und dem
Niedersächsischen Landgestüt Celle
Kryokonservierung von Hengstsperma
mittels direktionaler Gefriertechnik in Hollow-Tubes im Vergleich zur konventionellen Gefrierung in 0.5ml Pailletten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Heike Zirkler aus Sangerhausen
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Klug
PD Dr. H. Sieme
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Erich Klug 2. Gutachter: Prof. Dr. Detlef Rath Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2005
Meinen Eltern
1 Einleitung ... 9
2 Literatur ... 10
2.1 Grundlagen der Kryokonservierung... 10
2.1.1 Kälteschock ... 10
2.1.2 Vorgänge bei der Samenzellgefrierung... 12
2.2 Techniken der Gefrierkonservierung... 15
2.2.1 Aufbereitung... 15
2.2.1.1 Zentrifugation... 15
2.2.1.2 Verdünnermedien ... 17
2.2.2 Kühlregime... 22
2.2.3 Konfektionierungsform ... 22
2.2.4 Gefrierregime ... 25
2.2.5 Auftauregime... 27
2.3 Erfolgsbestimmende Faktoren bei Einsatz kryokonservierten Hengstspermas ... 28
2.3.1 Beeinflussung des Anteils überlebender Spermien nach Kryokonservierung ... 28
2.3.2 Funktioneller Status überlebender Spermien nach Kryokonservierung... 29
2.3.3 Befruchtungspotenz kryokonservierter Hengstspermien ... 30
2.3.3.1 Einflußfaktoren auf das Fertilitätsergebnis bei Einsatz kryokonservierten Hengstspermas ... 30
3 Material und Methoden ... 35
3.1 Versuchstiere ... 35
3.2 Gewinnung der Ejakulate ... 35
3.3 Untersuchung der Ejakulate ... 35
3.4 Aufbereitung... 36
3.5 Konfektionierung ... 37
3.6 Anpassungszeit vor der Tiefgefrierung ... 37
3.7 Gefrierverfahren ... 38
3.8 Auftauen ... 39
3.9 Untersuchungsparameter ... 40
3.9.1 Motilität ... 40
3.9.2 Morphologie der Spermien... 41
3.9.3 Durchflußzytometrische Spermauntersuchung ... 43
Auswertung ... 43
3.9.3.2 Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA™) ... 46
3.10 Statistische Auswertung ... 47
4 Ergebnisse ... 48
4.1 Motilität der Spermien ... 48
4.1.1 Vorwärtsbeweglichkeit... 48
4.1.2 Kurvolineare Geschwindigkeit (VCL) ... 49
4.1.3 Lineare Geschwindigkeit (VSL) ... 51
4.1.4 Mittlere Geschwindigkeit (VAP) ... 53
4.1.5 Seitliche Kopfauslenkung (LHD)... 55
4.2 Morphologie der Spermien... 56
4.3 Membranintegrität der Spermien ... 57
4.3.1 Anteil membranintakter Spermien nach FITC-PNA / SYTO® 17 / PI – Färbung . 57 4.3.2 Anteil membranintakter Spermien nach SYBR® 14 / PI-Färbung... 59
4.4 Akrosomaler Status der Spermien... 60
4.5 Mitochondrialer Status der Spermien... 62
4.6 Spermienchromatinstruktur ... 63
5 Diskussion ... 66
5.1 Kühlregime... 66
5.2 Gefrierregime ... 67
5.3 Auftauregime... 68
5.4 Konfektionierungsform ... 68
5.5 Motilitätsanalyse ... 70
5.6 Durchflußzytometrische Untersuchung... 72
5.6.1 Plasmamembranintegrität der Spermien ... 73
5.6.2 Akrosomaler Status der Spermien... 74
5.6.3 Mitochondrienmembranpotential der Spermien... 75
5.6.4 Spermienchromatinstrukturanalyse ... 76
Zusammenfassung ... 79
Summary ... 81
Schrifttumsverzeichnis ... 83
Anhang ... 109
Abb. = Abbildung
ATP = Adenosintriphosphat bidest = bidestillata
bzw. = beziehungsweise Ca2+ = Kalzium
DFI = DNA-Fragmentationsindex DNA = Desoxyribonukleinsäure DMSO = Dimethylsulfoxid et al. = et alii (und andere) Fa. = Firma
FS 25 = Frischsamen nach Verdünnung auf 25 Millionen Samenzellen/ml
FS 60 = Frischsamen nach Zentrifugation und anschließender Verdünnung mit TG- Verdünner und Glyzerin auf 60 Millionen Samenzellen/ml
FS 200 = wie FS60 nach Verdünnung auf 200 Millionen Samenzellen/ml Gruppe A = Hengste mit guter Tiefgefriereignung
Gruppe B = Hengste mit schlechter Tiefgefriereignung
INRA 82 = Institute Nationale de la Recherche Agronomique m =Anzahl der Wiederholungen pro Pferd
ml =Milliliter
MMP = Mitochondrienmembranpotential mm/s =Millimeter pro Sekunde
n = Anzahl der Pferde
P 60 = in Pailletten konfektioniertes Sperma mit 60 Millionen Samenzellen/ml P 200 = wie P60 mit 200 Millionen Samenzellen/ml
SCSA™ = Spermienchromatinstrukturanalyse T 60 = wie P60 in Hollow-Tubes®
T200 = wieP200 in Hollow-Tubes®
Tab. = Tabelle Temp. = Temperatur
TG-Verdünner = Tiefgefrierverdünner u. = und
z.B. = zum Beispiel
µm/s = Mikrometer pro Sekunde
1 Einleitung
Das Ziel der Samentiefgefrierung besteht in der zeitlich unbegrenzten Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit des Samens außerhalb des Körpers. Der Metabolismus zur Energieproduktion, die Vorwärtsbeweglichkeit, die Enzyme innerhalb des Akrosoms, die im Zellkern gelagerte DNA sowie die Proteine an der Plasmamembran ( Überleben des Spermiums im weiblichen Reproduktionstrakt, Spermienbindung an das Ei) müssen dazu in ihrer Funktion erhalten bleiben ( AMANN u. PICKETT 1987).
Schon in den 70er Jahren sind erste Trächtigkeiten mit tiefgefrorenen Pferdespermien produziert worden (POLGE u. MINOTAKIS 1964; MERKT u. KRAUSE 1966; NAGASE et al. 1966a,b). Dennoch weist kryokonserviertes Sperma im Vergleich zu frischkonserviertem Samen eine deutlich reduzierte Zellvitalität auf, welche schlechtere Befruchtungsergebnisse nach sich zieht (MÜLLER 1982; KLUG 1989; VIDAMENT et al. 1999).
In der vorliegenden Arbeit soll die Technik der direktionalen Gefrierung großvolumiger Hollow-Tubes® mit der konventionellen Gefrierung von 0,5ml-Pailletten im Tiefgefrierautomaten verglichen werden. Während es bei den konventionellen Verfahren zu einer Massengefrierung des Gefriergutes kommt, erfolgt bei der direktionalen Gefriertechnik eine sukzessive, partiell fortschreitende Gefrierung. Mit der direktionalen Gefrierung werden Einfriergeschwindigkeiten erreicht, die weit oberhalb der in konventionellen Verfahren im Tiefgefrierautomaten gebräuchlichen Einfriergeschwindigkeiten liegen. Es werden verschiedene Motilitätsparameter untersucht und zur Überprüfung der Membranintegrität, des Mitochondrienmembranpotentials, der Akrosomenintegrität und zur Bestimmung der Chromatinstruktur der Spermien werden Untersuchungen mit Hilfe durchflußzytometrischer Verfahren unter Verwendung spezifischer Färbemethoden durchgeführt.
2 Literatur
2.1 Grundlagen der Kryokonservierung
Spermien werden während des Einfrier- und Auftauprozesses von diversen chemischen und physikalischen Prozessen, wie Wärme- und Wassertransporte zwischen intra- und extrazellulärem Raum, betroffen, die deren Vitalität beeinflussen.
Zunächst erfahren die Samenzellen verschiedene Struktur- und Funktionsänderungen, welche allgemein mit dem Begriff „Kälteschock“ bezeichnet werden und durch eine schnelle Temperaturabsenkung bis auf +1°C verursacht werden.
Bei der Kryokonservierung wird das Samenzellmaterial in flüssigem Stickstoff bis zu Temperaturen von -196°C abgekühlt und kann so zeitlich unbegrenzt bei diesen Temperaturen aufbewahrt werden. Nicht die Verweildauer in diesen tiefen Temperaturen, in denen keine thermodynamischen Reaktionen vorkommen und in denen der einzig bestehende physikalische Zustand kristallin oder glasartig ist, beeinflußt das Überleben der Zelle, sondern die zweimalige Temperaturveränderung, der die Zelle beim Tiefgefrierprozeß und zurück zur physiologischen Temperatur beim Auftauprozeß ausgesetzt wird. Die meisten Schäden entstehen dabei in einem kritischen Zwischenbereich von -15°C bis -60°C (MAZUR 1984).
Für die Entstehung von Gefrierschädigungen kommen hauptsächlich zwei Ursachen in betracht, zum einen die intrazelluläre Eiskristallbildung und zum anderen sogenannte
„Lösungseffekte“, deren Auswirkungen vorwiegend von der Kühlrate abhängig sind.
2.1.1 Kälteschock
Die Spermien erfahren im Laufe der Abkühlung von +20°C bis +1°C verschiedene Veränderungen, die bei Temperaturen unter +15°C einsetzen und mit zunehmendem Kältestreß allmählich intensiver werden. Qualitativ sind diese Schäden bei Hengstspermien ähnlich denen bei Spermatozoen anderer Huftiere (WATSON et al. 1987). Hinsichtlich der Kälteschocksensibilität bestehen tierartliche sowie inter- und intraindividuelle Unterschiede.
Eberspermatozoen erweisen sich als äußerst kälteschockempfindlich, während Geflügelspermien die größte Resistenz besitzen (WATSON u. PLUMMER 1985). Im Vergleich zu Eber- und Schafbockspermien sind Hengstspermatozoen weniger kälteschockempfindlich (WATSON et al. 1987).
Mit sinkender Temperatur kommt es zu einer progressiven Minderung der Motilität der Samenzellen. Anfangs zeigt sich eine Kreisbewegung und bei weiterer Abkühlung kommt es
zur absoluten Unbeweglichkeit. Außerdem erfolgt eine beträchtliche Reduktion der Energieproduktion, die Membranpermeabilität nimmt zu und intrazelluläre Ionen und Moleküle gehen verloren (AMANN u. PICKETT 1987).
Durch Temperaturänderungen wird die Fluidität der Membranen stark beeinflußt. Durch die Abkühlung kommt es zu einem Phasenübergang vom flüssigen zum kristallinen Zustand infolge einer Formveränderung der Phospholipide. Es tritt eine Streckung der Fettsäureketten auf, die eine Zusammenballung der Phospholipide bedingt. Die Moleküle der Membran können sich in diesen kristallinen Domänen nicht frei bewegen. In einem flüssigen Zustand bleiben nur vereinzelte Regionen der Membran. In diesen Bereichen kommt es zur Aggregation der integralen Proteine, die zu einer erhöhten Membranpermeabilität und zu einem Verlust der metabolischen Funktion führt (AMANN u. PICKETT 1987). Die Membran wird durch die Kälteschockeinwirkung durchlässig für Substanzen, wie z. B. Sucrose, Natrium, Kalium, welche sonst nicht passieren können (DAW et al. 1973). FARRANT und MORRIS (1973) berücksichtigten ebenfalls einen Einfluß der hypotonen Belastung, welche an sich keine direkten Schäden verursacht, die Membran aber empfindlicher für andere Streßfaktoren, wie beispielsweise Temperatursenkung, macht.
Manche Phospholipide können auch eine zirkuläre Anordnung annehmen und die sogenannten „hexagonal-II Phasen“ bilden. Diese normalerweise nur flüchtig auftretenden Strukturen können bei Abkühlung auch länger fortbestehen.
Die Fähigkeit der Phospholipide, beim Wiedererwärmen wieder in die lamelläre Form überzugehen, scheint nach Anwendung langsamerer Abkühlraten bei Schafspermatozoen größer zu sein (HOLT u. MORRIS 1986).
An den Membranen der Eberspermatozoen äußern sich degenerative Veränderungen besonders in morphologischen Umbildungen am Akrosom (SCHILLING u. VENGUST 1985).
Die Membranschäden des Spermienkopfes betreffen zuerst die Plasmamembran und danach die Akrosommembranen, wobei die äußere Akrosommembran anscheinend keine völlige Ruptur erleidet, sondern ihre Kontinuität beibehält. Diese Membran scheint dennoch auch Veränderungen zu erfahren, zumal eine akrosomale Expansion meßbar wird. Da biologische Membranen nicht besonders dehnbar sind, würde das bedeuten, daß Läsionen gesetzt wurden.
Durch Anfügung von neuem membranösem Material könnte die Geschlossenheit der äußeren
Akrosommembran erklärt werden. Obwohl solches Material in der Zellumgebung beschrieben wird, ist der Ursprung dieser Fragmente unbekannt (WATSON et al. 1987).
Infolge des Kälteschocks kommt es aber auch zu einem Verlust von Lipiden, die nach DARIN-BENETT et al. (1973) von zerstörten Spermienmembranen stammen.
Durch den Kälteschock wird auch ein Defizit verschiedener Enzyme verursacht, wodurch die Glykolyse, die Fruktolyse und die Atmungsaktivität der Spermatozoen reduziert werden.
Durch Enzymaktivitätsmessung (ATP-ase, Cytochrom-Reduktase) kann das Ausmaß der Kälteeinwirkung bestimmt werden (HOLT u. NORTH 1985).
Temperatursenkung führt zu einer Verringerung der ATP-Produktion (QUINN 1985). Die Funktion ATP-abhängiger membranständiger Pumpen ist für die Aufrechterhaltung des Ionengleichgewichts von großer Bedeutung. Die Effizienz dieser Pumpen vermindert sich infolge der reduzierten ATP-Produktion bei Temperaturabfall. Dadurch kommt es zu einer Verschiebung der Ionenverhältnisse und folglich zur Depolarisation der Plasmamembran.
Diese Depolarisation führt zur Öffnung ladungsgesteuerter Kalziumkanäle und somit zu einem Kalziumeinstrom (AMANN u. PICKETT 1987). Bedingt durch die erhöhte Kalziumkonzentration im Zytosol werden Phospholipasen und Proteasen aktiviert und Membrankomponenten infolgedessen hydrolysiert (HAMMERSTEDT 1990). Insgesamt werden gravierende Veränderungen der Membranpermeabilität ausgelöst, die bis zum Tod der Zelle führen können.
2.1.2 Vorgänge bei der Samenzellgefrierung
Das umgebende Medium und der intrazelluläre Raum bleiben bis zu einer Temperatur von -5°C in einem flüssigen Zustand. Bei weiterer Temperatursenkung bis zu -15°C beginnt die umgebende Flüssigkeit spontan oder induziert (seeding) zu kristallisieren, während die innere Zellflüssigkeit noch ungefroren bleibt. Das unterkühlte intrazelluläre Wasser besitzt unter diesen Umständen ein höheres chemisches Potential als das extrazelluläre, so daß eine Potentialdifferenz entsteht, die durch den Wasseraustritt aus der Zelle kompensiert wird (MAZUR 1984).
Die weiteren physikalischen Vorgänge entstehen in Abhängigkeit von der Gefrierungsrate.
Die Zelle kompensiert den entstehenden Potentialunterschied bei langsamer
Temperaturerniedrigung per Exosmose. Dies führt zu einer progressiven Dehydrierung der Zelle und verhindert die intrazelluläre Eisbildung. Bei schneller Temperatursenkung ist die Zelle hingegen unfähig, das Wasser zeitig genug zu verlieren, um den Potentialausgleich zu bewahren und es kommt so im Zellinneren zur zunehmenden Unterkühlung bis hin zur intrazellulären Eisbildung (MAZUR 1963).
Die intrazelluläre Eiskristallbildung ist als Letalfaktor bei der Zellgefrierung einzustufen. Bei hohen Gefriergeschwindigkeiten kommt es zur Bildung kleinster intrazellulärer Eiskristalle, die thermodynamisch sehr instabil sind und einen niedrigeren Schmelzpunkt als größere Eiskristalle besitzen. Bei Temperaturerhöhung (Auftauen) neigen die kleinen Kristalle zur Aggregation und zur Bildung größerer Kristalle. Dieses Phänomen der sogenannten
„Rekristallisation“ tritt insbesondere bei langsamen Auftauraten von zuvor mit schneller Temperaturabsenkung gefrorenen Gefriergutes in Erscheinung und verursacht massive Zellschäden (MAZUR 1984).
Die optimale Auftaurate hängt von der eingesetzten Gefrierrate ab und erlaubt, die Schäden, die durch Rekristallisation oder durch Salz- und Wassermembrantransporte eintreten können, zu minimieren (HAMMERSTEDT et al. 1990). Im Allgemeinen sollte bei schneller Gefrierrate auch die Auftaurate schnell sein oder aber langsam, wenn eine langsame Einfrierrate gewählt wurde.
Der Spermienschwanz erfährt ebenfalls Schäden durch physikalische Störungen, die durch Eiskristalle verursacht werden. So können Verluste mitochondrialer Enzyme und eine Verzerrung des axialen Filamentkomplexes hervorgerufen werden (PONTBRIAND et al.
1989).
Mit der Eisbildung im extrazellulären Raum wird eine Konzentration von Substraten in den nicht gefrorenen extrazellulären Kompartimenten hervorgerufen. Zum osmotischen Ausgleich tritt Wasser aus den Zellen aus, wodurch die intrazelluläre Solutenkonzentration ansteigt. Bei langsamen Gefrierraten führt das in Verbund mit einer pH-Wertsenkung bis zur Sättigung und Präzipitation der Salze (MAZUR 1970). Diese Vorgänge wurden schon 1953 von LOVELOCK als sogenannte „Lösungseffekte“ bei Humanerythrozyten beschrieben.
Die durch Lösungseffekte verursachten Schädigungsmechanismen sind in ihrer Qualität nicht eindeutig beschrieben. Nach LOVELOCK (1953) werden die Lipide der Membran durch hohe Elektrolytkonzentrationen modifiziert, was eine Veränderung der Permeabilität zur Folge haben soll. Durch die undichte Membran dringen Substanzen in die Zelle, die beim
Auftauprozeß einen osmotischen Schock verursachen. Nach MERYMAN (1970) resultieren die Schäden aus der Unfähigkeit der Zellen, ab einem bestimmten Volumen, das 55 % des normalen isotonen Zellvolumens entspricht, weiter zu schrumpfen. Da kein Wasser mehr aus den Zellen austreten kann, kommt es zu einer zunehmenden osmotischen Druckdifferenz, die wiederum Schäden an der Membran verursacht.
FISER und FAIRFULL (1986) erzielten bei schnellen Einfrierraten in Abwesenheit von Glyzerin bessere Auftauresultate. Die Autoren schlossen daraus, daß bei langsamen Gefrierraten Spermienschädigungen hauptsächlich durch Lösungseffekte verursacht werden.
Andererseits bemerkten HOLT und NORTH (1994), daß die Intaktheit der Membran primär nicht unter hypertoner Belastung während des Gefrierprozesses verloren geht, sondern erst anschließend bei restaurativen Prozessen zur Erreichung der Isotonie während des Auftauprozesses.
Bei langsamen Gefrierraten verbleiben die Zellen in ungefrorenen Bereichen, welche sich zwischen den extrazellulären Eiskristallen bilden, in Suspension. Die Eiskristalle werden, indem den ungefrorenen Bereichen Wasser entzogen wird, zunehmend größer. Das führt zu einer progressiven Steigerung der Salzkonzentration und somit des osmotischen Druckes in dieser nicht gefrorenen Wasserfraktion, was wiederum eine sukzessive Zellschrumpfung bewirkt (MAZUR u. COLE 1989). Diese ungefrorenen interzellulären Bereiche haben für das Überleben der Zellen entscheidende Bedeutung. Suboptimale Größe der nicht gefrorenen Wasserfraktion - was im Regelfall mit zu langsamen Einfrierraten assoziiert ist – führt zu Zelle-Eis und Zelle-Zelle Interaktionen. Verursacht durch physikalische Kräfte, wie Scherungen mit den Eiskristallen oder Zusammendrängung und Deformierung der Zellen bestimmen diese Interaktionen das Ausmaß der Zellschädigung.
Nach AMANN und PICKETT (1987) verursacht die Suspension in extrem hypertonen Lösungen weniger Schäden für die Zellen im Vergleich zu sehr langsamen Gefrierraten. Die Autoren schließen hieraus, daß das Überleben der Zellen hauptsächlich von der ungefrorenen extrazellulären Wasserfraktion abhängt. Die Überlebenschancen der Zellen sind relativ hoch, wenn bis zu15 % des extrazellulären Wassers ungefroren bleibt.
Die Größe der ungefrorenen extrazellulären Bereiche ist abhängig von der Temperatur und der initialen Salzkonzentration des Suspensionsmediums. Ist die Ausgangsosmolalität hoch, bleibt eine größere Wasserfraktion ungefroren.
Zusammenfassend ist die Überlebensrate der Samenzellen bei der Tiefgefrierung vorwiegend durch zwei entgegengesetzte Faktoren (Intrazelluläre Eisbildung, Lösungseffekte), deren
Auswirkungen mit der Abkühlrate korreliert sind, bedingt. Die Vorstellungen verschiedener Untersucher hinsichtlich der „Pathogenese“ der bei langsamen Gefrierraten einsetzenden Schäden sind hierbei unterschiedlich.
Für jeden Zelltyp besteht eine optimale Gefrierrate. Diese ist abhängig von der Wasserpermeabilität der Zellmembran, der Aktivationsenergie, der intrazellulären Ausgangsosmolalität und dem zellulären Oberflächen- Volumenverhältnis. Die optimale Abkühlrate kann bei Kenntnis dieser Faktoren mathematisch errechnet werden (LEIBO et al.
1978; FAHY 1981; MAZUR 1984).
Bei Hengstspermatozoen führte eine schnelle Kühlrate (25°C/Minute) zu besseren Auftauresultaten als eine Tiefgefriergeschwindigkeit von 5°C pro Minute (RÖBBELEN 1993). Im Allgemeinen werden Spermien mit relativ hohen Einfriergeschwindigkeiten, welche in der Größenordnung von 15 bis 60°C pro Minute liegen, tiefgefroren (COCHRAN et al. 1984; HÅÅRD u. HÅÅRD 1991; PALMER u. MAGISTRINI 1992; WÖCKENER et al.
1992). Mit diesen empirisch ermittelten Einfriergeschwindigkeiten ließen sich die besten Überlebensraten von Samenzellen nach Kryokonservierung erzielen.
2.2 Techniken der Gefrierkonservierung 2.2.1 Aufbereitung
2.2.1.1 Zentrifugation
Equine Ejakulate unterliegen starken intra- und interindividuellen Schwankungen hinsichtlich Volumen und Dichte (KLUG 1982; MAGISTRINI et al. 1987). Die Zentrifugation wird eingesetzt, um für die Kryokonservierung einheitliche Spermienkonzentrationen durch Reduktion des Seminalplasmaanteils zu erzielen (McLEOD u. McGEE 1950; MEYER 1951;
BADER 1968). In den Untersuchungen von McLEOD und McGEE (1950) wurde ein negativer Einfluß der Zentrifugation auf die Spermienmotilität beschrieben. MEYER (1951), BUELL (1963) und BADER (1968) bestätigten dieses disqualifizierende Ergebnis und berichteten von Schädigungen des Samens und erheblicher Beeinträchtigung der Motilität durch die Zentrifugationstechnik. HESS et al. (1968) zentrifugierten unverdünnten Samen für acht Minuten bei 2700 U / min. Nach Entfernung von 75 % des Seminalplasmas und anschließender Resuspension mit einem glyzerinhaltigen Verdünner kam es nur zu einer geringgradigen Motilitätsabnahme. BAUMGARTL (1980) wies einen signifikanten Anstieg akrosomal geschädigter Zellen durch das Zentrifugieren mit oder ohne Verdünnerzusatz nach;
OETJEN (1988) und HEFFE (1993) bestätigten dies mit ihren Untersuchungen. CHAVES VIEIRA (1980) stellte allerdings fest, daß sich die Akrosinaktivität von zentrifugierten und nicht zentrifugierten Spermatozoen nicht signifikant unterscheidet. Da das Akrosom relativ fest mit der inneren Akrosommembran verbunden zu sein scheint, nahm CHAVES VIEIRA an, daß eine Schädigung des Akrosoms nicht unbedingt den Verlust der enzymatischen Aktivität bedingt.
MARTIN und KLUG (1979) verglichen die Auftaumotilitäten von unverdünnt zentrifugiertem und verdünnt zentrifugiertem Pferdesamen. Eine hypertone Glucose-EDTA- Lösung wurde als Verdünner eingesetzt und eine Zentrifugationsdauer von fünf Minuten bei 1000 g gewählt. Die verdünnt zentrifugierten Ejakulatteile waren dem unverdünnt zentrifugierten Samen signifikant überlegen.
COCHRAN et al. (1984) setzten als Zentrifugationsverdünner ein Zitrat-EDTA-Medium ein.
Sie unterschichteten den auf 50 Millionen Samenzellen/ml verdünnten Samen mit 0,25 ml der hypertonen Glukose-EDTA-Lösung nach MARTIN und KLUG (1979) und setzten die Zentrifugationsstärke auf 400 g herab. Die Zentrifugationsdauer betrug fünfzehn Minuten.
Die Auftaumotilität der in dieser Weise behandelten Proben übertraf die mit Glukose-EDTA und höherer Kraft zentrifugierten Ejakulate.
VOLKMANN (1987) vereinfachte das Verfahren von COCHRAN et al. (1984), indem er auf die Unterschichtung der Spermien mit dem Glukose-EDTA-Medium verzichtete. Beim Vergleich beider Methoden wurden keine Unterschiede hinsichtlich der Vorwärtsmotilität nach dem Auftauen, wohl aber ein geringerer Anteil an geschädigten Kopfkappen bei Verwendung der Originalmethode festgestellt.
PADILLA und FOOTE (1991) verglichen den Einsatz zweier Verdünner bei zentrifugierten und nicht zentrifugierten gelagerten Spermaproben. Wurde der originale Magermilchverdünner (KENNEY et al. 1975) verwendet, waren die nicht zentrifugierten den zentrifugierten Samenproben zu jeder Zeit überlegen. Bei Einsatz eines modifizierten Magermilchverdünners mit einer höheren Natrium- Kaliumration im Verhältnis von 4:1 kamen sie zu umgekehrten Ergebnissen. Sie schlossen daraus, daß die Motilität der Samenzellen durch Interaktionen zwischen Seminalplasma und Elektrolytgehalt des Verdünners beeinflußt wird.
HEITLAND et al. (1996) stellten beim Vergleich von zehn verschiedenen Zentrifugationszeiten nur eine geringe Motilitätsdepression bei einer Zentrifugationsdauer von mehr als 20 Minuten fest; außerdem nahm mit steigender Zentrifugationsdauer die Anzahl der Spermien im Überstand ab.
PICKETT et al. (1975) wiesen nach, daß der Anteil des Seminalplasmas am Ejakulat sowohl positive als auch negative Effekte auf die Spermienmotilität ausüben kann. AHLEMEYER (1991) zeigte, daß sich mit einem verbleibenden Seminalplasmaanteil von 5 % in der Endverdünnung die besten Resultate bezüglich der Motilität nach dem Auftauen erzielen ließen. Sowohl ein höherer ( 10 % oder 15 %) als auch ein niedrigerer ( 2 %) Prozentsatz führten zu signifikant schlechteren Ergebnissen. Eine erneute Zentrifugation des Überstandes zeigte eine starke negative Wirkung auf Kopfkappenintegrität und Auftaumotilität.
AURICH et al. (1996) konnten durch Zugabe von Seminalplasma von Pferden mit hohen Auftaumotilitäten zu Spermien von Pferden mit niedrigen Auftaumotilitäten deren Auftauergebnisse hinsichtlich Motilität und Membranintegrität signifikant verbessern. Im umgekehrten Fall kam es zur Verschlechterung der Motilitäten und Membranintegritäten.
Wurde den Pferdespermien mit guten Auftauergebnissen ihr eigenes Seminalplasma wieder zugesetzt, verschlechterten sich ihre Auftauresultate ebenfalls.
Der Zusatz von Eigelb zum Verdünner ohne vorherige Entfernung des Seminalplasmas durch Zentrifugation, führte in Untersuchungen von BEDFORD et al. (1994a,b) zu einer Motilitätsdepression, die sie auf möglicherweise schädigende Wechselwirkungen zwischen Seminalplasma und Eidotter zurückführten.
Zusammenfassend ist das Ergebnis der Zentrifugation also abhängig von der Wahl des Zentrifugationsverdünners, der Dauer der Zentrifugation, der Zentrifugationsstärke, der Wahl des Resuspensionsmediums und der Retention von Seminalplasma nach dem Zentrifugieren.
2.2.1.2 Verdünnermedien
Nach VARNER et al. (1987) erhöhen Nährstoffe die Lebensfähigkeit der Spermatozoen während der Lagerung. 1987 veröffentlichten AMANN und PICKETT, daß es noch unmöglich sei, eine konkrete Aussage über die Kombination und Konzentration von Nährstoffen zu machen.
Die jeweilige Verdünnerzusammensetzung, das Verdünnungsverhältnis und der Zeitpunkt des Einsatzes sind essentiell wichtig für ein gutes Auftauprodukt. Daher wird seit Beginn der Konservierungspraxis von vielen Spezialisten nach der optimalen Verdünnerzusammensetzung gesucht.
Bei der Herstellung eines Tiefgefrierverdünners ist vor allem die Wahl eines geeigneten Kryoprotektivums, eines Zuckers und der richtigen Puffersubstanz besonders wichtig.
Als Zuckerzusatz bei Tiefgefrierverdünnern sind Glukose, Laktose und Fruktose zu erwähnen, deren Wirkung zum größten Teil auf osmotischen Eigenschaften beruht, aber auch von ihren Wechselwirkungen mit anderen Verdünnerbestandteilen abhängig ist (PAQUINON 1985).
Samenzellen bilden toxische Endprodukte des anaeroben Stoffwechsels (u. a. Milchsäure), welche akkumulieren und im spermienumgebenden Milieu eine pH- Wertsenkung verursachen. Neutralisierend und pH- stabilisierend wirkende Puffersubstanzen müssen daher zur Erhaltung der Spermienmotilität zugesetzt werden (AMANN u. PICKETT 1987).
Folgende Anforderungen werden an einen idealen Puffer (GATHER 1994) gestellt:
- pK zwischen 6 und 8 (vorzugsweise 7);
- maximale Wasserlöslichkeit;
- eingeschränkte Passierfähigkeit biologischer Membranen;
- minimaler Einfluß von Pufferkonzentration, Temperatur und Ionenzusammensetzung auf die Dissoziation des Puffers;
- bekannte Metallbindungseigenschaften;
- Stabilität und Widerstandsfähigkeit gegenüber enzymatischer und nicht- enzymatischer Einwirkung.
Obwohl der ideale pH- Wert für einen Hengstsamenverdünner bis heute nicht festgelegt ist, tolerieren Hengstspermatozoen eine weite pH- Wertspanne ohne Effekt auf die Fertilität (AMANN u. PICKETT 1987). In den meisten Verdünnern wird der pH- Wert durch puffernde Substanzen wie Zitronensäure (Pufferbereich um 8), Ethylendiamintetraessigsäure „EDTA“
(pH- Optimum 4-5) oder Natriumbikarbonat (pH- Optimum 6,8-7,2) eingestellt (PAQUINON 1985).
In ihrem neu entwickelten modifizierten Magermilchverdünner mit dem pH- Wert 7,2 (Pufferbereich 7-8) verwendeten PADILLA und FOOTE (1991) erfolgreich einen Zwitterionenpuffer namens HEPES (N-(2-Hydroxyläthylpiperazine-N-(2- Äthenäsylfunidacid)). Nach FERGUSON et al. (1980) erfüllt der HEPES- Puffer alle Anforderungen an eine ideale Puffersubstanz.
Ein schützender und motilitätssteigernder Einfluß der Milch auf Samenzellen wurde sehr früh erkannt, daher enthalten viele Verdünnermedien als Grundsubstanz Milch (EBERTUS 1960) oder Magermilch (HUGHES u. LOY 1970; KENNEY et al. 1975).
Abschließend muß bei der Betrachtung der Zusammensetzung von Tiefgefrierverdünnern auch Eidotter erwähnt werden, dessen protektive Wirkung nach lichtmikroskopischen Untersuchungen von AMANN und PICKET (1987) als Bildung eines Schutzwalles um die Plasmamembran beschrieben wird. Lichtmikroskopisch ist in der Tat eine Anheftung zahlreicher Eidotterpartikel an das Akrosom zu beobachten.
Viele periphere und integrierte Proteine enthalten negativ geladene Carbohydratseitenketten.
Diese halten einen gewissen Abstand zur Lipidschicht der Membran ein, so daß sich Proteine des umgebenden Milieus locker an sie binden können.
MARTIN und KLUG (1979) erreichten eine erhöhte Ausnutzung dieser eidottervermittelten membranprotektiven Wirkung bei Hengstspermien mit der Modifizierung eines Gefrierverdünners von NAGASE und GRAHAM (1964) durch Zusatz einer Emulgatorpaste auf der Basis von Tri-Ethanolamin-Lauryl-Sulfat. Diese Substanz bewirkt eine bessere Verteilung des Eidotters in der Verdünnerlösung und eine deutlich verbesserte Auftaumotilität.
In seiner Untersuchung über Widdersperma veröffentlichte WATSON (1981), daß sowohl durch Lipoproteinfraktionen des Eidotters als auch durch Lecithin ein Kälteschock bei einer Lagerung bei + 5°C verhindert werden kann.
Durch Zentrifugation entfernten CRISTANELLI et al. (1985) einige Komponenten des Eigelbes. In anschließenden Einfrierversuchen stellten sie eine verringerte Überlebensrate der Spermien fest. Eine visköse Lipidfraktion und das Sediment, welche nach ihrer Ansicht für das Überleben der Spermien essentielle Substanzen enthielten, wurden durch die Zentrifugation entfernt.
FOULKES (1977) fand im Gegensatz dazu heraus, daß die Low-density-Fraktionen des Eidotters in Kombination mit Zitrat und Glyzerin die Motilität von Bullensperma ebenso effektiv beeinflussen wie vollständiges Eidottermaterial.
Ohne Einfluß auf die Akrosomintegrität von Hengstspermien blieb der Ersatz einer bestimmten Menge des Eigelbes durch Soja und Lecithin (OETJEN 1988).
HEFFE (1993) verglich zwei Ei-Lecithin-Verdünner, einen Verdünner mit PMSF- Zusatz und einen Magermilchverdünner nach KENNEY et al. (1975) miteinander. Bei den Verdünnern mit Lecithinzusatz stellte sie wie auch SCHROP (1991) sowohl hinsichtlich der Motilität als auch der membranprotektiven Wirkung schlechtere Resultate fest, konnte dafür aber keine Erklärung finden.
RÖBBELEN (1993) ersetzte 75 % des Eidotteranteils des Merck-Laktose-Verdünners (MARTIN u. KLUG 1979) durch Magermilchverdünner (KENNEY et al. 1975). Sie erzielte damit jedoch signifikant schlechtere Auftauergebnisse.
Mehrere Substanzen, wie z. B. Äthylenglycol, Polyäthylenglycol und Propylenglycol durch NISHIKAWA et al. (1968), Betain durch KOSKINEN et al. (1989) sowie DMSO durch LOVELOCK und BISHOP (1959), wurden als Alternativen zum Glyzerin als Kryoprotektiva getestet. Bisher wurde jedoch kein befriedigender Ersatz für das Glyzerin gefunden.
Glyzerin steht daher unter den Kryoprotektiva an erster Stelle. Die Tiefgefrierung tierischer Zellen wurde erst durch den Einsatz von Glyzerin möglich. POLGE et al. (1949) entdeckten die protektive Wirkung, als es ihnen durch Zugabe von Glyzerin zu Geflügelsperma erstmalig gelang, tierische Samenzellen erfolgreich zu konservieren.
Über den kryoprotektiven Mechanismus des Glyzerins und ob ein intra- oder extrazellulärer Schutzmechanismus anzunehmen ist, besteht noch weitestgehend Unklarheit.
In dem Maße, in dem Glyzerin in die Zelle penetriert, wird in Abhängigkeit von der Temperatur der Anteil intrazellulär gefrorenen Eises und damit auch die Salzkonzentration im ungefrorenen Anteil der Zelle reduziert (MAZUR 1980).
BERNDTSON und FOOTE (1972) untersuchten, ob Glyzerin die Zellmembran vollständig penetrieren muß, um einen ausreichenden kryoprotektiven Schutz zu gewährleisten. Sie stellten dabei fest, daß bei Rinderspermatozoen allein eine sehr kurze Einwirkungszeit (z. B.
10 Sekunden) zu einer signifikant höheren Spermienmotilität führte. Sie führten durch diese Ergebnisse auch die größere Überlebensrate nach kurzen Anpassungszeiten auf einen extrazellulären Gefrierschutzmechanismus zurück. Samenzellen, die sofort nach der Zugabe von Glyzerin gefroren werden, sollten zuvor durch das Konzentrationsgefälle und den dadurch bedingten Wasseraustritt ausreichend dehydratisiert sein, was den Vorteil habe, daß intrazelluläre Eisbildung während des Gefrierprozesses und Rekristallisation beim Auftauen vermieden werde.
Die Gefahr intrazellulärer Eiskristallbildung erhöht sich, wenn die Anpassungszeit ausreicht, um das Glyzerin vollständig in die Zelle penetrieren zu lassen, da dann auch Wasser wieder in die Samenzelle diffundieren wird.
Auf die Erhaltung der Befruchtungsfähigkeit besitzt außer der Einwirkungsdauer, auch die Konzentration des Glyzerins sowie die Temperatur, bei welcher der glyzerinhaltige Verdünner zum Samen hinzugegeben wird, einen wesentlichen Einfluß (BERNDTSON u.
FOOTE 1972; WILMUT u. POLGE 1974; BAMBA u. CRAN 1988). In höheren
Konzentrationen (8-10 %) hat Glyzerin die unerwünschten Eigenschaften der Zelltoxizität (FAHY 1986) und einer gewissen Fertilitätsdepression (POLGE 1956). Der Samen der einzelnen Haustierarten reagiert dabei nicht identisch. Ebersamen reagiert beispielsweise empfindlicher als der Samen anderer Haustiere (VENGUST et al. 1989). ALMID et al. (1988) wiesen bei Schweinespermien unterschiedliche Glyzerinoptima in Bezug auf die Motilität (3 bzw. 4%), Akrosomintegrität (2 bzw. 3%) und Plasmamembranintegrität (4 bzw. 6%) nach.
PURSEL et al. (1978) und SCHEID et al. (1980) kamen ebenfalls zu dem Ergebnis, daß mit zunehmender Glyzerinkonzentration (von 0 bis 7%) die Motilität zunimmt, die Akrosomintegrität jedoch abnimmt. Bei Pferdespermien nimmt die Fertilität mit steigender Glyzerinkonzentration (von 2 bis 7%) signifikant ab (PACE u. SULLIVAN 1975). Die meisten Labors setzen laut SAMPER und MORRIS (1998) Tiefgefrierverdünnern eine Glyzerinkonzentration von 2,5 bis 5% zu. Eine maximal protektive Wirkung in Kombination mit minimal schädigenden Effekten für Hengstsamen wird mit einem Glyzerinzusatz von 2%
in der Endverdünnung erreicht (BURNS u. REASNER 1995). RÖBBELEN (1993) erzielte bei Hengsten bessere Qualitäten tiefgefrorener-aufgetauter Spermien, wenn der glyzerinhaltige Verdünner bei 30°C zugegeben wurde, als wenn der Zusatz bei 5°C erfolgte.
Von VIDAMENT et al. (1999) wurde die Einfrierprozedur modifiziert, indem den Pferdespermien glyzerinhaltiger Tiefgefrierverdünner bei einer Temperatur von 22°C anstatt 4°C zugesetzt wurde. Bessere Auftaumotilitäten und eine höhere Fertilität waren die Folge.
Deutlich weniger morphologische Schädigungen wiesen auch Spermien auf, die nach Abwarten einer Anpassungszeit an den glyzerinhaltigen Verdünner tiefgefroren wurden. Auf die Motilität hatte die Anpassungszeit jedoch keinen Einfluß (RÖBBELEN 1993).
Der Übergang vom flüssigen zum glasartigen Stadium der Plasmamembran führt zu Gefrierschäden, die sich in einer sogenannten „Sprödigkeit“ der Zelle darstellen. Durch Volumenänderungen während des Tiefgefriervorgangs können Mikrofissuren entstehen, die bis zur Ruptur der Plasmamembran führen können. Indem sich das Glyzerin in der Membran löst und so deren Plastizität erhält, wirkt es als eine Art Prävention gegen die Bildung dieser Mikrofissuren (ALVAREZ u. STOREY 1993).
Eine Beeinträchtigung der Permeabilitätsraten und der spezifischen sowie unspezifischen Ionenbewegungen durch die Membran, konnten BASHFORD et al. (1986) als Folge einer durch Glyzerin bedingten Schädigung der Membrandoppelschicht feststellen. Eine mögliche Schlußfolgerung, die aus diesen Untersuchungen gezogen werden kann, besteht nach
HAMMERSTEDT et al. (1990) darin, daß jeder Membrantyp auf Gefrierschutzmittel mit unterschiedlicher Ausprägung von Wasser- und Ionenbewegungen reagieren kann.
2.2.2 Kühlregime
Zur Verhinderung des Kälteschocks durch plötzliche Abkühlung der Samenzellen werden geringe Abkühlgeschwindigkeiten empfohlen. Da Pferdespermien in einem Temperaturbereich von 37°C bis 20°C relativ unempfindlich auf Abkühlung reagieren, kann in diesem Bereich eine schnelle Abkühlung erfolgen. Der kritische Temperaturbereich liegt zwischen 20°C und 5°C, wobei Pferdespermien zwischen 18°C bis 8°C besonders temperaturempfindlich sind (MORAN et al. 1992; DROBNIS et al. 1993). Kühlraten von 0,05-0,1°C/min innerhalb des temperatursensitiven Bereiches sind optimal (DOUGLAS- HAMILTON et al.1984; KAYSER et al. 1992). Bei Übergabe des während der Aufbereitung auf Raumtemperatur herabgekühlten Samens in den Kühlschrank werden initiale Kühlraten von 0,2°C/min erreicht. Geringere Kühlraten (0,07°C/min) können erreicht werden, indem das Samenaufbereitungsgefäß in ein Wasserbad mit Raumtemperatur verbracht wird und dieses Wasserbad in den Kühlschrank gestellt wird. Der Wasserstand im Wasserbad muß gleich oder höher sein als die Füllhöhe des Samens.
Unterhalb des temperatursensitiven Bereiches kann wiederum eine schnelle Abkühlung erfolgen (SQUIRES et al.1999).
2.2.3 Konfektionierungsform
Aus kryobiologischer Sicht sollte die gewählte Verpackungsform möglichst gleichmäßige Einfrier- und Auftauverläufe gewährleisten.
Außerdem soll die Verpackungsform eine einfache, eindeutige, nicht zu entfernende und den gesetzlichen Reglementierungen (Tierzuchtgesetz) genügende Identifizierung der individuellen Besamungsdosis ermöglichen. Des weiteren sind eine sterile und hygienisch einwandfreie Lagerung sowie die einfache Handhabung während der Verarbeitung und Besamung, wobei möglichst keine Angriffspunkte für eine Kontamination geboten werden sollten, zu berücksichtigen. Die optimale Konfektionierungsform sollte zudem möglichst die gesamte Besamungsdosis aufnehmen und eine sofortige Insemination ermöglichen, d. h. keine Auftaumedien oder andere zusätzliche Arbeiten erfordern.
Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurden die unterschiedlichsten Konfektionierungsformen eingesetzt.
Zunächst wurden Glasampullen mit einem Volumen zwischen 1 und 10 Millilitern verwendet, die bei -79°C tiefgefroren wurden. SZUMOWSKI (1954) sowie ILJINSKAJA (1956) erzielten auf diese Weise Auftaumotilitäten von 70-80 %, während die folgenden Arbeiten weniger zufrieden stellende Resultate lieferten (BARKER u. GANDIER 1957; ZMURIN 1961; BUELL 1963; POLGE u. MINOTAKIS 1964).
Die erste kleinvolumigere Verpackungsform stellte das von NAGASE und GRAHAM (1964) zur Tiefgefrierung von Bullensperma entwickelte Pelletverfahren dar. MERKT und KRAUSE (1966) setzten diese Methode zur Konservierung von Hengstsamen ein. Sie setzten dem Sperma unterschiedliche Anteile des originalen Lactose-Eidotter-Glycerin- Verdünners nach NAGASE und GRAHAM (1964) zu und froren den verdünnten Samen in 0,1 ml großen Pellets ein. Im Vergleich zum Nativsamen hatte sich die Vorwärtsmotilität der Ejakulate nach dem Auftauen lediglich um 10 % reduziert
In weiteren Untersuchungen wurden größere Pelletvolumina (0,2 bzw. 0,3 ml) eingesetzt (NAGASE et al. 1966 a, b; OSHIDA et al. 1967; BADER u. MAHLER 1968; HESS et al.
1968). Von HORSTEN (1975) sowie SALAMON (1973) konnten trotz erheblicher meßbarer Differenzen hinsichtlich der Einfriergeschwindigkeit keine Abhängigkeit zwischen der Größe der Samenportion (0,1; 0,3; 0,5; 1,0 ml) und der Auftaumotilität des Samens nachweisen.
Dem Vorteil, bei einfacher Handhabung eine schnelle Einfrierrate zu erreichen, stehen bei der Pelletmethode gravierende Nachteile gegenüber, welche in der Schwierigkeit der Kennzeichnung und sicheren Identifizierung sowie den Möglichkeiten der Kontamination während der Verarbeitung und Lagerung bestehen.
Erste Versuche zur Tiefgefrierung in 1,0 ml fassenden Kunststoffpailetten führten NISHIKAWA et al. (1968) durch. Sie verwendeten ein Eidotter-Glukose-Medium mit 4-5 % Glyzerin als Verdünner.
PACE und SULLIVAN (1975) ermittelten eine signifikante Interaktion zwischen Konfektionierungsform und Verdünner.
MARTIN und KLUG (1979) entwickelten das Makrotüb®-Verfahren. Sie modifizierten die bei Schweinesperma benutzten großvolumigen Kunststoffröhrchen (WESTENDORF et al.
1975) für die Tiefgefrierung von Pferdesamen. Diese als Makrotüb® bezeichnete
Verpackungsform mit beidseitigem Stahlkugelverschluß wurde mit 4 ml verdünntem (Laktose-Eidotter-Glyzerin-Medium) Samen beschickt. Der im Makrotüb®-Verfahren kryokonservierte Samen wies im Vergleich zum pelletierten Samen eine um 10 % verbesserte Auftaumotilität auf (MARTIN et al. 1979) und führte zu einer geringeren Reduzierung der Akrosinaktivität (CHAVES VIEIRA 1980). Auch hinsichtlich praktischer und hygienischer Gesichtspunkte überzeugt das Makrotüb®-Verfahren gegenüber dem Pelletverfahren, da die gesamte Besamungsdosis in einer Konfektionierungsform untergebracht werden kann und somit das Auftauen und die Insemination wesentlich vereinfacht werden. Im Gegensatz zum Pellet kann jede Inseminationsportion individuell identifiziert werden und ist hygienisch verschlossen.
Eine weitere Verpackungsform wurde von TISCHNER (1979) sowie MÜLLER (1982) beschrieben. Dabei handelte es sich um abgeflachte Aluminiumtuben mit einem Füllvolumen von 15 Millilitern, die in den osteuropäischen Ländern eingesetzt wurden.
Da die Forderung nach gleichmäßigen Einfrier- und Auftauverläufen bei Einsatz eines geringeren Verpackungsvolumens (SIMMANK 1981) und einer dünneren Schichtdicke des umgebenden Materials eher gewährleistet wird, wurden von verschiedenen Gruppen Untersuchungen mit kleinervolumigen Kunststoffröhrchen durchgeführt.
LOOMIS et al. (1983) bereiteten den Samen in Anlehnung an das Verfahren von MARTIN und KLUG (1979) auf. Sie erhöhten allerdings die Spermienkonzentration von 100 Millionen auf 500 Millionen vorwärtsbewegliche Samenzellen pro Milliliter und froren den Samen in 0,5 Milliliter fassenden Kunststoffröhrchen ein. Die durchschnittliche Auftaumotilität betrug jedoch nur 22 %.
COCHRAN et al. (1983) verpackten den ebenso aufbereiteten Samen in 1,0 Milliliter fassenden Plastikröhrchen, welche den gleichen Durchmesser, aber die doppelte Länge hatten wie die 0,5-ml-Pailletten.
PALMER (1984) benutzte wie LOOMIS et al. (1983) die 0,5-ml-Pailletten. Der Samen wurde jedoch vor der Tiefgefrierung in neuartiger Weise bearbeitet. Als Zentrifugationsverdünner wurde ein aus Magermilch und Zuckern bestehendes Medium (INRA 82) eingesetzt. Der Samen wurde auf 4°C abgekühlt, erst dann zentrifugiert und anschließend auf eine Endkonzentration von 100 Millionen Spermien pro Milliliter verdünnt (INRA + 2 % Eidotter + 2 % Glyzerin). PALMER vertrat die Meinung, daß sich eine höhere Konzentrierung der Spermien nachteilig auf die Samenqualität auswirke.
COCHRAN et al. (1984), CRISTANELLI et al. (1984) sowie VOLKMANN (1987) setzten ebenfalls 0,5-ml-Pailletten ein.
Um eine größere Menge Gefriergut in einer Verpackungseinheit unterzubringen und gleichzeitig einen gleichmäßigeren Temperaturverlauf zwischen dem zentralen und dem peripheren Bereich des Gefriergutes erzielen zu können, modifizierte LEPS (1988) den Makrotüb®, indem er ihn zu einem flacheren Format zusammenpresste. Gegenüber den Proben aus dem Makrotüb® zeigte der im Flachbehältnis eingefrorene Ebersamen eine signifikante Verbesserung der Motilität und des akrosomalen Status.
KNEIßL (1993) erzielte beim Vergleich verschieden konfektionierter Samenproben mit 0,5- ml-Pailletten die besten Resultate.
Weltweit wird Hengstsperma mittlerweile vorwiegend in 0,5-ml-Pailetten eingefroren.
2.2.4 Gefrierregime Tiefgefrierung über Stickstoffdampf
Die Pailletten werden bei der Tiefgefrierung in der Styroporbox nach MARTIN und KLUG (1979) eine bestimmte Zeit lang auf einem Metallrost horizontal über einem flüssigen Stickstoffspiegel in einer abgedichteten Styroporbox gelagert. Danach wird das Gefriergut in den flüssigen Stickstoff getaucht.
Durch die Änderung der Distanz der Pailletten zum Stickstoffspiegel und durch die Lagerungszeit, kann die Kühlrate variiert werden. Je größer der Abstand zwischen dem Kühlgut und dem Stickstoffspiegel ist, desto niedriger sind die Kühlrate und die Endtemperatur. Bei einem Abstand von 5 cm wird das Kühlgut mit einer Geschwindigkeit von 60°C/min (HEITLAND et al. 1996) eingefroren.
Tiefgefrierautomat
Während in der Rinderzucht das computergesteuerte Einfrieren inzwischen die ungesteuerten Verfahren vollständig verdrängt hat, wurden bei der Tiefgefrierung von Pferdespermien Mitte der 80er Jahre (COCHRAN et al. 1984; CRISTANELLI et al. 1985; DELIUS 1985) erste vergleichende Untersuchungen durchgeführt.
Das Gefriergut wird horizontal auf Metallrosten gelagert, die in dem Tiefgefrierautomaten übereinander gestapelt werden. Entsprechend der in der Gefrierkammer gemessenen
Temperatur wird der flüssige Stickstoff aus einem Druckbehälter in die Gefrierkammer geleitet. Der zerstäubte Stickstoff wird über einen Turbinenventilator gleichmäßig in der Gefrierkammer verteilt. Die Kristallisation läuft spontan in Form eines Massenseedings ab.
Nach Erreichen der Endtemperatur wird das Gefriergut in flüssigem Stickstoff gelagert.
Direktionale Gefrierung
Die direktionale Gefrierung („directional soldification“) ist eine neue Technik, die auf dem Prinzip einer Kühlung biologischen Materials mit kontrollierter, vorher einstellbarer Geschwindigkeit beruht. Sie wurde 1985 von RUBINSKY und IKEDA entwickelt, die die ersten Versuche mit Erythrozyten in 0,9 %-iger Kochsalzlösung durchführten. RUBINSKY et al. (1991) froren experimentell Oozyten von Schweinen mit der direktionalen Gefrierung ein.
Wesentliche Unterschiede der direktionalen Gefriermethode im Vergleich zur etablierten Tiefgefrierung im Tiefgefrierautomaten sind die deutlich höheren Einfriergeschwindigkeiten und die Art der Gefrierung. Während das Gefriergut bei der Tiefgefrierung in einem Tiefgefrierautomaten in Form eines Massenseedings ungesteuert und inhomogen tiefgefroren wird, erfolgt bei der direktionalen Gefrierung eine gesteuerte, partiell fortschreitende Gefrierung. Die Einfrierapparatur (Harmony CryoCare - Multi Thermal Gradient 516®, MTG 516®, Fa. IMT, International Ltd, Chester, GB) besteht aus zwei Blöcken, die durch einen Spalt getrennt sind und in die Aussparungen zur Aufnahme der Gefrierröhrchen eingeschliffen sind. Die Röhrchen werden in eine Kammer (Block A, +5°C) eingelegt. Die Auslösung des initialen Seedings erfolgt, wenn die Röhrchenspitze in den zweiten Block (- 50°C) vorgetrieben wird. Danach folgen der weitere Vortrieb und die direktionale Gefrierung mit konstanter Geschwindigkeit. Dem zweiten Kupferblock schließt sich eine mit Stickstoffdampf befüllte Kammer (-100°C) an, aus der die Röhrchen entnommen und manuell in flüssigen Stickstoff überführt werden müssen.
Diese Form der Gefrierung wird aktuell in Kombination mit speziellen Glasröhrchen, sogenannten Hollow Tubes®, angeboten, welche aus einem zylindrischen Glasröhrchen mit zentraler Aushöhlung und einem Fassungsvermögen von ca. 10 ml bestehen. Aus der Kombination der Konfektionierungsform („Large volume freezing“) und der patentierten Gefriermethode sollen verbesserte Auftauresultate möglich werden (ARAV et al. 2002;
RUBEI et al. 2004).
KLUS (2001) verglich die Tiefgefrierung von in Pailletten verpacktem Hengstsperma im konventionellen Tiefgefrierautomaten mit der direktionalen Gefrierung in einem Prototyp der
Fa. I.M.T. (Rehovot, Israel). Mit den in ihren Versuchen durchgeführten Einfriergeschwindigkeiten erwies sich die Gefriertechnologie der direktionalen Gefrierung als nicht geeignet für die Tiefgefrierung von Hengstspermatozoen und zeigte deutlich niedrigere Auftauqualitäten als die Samenproben, die mit dem Vergleichsverfahren in einem Tiefgefrierautomaten eingefroren wurden.
2.2.5 Auftauregime Die Auftaugeschwindigkeit muß an die Gefriergeschwindigkeit angepaßt sein (MAZUR 1980). Die Wassertemperatur, die Dauer der Wärmeexposition, die Wasserbewegung, die Größe, Form und der Abstand des Gefriergutes von der Verpackungswand sowie das Material der Verpackung beeinflussen den Auftauverlauf.
Für das Auftauen von Pellets war ein spezielles Auftaumedium erforderlich (NAGASE u.
GRAHAM 1964; KRAUSE u. GROVE 1967; u.a.).
Beim Auftauen des Makrotüb® wird eine Auftauzeit von 40 Sekunden bei 50°C empfohlen (MARTIN u. KLUG 1979; MARTIN et al. 1979; CHAVES VIEIRA 1980).
Zum Auftauen von tiefgefrorenem Hengstsamen in Normalpailletten (0,5 ml) wird für die Besamungspraxis eine Temperatur von 37 °C für die Dauer von 30 Sekunden empfohlen (COCHRAN et al. 1984; PALMER u. MAGISTRINI 1992; WÖCKENER et al. 1992).
LOOMIS et al. (1983) bevorzugte eine Temperatur von 38°C für 30 Sekunden.
COCHRAN et al. (1984) verglichen die Auftauresultate bei 0,5-ml fassenden Pailletten, die bei 75°C in 7 Sekunden bzw. bei 37°C in 30 Sekunden aufgetaut wurden. Das Auftauverfahren bei höherer Temperatur war hinsichtlich der Anzahl motiler Spermien überlegen. Die Autoren betonten jedoch dabei, daß bei dem schnellen Auftauen die Zeit exakt eingehalten werden müsse. Schon ein 2 Sekunden längeres Verbleiben im Wasserbad mit 75°C könne zu einem Anstieg der Samentemperatur über 40°C und damit zu starken Zellschädigungen führen. Auch das Auftauen bei 75°C für 7 Sekunden mit anschliessender Inkubation für 10 – 30 Sekunden bei 35 °C wird beschrieben (HÅÅRD u. HÅÅRD 1991).
2.3 Erfolgsbestimmende Faktoren bei Einsatz kryokonservierten Hengstspermas
2.3.1 Beeinflussung des Anteils überlebender Spermien nach Kryokonservierung
Die Kryokonservierung beinhaltet eine Reihe potentiell samenzellschädigender Faktoren. Die Schäden an den Spermien werden dabei durch die Temperaturveränderungen, die osmotischen und toxischen Effekte des Kryoprotektivums und die Bildung von Eiskristallen bedingt.
Um die als Kälteschock bezeichneten Veränderungen zu minimieren, müssen Hengstspermatozoen im temperatursensitiven Bereich (18 bis 8°C) mit niedrigen Kühlraten abgekühlt werden. Aber auch bei niedrigen Kühlraten kommt es zu dem in Kapitel 2.1.1 beschriebenen Phasenwechsel der Lipide vom flüssigen zum festen Zustand und zu den Änderungen des funktionellen Status der Membranen. Die Aggregation integraler Membranproteine in den verbleibenden flüssigen Bereichen der Membran führen zu einer erhöhten Membranpermeabilität nach der Kühlung (ROBERTSON u. WATSON 1986;
ROBERTSON et al. 1988). Durch die Abkühlung wird auch die Kalziumregulation der Zelle beeinflußt, was zweifelsohne Konsequenzen für die Zellfunktion hat (BAILEY u. BUHR 1994); in einigen Fällen können diese Veränderungen unvereinbar mit dem Überleben der Zelle sein.
Die Kalziumaufnahme während der Kühlung ruft kapazitative Veränderungen sowie die Fusion der Plasmamembran mit der darunterliegenden äußeren Akrosommembran hervor.
Zwischen diesen Membranschädigungen während der Kühlung und der Akrosomreaktion besteht eine deutliche Ähnlichkeit, wobei die bei der Kühlung auftretenden Vorgänge, im Gegensatz zur „echten Akrosomreaktion“, als rein degenerative Veränderungen aufzufassen sind (BEDFORD 1970).
Auch die zytoskeletalen Elemente sind temperatursensitiv. Die Kühlung von Zellen führt zu einer verfrühten Depolymerisation von Aktinfilamenten (HALL et al. 1993; SAUNDERS u.
PARKS 1999). SPUNGIN et al. (1995) sind der Auffassung, daß die Depolymerisation von zytoskeletalem F-Aktin ein notwendiger Schritt ist, der die Annäherung der Plasmamembran an die darunterliegende äußere Akrosommembran erlaubt und somit die akrosomale Exozytose fördert. Diese Vorgänge sind möglicherweise an der akrosomreaktionsähnlichen Verschmelzung der Membranen während der Kühlung und Tiefgefrierung von Spermien beteiligt.
In Abhängigkeit von der Permeabilität der Plasmamembran für das Kryoprotektivum wird durch die Zugabe des Gefrierschutzmittels ein deutlicher aber vorübergehender osmotischer
Streß für die Samenzellen verursacht (GAO et al. 1993). GAO et al. zeigten 1995 an humanen Spermien, daß die Zugabe von 1 M Glyzerin in einem Schritt zu extremen Volumenschwankungen der Samenzellen führt. Sie konnten darstellen, daß der osmotische Streß durch eine schrittweise Zugabe des Glyzerins auf ein tolerierbares Maß reduziert werden kann, was zu einer wesentlichen Steigerung des Anteils lebender Spermien führte.
Die Bildung von Eiskristallen und die Osmolalität der umgebenden ungefrorenen Lösung sind temperaturabhängig. Wie in Kapitel 2.1.2 beschrieben nimmt mit sinkender Temperatur die Größe der ungefrorenen Bereiche ab und die Osmolalität der verbleibenden ungefroreren Lösung steigt. Als kritischer Temperaturbereich während des Tiefgefriervorganges wird der Bereich bezeichnet, bei dem die Spermien die meisten letalen Schädigungen erleiden und ist nach MAZUR (1980) im mittleren Temperaturbereich von -10 bis -50°C anzutreffen. Der Temperaturbereich in dem die meisten Spermienschädigungen auftreten entspricht dem Bereich, in dem die Eiskristallbildung abläuft (NIWA u. TAGUCHI 1981). Zur Minimierung der Schäden sollte dieser Temperaturbereich möglichst schnell durchlaufen werden. Bei hohen Kühlraten kommt es jedoch zur intrazellulären Eisbildung, welche letal ist. Bei niedrigen Kühlraten ist zwar die Wahrscheinlichkeit intrazellulärer Eisbildung gering, es können aber massive Zellschädigungen durch die Lösungseffekte auftreten. Eine optimale Kühlrate, bei der sowohl Schäden durch intrazelluläre Eisbildung als auch durch Lösungseffekte gering bleiben, ist daher bedeutend für die Überlebensrate der Spermien (MAZUR 1980; SAAKE 1982). Die Spermien müssen den kritischen Temperaturbereich beim Auftauen zum zweiten Mal durchlaufen (MAZUR 1985; HOLT u. NORTH 1994).
Langsam eingefrorene Zellen sollen auch langsam aufgetaut werden; ebenso wie eine schnell gewählte Kühlrate ein schnelles Auftauen bedingt (WEITZE 1977), um die Schädigungen durch mögliche Rekristallisation zu minimieren (MAZUR 1980; HAMMERSTEDT et al.
1990).
2.3.2 Funktioneller Status überlebender Spermien nach Kryokonservierung
Kryokonservierte Spermatozoen weisen eine deutlich reduzierte Motilität auf. Nur wenige Spermien zeigen eine deutliche Vorwärtsbeweglichkeit, während die Mehrzahl der Samenzellen eine in unterschiedlichem Grade verminderte Bewegungsaktivität aufweist. In einer Studie an kryokonservierten Humanspermatozoen unter den Bedingungen der In-Vitro- Fertilisation konnten KELLY et al. (1997) zeigen, daß die Motilität und Vorwärtsbeweglichkeit wichtige Faktoren für die Befruchtungspotenz sind.
Durch die Tiefgefrierung werden reaktive Sauerstoffverbindungen gebildet, welche schädigende Wirkungen besitzen und die Befruchtungsfähigkeit herabsetzen (ALVAREZ u.
STOREY 1992; BELL et al. 1993; O´FLAHERTY et al. 1997). Die meisten Arbeiten zur Lipidperoxidation während der Kryokonservierung basieren auf Untersuchungen an Humanspermatozoen.
ELLINGTON et al. (1999) untersuchten, inwiefern die überlebenden Spermien in ihrer Fähigkeit zur Interaktion mit dem Eileiterepithel beeinträchtigt werden. Es wird davon ausgegangen, daß es sich dabei um Rezeptor-Ligand-Interaktionen handelt, die mit intrazellulären Signalübertragungsmechanismen einhergehen. Eine ähnliche Interaktion wird auch zwischen Spermatozoen und Eizellen angenommen (BWANGA et al. 1991;
OEHNINGER et al. 1993). Die durch die Membranveränderungen während der Kühlung bedingte Aggregation und Beeinflussung der Membranproteine ist nicht vollständig reversibel, was möglicherweise auch für die Rezeptor-Ligand-Interaktion von Bedeutung ist.
Nach der Tiefgefrierung ist außerdem die Membranpermeabilität erhöht (ROBERTSEN u.
WATSON 1986; ROBERTSEN et al.1988).
2.3.3 Befruchtungspotenz kryokonservierter Hengstspermien
Mit der Kryokonservierung von Samenzellen geht im allgemeinen eine verminderte Fertilität im Vergleich zum Frischsamen einher (JASKO et al. 1992; VIDAMENT et al. 1999).
Grundsätzlich sind zur Samengefrierkonservierung nicht alle Hengste geeignet. Die Gründe hierfür sind vielschichtig, jedoch mag hier auch die im Vergleich zu anderen landwirtschaftlichen Nutztieren mangelhafte Selektion von Zuchthengsten hinsichtlich fertilitätsrelevanter Parameter eine Rolle spielen. Die Fertilitätseinbußen nach der Samentiefgefrierung werden durch die verminderte Anzahl lebender Samenzellen und die Beeinträchtigung der Zellfunktionen infolge der Kryokonservierung hervorgerufen.
2.3.3.1 Einflußfaktoren auf das Fertilitätsergebnis bei Einsatz kryokonservierten Hengstspermas
Der optimale Zeitraum für die Herstellung von Pferdetiefgefriersperma wird nach wie vor kontrovers diskutiert, einige Autoren ermittelten keine nennenswerten saisonalen Effekte auf die Tiefgefrierspermaqualität (BLOTTNER et al. 2001), während andere bessere Auftauresultate in den Wintermonaten (MAGISTRINI et al. 1987) bzw. im Herbst
(September-November) (JANETT et al. 2003) erzielten. Aus organisatorischen Gründen wird überwiegend Tiefgefriersperma außerhalb der Zuchtsaison hergestellt, da die Hengste während der Zuchtsaison im Frischsameneinsatz stehen oder im Natursprung eingesetzt werden.
Die Samenqualität wird auch durch das Alter des Hengstes beeinflußt. Die höchste Samenzellproduktion verbunden mit der besten Samenqualität wird bei Hengsten im Alter zwischen 5 und 12 Jahren gefunden. Bei älteren Hengsten ist die Spermaqualität bezüglich der Samenzellkonzentration, der Vorwärtsbeweglichkeit und der Morphologie reduziert. Die Motilität der Spermien nach dem Auftauen und die Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen nach dem Auftauen sind bei alten Hengsten oft vermindert. Auch jüngere Hengste (2- oder 3- jährig) weisen häufig eine suboptimale Samenqualität auf (VIDAMENT et al. 1997;
SQUIRES et al. 1999).
Den größten Einfluß auf das Fertilitätsergebnis bei Einsatz kryokonservierten Pferdespermas bestimmen intra- und interindividuelle Unterschiede der Hengste (AMANN u. PICKETT 1987). Zwischen den einzelnen Hengsten bestehen große Unterschiede hinsichtlich der Trächtigkeitsraten nach Einsatz von Tiefgefriersperma (SAMPER et al.1991; SAMPER 1995;
VIDAMENT et al. 1997).
Der Einfluß der Spermienkonzentration auf das Fertilitätsergebnis ist für Tiefgefriersperma des Hengstes bisher nicht eindeutig geklärt. HEITLAND et al. (1996) untersuchten den Einfluß unterschiedlicher Spermienkonzentrationen auf die Auftaumotilität und stellten fest, daß bei einer höheren Verdünnung des Spermas (100 x 106/ml) die Auftauqualität tendentiell besser ist. LEIPOLD et al. (1998) erzielten jedoch tendentiell bessere Trächtigkeitsresultate, wenn Tiefgefriersperma zum Einsatz kam, welches hochkonzentriert (1600 x 106/ml gegenüber 400 x 106/ml) eingefroren wurde.
Der Eileiteristhmus dient als Spermienreservoir für potentiell befruchtungsfähige Samenzellen (HUNTER u. NICHOL 1983; HUNTER 1984), wobei nur ein Bruchteil der Spermien, die in den unteren Bereich des weiblichen Genitaltraktes verbracht werden, dieses Samenreservoir im Eileiter erreichen. Der größte Teil der Samenzellen geht über die Vulva oder durch Phagozytose im Genitaltrakt verloren (KATILA et al. 2000). Die Zahl und die qualitativen Eigenschaften der Spermatozoen im Eileiteristhmus werden bedingt durch die Anzahl sowie die Qualität der in den unteren Genitaltrakt verbrachten Spermien. SCOTT et al. (2000) zeigten, daß der Prozeß des Spermientransportes durch den Uterus der Stute als selektiver Gradient funktioniert, der zu einem großen Verlust von Samenzellen führt, wobei der Anteil morphologisch veränderter Spermien reduziert wird. Wenn die Anzahl oder
Qualität der Samenzellen im Inseminat reduziert ist, sinkt die Fertilität in Form einer exponentiellen Kurve. Es wird daher angestrebt, ein Inseminat zu verwenden, mit dem Fertilitäten im Bereich der Asymptote der Kurve erreichbar sind. Die Steigung und die Asymptote der Kurve variieren dabei in Abhängigkeit vom Hengst und können durch die Vorgänge bei der Samentiefgefrierung beeinflußt werden (AMANN u. HAMMERSTEDT 1993).
Die Glyzerinkonzentration ist ein wichtiger Faktor, der die Motilität und die Fertilität der Spermien beeinflußt. Die optimale Glyzerinkonzentration hinsichtlich der Motilität von Pferdespermien nach dem Auftauen kann in Abhängigkeit der Verdünnerzusammensetzung variieren (ECOT et al. 2000). Nach den Untersuchungen von ECOT et al. (2000) und VIDAMENT et al. (2002) scheint die optimale Glyzerinkonzentration bezüglich der Motilität bei mit INRA 82-Verdünner tiefgefrorenen Pferdespermien zwischen 2,5 und 3,5% zu liegen.
Der fertilitätsmindernde Effekt von Glyzerin konnte in verschiedenen Untersuchungen mit Frischsamen, dem Glyzerin zugesetzt wurde, gezeigt werden (PACE u. SULLIVAN 1975;
DEMICK et al. 1976; LOOMIS et al. 1983; BEDFORD et al. 1994b). PACE und SULLIVAN (1975) erzielten mit Tiefgefriersperma deutlich niedrigere Befruchtungsergebnisse, wenn das Hengstsperma mit 7% Glyzerin eingefroren wurde, als bei einem Glyzerinzusatz von 2%.
VIDAMENT et al. (2002) erzielten bei mit INRA 82-Verdünner und 2 bzw. 3% Glyzerin tiefgefrorenem Pferdesperma ähnlich hohe saisonale Befruchtungsergebnisse pro Rosse (46 bzw. 58%). Bei Tiefgefriersperma von Eselhengsten ist schon bei deutlich niedrigeren Glyzerinkonzentrationen mit Fertilitätseinbußen zu rechnen.
Auch durch die Wahl des Tiefgefrierverdünners kann das Fertilitätsergebnis beeinflußt werden. HEITLAND et al. (1996) fanden höhere Motilitäten nach dem Auftauen von in INRA 82-Verdünner (mit 4% Eigelb und 4% Glyzerin) tiefgefrorenen Pferdespermien als bei in Laktose-EDTA-Verdünner (nach MARTIN et al. 1979) eingefrorenen Spermien. ECOT et al.
(2000) erzielten bei mit KENNEY-Verdünner (4% Eigelb und 3,5% Glyzerin), der wie von BURNS (1992) beschrieben zubereitet wurde, tiefgefrorenen Spermien höhere Auftaumotilitäten als bei in INRA 82-Verdünner (2,5% Glyzerin) kryokonservierten Pferdespermien. Die mit KENNEY-Verdünner eingefrorenen Proben wiesen jedoch einen niedrigeren Prozentsatz akrosomintakter Spermien auf und auch die Trächtigkeitsrate pro Rosse war im Vergleich zu den mit INRA 82-Verdünner eingefrorenen Proben deutlich reduziert (ECOT et al. 2001).
Eine minimale Spermienzahl über 200 x 106 vorwärtsbeweglichen Samenzellen im Inseminat wird allgemein als notwendig erachtet, um befriedigende Trächtigkeitsraten mit
kryokonservierten Pferdespermien und konventionellen Besamungstechniken zu erzielen (VIDAMENT et al. 1997; PICKETT et al. 2000). Es konnte gezeigt werden, daß konventionelle Inseminationen bei Stuten mit weniger als 100 x 106 Spermien zu unbefriedigenden Trächtigkeitsresultaten führen (PACE u. SULLIVAN 1975; VOSS et al.
1979). Durch die Platzierung des Inseminates höher im weiblichen Genitaltrakt werden weniger Spermien benötigt, um vergleichbare Befruchtungsergebnisse zu erzielen. Der Vorteil einer Platzierung des Samens näher zum Eileiter, wodurch die Strecke, welche die Samenzellen im Uterus zurücklegen müssen, verkürzt wird, konnte beim Schaf (LIGHTFOOT u. SALAMON 1970; MAXWELL et al. 1993) und beim Schwein (KRÜGER et al. 1999; MARTINEZ et al.2000) gezeigt werden. MAXWELL (1986) zeigte, daß 20 Millionen bewegliche kryokonservierte Schafspermatozoen genügen, um ein Befruchtungsergebnis von über 50 % zu erreichen, wohingegen bei zervikaler Insemination für ein vergleichbares Ergebnis die zehnfache Dosis notwendig ist. Wurde der Samen direkt in den Eileiter verbracht genügten weniger als 1 Million Samenzellen (MAXWELL et al.
1993). Auch beim Pferd wurden in den vergangenen Jahren verschiedene Methoden, wie die tiefe intrauterine Insemination unter transrektaler Kontrolle (BUCHANAN et al. 2000) oder die hysteroskopische Insemination (MORRIS et al. 2000) entwickelt, um die Samenzellen näher am Befruchtungsort zu platzieren. MORRIS et al. (2000) erzielten dabei nach hysteroskopischer Insemination von Frischsamen mit 10 x 106, 5 x 106 bzw. 1 x 106 motilen Spermien Trächtigkeitsraten von über 60%; bei 0,5 x 106 Spermien stellten sie jedoch deutlich niedrigere Trächtigkeitsraten (<30%) fest. Mit kryokonservierten Spermien erzielten MORRIS et al. (2003) sowohl nach hysteroskopischer als auch nach konventioneller Insemination mit 14 x 106 motilen Spermien Trächtigkeitsraten pro Rosse von über 60%. Bei einer Reduktion der Spermienzahl auf 3 x 106 bestand jedoch ein deutlicher Vorteil der hysteroskopischen Insemination (Platzierung des Inseminates an der uterotubalen Verbindung) gegenüber einer Platzierung des Inseminates im Uteruskörper. SIEME et al.
(2004) erzielten ähnliche saisonale Befruchtungsergebnisse pro Rosse bei einmaliger Besamung innerhalb von 6 Stunden vor der Ovulation mit 100 x 106 Spermien in den Uteruskörper (43%), bei tiefer intrauteriner Insemination unter transrektaler Kontrolle (45%) und bei hysteroskopischer Insemination (46%) oder mit 800 x 106 Spermien und Insemination in den Uteruskörper (43%).
Der Inseminationszeitpunkt hat ebenfalls einen Einfluß auf den Besamungserfolg. Die höchsten Trächtigkeitsraten bei Einsatz von Tiefgefriersperma werden erzielt, wenn die Insemination innerhalb eines Zeitraumes von 12 Stunden vor der Ovulation bis 6 Stunden
nach Ovulation erfolgt (PACE u. SULLIVAN 1975; ALIEV 1981; KLOPPE et al. 1988;
VIDAMENT et al. 1997; SIEME et al. 2003). Außerdem konnten PALMER und MAGISTRINI (1992) höhere Befruchtungsergebnisse pro Rosse verzeichnen, wenn Stuten zweimal anstatt nur einmal besamt wurden, wodurch die Wahrscheinlichkeit steigt, daß der optimale Besamungszeitraum getroffen wird (SIEME et al. 2003).