wiederum nach dem gleichen Prinzip wie in der Vorinkubation weiter um- gesetzt wird und damit das Gleichgewicht der spezifi- schen Reaktion vollständig auf die Seite des Kreatins ver- lagert. In der dritten Stufe erfolgt die Indikatorreaktion mit Hilfe des Jaffe-Verfahrens, wobei die Differenz der Absorbanz zwischen einem Reaktionsansatz mit Krea- tininase und einem Vergleichsansatz ohne Kreatininase erfaßt wird. Zu dieser Arbeit war die Ausarbeitung der optimalen Reaktionsbedingung, ihre Adaptation an einen diskreten Analyzer¹, die Überprüfung des Verfahrens hin- sichtlich seiner Spezifität, Richtigkeit, Praktikabilität und Wirtschaftlichkeit sowie der Methodenvergleich mit an- deren Verfahren zur Bestimmung der Kreatininkonzentra- tion in Körperflüssigkeiten und Ausscheidungen.

Reaktionsprinzip Vorinkubation

Kreatin -H ATP ADP +PEP Pyruvat +NADH +

c« Kreatin-P +ADP PK ATP + Pyruvat LOH L-Lactat +NAD"1"

Kreatininabbau

Kreatinin Kfeatininai* Kreatinabbau gemäß Vorinkubation Jaffe-Reaktion

Kreatinin + Pikrinsäure ° Farbkomplex

Material und Methoden 1.Probenmaterial

Für die Untersuchungen aus Blut wurde Serum oder Plasma, welches mit Natriumheparinat gewonnen wor- den war, als Probenmaterial verwandt. Ein Teil der Proben stammte von terminal niereninsuffizienten Patienten.

Zur Untersuchung von Urinproben wurde Spontan- oder Sammelharn im Verhältnis 1:20 mit aqua bidest. ver- dünnt. Die Proben wurden nicht enteiweißt.

Zur Kalibration wurden Standardlösungen mit Kreatinin in wäßriger Humanalbuminlösung (4 g/dl) selbst herge- stellt (Bezugsquelle siehe Reagenzien).

Zur Qualitätskontrolle wurden Kontrollseren verschiede- ner Hersteller verwandt (siehe Tab. 3).

Serum und Plasma wurden ggf. bei 4°C gelagert, die Lagerung über mehr als zwei Tage erfolgt bei -20^eC. Die Lagerung von Standardlösungen erfolgte bei -20°C.

Qualitätskontrollseren wurden frisch eingesetzt oder ggf.

nach Angabe des Herstellers gelagert.

2. Reagenzien

Folgende Reagenzien und Chemikalien wurden ver- wandt:

Test-Kombination Kreatinin enzymatisch (Boehringer Mannheim)

Kreatinin (Merck) Kreatin (Serva)

Humanalbumin (Behringwerke) Pikrinsäure (Merck)

Dodecylhydrogensulfat Natriumsalz (Merck) Tetrahydrofuran (Merck)

Natriumhydroxid (Merck) Lithiumacetat (Fluka).

3. Standardlösungen

Kreatininstandard Preciset (Boehringer Mannheim).

Eigene Herstellung: 25-2500 / Kreatinin in wäßri- ger Humanalbuminlösung (4 g/l).

4. Vergleichsmethoden

4.1. Kinetische Methoden nach Jaffa 4.1.1. Greiner G 300 und G 400

Die Kreatininbestimmung am Greiner G 300 und G 400 ist eine modifizierte Jaffe-Reaktion ohne Enteiweißung.

In einem Fixed-Time-Verfahren für zwei Ansätze weist der Leerwertansatz eine kürzere Reaktionszeit auf als der Hauptansatz. Die Extinktionsdifferenz beider Ansätze ist ein Maß für die Kreatininkonzentration. Es wurde nach der Arbeitsanleitung des Herstellers in Anlehnung an (16) verfahren.

4.1.2. ASTRA8²

Es handelt sich um eine kinetische Kreatininbestimmung mit einer modifizierten Jaffe-Methode ohne Enteiwei- ßung. 25,6 Sekunden nach dem Start der Jaffe-Reaktion wird die Reaktionsgeschwindigkeit gemessen. Diese ist der K/eatiriinkonzentration proportional.

1 Selective Analyzer G 300 und G 400 der Firma Greiner Electro-

nics AG, CH-4900 Langenthal 2 Beckman Instruments GmbH, München 366 Lab.med.8:366(1984)

4.2. Enzymatische Kreatininbestimmung

Für die enzymatische Kreatininbestimmung (9) wurde die fest-Kombination „Kreatinin enzymatisch" (Boehringer Mannheim) verwandt. Diese manuelle Methode wurde zur Erhöhung der Zuverlässigkeit an dem G 300 adaptiert.

Die gemäß Arbeitsanleitung des Herstellers angesetzten Reagenzien wurden nach dem aufgeführten Dosier- schema verwandt. Die Eichkurve wurde mit der eigenen Standardlösung ermittelt.

Dosierschema für die enzymatische Methode (G 300) Meßwellenlänge:

334 nm

Temperatur: 37 eC

Probe + 100 ! Verdünnungslösung

Dosier- position Zeit Nr.

(min) _

Dosier- volumina ( ) Probe Proben-

leer- wert

160 160 R-1: Reaktionsgemisch II

(Enzym-Substrat-

Kreatininase) 12,6 63 R-2: Reaktionsgemisch l

(Enzym-Substrat) 12,4 62 400

400 4.3. Direkte photometrische Bestimmung

von Kreatinin mit der Hochdruckflüssigkeits- chromatographie (HPLC)

Die Probenvorbereitung erfolgte mit dem AMICON-Sy- stem M PS 1. Es wurde eine Ultrafiltration über eine YM B- Membran Durchlaßgrenze 15000 Dalton durchgeführt, 1800 g, 40 min, Zentrifuge Christ Typ l KS.

Die weitere Analytik erfolgte in Anlehnung an die von Ambrose (17) veröffentlichte Methode, es wurde jedoch nur ein Elutionsmittel eingesetzt.

20 des Ultrafiltrates wurden direkt in eine Partisilsäure 10 SXL 25cm lang, 4,6mm Durchmesser (Whatman 1 E6568) injiziert. Als Analysengerät wurde das Gerät HP 1084 der Firma Hewlett Packard benutzt. Zur Elutiön wurde eine 80 mmol/Lithiumacetatlösung pH 7,1 be- nutzt. Die Flußrate betrug 1,2 ml/min, Detektionswellen- länge 234/580 nm. Die Kalibration erfolgte mit dem Krea- tinin-Standard Preciset.

5. Enzymatische Methode mit Jaffe-Indikatorreaktion 5.1. Ansetzen der Gebrauchslösungen

Konzentration der Reagenzien aus der Test-Kombination

Reagenz Inhalt Konzentration

1

2 3

4

Puffer Glycerin Kaliumphosphat Detergenz ATPNADH PEP

CK £PK £

LDH £ MgCI2

Kreatininase £

100 mmol/l 75 mol/l, pH 8,0

2,5 ml/l 12 mmol/l 66 mmol/l 22 mmol/l 500 U/ml 200 U/ml 500 U/ml 100 mmol/l 500 U/l

Gebrauchslösungen:

R-1 Enzym-Substrat-Gemisch 1,6ml Reagenz 2 1.6 ml Reagenz 3 19 ml Reagenz 1 (Puffer)

Haltbarkeit: bei +2°-8°C ca. 48 Std.

R-2 Kroatininase 0,5 ml Reagenz 4 20 ml Reagenz 1 (Puffer)

Haltbarkeit: bei +2°-8°C ca. 48 Std.

R-4 Pikrat-Reagenz

4 Teile Pikrinsäurelösung + 1 Teil Natronlauge

Haltbarkeit: bei +2°-8°C ca. 48 Std.

Stammlösungen : Pikrinsäurelösung:

20 mmol/l Pikrinsäure

1.7 mmol/l Dodecylhydrogensulfat Natrium 50 ml/l Tetrahydrofuran.

Natronlauge:

1,65 mmol/l.

Konzentration im Test Bestandteil Glycerin Kaliumphosphat ATPNADH PEPCK PKLDH MgCI2

Kreatininase Pikrinsäure

(pH 8,0) ca.ca.

>9468

>3787

>9468

Konzentration 53 (72) 39 (53) 0,23 (0,31 ) 1,25(1,7) 0,42 (0,57) (12857) (5143) (12857) 1,9(2,6)

£9,13207

mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l mmol/l U/lU/l U/lmmol/l mmol/lU/l Die Konzentrationen während der Vorinkubation stehen in Klam- mern

5.2. G 300: Fixed-Time-Kinetik

Es handelt sich um ein Zwei-Ansatz-Verfahren mit Pro- ben- und partiellem Reagenzleerwert. Die Messung der Jaffe-Extinktionen erfolgt in beiden Ansätzen nach einer Reaktionszeit von 3,4 min ( /3,4 min).

Dosierschema

Haltbarkeit nach Angabe des Herstellers

Meßwellenlänge:

492 n m Temperatur:^ 37°C

Probe + 100 Verdünnungslösung R-1 : Enzym-

S übst rat - Gemisch R-2: Kreatininase R-3: Reagenz 1

(Puffer) R-4: Pikrat- Reagenz

Dosier- position Zeit (min) bis zur Messung

12,6 8 4,6 3,4 '

Nr.

- 63 40 23 17

Dosier- volumina ( ) Prozeßgefäß

1 II 180 180 100 100

200 500 500 Lab.med.8:367(1984) 367

5.3. G 400: Fixed-Time-Kinetik

Die Methode entspricht der Fixed-Time-Kinetik des G 300, dessen Dosierschema bernommen wurde. Ledig- lich die Positionsnummern der Reagenzdosierer erh hen sich ger tebedingt um jeweils zwei auf 65, 42, 25 und 19, Die Reaktionszeiten f r die Vorinkubation und den Kreatininabbau ndern sich gegen ber dem G 300 nicht.

Lediglich die Reaktionszeit mit Pikrat-Reagenz ist um 24 sec verl ngert, da eine Positionsnummer einer Reak- tionszeit von 12 sec entspricht.

5.4. G 400: Kinetik

Es handelt sich um die direkte kinetische Messung der Jaffo-lndikatorreaktion im Zwei-Ansatz-Verfahren mit Proben- und partiellem Reagenzienleerwert (ΔΕ/min).

Die Programmierung wurde sinngem von der Fixed- Time-Kinetik bernommen. Die Dosierposition und die Zeitabst nde bis zur Messung sind: R-1 = 65 (13 min);

R-2 = 42 (8,4min); R-3 = 25 (5min); R-4 = 7 (1,4 min).

6. Berechnung der

methodenspezifischen Konstanten der Eichkurve Zur Ermittlung der Eichkurvencharakteristik werden Stan- dardl sungen unterschiedlicher Konzentration je 10χ gemessen. Die Mittelwerte der erhaltenen Absorbanz werden auf der Ordinate, die Sollwerte der Standardl - sungen auf der Abszisse aufgetragen. Aus der resultieren- den Geraden y = ax + b (a = Steigung; b = y-Ach- senabschnitt) werden die Konstanten A = 1/a und B = -b/a berechnet und in das Ger t zur Ermittlung der Analysenergebnisse einprogrammiert (Abb. 5).

7. Statistik

Die Beurteilung der Me ergebnisse erfolgte ber die Be- rechnung der statistischen Gr en Mittelwert, Standard- abweichung und Variationskoeffizient. Die vergleichende Methodenbewertung wurde mit Hilfe von Korrelations- analysen vorgenommen (18-20).

^iSi^IL'i?? und Diskussion Spezifit t der Methode

Durch Verwendung von Kreatininase entspricht der kom- binierte Enzym-Jaffa-Test hinsichtlich der Spezifit t dem enzymatischen Test. Die wesentliche St rgr e, das Kreatin in der Probe, bleibt durch die Art der Reaktions- f hrung ohne Einflu . Dies konnte bei Kreatin-Standard- l sungen gezeigt werden, die bis zu 200 μηποΙ/Ι Kreatin enthielten. Die Lage der Eichkurven nderte sich durch den Kreatingehalt nicht.

Pr zision

Wie die Me ergebnisse zeigen, liegt die Pr zision im Ent- scheidungsbereich und im pathologisch-erh hten Be- reich in einer Gr enordnung, die den Erfahrungen mit den g ngigen Jaffe-Methoden und den blicherweise in der klinischen Chemie durchgef hrten Substrattesten entspricht (Tab. 1,2).

Richtigkeit

Die Pr fung der Richtigkeit wurde mit Qualit tskontroll- seren verschiedener Hersteller und im Aufstockversuch vorgenommen (Tab. 3). Die bereinstimmung mit den Sollwertangaben f r die einzelnen Kontrollmaterialien ist gut. Nur bei zwei .Kontrollseren liegt der gefundene Mit- telwert geringf gig au erhalb des f r den vollenzymati- schen Test angegebenen 1-s-Bereiches. Im Aufstock- versuch ergab sich eine Wiederfindung von 100 ±2% an zwei Plasmapoplproben (χ = 791μΓηο!/Ι bzw. 63μπηοΙ/Ι Kreatinin).

Nach weisgrenze

Die Nachweisgrenze liegt bei 22 μηιοΙ/Ι Kreatinin. Sie wurde durch eine Serienbestimmung (n = 15) von Aqua bidest. ermittelt und bezieht sich auf den berechneten 3-s-Bereich.

Linearit t

Die Linearit t der Methode wurde mit Standardl sungen steigender Konzentration gepr ft und umfa t einen Me - bereich von 25 μηποΙ/Ι bis 2500 μιηοΙ/Ι Kreatinin.

Tab. 1: Pr zision in der Serie

X CKreatinin

μιηοΙ/Ι 4883 700·181

n

1510 1510

s

3,93,5 3,75,2

VK (%)

- 8,1 4,22,9 0,5

Material: Qualit tskontrollseren und 'Standardmaterial

Tab. 2: Pr zision von Tag zu Tag χ

CKreatinin

μηηοΙ/Ι

19764 12

12 5,8

8,6

Material: Qualit tskontrollseren

368 Lab.med.8:368(1984)

VK (%)

9,14,3

Tab. 3: Richtigkeit und Standardabweichung von Qualit tskon - trollseren bezogen auf die Sollwerte der enzymatischen Methode (2) nach Angaben der Hersteller

Kontrollserum Soll-Wert ( Enzym. - Methode) μπιοΙ/Ι

Ist-Wert (Enzym- Jaffe-Methode) (G 300

gem 5.2.) μηποΙ/Ι

Monitrol l Merz & Dade

Nr. 178 121 9,5 Monitrol II

Merz & Dade Nr. 76 331 9,5 Precipath U

Boehringer Mannheim

Nr. 518 335 23 Validate A

G decke

Nr. 2236120 274 27,5

16 111 7 330

3 328

14 283 3,3 .6,6

7.6

5,2

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K; J

VI

Zur Stabilität und Handhabung der Reagenzien

Dje, Reagenzien für die Gebrauchslösungen R-1, R-2 und R-3 sind dem käuflichen enzymatischen Test entnom- men. Da die Ergebnisse bei diesem Test mit Hilfe von konstanten Faktoren berechnet werden, ist die Haltbarkeit der Gebrauchslösungen vom Hersteller auf 24 Std. bei 2-8°C beschränkt. Beim vorgestellten Verfahren kann diese Gebrauchsdauer überschritten werden, da die Me- thode mit Standardlösungen geeicht wird und .ein gerin- ger Abfall der Enzymaktivitäten nicht ins Gewicht fällt. In der Routine_sollte die Kalibration täglich neu durchge- führt werden, da die Reagenzienstabilität innerhalb der üblichen Meßdauer von etwa 6 Std. nicht merklich ab- nimmt.

Bei längerer Pause, z. B. über Nacht, sollten die Schlauchsysteme der Dosierer R-1 und R-2 mit aqua bidest. gespült werden.

Die Stammlösungen für das Pikrat-Reagenz sind stabil.

Bei der Verwendung der Gebrauchslösung mußte eine besondere Schwierigkeit überwunden werden. Einerseits sollte die Konzentration an Pikrinsäure im Test 9 mmol/l nicht unterschreiten, um bei der relativ kurzen Reaktions- zeit der Kreatininase ein ausreichend hohes Meßsignal zu erhalten. Andererseits ist dadurch die Konzentration in der Gebrauchslösung so hoch, daß die Pikrinsäure im gekühlten Reagenzdosierer auskristallisiert. Das Problem wurde durch Zugabe von Tetrahydrofuran (THF) beho- ben. Die hier stattfindende langsame Jaffe-Reaktion von THF und Pikrinsäure begrenzt zwar die Haltbarkeit des Reagenzes, wird jedoch durch das Zwei-Ansatz-Verfah- ren kompensiert. Getrennte Zugabe von Pikrinsäure und Natronlauge ist nicht möglich, da nur 4 Dosierer pro Me- thode programmiert werden können. Es wurde daher auch darauf verzichtet, Natriumdihydrogenphosphat zur Extinktionserhöhung zu verwenden (12). Dodecylhydro- gensulfat Natrium beseitigt probenbedingte Trübungen.

Methoden vergleich

Da Pikrat mit mehreren chrqmogenen Substraten reagiert, wurden zahlreiche Modifikationen des Jaffe-Tests erar- beitet, um die spezifische Bestimmung von Kreatinin zu gewährleisten und dem „wahren Wert" möglichst nahe zu kommen. Das Verfahren nach Adsorption an Füller- Erde wurde als „ausgewählte Methode" empfohlen (5), eine Referenzmethode existiert jedoch bisher nicht.

Hierfür kommen aus heutiger Sicht in erster Linie die Bestimmung des Kreatinins mit Hilfe der Hochdruckflüs- sigkeitschromatographie oder enzymatische Verfahren in Betracht. Nach den vorliegenden Eigenergebnissen zur Kreatininbestimmung mit Hilfe der Hochdruckflüssig- keitschromatographie sollte diesem Verfahren der höchste Wert als Referenzmethode zugesprochen wer- den, da dieses Verfahren weitgehend frei von Störungen durch unspezifische Matrixeinflüsse ist. Wie an anderer Stelle gezeigt.(2), ist der Kreatininpeak in dem Hoch- druckflüssigkeitschromatogramm durch vollständigen Kreatininabbau als Kreatin zu identifizieren. Das Ver- schwinden des Peaks zeigt an, daß keine andere Substanz der Probe mit der gleichen Retention eine entsprechende Adsorbanz besitzt. Bei Einsatz eines Ultrafiltrationsver- fahrens zur Vorbereitung der hochdruckflüssigkeitschro- matographischen Auftrennung läßt sich verlustfrei arbei- ten und eine wesentlich bessere Präzision und Vereinfa- chung der Verfahrens erzielen. Das Vorgehen erfolgt in Anlehnung an Ambrose (17), wobei jedoch nur Elutions- puffer verwendet wurde. Die Überprüfung der Reinheit

der in den Analysen verwendeten Standards erfolgte ebenfalls mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromato- graphie. Es konnten keine Hinweise auf das Vorliegen einer Verunreinigung im Ausgangsmaterial gefunden werden. Im Methodenvergleich zwischen dem hier vor- gestellten Verfahren und der Kreatininbestimmung mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie ergab die Auswertung durch Korrelationsanalysen eine gute Übereinstimmung (Abb. 1). Offensichtlich ist in dem ge- wählten Vorgehen der Störfaktor Kreatin ausgeschaltet.

Beim Methodenvergleich der kombinierten enzymatisch- chemischen Methode mit dem chemischen Verfahren nach Jaffe zeigen die gefundenen Korrelationsangaben eine deutliche Verschiebung der Achsenabschnitte zu negativen Werten. Hier ist die geringere Spezifität das Jaffe-Tests erkennbar. Durch die Erfassung von „Pseudo- kreatininen" liegen die Ergebnisse dieser chemischen Methoden stets signifikant höher als die der kombinierten Enzym-Jaffe-Methode (Abb. 2, 3).

Zum Vergleich der Enzym-Jaffa-Methode mit der vollen- zymatischen Methode erscheint es sinnvoll, die Beseiti- gung des Störeinflusses von Kreatin noch einmal einge- hend zu erläutern.

Kreatininase baut Kreatinin aufgrund der Gleichge- wichtslage nur zu 60% zu Kreatin ab. Durch Einbeziehung der Enzyme CK, PK und LDH in Hilfs- und Indikatorreak- tionen wird Kreatin dem Kreatinin/Kreatin-Gleichgewicht vollständig entzogen. Bei einer Reaktionstemperatur von 20-25°C ist die Umsetzung nach ca. 30 min vollständig.

Diese Reaktionsführung wird bei der Endpunktmethode des vollenzymatischen Tests angewandt (9). Eine Verkür- zung der Reaktionszeit bewirkt den unvollständigen Ab- bau von Kreatinin. Dann fallen die Kreatininergebnisse um so niedriger aus je höher die Kreatinkonzentration in der Probe3 war.

Dieser Effekt konnte mit Hilfe von Kreatinin-Standardlö- sungen verifiziert werden, die steigende Konzentrationen von Kreatin (bis 200 / ) enthielten.

Bei der Adaption des vollenzymatischen Tests auf den Analysenautomaten muß die Reaktionszeit gerätebedingt auf ca. 12,5 min verkürzt werden. Der zu erwartende Stör- einfluß von Kreatin wird dadurch vermieden, daß die Re- aktionstemperatur von 20-25°C auf 37°C erhöht und das Probevolumen um 25% vermindert wird. Dadurch ist der vollständige Abbau von Kreatinin gewährleistet.

Beim kombinierten enzymatisch-chemischen Test ist eine weitere Verkürzung der Reaktionszeit unumgänglich. Da- mit wäre bei unvollständigem Abbau des Kreatinins das Analysenergebnis aus den oben angeführten Gründen vom Kreatingehalt der Probe abhängig. Dieses Problem wird dadurch gelöst, daß zunächst probeneigenes Kreatin durch Vorinkubation abgebaut wird. Erst anschließend wird Kreatininase zugefügt und nach einer definierten Reaktionszeit die Jaffe-Rea'ktion nachgeschaltet. Auf diese Weise ist der Störeinfluß des Kreatins auf den Kreati- ninabbau ausgeschaltet. Die Korrelation der vollenzyma- tischen und der kombinierten enzymatisch-chemischen Methode weist sehr gute Übereinstimmung auf (Abb. 4).

Eine durch Kreatin verursachte gleichsinnige Störung bei- der Methoden kann wegen der guten Übereinstimmung des Enzym-Jaffe-Verfahrens mit der Hochdruckflüssig- keitschromatographie ausgeschlossen werden.

Im Analysenautomaten G 400 besteht zusätzlich die Möglichkeit, die direkte Kinetik einer Reaktion zu verfol-

3 Normalwert im Serum: 20-47 / (21)

Lab.med.8:369(1984) 369

gen. Dies führte zu einer zweiten Variante des Enzym- Jaffo-Verfahrens, bei dem die Jaffe-Kinetik direkt gemes- sen wird. Dies erlaubt längere Reaktionszeiten für Vorin- kubation und Hauptreaktion. Die Korrelation zur Fixed- Time-Kinetik ist erwartungsgemäß sehr gut, da sich die Methoden lediglich in der Meßtechnik unterscheiden (Tab. 4).

Die angegebene Verkürzung des Meßintervalls bei der kinetischen Bestimmung der Jaffa-Reaktion verursacht jedoch eine wesentliche Abnahme der Extinktionsdiffe- renz, Damit ist die Steigung der Eichkurve wesentlich geringer. Weitere Unterschiede beider Meßtechniken wurden nicht beobachtet. Damit ist Fixed-Time-Kinetik- Methode der Vorzug als Indikatorreaktion zu geben (Abb. 5). Die statistische Auswertung in Tab. 4 beinhaltet einmal die Ergebnisse der herkömmlichen Regressions- analyse (18). Zur weiteren Absicherung der Ergebnisse wurden zusätzlich die Methode der standardisierten Hauptkomponente (19) und die Methode nach Passing/

Enzym Jolle (Fixed-Time-Kmetik) Creotinin1400

pmol/l

JOOO

600

200'

1000 1400 Creatinin jjmol/i Abb. 1: Vergleich der kombinierten enzymatisch-chemischen Methode (G 400) mit der HPLC-Methode

1000 ' 1400 Creatinin //mo///

Abb. 2: Vergleich der kombinierten enzymatisch-chemischen Methode mit der kinetischen Jaffa-Methode des Greiner G 300 (Plasma)

Cnotinn12 mm oll l

£nzym-Joff*

10 12 Creatinin mmollt Abb. 3: Vergleich der kombinierten enzymatisch-chemischen Methode mit der kinetischen Jaffe-Methode des Greiner G 300 (Urin)

Creotinineoo

fimolll

600

400

200 Enzym-Joff*

Plasma

enzymatisch 200 400 600 000

Creatinin pmotll Abb. 4: Vergleich der kombinierten enzymatisch-chemischen Methode mit der vollenzymatischen Methode (G 300)

0.5

OJ 0.2

0.1-

Fixed-Time-Kinetik E) A = 1546

B =25

Kinetik fa E/min) A=4294 B=0

300 500 700

Creotinin umol/t Abb. 5: Eichkurvencharakteristik bei identischem Standardmate- rial

370 Lab.med. 8:370(1984)

Ji

Tab. 4: Auswertung der Korrelationsanalysen

Methode Material/

Dimension n Herk mmliche syx r Regressions-

analyse y = b + ax

Methode der Methode standardisierten nach Hauptkompo- Passing/

nente(19) Bablok (20)

x= enzymatische Methode Plasma μηηοΙ/Ι 29 y=7,2 + 0,972x (G 300)

y= Enzym-Jaffe (G 300) (Fixed-Time-Kinetik)

19,8 0,995 0,977 6,3 0,931 12,5

Jaffe-Fixed-Time-Kinetik Plasma μηηοΙ/Ι 30 y=-29,6 + 0,952x 20,3 nach Arbeitsanleitung

(G 300)

0,998 0,954 -30,0 0,954 -26,7

y= Enzym-Jaffe (G 300) Urin mmol/l 34 y=-0,29 + 0,992x 0,189 0,997 0,995 -0,3 1,0 -0,3 x= Jaffe-Kinetik Plasma μΓηοΙ/Ι 44 y=-19,2 - 0,935x 24,8

Ger t: Beckman ASTRA 8 0,998 0,938 -19,9 0,937 -16,5

Enzym-Jaffe (G 300) Urin mmol/l 36 y=-0,429 + 0,99x 0,209

(Fixed-Time-Kinetik) 0,998 0,991 - 0,44 0,991 - 0,37

x= Enzym-Jaffe (G 400) (Fixed-Time-Kinetik) y= Enzym-Jaffe (G 400)

(Kinetik) x= HPLC

y= Enzym-Jaffe (G 400) Kinetik

x= HPLC

y= Enzym-Jaffe (G 400) (Fixed-Time-Kinetik)

Plasma μπηοΙ/Ι 25 y=-3,7 + 1,018x 13,6

Plasma μπιοΙ/Ι 25 y = 1,4 + 0,957 χ 12,3

Plasma μΓποΙ/Ι 30 y=-0,6 + 0,94x 14,6

0,999 1,019 - 3,8 1,024 - 5,9

0,999 0,958 - 1,6 0,963 - 2,6

0,999 0,943 - 0,85 0,942 2,66

Bablok (20) angewandt. Im Vergleich der Parameterab- sch tzung der drei Regressionsgeraden werden die ber- einstimmungen und Abweichungen der verschiedenen Methoden sehr gut best tigt.

St rfaktoren

Anhand einiger repr sentativer Wirkstoffe und Substan- zen, bei denen eine positive Jaffe-Reaktion bekannt ist, wurde gepr ft, ob Interferenzen beim kombinierten enzy- matisch-chemischen Test vorliegen. Als Probenmaterial wurde ein Qualit tskontrollserum verwandt. Die einge- setzten Substanzen und ihre Konzentrationen sind in Tab. 5 aufgef hrt. Bei keiner dieser Substanzen wurde ein signifikanter Einflu auf die Ergebnisse beobachtet.

In der Arbeitsanleitung der Test-Kombination Kreatinin (Boehringer Mannheim) ist H molyse als St rfaktor an- gef hrt. Entsprechend dieser Angabe wurde der Einflu von H molyse auf den kombinierten enzyrnatisch-chemi- schen Test untersucht. Schon bei einer H moglobinkon- zentration von 0,5 g/l ist das Ergebnis der Kreatininbe- stimmung um1 ca. 5% verringert und vermindert sich bei 5 g/l um nahezu 18%. Demnach ist h molytisches Pro- benmaterial beim kombinierten enzymatisch-chemischen Test ebenso wie beim vollenzymatischen Verfahren nicht geeignet.

In einer weiteren Untersuchungsreihe wurde der Einflu von Bilirubin gepr ft Die Untersuchungsproben bestan- den aus einer Mischung von einem Teil einer Kreatinin·

l sung und einem Teil ein.er Bilirubinl sung steigender Konzentration. Die Kreatininl sung wurde durch Aufl - sung von Welcomtrol mit einer Kreatininstandardl sung

Tab. 5: Pr fung des kombinierten enzymatisch-chemischen Ver- fahrens zur Bestimmung von Kreatinin auf St rfaktoren

Substanz Konzentration

Coffein

Dimethylmaniophenazon (DMAP) Adrenalin

Zinacef (Cefuroxim Na) Mefoxitin

Furadantin Natriumoxalat Presinol Aceton Azulfidine

10ng/dl 10ng/dl 10ng/dl 10ng/dl 10ng/dl 3 mg/dl 50 mg/dl

5μΙ/1θΓηΙ Serum Ι Ο μ Ι / I O m l Serum

5 mg/dl

Probenmaterial: Welcomtrol Nr. K1765

(Preciset, 529 μηηοΙ/Ι) gewonnen. Als Basisl sung f r Bilirubin diente Bilicontrol (Merz & Dade, Sollwert:

342 μηηοΙ/Ι). Die Verd nnung der Bilirubinl sung erfolgte mit 0,9% NaCI-L sung mit Humanalbumin (4 g/l).

Die Me reihe ergab, da der Test bis zu einer Konzentra- tion von 100 μιηοΙ/Ι Bilirubin nicht gest rt wird. Oberhalb dieser Konzentration fallen die Kreatininergebnisse zu hoch aus. In der angegebenen Unters chungsreihe liegt der Kreatininwert bei der Probe mit den h chsten Konzentrationen (Kreatinin = 311 μΓηοΙ/Ι; Bilirubin

= 178 μηιοΙ/Ι) 10% ber dem erwarteten Wert. Wie Bili- rubin auf den Test einwirkt, ist nicht bekannt. Es liegt jedoch nahe, da es in die Jaffe-Reaktion eingreift, da auch die Jaffe-Methode des Greiner-Analysators in glei- cher Weise gest rt wird.

Lab.med. 8: 371 (1984) 371

Demnach sollten die Patientenproben möglichst ver- dünnt werden, wenn die Bilirubinkonzentration über 100 / liegt. Verschleppungsfehler wurden nicht be- obachtet. Das Spülsystem des Probendosierers arbeitet so gründlich, daß bei wechselnden Serien mit bidest. Wasser und Proben mit hohen Kreatininkonzentrationen keine merklichen Verschleppungsfehler auftraten. Dies ent- spricht auch den Erfahrungen mit allen anderen Parame- tern, die routinemäßig mit dem Analysengerät bestimmt werden.

Wirtschaftlichkeit

Der vollenzymatische Test zeichnet sich durch hohe Rea- genzienkosten aus. Schon durch die Adaption an den Analysenautomaten lassen sich diese wesentlich verrin- gern. Das vorgestellte Enzym-Jaffe-Verfahren bringt wei- tere erhebliche Ersparnis und reduziert die Kosten auf etwa 20% bezogen auf den vollenzymatischen Test. Das Probenvolumen wurde auf 80 gesenkt. Letztlich wur- den die Lösungen so abgestimmt, daß der käufliche Test vollständig verbraucht wird. Daher ist dieses Verfahren auch von der Kostenseite her für die Routine akzeptabel.

Schrifttum:

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21. BERGMEYER, H. U.: Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Aufl., Bd. l, Verlag Chemie, Weinheim 1974, S. 472.

Anschrift der Verfasser:

Institut für Klinische Chemie II der Medizinischen Hochschule Zentrum Laboratoriumsmedizin

Zentrallabor Podbielskistraße 380

3000 Hannover 51 D

372 Lab.med.8:372(1984)

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