Eine erste toxikologische Einschätzung von (Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester
Abschlussarbeit
Postgradualstudium Toxikologie der Universität Leipzig
Dr. Carsten Gaebert München, im Oktober 2006
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 3
2 Substanzcharakteristik... 5
3 Herstellverfahren ... 6
4 Anwendungsfelder, Exposition ... 7
5 Toxikologische Studien... 9
5.1 GLP-Konformität... 9
5.2 Akute orale Toxizität ... 12
5.3 Akute dermale Toxizität ... 14
5.4 Akute Hautreizung ... 18
5.5 Akute Augenreizung ... 20
5.6 Sensibilisierungsstudie ... 25
5.7 Mutagenitätstests ... 31
5.7.1 Ames-Test ... 31
5.7.2 Chromosomenaberrationstest... 37
6 Toxikologische Beurteilung der Datenlage ... 43
7 Zusammenfassung ... 48
8 Abkürzungsverzeichnis... 50
9 Literaturverzeichnis... 51
1 Einleitung
In den Forschungslaboratorien der chemischen Industrie werden seit jeher Produkte entwickelt, die in der Zukunft den marktwirtschaftlichen Erfolg der Firmen sichern sollen. Um erfolgreich zu sein, genügte es in früheren Zeiten, mit innovativen Produkten möglichst preisgünstig eine Nachfrage bedienen zu können. Die toxikologischen bzw. ökotoxikologischen Aspekte eines Produktes spielten dabei zunächst eine untergeordnete Rolle. Im Laufe der Zeit entstand eine allgemeine Sensibilisierung für sicherheitstechnisch relevante Themen. Dem Schutz des Menschen und seiner Umwelt wird heute eine gleich wichtige Rolle zugestanden.
Die Anfänge des Gefahrstoffrechts liegen über 100 Jahre zurück. Bereits im Jahre 1894 wurde im „Giftrecht“ per Bundesratsbeschluß der Länder des Deutschen Reiches der Handel mit Giften geregelt [BGVV-Schrift]. Seither haben vielfältige gesetzgeberische, behördliche und andere Maßnahmen zu immer mehr Sicherheit im Umgang mit Giften und anderen gefährlichen Stoffen, Zubereitungen und Erzeugnissen beigetragen. Ein wichtiger Meilenstein in der Historie des Gefahrstoffrechts stellt das Jahr 1967 dar, in dem die erste EG-Umweltrichtlinie verabschiedet wurde [67/548/EWG]. Auf nationaler Ebene wurde daraufhin am 16. September 1980 das Chemikaliengesetz (ChemG) im Bundestag beschlossen.
Der Zweck dieses Gesetzes ist im §1 definiert: „Zweck des Gesetzes ist es, den Menschen und die Umwelt vor schädlichen Einwirkungen gefährlicher Stoffe und Zubereitungen zu schützen, insbesondere sie erkennbar zu machen, sie abzuwenden und ihrem Entstehen vorzubeugen“ [ChemG, §1]. Während dieser Umsetzungsphase von EG-Richtlinie in nationales Recht wurde im Jahre 1977 das Programm zur Verhütung von Gesundheitsschädigungen durch Arbeitsstoffe von der Berufsgenossenschaft der chemischen Industrie (BG Chemie) beschlossen [BG Chemie-Programm]. Ziel war es, durch die Bestimmung der toxikologischen und gesundheitsschädlichen Eigenschaften von Stoffen den Umgang von Chemikalien in Betrieben abzusichern. 4000 Stoffe wurden in einer Stoffliste zusammengetragen.
Daraus wurden 325 relevante Stoffe identifiziert, für 244 Stoffe liegt mittlerweile eine toxikologische Bewertung vor.
Mit Inkrafttreten der 6. Änderung der EG-Richtlinie 67/548/EWG [79/831/EWG] von 1981 wurde das europäische Registrierungssystem von Neustoffen weitgehend harmonisiert. Man unterscheidet seitdem zwischen Altstoffen und Neustoffen. Als
Altstoffe werden die chemischen Stoffe bezeichnet, die vor dem 18. September 1981 in Verkehr gebracht wurden. Es gibt 100204 Altstoffe. Diese Stoffe werden im Altstoffinventar EINECS (European Inventory of Existing Commercial Substances) der EU gelistet. Neustoffe sind Stoffe, die nicht im EINECS-Altstoffinventar gelistet sind, also nach 1981 in Verkehr gebracht wurden. Seit 1981 sind ca. 3850 Stoffe in der Neustoffdatenbank ELINCS (European List of Notified Chemical Substances) registriert worden. Für die Zulassung eines Neustoffes müssen u.a. folgende Daten eingereicht werden:
- Zusammensetzung des Produktes sowie Identitätsmerkmale
- je nach Tonnage ein bestimmter Katalog an physikalisch-chemischen, toxikologischen und ökotoxikologischen Untersuchungen
- Angaben zur Verwendung und Exposition.
Das Verfahren der Altstoffbewertung konnte erst im Jahr 1993 mit dem Inkrafttreten der EU-Altstoffverordnung [793/93/EWG] vereinheitlicht werden. Für Substanzen mit einem Produktionsvolumen zwischen 10 und 1000 t/a (Low Production Volume Chemicals) müssen produzentenbezogene Datensätze dem Europäischen Chemikalienbüro (ECB) übermittelt werden, für Substanzen mit einem höheren Produktionsvolumen (High Production Volume Chemicals) muß ein stoffbezogener Datensatz ermittelt werden.
In den letzten Monaten ist die Chemikalienpolitik wieder ein aktuelles Thema. Die EU-Kommission hat am 29. Oktober 2003 einen Vorschlag für eine Verordnung des Europäischen Parlaments und des Rates zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals, kurz REACH) vorgelegt [REACH]. Die erste Lesung im EU- Parlament fand im November 2005 statt. Nun sollen EU-Parlament und Ministerrat sich abstimmen und einen gemeinsamen Standpunkt erarbeiten, damit die EU- Kommission einen neuen Entwurf verfassen kann, der dann zur 2. Lesung wieder ins EU-Parlament gehen kann. Wenn eine Einigung erzielt wird, soll REACH im Jahr 2007 in Kraft treten.
Dem Schutz des Menschen und seiner Umwelt wird heutzutage also ein hoher Rang zugestanden. Dies bedeutet für die Forschung in der chemischen Industrie, dass man sich mit den toxikologischen und ökotoxikologischen Aspekten eines Stoffes frühzeitig auseinandersetzen muß. Ansonsten besteht die Gefahr, dass ein Produkt über Jahre entwickelt wird und letztlich, kurz vor der Markteinführung, wegen
toxikologischer oder ökotoxikologischer Bedenken scheitert. Das kann sich im Zeitalter des globalen Wettbewerbs kein Unternehmen leisten. Deswegen werden toxikologische Fragestellungen möglichst früh in die Produktentwicklung mit einbezogen. In der vorliegenden Arbeit wird über die als Neustoff einzustufende Substanz (Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester berichtet.
P O
O O
CH2 CH2 CH3
CH2 CH3 Si
O O
O C H3
CH3 C
H3
Abbildung 1: Strukturformel von (Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester
Da die ersten Forschungsergebnisse hinsichtlich der beabsichtigten Verwendbarkeit viel versprechend waren, zog man erste toxikologische Untersuchungen nach. So können Informationen für einen optimalen Arbeitsschutz gewonnen sowie erste toxikologische Produkteigenschaften abgeschätzt werden. Zudem liegen für eine spätere Chemikalienanmeldung dann bereits einige für die Zulassung geforderte Untersuchungen vor, so dass eine Markteinführung schneller angestrebt werden kann. In dieser Arbeit sollen die durchgeführten toxikologischen Studien beschrieben und zusammenfassend bewertet werden.
2 Substanzcharakteristik
(Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester ist eine farblose bis leicht gelbliche Flüssigkeit. Sie wird am besten bei mittleren Temperaturen im Dunkeln und gut verschlossen aufbewahrt.
Kennung: SLM 88000
IUPAC-Name: Phosphonic acid [(trimethoxysilyl)methyl]-, diethyl ester Synonym: EPS-TMO
Summenformel: C8H21O6PSi Molekulargewicht: 272,32 g/mol
Aggregatzustand: bei Raumtemperatur flüssig
Flammpunkt: 50°C Zündpunkt: 310°C Charge: BrL1034 Reinheit: 96,3 % (GC, NMR)
Verunreinigungen: 2,4 % (Ethoxydimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester
P O
O O
CH2 CH2
CH3
CH2 CH3 Si
O O
O C H3
CH3 CH2
C H3
0,3 % Methylphosphonsäurediethylester
P O
O O C
H3 CH2
CH3
CH2 CH3
0,2 % Triethylphosphit
P(OEt)3
0,2 % Chlormethyltrimethoxysilan
Si O O
O C H3
CH3 C
H3
Cl
(Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester ist bisher in keinem Chemikalien- inventar gelistet.
3 Herstellverfahren
(Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester kann hergestellt werden, indem man das reaktive α-Silan Chlormethyltrimethoxysilan mit Triethylphosphit umsetzt.
Dabei wird Ethylchlorid freigesetzt, das destillativ aus dem Ansatz entfernt werden kann. Die Synthese benötigt keine Lösungsmittel und eignet sich für ein kontinuierliches Verfahren. Vorsicht ist bei der Reaktion jedoch geboten, da α-Silane thermisch labil sind und sich in exothermen Reaktionen zersetzen. Die Zersetzungsprodukte sind brennbar. Zudem kann die Si-C-Bindung in α-Silanen von starken Säuren bzw. Basen angegriffen werden.
Si O O
O C H3
CH3 C
H3
Cl
+
P(OEt)3 PO
O
O CH3 CH3 Si
O O
O C H3
CH3 C
H3 - EtCl
Abbildung 2: Synthese von (Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester
Die besten Ausbeuten werden erzielt, wenn man das Produkt über einen Dünnschichtverdampfer destillativ dem Reaktionsgemisch entzieht. Dabei mitabgetrennte Edukte können in das Reaktionsgefäß zurückgeführt werden. Durch die niedrige Prozesstemperatur von unter 100°C ist die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten weitgehend unterdrückt, so dass das Rohprodukt bereits eine per Gaschromatographie ermittelte Reinheit von 93 % besitzt.
4 Anwendungsfelder, Exposition
Die α-Phosphonato-Silane sind eine leicht zugängliche Produktklasse, wie unter Kapitel 3 (siehe Kapitel 3 Herstellverfahren, Seite 6) dargelegt wurde. Der Einbau von α−Phosphonato-Silanen in Siliconen führt zu polaren Systemen. So kann man von wasserlöslichen Siloxanen über emulgierbare Systeme hin zu leicht polaren Strukturen vielfältige Modifikationen erzeugen. Eine mögliche Kondensations- reaktion mit Polydimethylsiloxan (PDMS) unter Abspaltung von Methanol ist in Abbildung 3 dargestellt. In diesem Fall wird Polydimethylsiloxan an den Kettenenden durch die Phosphonat-Einheit terminiert.
Für die phosphonat-modifizierten Siloxane ist ein breites Anwendungsspektrum denkbar. Es reicht von der Hydrophilisierung von Textilien und dem Einsatz als Haftvermittler über die Verwendung als Flammschutz- und Korrosionsschutzmittel bis hin zur Anwendung im Bautenschutz und als Anti-Statik-Additiv in Siliconen. Zudem sind Anwendungen im Bereich der Katalyse sowie in Ionentauschern und Membranen denkbar. Aufgrund dieser Breite der möglichen Anwendungen ist das Marktpotential der Phosphonato-Silane beträchtlich.
Si CH3
CH3 O OH H
n
2 Si
OCH3
OCH3
H3CO CH2 P(OEt)2 O
∆ - 2 CH3OH
+
n Si
OCH3
OCH3
CH2 Si
CH3
CH3 O
O Si
OCH3
OCH3
CH2 P(OEt)2 O (EtO)2P
O
Abbildung 3: Kondensationsreaktion von SLM 88000 mit Polydimethylsiloxan
Wie man an den Ausführungen zu den Anwendungsfeldern entnehmen kann, stellt (Trimethoxysilyl)methylphosphonsäurediethylester (SLM 88000) ein Zwischenprodukt dar. Es wird mit Siliconölen zu phosphonat-modifizierten Siloxanen umgesetzt. Diese Polymere sollen dann zur Weiterverarbeitung oder Anwendung in die entsprechenden Industriezweige verkauft werden. SLM 88000 wird also nicht direkt an den privaten oder industriellen Endverbraucher verkauft werden. Eine mögliche Exposition des privaten oder industriellen Endverbrauchers mit SLM 88000 ist folglich unwahrscheinlich. Lediglich bei unvollständiger Umsetzung wäre eine Exposition mit SLM 88000 denkbar. Dann wäre SLM 88000 in Teilen noch nach der Reaktion als Monomereinheit im Silicon vorhanden und könnte über die Zeit aus dem Silicon herausdiffundieren. Diese Expositionsmöglichkeit darf man nicht aus den Augen verlieren, insbesondere bei Anwendungen im Bereich Textilien. Ansonsten ist der private oder industrielle Endverbraucher maximal mit dem polymerisierten Silicon in Kontakt, das als Polymer natürlich ganz andere physikalische, chemische und toxikologische Eigenschaften besitzt als die Monomereinheit SLM 88000.
Ein zweiter toxikologischer Aspekt soll hier erörtert werden: der Arbeitsschutz.
Kommt der private oder industrielle Endverbraucher also in der Regel nicht in Kontakt mit SLM 88000, so sieht dies anders aus für die Mitarbeiter der Wacker Chemie AG. Bei der Herstellung, Abfüllung bzw. weiteren Umsetzung von (Trimethoxysilyl)methyl-phosphonsäurediethylester ist ein direkter Kontakt nicht nur
bei Unfällen möglich. Dementsprechend stellt die Ermittlung eines toxikologischen Grunddatensatzes im Wesentlichen einen Beitrag zum Arbeitsschutz dar. Anhand dieser Daten sollen Risiken erkannt und Sicherheitsregeln abgeleitet werden.
5 Toxikologische Studien
5.1 GLP-Konformität [GIT-Buch]
Anfang der 70er Jahre entdeckte die FDA (Food and Drug Administration) in einigen großen amerikanischen Pharmaunternehmen sowie bei mehreren Auftragsinstituten erhebliche Unregelmäßigkeiten in der Durchführung und vor allem in einer Reihe von Berichten zu toxikologischen Untersuchungen. Aufgrund dieser zum Teil kriminellen Machenschaften sah die FDA die Sicherheit der amerikanischen Bevölkerung gefährdet und veröffentlichte erste Regelungen mit dem Ziel, eine Qualitätsnorm für Laboruntersuchungen zu schaffen. Das war die Geburtsstunde von GLP (Good Laboratory Practice, Gute Laborpraxis). Im Jahre 1979 wurden die ersten gesetzlichen Vorschriften hinsichtlich GLP für die Vereinigten Staaten erlassen.
Um Handelsbeschränkungen zu verhindern, befasste sich daraufhin die OECD (Organisation of Economic Co-operation and Development) mit dem Thema. 1981 gab es eine OECD Council Decision [Council Decision], die neben der internationalen Angleichung der Prüfmethoden (Annex 1) die ersten international anerkannten Grundsätze der Guten Laborpraxis (Annex 2) enthielten. Dabei war der OECD wichtig, ebenfalls einen „Leitfaden für die Verfahren zur Überwachung der Einhaltung der GLP“ zu entwickeln und diese staatliche Kontrolle zu institutionalisieren. 1989 wurde dieser Leitfaden von den OECD-Staaten als bindend anerkannt. Damit war ein Grundstein für die zwischenstaatliche Anerkennung von GLP sowie deren jeweiliger Einhaltung gelegt.
Die europäische Union hat die OECD-Regelungen in ihren Richtlinien 87/18/EWG, 88/320/EWG sowie 90/18/EWG [87/18/EWG, 88/320/EWG 90/18/EWG] aufgenom- men und damit für Europa die Einhaltung der Grundsätze der GLP für bestimmte Untersuchungen von Chemikalien, Arzneimitteln und Pflanzenschutzmitteln sowie die einheitliche Kontrolle der Einhaltung der GLP festgeschrieben.
Mit der Novelle des Chemikaliengesetzes im August 1990 wurden die entsprechenden Richtlinien der Europäischen Gemeinschaft in deutsches Recht umgesetzt. Der §19a, Absatz 1 des ChemG [ChemG, §19a] lautet: „Nicht-klinische gesundheits- und umweltrelevante Sicherheitsüberprüfungen von Stoffen oder Zubereitungen, deren Ergebnisse eine Bewertung ihrer möglichen Gefahren für Mensch und Umwelt in einem Zulassungs-, Erlaubnis-, Registrierungs-, Anmelde- oder Mitteilungsverfahren ermöglichen sollen, sind unter Einhaltung der Grundsätze der Guten Laborpraxis nach dem Anhang 1 zu diesem Gesetz durchzuführen.“
Zusammenfassend kann man sagen, dass GLP folgende Punkte zum Ziel hat:
- Verbesserung der Qualität von Daten aus Prüfungen
- Vermeidung der Wiederholung von Prüfungen (besonders von Tierversuchen) - gegenseitige Anerkennung von Daten
Ausdrücklich sei an dieser Stelle angemerkt, dass durch die Beachtung der GLP- Richtlinien nur die korrekte Durchführung einer Prüfung belegt wird. Die Antwort auf die Frage, ob eine Prüfung für eine spezielle Fragestellung sinnvoll ist oder nicht, kann (und wird) durch solch ein Regelwerk nicht gegeben werden.
Um Zeit, Kosten und Ressourcen zu sparen sowie um unnötige Tierversuche zu vermeiden, ergibt es sich zwangsläufig, dass die in dieser Arbeit beschriebenen Studien unter Beachtung und Einhaltung der GLP-Richtlinien zu erfolgen hatten. Bei der Auswahl des toxikologischen Instituts wurde folglich Wert darauf gelegt, dass eine gültige GLP-Bescheinigung für diese Prüfeinrichtung vorliegt. Ausgewählt wurde TNO Nutrition and Food Research, Zeist, Niederlande. Die GLP-Bescheinigung ist in Abbildung 4 wiedergegeben.
Desweiteren wurde darauf geachtet, dass alle Berichte ein „Statement of GLP compliance“ sowie ein „Quality Assurance Statement“ der internen Qualitäts- sicherungseinheit beinhalten. Damit ist sichergestellt, dass diese Untersuchungs- ergebnisse bei einer späteren Anmeldung nach dem ChemG verwendet werden können.
Abbildung 4: GLP-Bescheinigung von TNO Nutrition and Food Research
5.2 Akute orale Toxizität [TNO report V 5610/08]
Die Akute-Toxische-Klassen-Methode (Acute Toxic Class, ATC) liefert Daten sowohl für die Gefahrenabschätzung als auch für die Gefahrenklassifikation. Man benötigt dafür wenige Tiere, folglich hat die ATC-Methode mittlerweile die aufwendigere LD50- Bestimmung abgelöst. Das Design der vorliegenden Studie folgt der EG Directive 96/54/EG, Methode B.1 tris [96/54/EG B.1 tris] sowie der OECD Guideline Nr. 423 [OECD 423].
Da es sich um ein erstes Herantasten an die toxikologischen Eigenschaften des Stoffes handelt und bei einer Forschungschemikalie nicht abzusehen ist, ob es tatsächlich zu einer Chemikalienanmeldung kommt, wurde der Umfang der Studie reduziert. Die Studie wurde in Form eines Limit-Tests durchgeführt. Das bedeutet, die erste Dosierung betrug 2000 mg/kg Körpergewicht und wurde zeitversetzt an sechs Ratten getestet. Zum Einsatz kamen ausschließlich beim Start der Studie acht bis neun Wochen alte weibliche Wistar-Ratten des Albino-Auszuchtstammes Crl:(WI) WU Br von Charles River, Deutschland. Die Testsubstanz SLM 88000 wurde den Ratten über eine Spritze oral verabreicht (10 mL/kg Körpergewicht einer 200 mg/mL Verdünnung in Maisöl). Vor der Dosierung wurde eine Futterkarenz über Nacht eingehalten. 4 Stunden nach der Dosierung hatten die Tiere wieder Zugang zum Futter. Bei dieser Dosierung von 2000 mg/kg starben vier der sechs Ratten.
Deswegen wurde eine zweite Dosierung von 300 mg/kg an sechs Ratten ausgetestet. Wieder erfolgte die Dosierung der Testsubstanz oral über eine Spritze (10 mL/kg Körpergewicht einer 30 mg/mL Verdünnung in Maisöl). Alle sechs Ratten überlebten. Der Beobachtungszeitraum belief sich auf 14 Tage nach der Dosierung.
Das Körpergewicht der lebenden Ratten wurde an den Tagen 0, 3, 7 und 14 kontrolliert (Tabelle 1). Ebenso wurden alle Anzeichen von klinischen Symptomen nach einer Stunde, nach vier Stunden sowie dann mindestens einmal täglich festgehalten (Tabelle 2). Am Ende der Studie wurden alle überlebenden Ratten mit Kohlendioxid eingeschläfert und auf äußere Veränderungen hin untersucht. Danach wurden das Abdomen und der Thorax von jedem Tier geöffnet, um makroskopische pathologische Änderungen im Inneren festzuhalten.
Die Untersuchung auf äußere Veränderungen verlief ohne besonderen Befund. Die Obduktion der überlebenden sowie der im Versuchsverlauf gestorbenen Tiere offenbarte keine auffälligen, auf die Behandlung zurückzuführenden Erscheinungen.
Die weiteren Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt:
Ratte Dosisgruppe Dosis1 Körpergewicht [g] am Tag Mortalität2
Nr. [mg/kg] [mL] 0 3 7 14
31 2000 1,5 154 150 Tod am 4.Tag
(143)
+
33 2000 1,6 165 174 179 192 -
35 2000 1,7 174 152 Tod am 4.Tag
(151)
+
73 2000 1,5 150 153 157 177 -
75 2000 1,6 164 Tod am 4.Tag (151) +
77 2000 1,6 161 156 116 Tod am
9.Tag (94) + Mortalität Summe 4 / 6
79 300 1,7 170 171 183 191 -
81 300 1,8 179 199 205 205 -
83 300 1,8 177 195 197 200 -
85 300 2,0 196 206 213 219 -
87 300 1,7 174 188 193 195 -
89 300 1,23 186 204 206 212 -
Mortalität Summe 0 / 6 1) 2000 mg/kg: Dosis von 10 mL/kg Körpergewicht einer 200 mg/mL Lösung von
SLM 88000 in Maisöl,
300 mg/kg: Dosis von 10 mL/kg Körpergewicht einer 30 mg/mL Lösung von SLM 88000 in Maisöl
2) Mortalität: + Tier ist gestorben, - Tier hat überlebt
3) fehlerhafte Dosierung: 1,2 mL und nicht 1,7 mL wurden verabreicht
Tabelle 1: Entwicklung des Körpergewichts während der ATC-Testreihe
Klinisches Symptom Häufigkeit
300 mg/kg 2000 mg/kg
Trägheit 0 / 6 6 / 6
Zusammenkauern 0 / 6 6 / 6
Lidspasmen 0 / 6 6 / 6
Haarsträuben 0 / 6 4/ 6
Nasenverkrustung 0 / 6 1/ 6
Diarrhoe 0 / 6 1/ 6
Dyspnoe 0 / 6 2/ 6
Unterkühlung 0 / 6 2/ 6
Keine Anomalien 6 / 6 0/ 6
Tabelle 2: Klinische Symptome während der ATC-Testreihe als Summenparameter zusammengefaßt
Es bleibt festzuhalten, dass bei einer Dosierung von 2000 mg/kg Körpergewicht vier von sechs Ratten verstarben, während bei einer Dosierung von 300 mg/kg Körpergewicht keinerlei Beeinträchtigung festgestellt werden konnte. Als häufige klinische Symptome waren bei der hohen Dosierung Trägheit, Zusammenkauern, Lidspasmen sowie Haarsträuben zu beobachten. Nur bei den später verstorbenen Ratten trat während der Beobachtungszeit eine Gewichtsabnahme auf, alle anderen entwickelten sich normal. Die Obduktion aller Tiere zeigte keinerlei Auffälligkeiten.
Die orale LD50 von SLM 88000 liegt folglich zwischen 300 und 2000 mg/kg Körpergewicht. Gemäß den EG-Standards [Official Journal] ist SLM 88000 damit als
„gesundheitsschädlich beim Verschlucken“ einzustufen.
5.3 Akute dermale Toxizität [TNO report V 5616/04]
Die Prüfung auf akute dermale Toxizität folgt der EG Directive 92/69/EG, Methode B.3 [92/69/EG B.3] sowie der OECD Guideline Nr. 402 [OECD 402].
Da es sich hier ebenfalls um ein erstes Herantasten an die toxikologischen Eigenschaften des Stoffes handelt und nicht abzusehen ist, ob es tatsächlich zu einer Chemikalienanmeldung kommt, wurde der Umfang der Studie auch hier auf einen so genannten Limit-Test reduziert. Dadurch wurde die Anzahl der Versuchs- tiere auf zehn beschränkt. Zum Einsatz kamen jeweils fünf männliche und fünf weibliche Wistar-Ratten des Albino-Auszuchtstammes Crl:(WI) WU Br von Charles River, Deutschland. Alle Ratten waren beim Start der Studie zwischen acht und neun Wochen alt. Die Studie wurde also in Form eines Limit-Tests durchgeführt. Das bedeutet, nur eine Dosierung (2000 mg Testsubstanz SLM 88000 pro kg Körpergewicht) wurde getestet. Dafür wurden die Flanken der Ratten mit einem elektrischen Rasierer geschoren. Am nächsten Tag wurden 10 mL/kg Körpergewicht einer 200 mg/mL Verdünnung der Testsubstanz in Maisöl auf eine Fläche von mindestens 4 x 5 cm intakter, geschorener Haut (entspricht mindestens 10 % der gesamten Körperoberfläche der Tiere) in Form eines dünnen Films aufgetragen.
Diese Expositionsfläche wurde mit Gaze bedeckt und zur Fixierung verbunden.
Während der Expositionszeit wurden die Ratten in Einzelkäfigen gehalten. Nach ca.
24 Stunden wurde der Verband entfernt und die Stelle mit Wasser gewaschen. Der sich anschließende Beobachtungszeitraum belief sich auf 14 Tage. Alle Anzeichen von klinischen Symptomen wurden nach einer Stunde, nach vier Stunden sowie dann mindestens einmal täglich festgehalten. Das Körpergewicht der lebenden Ratten wurde an den Tagen 0, 3, 7 und 14 kontrolliert (Tabelle 3). Hautreaktionen wurden an den Tagen 1, 3, und 14 nach dem Säubern der Expositionsfläche registriert (Tabelle 4). Am Ende der Studie wurden alle überlebenden Ratten mit Kohlendioxid eingeschläfert und auf äußere Veränderungen hin untersucht. Danach wurden das Abdomen und der Thorax von jedem Tier geöffnet, um makroskopische pathologische Änderungen im Inneren festzuhalten.
Alle Ratten überlebten den Beobachtungszeitraum von 14 Tagen. Während dieser Zeit wurden keine klinischen Auffälligkeiten registriert. Die Untersuchung auf äußere Veränderungen verlief ohne besonderen Befund. Die Obduktion der Tiere offenbarte keine auffälligen, auf die Behandlung zurückzuführenden Erscheinungen.
Die weiteren Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt:
Ratte Geschlecht Dosis1 Körpergewicht [g] am Tag Mortalität2
Nr. [m/w] [mL] 0 3 7 14
22 m 2,2 221 220 236 267 -
24 m 2,4 242 246 269 298 -
26 m 2,4 239 241 258 287 -
28 m 2,3 230 232 250 280 -
30 m 2,2 219 222 239 259 -
Mortalität Summe 0 / 5
21 w 1,7 173 173 180 190 -
23 w 1,8 181 181 186 198 -
25 w 1,7 174 172 181 192 -
27 w 1,7 173 172 179 184 -
29 w 1,7 171 161 165 178 -
Mortalität Summe 0 / 5 1) 2000 mg/kg: Dosis von 10 mL/kg Körpergewicht einer Lösung von 200 mg/mL
SLM 88000 in Maisöl
2) Mortalität: + Tier ist gestorben, - Tier hat überlebt
Tabelle 3: Entwicklung des Körpergewichts während der Studie
Legende zur Einstufung der Hautreaktionen nach Draize [Draize 1944]
A: Bildung von Erythemen (incl. Ischämie, Blutungen, Verkrustung) und Schorf
Erscheinung Wert
kein Erythem 0
sehr leichtes Erythem (kaum wahrnehmbar) 1
klar umschriebenes Erythem 2
mäßiges bis starkes Erythem 3
starkes Erythem (starke Rötung) oder Schorfbildung (tiefgehende Verletzungen), die eine Bewertung des Erythems nicht erlauben
4
B: Ödem-Bildung
Erscheinung Wert
kein Ödem 0
sehr leichtes Ödem (kaum wahrnehmbar) 1
leichtes Ödem (Ränder der Stelle sind durch eine deutliche Schwellung klar umschrieben)
2
mäßiges Ödem (Schwellung etwa 1 mm) 3
starkes Ödem (Schwellung mehr als 1 mm und über den Expositionsbereich hinaus)
4
Ratte Geschlecht Anzeichen und Stärke [A-B] am Tag
Nr. [m/w] 1 3 7 14
22 m 1-0 05-0 03-0 0-0
24 m 1-0 0-0 0-0 0-0
26 m 1-0 05-0 03-0 0-0
28 m 1-0 0-0 06-0 0-0
30 m 1-0 0-0 0-0 0-0
21 w 1-0 05-0 0-0 0-0
23 w 1-0 05-0 04-0 0-0
25 w 1-0 03-0 01-0 0-0
27 w 1-0 06-0 04-0 0-0
29 w 1-0 03-0 01-0 0-0
Verkrustungsgrad: 1) sehr leicht, 2) leicht, 3) mäßig Schuppenbildung: 4) sehr leicht, 5) leicht, 6) mäßig
Tabelle 4: Einstufung der Hautreaktionen nach Draize [Draize 1944]
Es bleibt festzuhalten, dass alle Ratten unabhängig vom Geschlecht eine dermale Dosierung von 2000 mg/kg Körpergewicht an SLM 88000 mit nur geringen Beeinträchtigungen überlebten. Lediglich Erytheme der Graduierung „sehr leicht“,
häufig verbunden mit leichter Schuppenbildung bzw. einer leichten bis mäßigen Verkrustung, wurden beobachtet. Nach spätestens 14 Tagen waren keine Veränderungen mehr festzustellen. An den Überprüfungstagen 7 bzw. 14 traten keinerlei Anzeichen einer Hautreizung mehr auf. Bei allen Ratten lag eine normale Entwicklung des Körpergewichts vor. Auch die Obduktion aller Tiere zeigte keinerlei Auffälligkeiten.
Die dermale LD50 von SLM 88000 liegt folglich oberhalb von 2000 mg/kg Körpergewicht. Anhand der Beobachtungen ist sogar anzunehmen, dass die dermale LD50 deutlich oberhalb von 2000 mg/kg liegt. Gemäß den EG-Standards [Official Journal] ist SLM 88000 einzustufen als „nicht gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut“.
5.4 Akute Hautreizung [TNO report V 5611/07]
Die Prüfung auf akute Hautreizung folgt der EG Directive 92/69/EG, Methode B.4 [92/69/EG B.4] sowie der OECD Guideline Nr. 404 [OECD 404].
Da aus der Studie zur akuten dermalen Toxizität (siehe Kapitel 5.3 Akute dermale Toxizität, Seite 14) bekannt ist, dass bei einem dermalen Limit-Test von 2000 mg/kg Körpergewicht nur sehr leichte Erytheme auftraten, kann ohne weitere Vortestung eine vollständige Untersuchung auf akute Hautreizung mit drei Tieren durchgeführt werden. Zum Einsatz kamen drei spezifisch pathogenfreie (SPF) Albino-Kaninchen der Spezies New Zealand White Albino Rabbits von Centre Lagro, Frankreich. Es handelte sich um adulte Kaninchen männlichen Geschlechts. Drei Tage vor Beginn der Studie wurden die Kaninchen am Rücken und an den Flanken rasiert. Wenn notwendig, wurde diese Rasur an den nachfolgenden Tagen wiederholt. Zum Start der Studie wurden jeweils 0,5 mL der Testsubstanz SLM 88000 auf drei Baumwoll- binden aufgetragen. Diese wurden an einer geeigneten Stelle der rasierten Flanken der drei Tiere mit Leukopor befestigt und mit einer Mullbinde verbunden. Nach vier Stunden Expositionszeit wurde der Verband entfernt und die Stelle mit einem feuchten Tuch gereinigt. Eine Stunde nach dieser Behandlung wurde eine Begutachtung der Expositionsstelle nach der Methode von Draize [Draize 1944]
durchgeführt. Weitere Befunderhebungen schlossen sich nach 24, 48 und 72 Stunden sowie nach sieben Tagen an. Als man den Verband entfernte, blieb ein Teil
der Testsubstanz an der Haut kleben. An den folgenden Tagen lockerte sich dieser Teil und fiel mit der Zeit ab, so dass am siebten Tag keine Testsubstanz mehr gefunden wurde. Eine korrekte Begutachtung war jederzeit möglich. Als Blindwert diente eine freie Stelle der Kaninchenhaut ohne Substanzexposition.
Ratte Anzeichen und Stärke [A-B] am Tag
Nr. 1 h 24 h 48 h 72 h 7 d
50 1-0 2-2 2-1 2-1 0-0 52 1-0 3-3 3-2 3-2 0-0 54 1-0 3-2 2-2 2-2 0-0 A: Erythem-Bildung einschließlich Ischämien, Blutungen, Verkrustungen
B: Ödem-Bildung
Tabelle 5: Einstufung der Hautreaktionen nach Draize [Draize 1944]
Man erkennt, dass nach einer Stunde alle Kaninchen sehr leichte Erytheme an den behandelten Stellen aufwiesen. Nach 24 Stunden wurden klar umschriebene bzw.
mäßige bis starke Erytheme beobachtet. Zusätzlich traten leichte bis mäßige Ödeme auf. Nach 48 bzw. 72 Stunden war ein Abklingen der Hautreaktionen zu erkennen.
Nur noch ein Kaninchen zeigte ein mäßiges bis starkes Erythem, die anderen beiden Tiere wiesen nur noch ein klar umschriebenes Erythem auf. Auch die Ödeme gingen in ihrer Stärke zurück. Man beobachtete nur noch sehr leichte bis leichte Ödeme.
Nach 7 Tagen konnten keine Hautveränderungen mehr festgestellt werden.
Um zu entscheiden, ob eine Kennzeichnung gemäß R 38 „Reizt die Haut“
vorzunehmen ist, wurden die Mittelwerte der Erythem- bzw. Ödem-Bildung nach 24, 48 und 72 Stunden berechnet. Die Ergebnisse befinden sich in Tabelle 6.
Kaninchen Nr. Erytheme Ödeme
50 2,0 1,3 52 3,0 2,3 54 2,3 2,0 Tabelle 6: Mittelwertbildung der Beobachtungen nach 24, 48 und 72 Stunden
Die EU-Directive 93/21/EU [93/21/EWG] legt fest, dass für eine Kennzeichnung als R 38 „Reizt die Haut“ die folgenden Kriterien jeweils von mindestens zwei Kaninchen erfüllt werden müssen:
Erytheme: ≥ 2,0 (bei allen drei Tieren der Fall) Ödeme: ≥ 2,0 (bei Kaninchen 52 und 54 der Fall)
Aus den ermittelten Werten in Tabelle 6 ergibt sich gemäß den EG-Standards [Official Journal], dass SLM 88000 auf die Haut reizend wirkt und mit dem Gefahrenhinweis R 38 „Reizt die Haut“ zu versehen ist.
5.5 Akute Augenreizung [TNO report V 5615/06]
Die Prüfung auf akute Augenreizung folgt der EG Directive 92/69/EG, Methode B.5 [92/69/EG B.5] sowie der OECD Guideline Nr. 405 [OECD 405].
Um die Anzahl der Tierversuche zu reduzieren, wurde bei der Prüfung auf akute Augenreizung zunächst auf einen in vitro-Test zurückgegriffen, der nicht unter GLP- Bedingungen durchgeführt wurde. In den Niederlanden ist der Chicken Enucleated Eye Test (CEET), auch Isolated Chicken Eye Test (ICE Test) genannt, etabliert. Da sich die Prüfeinrichtung in den Niederlanden befindet, wurde dementsprechend nicht der in Deutschland gebräuchliche HET-CAM (Hen’s Egg Test - Corionallantois- Membran), sondern der CEET durchgeführt. Beim CEET wird ein isoliertes Hühner- auge der Prüfsubstanz ausgesetzt. Das Potential zur Augenreizung wird anhand der Cornea-Schwellung, der Cornea-Trübung sowie der Retention von Fluorescein bewertet. Das Ergebnis des CEET war nicht eindeutig. Es gab Anzeichen, die auf eine leichte Reizung hindeuteten. Deswegen musste eine Prüfung gemäß OECD Guideline Nr. 405 (Draize Test am Kaninchenauge) angeschlossen werden.
Da keine weiteren Daten als die Ergebnisse des CEET vorhanden waren und unnötiges Leiden der Versuchstiere verhindert werden sollte, wurde zunächst nur ein Kaninchen behandelt. Erst nach der ersten Beobachtungskontrolle nach einer Stunde wurde entschieden, zwei weitere Kaninchen entsprechend zu testen. Zum Einsatz kamen insgesamt drei spezifisch pathogenfreie (SPF) Albino-Kaninchen der Spezies New Zealand White Albino Rabbits von Centre Lagro, Frankreich. Es handelte sich um adulte Kaninchen männlichen Geschlechts. Eine Untersuchung vor
dem Start der Studie ergab, dass alle Augen der Kaninchen unversehrt waren. Dann wurden 0,1 mL der Prüfsubstanz in den Conjunctivalsack des einen Auges getropft.
Nach dieser Verabreichung wurden die Augenlieder vorsichtig für mindestens eine Sekunde zusammengehalten, um einen Substanzverlust zu vermeiden. Das zweite Auge wurde nicht behandelt und diente als Kontrolle. Die Augen wurde nach einer Stunde, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden sowie nach sieben Tagen kontrolliert und die Augenreaktionen nach den in Tabelle 7 wiedergegebenen Einstufungen beurteilt.
Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
Legende zu den Einstufungen der Augenreaktionen nach Draize [Draize 1944]
Cornea
A) Opazität (Trübungsgrad) an der dichtesten Stelle
Wert
keine Ulzeration oder Opazität (Trübung) 0 verstreute oder diffuse Opazitätsbereiche, Einzelheiten der Iris klar
sichtbar
1
leicht erkennbarer durchscheinender Bereich, Einzelheiten der Iris etwas verschattet
2
perlmuttartige Bereiche, keine Einzelheiten der Iris sichtbar, Größe der Pupille kaum erkennbar
3
opake Cornea, Iris aufgrund der Opazität nicht erkennbar 4 Cornea
B) betroffene Fläche
Wert
ein Viertel oder weniger, aber nicht 0 1
mehr als ein Viertel, aber weniger als die Hälfte 2 mehr als die Hälfte, aber weniger als drei Viertel 3 mehr als drei Viertel bis zur ganzen Fläche 4
Iris Wert
normal 0 ausgesprochen vertiefte Falten, Kongestion, Schwellung, mäßige
circumcorneale Hyperämie oder Injektion; die Iris reagiert noch träge auf Licht
1
keine Reaktion auf Licht, Hämorrhagie, starke Zerstörung 2
Conjunctiven
A) Rötung bezieht sich auf den schwersten Befund
Wert
Blutgefäße normal 0
einige Blutgefäße zeigen eine deutliche Hyperämie (Injektion) 1 diffuse, karmesinrote Farbe, einzelne Gefäße nur schwer erkennbar 2
diffuses kräftiges Rot 3
Conjunctiven
B) Schwellung (Chemosis): Lider und/oder Nickhaut
Wert
keine Schwellung 0
jede über dem normalen liegende Schwellung 1 eindeutige Schwellung mit partieller Auswärtskehrung der Lider 2 Schwellung mit etwa halbgeschlossenen Lidern 3 Schwellung mit mehr als halbgeschlossenen Lidern 4
Ausfluß Wert
kein Ausfluß 0
mehr Ausfluß als normale Befeuchtung 1
Ausfluß mit Benetzung der Lider und der benachbarten Haare 2 Ausfluß mit Benetzung der Lider/Haare sowie weiterer Flächen rund
um das Auge herum
3
Kaninchen Cornea Iris Conjunctiven Ausfluß Nr. Trübung Fläche Rötung Schwellung
1 Sunde
56 1 4 1 2 3 3 58 1 4 1 2 3 3 60 1 4 1 2 3 3
24 Stunden
56 2 4 1 31 3 3
58 2 4 1 31 3 3
60 2 4 1 31 3 3
48 Stunden
56 2 4 1 31 3 3
58 2 4 1 31 3 3
60 2 4 1 31 3 3
72 Stunden
56 1 4 1 21 2 2
58 2 4 1 21 2 2
60 2 4 1 21 2 2
7 Tage
56 0 0 0 0 0 0 58 0 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 0
1) Ischämische Nekrose der Nickhaut
Tabelle 7: Einstufung der Augenreaktionen nach Draize [Draize 1944]
Es bleibt festzuhalten: alle Kaninchen zeigten nach einer Stunde eine leichte Cornea- Trübung, eine leichte Iritis, eine mäßige Rötung bei einer starken Schwellung der Conjunctiven sowie starken Ausfluß. Die Symptome steigerten sich nach 24 bzw. 48 Stunden hin zu einer mäßigen Cornea-Trübung sowie zu einer starken Rötung der Conjunctiven. Zusätzlich trat eine ischämische Nekrose an der Nickhaut auf. 72 Sunden nach der Behandlung war ein Abklingen der Symptome festzustellen. Nach 7 Tagen sind keine Beeinträchtigungen mehr zu erkennen. Alle Effekte waren folglich reversibel.
Um zu entscheiden, ob eine Kennzeichnung gemäß R 36 „Reizt die Augen“
vorzunehmen ist, wurden die Mittelwerte der Cornea-Trübung, der Iritis sowie der Rötung und Schwellung der Conjunctiven von jedem Kaninchen, beobachtet nach 24, 48 und 72 Stunden, gebildet. Die Ergebnisse befinden sich in Tabelle 8.
Kaninchen Nr. Cornea Iritis Conjunctiven
Trübung Rötung Schwellung
56 1,7 1,0 2,7 2,7 58 2,0 1,0 2,7 2,7 60 2,0 1,0 2,7 2,7
Tabelle 8: Mittelwertbildung der Beobachtungen nach 24, 48 und 72 Stunden
Die EU-Directive 93/21/EU [93/21/EU] legt fest, dass für eine Kennzeichnung als R 36 „Reizt die Augen“ eines der folgenden Kriterien erfüllt sein muß:
Cornea-Trübung: ≥ 2,0 , aber < 3,0 Iritis: ≥ 1,0 , aber < 2,0 Conjunctiven-Rötung: ≥ 2,5
Conjunctiven-Schwellung: ≥ 2,0
Liegen alle Werte unterhalb der angegebenen Richtwerte, so ist keine Kenn- zeichnung vorzunehmen. Bei Werten für die Cornea-Trübung von ≥ 3,0 oder/und für die Iritis von ≥ 2,0 ist eine Kennzeichnung mit dem Gefahrenhinweis R 41 „Gefahr ernster Augenschäden“ verpflichtend. Aus den ermittelten Werten in Tabelle 8 ergibt sich gemäß den EG-Standards [Official Journal], dass SLM 88000 mit dem Gefahrenhinweis R 36 „Reizt die Augen“ zu versehen ist.
5.6 Sensibilisierungsstudie [TNO report V 5613/02]
Die Sensibilisierungsstudie folgt der EG Directive 96/54/EG, Methode B.6 [96/54/EG B.6] sowie der OECD Guideline Nr. 406 [OECD 406].
Es gibt kein Prüfverfahren, mit dem man das Sensibilisierungspotential aller Substanzen ermitteln kann. Es gibt jedoch eine Reihe von Tests, von denen sich zwei Tests mit Meerschweinchen besonders etabliert haben. In dem einen Test wird die Prüfsubstanz direkt am gesunden, lebenden Meerschweinchen durch Anwendung der Testsubstanz auf der Haut getestet (Epicutantest oder auch Bühler- Test). In dem anderen Test wird die Prüfsubstanz im kompletten Freundschen Adjuvans (FCA) gelöst bzw. suspendiert und unter die Haut gespritzt (Intracutantest).
Damit wird zusätzlich die eventuell schwache Immunreaktion beim Meerschweinchen massiv verstärkt. Wegen dieser Verstärkung wird ein eventuell auch kleines Sensibilisierungspotential einer Substanz eher aufgedeckt und somit die Vorhersage für eine eventuelle Reaktion des Menschen verbessert. Dem Test unter Verwendung des kompletten Freundschen Adjuvans wird folglich die größere Vorhersage- wahrscheinlichkeit zugesprochen. Wegen dieser grösseren Aussagekraft und der möglichen Verwendung der Folgeprodukte von SLM 88000 im Textilienbereich wurde in der vorliegenden Studie zur Bestimmung der möglichen Sensibilisierungswirkung von SLM 88000 auf die menschliche Haut der Intracutantest nach Magnusson und Kligmann [Magnusson Kligmann] am Meerschweinchen (GPMT, Guinea Pigs Maximization Test) unter Verwendung der Adjuvans-Methode durchgeführt. Die Verwendung des Freundschen Adjuvans bereitet den Tieren allerdings erhebliche Schmerzen, so dass dieser Test heutzutage nicht mehr durchgeführt wird.
Das Prinzip des Prüfverfahrens beruht darauf, Versuchstiere zunächst durch intradermale Injektion und durch epidermale Applikation der Prüfsubstanz auszusetzen (Induktionsexposition). Während einer Ruhephase von 10 bis 14 Tagen (Induktionsphase) kann sich eine Immunreaktion entwickeln. Anschließend werden die Tiere einer Provokationsdosis ausgesetzt. Das Ausmaß sowie der Grad der Hautreaktion auf die Provokationsdosis werden dann beurteilt.
Zum Einsatz kamen weibliche Meerschweinchen des spezifisch pathogenfreien Albino-Auszuchtstammes Dunkin Hartley von Harlan, Niederlande. Alle Meer- schweinchen waren beim Start der Studie circa fünf Wochen alt.
Zunächst wurden in einer Vorstudie die Induktions- sowie Provokationsdosen festgelegt. Um eine geeignete Dosis für die intradermale Induktionsexposition zu finden, wurde die Reizwirkung von mehreren Konzentrationen an SLM 88000 in Maisöl bei intradermaler Injektion bestimmt. Dazu wurde eine genügend große Fläche an den Flanken der Meerschweinchen rasiert und 0,1 mL von der ausgewählten Konzentration intradermal injiziert. 24 Stunden nach dieser Behandlung wurden die Meerschweinchen optisch untersucht. Dabei wurde die folgende Bewertungsskala von Magnusson und Kligman [Magnusson Kligman]
verwendet:
0 : keine sichtbare Veränderung 1 : leichtes oder fleckiges Erythem
2 : mittelgradiges und konfluierendes Erythem
3 : starkes Erythem und Schwellung, Bildung von Schorf
Die Ergebnisse dieser Vorstudie sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben:
Tier Nr. Konzentration an SLM 88000 in Maisöl
10 % 3,0 % 1,0 % 0,3 % 0,1 %
97 3a 3a 3a 2a 2 109 3a 3a 3a 2a 2 a: Abszessbildung
Tabelle 9: Übersicht zur Dosisfindung für die intradermale Induktion
Für die intradermale Induktionsexposition ist die höchste Konzentration geeignet, bei der leichte bis mittlere Hautreizungen sichtbar werden, die ansonsten aber gut vom Tier vertragen wird. Folglich wurde für die Studie die Konzentration von 0,1 % SLM 88000 in Maisöl für die intradermale Induktionsexposition ausgewählt.
Zwecks Dosisfindung für die topische Induktionsexposition wurden vier weitere Meerschweinchen behandelt. SLM 88000 wurde in unterschiedlichen Kon- zentrationen in Maisöl gelöst und auf Binden aufgetragen. Diese Binden wurden auf
rasierten Flächen der Meerschweinchenhaut aufgelegt und für 24 Stunden fixiert. 24 und 48 Stunden nach Entfernen dieser Bandagen wurde die Haut der Meer- schweinchen optisch beurteilt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben. Die Bewertung folgt wieder der Einteilung nach Magnusson und Kligman [Magnusson Kligman].
Tier Konzentration an SLM 88000 in Maisöl
Nr. 100 % 30 % 10 % 3 %
24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
89 1 0 0 0 - - - - 91 0 0 0 0 - - - -
93 - - - - 0 0 0 0
95 - - - - 0 0 0 0
- : nicht getestet
Tabelle 10: Übersicht zur Dosisfindung für die topische Induktion
Wie bei der intradermalen Induktionsexposition ist für die topische Induktions- exposition die höchste Konzentration geeignet, bei der leichte bis mittlere Haut- reizungen sichtbar werden, die ansonsten aber gut vom Tier vertragen wird. Wie man der Tabelle 10 entnehmen kann, zeigte nur ein Tier bei Anwendung der unverdünnten Prüfsubstanz (100 %) nach 24 Stunden ein leichtes oder fleckiges Erythem. Bei allen anderen Tieren und Dosierungen waren keine Veränderungen festzustellen. Folglich wurde für die Studie als topische Induktionskonzentration die unverdünnte Prüfsubstanz (100 % SLM 88000) ausgewählt. Da allerdings nicht alle Tiere auf die unverdünnte Anwendung von SLM 88000 mit einem leichten Erythem reagierten, wurde für die Hauptstudie eine Anregung der Induktionsstelle mit 10 % Natriumlaurylsulfat in Vaseline beschlossen.
Als Vorgabe für die Provokationsdosis (Auslösedosis) gilt, dass diese Dosis selbst nicht reizend wirken darf. Da ein Tier bei topischer Anwendung der unverdünnten Prüfsubstanz SLM 88000 ein leichtes oder fleckiges Erythem zeigte, wurde für die
Provokationsdosis neben der unverdünnten Prüfsubstanz auch eine Dosis von 30 % SLM 88000 in Maisöl gewählt.
Zusammenfassend ergaben sich also folgende Induktions- bzw. Provokationsdosen:
Induktionsdosis:
- intradermal 0,1 % SLM 88000 in Maisöl
- topisch 100 % SLM 88000 nach Einwirken von 10 %igem Natriumlaurylsulfat in Vaseline
Provokationsdosis: a) 30 % SLM 88000 in Maisöl b) 100 % SLM 88000
Für die Hauptstudie wurden 15 Meerschweinchen aufgeteilt in eine Testgruppe aus zehn und eine Kontrollgruppe bestehend aus fünf Tieren. Zu Beginn sowie am Ende der Studie wurde das Gewicht aller Tiere erfasst. Die Induktion wurde auf zwei verschiedene Arten durchgeführt, zum einen durch intradermale Injektion und zum anderen durch topische Applikation.
Für die intradermale Induktion wurden 24 cm2 Rückenhaut in der Schulterregion der Meerschweinchen rasiert. In dieser Region wurden paarweise je 0,1 mL der folgenden Lösungen injiziert:
Testgruppe:
- zwei Injektionen mit einer 1:1-Verdünnung aus komplettem Freund’schen Adjuvant (FCA) und physiologischer Salzlösung
- zwei Injektionen mit der ausgewählten Konzentration an SLM 88000 (0,1 % SLM 88000) in Maisöl
- zwei Injektionen mit der ausgewählten Konzentration an SLM 88000 (0,1 % SLM 88000) in einer 1:1-Verdünnung aus FCA und Maisöl
Kontrollgruppe:
- zwei Injektionen mit einer 1:1-Verdünnung aus komplettem Freund’schen Adjuvant (FCA) und physiologischer Salzlösung
- zwei Injektionen mit Maisöl
- zwei Injektionen einer 1:1-Verdünnung aus FCA und Maisöl
Ca. 24 Stunden nach der Behandlung wurden die Hautbeobachtungen durchgeführt.
Für die topische Induktion wurde sechs Tage nach der intradermalen Induktion die Rückenhaut in der Schulterregion der Meerschweinchen erneut rasiert und zur Empfindlichkeitssteigerung mit einer 10 %igen Verdünnung von Natriumlaurylsulfat in Vaseline bestrichen. Am folgenden Tag wurden in dieser Region 2 x 4 cm große Binden, die zuvor mit der Prüfsubstanz SLM 88000 (100 %) beladen wurden, über den Einstichstellen der intradermalen Induktion fixiert. Bei der Kontrollgruppe wurden frische Binden (ohne Prüfsubstanz) eingesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Binden entfernt und die Hautstellen bewertet.
14 Tage nach der topischen Induktion wurde die Provokation durchgeführt. Dazu wurde eine Fläche von 5 x 5 cm an beiden Flanken aller Tiere rasiert. Bei allen Tieren wurden Binden, die die Provokationsdosis (30 % SLM 88000 in Maisöl sowie 100 % SLM 88000) bzw. pures Maisöl enthielten, fixiert. Nach 24 Stunden wurden alle Binden entfernt. Nach weiteren 24 bzw. 48 Stunden wurden die Hautstellen begutachtet. Dabei bildet die bereits erwähnte Bewertungsskala nach Magnusson und Kligmann [Magnusson Kligman] den Maßstab.
Alle Tiere haben den Versuch bei guter Gesundheit und mit einer normalen Entwicklung des Körpergewichts beendet. Generell lassen sich bei der intradermalen Injektion die folgende Hautreaktionen festhalten:
Testgruppe:
- FCA/physiologische Salzlösung (1:1): mittelgradiges Erythem - 0,1 % SLM 88000 in Maisöl: leichtes Erythem
- 0,1 % SLM 88000 in FCA/Maisöl (1:1): mittelgradiges Erythem Kontrollgruppe:
- FCA/physiologische Salzlösung (1:1): mittelgradiges Erythem
- Maisöl: keine Hautreaktion
- FCA/Maisöl (1:1): mittelgradiges Erythem Die topische Vorbehandlung der Hautstellen mit 10%igem Natriumlaurylsulfat führte sowohl bei der Testgruppe als auch bei der Kontrollgruppe zu einem deutlichen Erythem. Nach der topischen Applikation bei der Kontrollgruppe (frische Binden ohne Testsubstanz) wurde ein leichtes Erythem festgestellt. Bei der Testgruppe dagegen wurde bei der Applikation von 100 % der Testsubstanz SLM 88000 nach 48 Stunden ein mittelgradiges Erythem beobachtet.
Die Ergebnisse der Provokation sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Häufigkeit von Hauterscheinungen nach der Provokation
Hautbeurteilung 24 h 48 h
0 % 30 % 100 % 0 % 30 % 100 %
Leichtes Erythem
Kontrolle 4/5 0/5 0/5 2/5 0/5 0/5
Test 5/10 3/10 2/10 4/10 0/10 0/10
mittelgradiges Erythem
Kontrolle 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
Test 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10
Tabelle 11: Übersicht zur Häufigkeit von Hauterscheinungen nach der Provokation durch Konzentrationen von 0 %, 30 % bzw. 100 % an SLM 88000
Die Funktionalität des Tests wird bei TNO regelmäßig überprüft. Als positive Kontrolle wird mit der Substanz α-Hexylzimtaldehyd (10 % bzw. 20 %) provoziert.
Alle Tiere zeigten in der Vergangenheit darauf eine positive Reaktion. Durch die erfolgreiche Positivkontrolle können die oben dargelegten Ergebnisse mit der verwendeten Tierstammlinie als valide angesehen werden.
Durch die Provokation mit einer Dosis von 30 % bzw. 100 % an SLM 88000 wurde bei Tieren der Testgruppe Hautreaktionen hervorgerufen. Nach 24 Stunden zeigte jeweils eins der zehn Tiere ein mittelgradiges Erythem, während bei zwei bzw. drei der zehn Tiere ein leichtes Erythem festgestellt werden konnte. In der Kontrollgruppe dagegen traten durch die Provokation keinerlei Hautveränderungen auf. Maisöl alleine erzeugte sowohl in der Test- als auch in der Kontrollgruppe leichte bis mittelgradige Erytheme.
Da bei den Dosierungen von SLM 88000 die Kontrolltiere nach der Provokation keine Hautreaktion zeigten, während einige Testtiere Erytheme entwickelten, wird SLM 88000 entsprechend den EG-Standards [Official Journal] als „sensibilisierend“
eingestuft. Die Reaktion wird nicht der hautreizenden Eigenschaft von SLM 88000
zugeschrieben (siehe Kapitel 5.4 Akute Hautreizung, Seite 18), da in diesem Falle auch die Kontrolltiere Erytheme hätten ausbilden müssen.
5.7 Mutagenitätstests
Zur Abschätzung des mutagenen Potentials von SLM 88000 liegen im Moment zwei unabhängige Tests vor. Zum einen wurde ein klassischer Ames-Test, zum anderen ein Chromosomenabberationstest durchgeführt. Beide Tests werden im Anschluß genauer beschrieben.
5.7.1 Ames-Test [TNO report V 5605/06]
Der Ames-Test wurde gemäß der EG Directive 2000/32/EG, Methode B.14 (Salmonella typhimurium) bzw. B.13 (E.coli) [2000/32/EG B.13/B.14] sowie der OECD Guideline Nr. 471 [OECD 471] durchgeführt.
Der Ames-Test ist ein Bakterientest zum Nachweis der mutagenen Wirkung von Stoffen. Dazu werden Mutanten von Salmonella typhimurium, die nur bei Zusatz von Histidin zum Nährmedium wachsen können (his--Mutanten, Histidin-auxotrophe Organismen) eingesetzt. Die Behandlung dieser Bakterien mit mutagenen Stoffen bewirkt die Rückmutation zum Wildtyp, der als his+-Stamm auch ohne Histidin-Gabe wachsen kann (Rückmutationstest). Durch den Einsatz von Salmonella-Stämmen mit unterschiedlich mutiertem Histidin-Gen kann man Rückschlüsse auf die Art der Mutation ziehen. Damit auch Mutagene erfasst werden, die erst nach Bioaktivierung mutagen wirken, werden aktivierende Systeme in Form von Enzympräparaten zugesetzt. Bewährt hat sich dabei der sogenannte S9-Mix. Der S9-Mix ist der bei 9000 g für 10 Minuten zentrifugierte Überstand eines Leberhomogenats. Er besteht aus dem Cytosol sowie aus den Mikrosomen. Damit enthält der S9-Mix die wesentlichen Enzyme, die für den Phase-I-Metabolismus verantwortlich sind, z.B.
Cytochrom-P450-Enzyme. Was dem S9-Mix jedoch fehlt und unbedingt zugesetzt werden muß, ist NADPH bzw. ein NADPH-generierendes System. Der Phase-II- Metabolismus ist durch die Verdünnung von Kofaktoren – das Leberhomogenat wird z.B. als eine 0,25 molare Saccharose-Lösung hergestellt – nur rudimentär vorhanden.
Bei der vorliegenden Studie wurden die Salmonella typhimurium-Stämme TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537, sowie die Tryptophan-abhängige E.coli-Mutante WP2 uvrA, sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit eines metabolisch aktivierenden Systems (S9-Mix) getestet. Der S9-Mix wurde gemäß der von Ames et al. [Ames 1975, Ames 1983] veröffentlichten Methode aus zwölf männlichen Wistar-Ratten von Charles River, Deutschland, gewonnen. Dazu wurde den Ratten fünf Tage vor der Leberentnahme Aroclor 1254 verabreicht, um eine Enzyminduktion zu bewirken. Das Leberhomogenat wurde als 0,15 molare KCl-Lösung eingesetzt.
Die Salmonella typhimurium-Stämme wurden von Dr. B.N. Ames, University of California Berkeley, USA, und der E.coli-Stamm von Dr. C. Voogd, National Institute of Public Health, Bilthoven, Niederlande, bezogen. Die Genotypisierung der Stämme ist in der folgenden Tabelle 12 dargelegt.
Zusätzliche Mutationen1
Stamm Aminosäurenmutation LPS UV-Reparatur R-Faktor TA 98
TA100 TA 1535 TA 1537 WP2 uvrA
His D3052 His G46 His G46 His C3076
Trp
rfa- rfa- rfa- rfa- rfa+
uvrB- uvrB- uvrB- uvrB- uvrA-
+R +R -R -R -R 1) rfa: diese Mutation verursacht einen partiellen Verlust der Lipoyl-
saccharidbarriere (LPS), die die Oberfläche der Bakterien bedeckt;
dadurch wird die Permeabilität erhöht, so dass auch größere Moleküle, wie Kristallviolett, aufgenommen werden können
uvrA/B- diese Mutationen verursachen einen Verlust der Gen-Codierung für das DNA Excisionsreparatursystem; daraus folgt eine erhöhte Sensibilität gegenüber vielen Mutagenen inclusive UV-Strahlung R-Faktor: die R-Faktor-Stämme enthalten das Plasmid pKM 101, das die
chemische sowie die spontane Mutagenese durch Stimulierung eines fehleranfälligen DNA-Reparatursystems erhöht; es trägt ein Ampicillin-Resistenzgen
Tabelle 12: Genotypen von den Salmonella typhimurium- bzw. E.coli-Stämmen
Die Prüfsubstanz SLM 88000 wurde in DMSO auf eine Konzentration von 50 mg/mL verdünnt. Um zwei voneinander unabhängige Versuchsreihen zu erhalten, wurden eine Zweifach-Verdünnung und eine Dreifach-Verdünnung hergestellt. Bei der Zweifach-Verdünnung wurden fünf Konzentrationen in dem Bereich von 312 bis 5000 µg/Platte getestet, bei der Dreifach-Verdünnung fünf Konzentrationen in dem Bereich von 62 bis 5000 µg/Platte. Um einer möglichen Polymerisation der Prüfsubstanz vorzubeugen, wurde diese so spät wie möglich verdünnt und eingesetzt. Eine positiv- Kontrolle wurde – entsprechend der Tabelle 13 – mitgeführt. Als negativ-Kontrolle wurde reines DMSO (SLM 88000: 0 µg/Platte) eingesetzt.
Substanzen und Konzentrationen für die Positiv-Kontrollen
Stamm Ohne S9-Mix Mit S9 Mix
TA 98 2-Nitrofluoren:
2.0 µg/Platte
2-Aminoanthracen:
2.0 µg/Platte TA 100 Natriumazid:
1.0 µg/Platte
2-Aminoanthracen:
2.0 µg/Platte TA 1535 Natriumazid:
1.0 µg/Platte
2-Aminoanthracen:
2.0 µg/Platte TA 1537 9-Aminoacridin:
80.0 µg/Platte
Benzo(a)pyren:
4.0 µg/Platte WP 2 uvrA N-Ethyl-N-Nitrosoharnstoff:
100 µg/Platte
2-Aminoanthracen:
80.0 µg/Platte
Tabelle 13: Substanzen und Konzentrationen für die Positiv-Kontrollen
Die Ergebnisse der beiden Versuchsreihen sind in den folgenden beiden Tabellen wiedergegeben. Ausgezählt wurden bei den Salmonella typhimurium-Platten die his+- bzw. bei den E.coli-Platten die trp+-Revertantenkolonien. Zur Übersicht sind jeweils nur die Mittelwerte aus einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung angegeben.
TA 98 TA 100 TA 1535 TA 1537 WP 2 uvrA µg/Platte - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9
0 MW 38 62 177 189 24 18 10 14 24 38
STD 3 3 8 13 2 5 3 6 10 11
312 MW 30 48 180 203 32 20 14 13 35 44
STD 4 14 6 5 4 9 9 4 8 9
625 MW 31 49 191 190 34 25 13 21 33 46
STD 2 6 34 24 3 6 6 6 3 5
1250 MW 30 52 193 205 32 22 9 22 40 53
STD 2 8 18 19 3 1 4 3 14 7
2500 MW 37 67 213 172 29 19 13 16 33 47
STD 9 8 25 33 4 6 3 3 3 10
5000 MW 26 60 193 190 27 21 15 16 26 47
STD 3 7 10 7 5 4 6 3 6 1
+ Kontr. MW 1675 1193 818 3344 689 442 1170 233 188 1773 STD 197 236 31 153 16 53 839 8 3 240
MW: Mittelwert aus einer Dreifachbestimmung STD: Standardabweichung
+ Kontr.: positiv-Kontrolle
- S9: Abwesenheit vom aktivierenden S9-Mix + S9: Anwesenheit vom aktivierenden S9-Mix
Tabelle 14: erste Versuchsreihe des Ames-Tests (Zweifach-Verdünnung)
TA 98 TA 100 TA 1535 TA 1537 WP 2 uvrA µg/Platte - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9 - S9 + S9
0 MW 33 50 186 184 29 28 17 23 44 50
STD 11 14 5 16 4 7 3 8 4 3
62 MW 36 62 185 183 30 20 18 25 53 50
STD 13 6 3 5 6 5 2 9 5 4
185 MW 28 58 176 179 19 29 20 16 45 41
STD 6 10 15 22 3 3 8 6 9 4
556 MW 25 58 142 197 27 17 11 22 46 50
STD 2 2 10 11 4 5 3 12 3 7
1667 MW 42 64 190 176 27 26 1 0 41 52
STD 6 6 4 15 2 1 1 1 2 10
5000 MW 39 57 160 187 30 24 11 17 38 46
STD 8 10 9 8 2 10 2 6 4 6
+ Kontr. MW 2222 1518 785 2844 602 677 3134 263 193 1771 STD 324 50 25 309 61 33 633 23 40 125
MW: Mittelwert aus einer Dreifachbestimmung STD: Standardabweichung
+ Kontr.: positiv-Kontrolle
- S9: Abwesenheit vom aktivierenden S9-Mix + S9: Anwesenheit vom aktivierenden S9-Mix
Tabelle 15: zweite Versuchsreihe des Ames-Tests (Dreifach-Verdünnung)
Zur Beurteilung der Ergebnisse benötigt man die Aussage, welche Kolonienanzahlen für einen positiven bzw. einen negativen Befund akzeptiert werden. Diese Werte sind in der nachstehenden Tabelle 16 aufgeführt.
Revertantenkolonien in der negativ-Kontrolle (0 µg/Platte)
Minimales Mutationsverhältnis
Stamm - S9 / + S9 - S9 + S9
TA 98 20 – 95 5 3
TA 100 100 – 230 3 3
TA 1535 10 – 75 5 5
TA 1537 4 – 40 10 3
WP 2 uvrA 18 – 60 3 5
- S9: Abwesenheit vom aktivierenden S9-Mix + S9: Anwesenheit vom aktivierenden S9-Mix
Mutationsverhältnis: Anzahl der induzierten Revertanten/ Anzahl der Revertanten in der negativ-Kontrolle
Tabelle 16: Beurteilungskriterien für den Ames-Test
Man erkennt, dass alle negativ-Kontrollen sowie alle positiv-Kontrollen im akzeptierten Bereich liegen. Zusätzlich wurde der Untergrundbewuchs unter dem Mikroskop untersucht, um festzustellen, ob die Substanz einen cytotoxischen Effekt ausübt. Die cytotoxische Wirkung würde sich in einer Reduktion des Untergrundbewuchses bzw. einer Verminderung der Revertanten-Kolonien im Vergleich zur negativ-Kontrolle zeigen. Der Untergrundbewuchs weist keine Auffälligkeiten auf. Die Revertanten-Kolonien sind bei keiner Dosierung von SLM 88000 im Vergleich zur negativ-Kontrolle reduziert. Hier bilden die Werte aus der zweiten Versuchsreihe vom Stamm TA 1537 und einer Dosierung von 1667 µg/Platte eine Ausnahme. Der Grund könnte darin liegen, dass womöglich keine Bakterien dem Agar zugefügt wurden. Es handelt sich allerdings um ein einmaliges Ereignis.
Aus dieser Datenlage kann man schließen, das SLM 88000 keinen cytotoxischen Effekt ausübt.
Bei keiner Dosierung und bei keinem Stamm liegt die Anzahl der Revertanten- Kolonien oberhalb des Doppelten der negativ-Kontrolle. Da die positiv- und negativ- Kontrollen ordnungsgemäß ausgefallen sind und SLM 88000 keine cytotoxische Wirkung besitzt, kann man aus dieser Datenlage ableiten, dass SLM 88000 unter den Bedingungen dieser Studie mit oder ohne Aktivierung kein mutagenes Potential aufweist.
5.7.2 Chromosomenaberrationstest [TNO report V5602/07]
Der Chromosomenaberrationstest folgt der EG Directive 2000/32/EG, Methode B.10 [2000/32/EG B.10] sowie der OECD Guideline Nr. 473 [OECD 473].
Dieser cytogenetische in vitro-Test ist ein Kurzzeit-Mutagenitätstest zum Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen an kultivierten Säugetierzellen. Diese Säugertierzellen werden in Abwesenheit sowie in Anwesenheit eines meta- bolisierenden Systems der Prüfsubstanz ausgesetzt. Nach der Exposition werden die Zellkulturen mit einem Spindelgift behandelt, um eine Anreicherung von Metaphasen zu erhalten. Die Zellen werden aufgearbeitet und Chromosomenpräparate daraus hergestellt. Die Präparate werden eingefärbt und die Metaphasen im Hinblick auf Chromosomenveränderungen untersucht.
In der vorliegenden Studie wurden Zellen aus den Eierstöcken von chinesischen Hamstern eingesetzt, die von Prof. Dr. A.T. Natarajan von der Universität Leiden, Niederlanden, bezogen wurden. Diese CHO-Zellen (CHO K-1 Linie) wurden für eine Dauer von vier Stunden in Anwesenheit der Prüfsubstanz SLM 88000 bei gleichzeitiger Ab- bzw. Anwesenheit eines metabolisierenden Systems kultiviert. Als metabolisierendes System wurde der gleiche S9-Mix unter Zugabe eines NADPH- generierenden Systems verwendet wie beim Ames-Test (siehe Kapitel 5.7.1 Ames- Test, Seite 31). Es wurden zwei unabhängige Testreihen durchgeführt. Für beide Testreihen wurde die Prüfsubstanz SLM 88000 in DMSO gelöst. Beim ersten Test betrugen die Endkonzentrationen der Prüfsubstanz in Abwesenheit vom aktivierenden S9-Mix 500, 1000, 2000 µg/mL sowie 1000, 2000 und 2723 µg/mL bei Anwesenheit vom S9-Mix. Im zweiten Test beliefen sich die Endkonzentrationen an
SLM 88000 sowohl bei Ab- als auch bei Anwesenheit vom S9-Mix auf 1000, 1500 sowie 2000 µg/mL. Als negativ-Kontrolle wurde reines DMSO eingesetzt. Die positiv- Kontrolle bei Abwesenheit des aktivierenden Systems wurde durch Zugabe von Mitomycin C erreicht. Als positiv-Kontrolle bei Anwesenheit des metabolisierenden S9-Mixes kam Cyclophosphamid zum Einsatz. Nach vier Stunden Inkubationszeit wurden die Zellen mit einem Phosphat-Puffer gewaschen und in einem frischen Medium erneut kultiviert. Nach 16 Stunden wurde das Spindelgift Colcemid, ein synthetisches Analogon von Colchizin, zugegeben, so dass nach 18 Stunden geerntet werden konnte. Für jede Kultur wurden zwei Bilder im Mikroskop untersucht.
Dabei wurden mindestens 500 Nuclei pro Bild untersucht, um den prozentualen Anteil der Zellen zu ermitteln, die sich in der Mitose befanden. Dieser Anteil lag zwischen 3,0 und 11,0 % der beobachteten Zellen. Zusätzlich wurde ein mitotischer Index errechnet, der die Anzahl der Zellen, die sich in der Mitose befinden, ins Verhältnis setzt zu denen der negativ-Kontrolle. Eine Übersicht über den mitotischen Index liefert die folgende Tabelle.
Versuchsreihe aktivierendes System Dosis in µg/mL Mitotischer Index in %
01 100
500 94
1 - S9 1000 90
2000 83
0,12 63
01 100
1000 94
1 + S9 2000 50
2732 54
5,03 51
Versuchsreihe aktivierendes System Dosis in µg/mL Mitotischer Index in %
01 100
1000 83
2 - S9 1500 66
2000 64
0,052 107
01 100
1000 77
2 + S9 1500 69
2000 66
5,03 36
1) DMSO: negativ-Kontrolle
2) Mitomycin C: positiv-Kontrolle bei Abwesenheit vom S9-Mix 3) Cyclophosphamid: positiv-Kontrolle bei Anwesenheit vom S9-Mix
Tabelle 17: Übersicht über den mitotischen Index
Für die Bestimmung der Chromosomenaberrationen wurden je 100 Metaphasen pro Bild analysiert. Die Ergebnisse der beiden Versuchsreihen sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst. Dabei wurde zwischen strukturellen Chromosomen- aberrationen (Chromatidenbruch bzw. -austausch, Chromosomenbruch bzw. - austausch sowie andere Chromosomenveränderungen), Gaps sowie numerischen Chromosomenaberrationen (Polyploidie oder andere) unterschieden. Die Einzel- ergebnisse der beiden Bilder pro Kultur sind in den Tabellen aufsummiert dargestellt.
Zunächst sind die Ergebnisse der jeweiligen Versuchsreiche in Abwesenheit und dann in Anwesenheit des metabolisch aktivierenden S9-Mixes aufgeführt.
Dosis Zellen Chromosomenaberrationen
In struktureller Art Gaps numerischer Art
µg/mL Chromatiden- Chromosomen- andere Polyploidie andere Bruch Austausch Bruch Austausch
01 200 0 0 0 0 0 3 0 0
500 200 0 0 0 0 0 0 0 0
1000 200 0 0 0 0 0 2 0 0
2000 200 1 0 0 0 0 2 0 0
0,12 200 27 41 1 0 0 0 0 0
1) DMSO: negativ-Kontrolle 2) Mitomycin C: positiv-Kontrolle
Tabelle 18: erste Versuchsreihe in Abwesenheit vom S9-Mix
Dosis Zellen Chromosomenaberrationen
In struktureller Art Gaps numerischer Art
µg/mL Chromatiden- Chromosomen- andere Polyploidie andere Bruch Austausch Bruch Austausch
01 200 1 0 0 0 0 4 0 0
1000 200 0 1 0 0 0 4 0 0
2000 200 1 7 0 0 0 8 0 0
2723 200 1 1 0 0 0 1 0 0
5,02 200 21 29 5 0 0 0 0 0
1) DMSO: negativ-Kontrolle
2) Cyclophosphamid: positiv-Kontrolle
Tabelle 19: erste Versuchsreihe in Anwesenheit vom S9-Mix
