Biochemie der Medizinischen Hochschule Hannover
Expression der Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors c-Myb im pGEX-6P-
System und biophysikalische Charakterisierung mittels CD- und Fluoreszenzkorrelations-Spektroskopie
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Mirco Müller aus Burgwedel
Hannover, 2008
am 27.04.2010
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: P.D. Dr. Heiner Wolfes
Referent: Prof. Dr. Bernhard Brenner Koreferentin: Prof. „in Dr. Beate Sodeik Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2010
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Sigurd Lenzen
Prof. Dr. Evgeni Ponimaskin
Prof. Dr. Reinhard Schwinzer
1. Einleitung ... 4
1.1 Krebs - Tumorigenese ... 4
1.2 Genregulation und Transkriptionsfaktoren ... 5
1.3 Das Myb-Onkoprotein ... 5
1.4 Die DNA-Bindungsdomäne ... 7
1.5 Die Transaktivierungsdomäne TAD ... 9
1.6 Der N-Terminus... 10
1.7 Die negativ-regulatorische Domäne NRD ... 10
1.8 Phosphorylierungsstellen ... 11
1.9 Myb reguliert das Zellwachstum ... 12
1.9.1 c-Myb reguliert Gene ... 12
1.9.2 Regulation von c-Myb ... 14
1.9.3 Kofaktoren von c-Myb ... 14
1.10 Ziel der Arbeit ... 15
2. Materialien und Methoden ... 16
2.1 Mikrobiologische Methoden ... 16
2.1.1 Arbeiten mit Escherichia coli... 16
2.1.2 Transformation von E. coli ... 16
2.1.3 Kulturmedien ... 16
2.1.4 Vektor pGEX-6P-1 ... 17
2.1.5 Expression von Proteinen ... 18
2.1.5.1 Expressionstest ... 18
2.1.5.2 Fermentation und Proteinexpression ... 19
2.2 Molekularbiologische Methoden ... 19
2.2.1 Plasmidpräparation ... 19
2.2.2 Restriktionsspaltung ... 21
2.2.3 Dephosphorylierung ... 22
2.2.4 Phosphorylierung ... 22
2.2.5 Ligation ... 22
2.2.6 Konzentrationsbestimmung von DNA ... 23
2.2.7 DNA-Isolierung aus Agarosegelen ... 23
2.2.8 Gelelektrophorese ... 24
2.2.9 Electrophoretic-Mobility-Shift-Assay (EMSA) ... 27
2.3 Proteinbiochemische Methoden ... 29
2.3.1 Proteinaufreinigung: Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen ... 29
2.3.2 Proteinmarkierung ... 30
2.3.2.1 Markierungsreaktion ... 30
2.3.2.2 Aufreinigung des markierten Proteins ... 31
2.3.2.3 Berechnung der Proteinkonzentration und des Markierungsgrads ... 32
2.3.3 Konzentrierung der Proben ... 32
2.4 Biophysikalische Methoden ... 33
2.4.1 Schmelzkurven von Oligonukleotiden ... 33
2.4.2 Aufnahme von CD-Spektren ... 33
2.4.3 Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ... 36
2.4.4 Kreuzkorrelation ... 38
2.5 Verwendete Computerprogramme ... 38
2.5.1 CDPro ... 38
2.5.1 RasMol ... 39
2.5.2 BPCFIT ... 39
2.5.3 ISS® Inc. Vista Fluorescence Correlation Spectrometry Software ... 39
2.5.4 Origin® ... 39
2.5.6 Oligonucleotide Properties Calculator ... 39
3. Ergebnisse ... 40
3.1 Molekularbiologischer Teil ... 40
3.1.1 Klonierung und Aufreinigung der c-Myb-DNA-Bindungsdomäne ... 40
3.1.2 EMSA ... 49
3.1.3 Konzentrationsbestimmung der präparierten Bindungsdomäne ... 51
3.1.4 Markierung der c-Myb-Bindungsdomäne mit dem Farbstoff Alexa 594 ... 54
3.2 Biophysikalischer Teil ... 56
3.2.1 Biophysikalische Charakterisierung der Oligonukleotide ... 56
3.2.2 Fluoreszenzspektrum der mit Alexa konjugierten Bindungsdomäne ... 59
3.2.3 CD-Spektrum der Bindungsdomäne ... 60
3.2.4 Messung der thermischen Denaturierung der Bindungsdomäne und des Komplexes mittels CD ... 62
3.2.5 Auswertung und Ergebnisse der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ... 65
3.2.6 Auswertung und Ergebnisse des Kreuzkorrelationsexperiments ... 77
4. Diskussion ... 87
5. Zusammenfassung ... 94
6. Literaturverzeichnis... 95
7. Abkürzungsverzeichnis ... 101
8. Anhang ... 102
1. Einleitung
1.1 Krebs - Tumorigenese
Krebs ist eine genetische Erkrankung und beruht auf einem Ungleichgewicht der sonst exakt regulierten Zellteilung und -Entwicklung. In dieser Dysregulation des Wachstums spielen die unkontrollierte Aktivierung von wachstumsinduzierenden Genen (Onkogenen) und der Verlust bzw. die Inaktivierung von wachstumshemmenden Genen (Tumorsuppressorgenen) eine wichtige Rolle. Außerdem besitzen Tumorzellen eine hohe Telomeraseaktivität. Das Enzym Telomerase verhindert die altersabhängige Verkürzung der Chromosomenenden bei der Replikation.
Die meisten Tumoren sind monoklonal und leiten sich von einer einzigen Zelle ab. Sie entwickeln sich rasch zu einer heterogenen Tumorzellpopulation, die unterschiedliche Genveränderungen trägt.
Zu den an der Tumorigenese beteiligten Faktoren gehören Zellkommunikations-, Differenzierung-, Proliferations- sowie immunologische Faktoren. Bei der Zellkommunikationsstörung kommt es durch das Fehlen von Zelladhäsionsmolekülen dazu, dass Zellen sich nicht mehr zum Gewebe zusammenschließen, sich unabhängig von den Nachbarzellen ständig teilen können und den Zellverband verlassen können.
Bei einer Differenzierungsstörung kann es sowohl zu einer Entdifferenzierung von spezialisierten Organzellen kommen als auch zu einer Blockade der Differenzierung.
Durch den Ausfall von Tumorsuppressorgenen und die unkontrollierte Aktivierung von Onkogenen kommt es zum Ausfall der Proliferationsunterdrückung.
Protoonkogene kodieren für Proteine, die die Zellvermehrung steuern und werden physiologischerweise nur in Phasen des embryologischen, regenerativen und adaptiven Wachstums exprimiert. In Krebszellen werden Protoonkogene zu Onkogenen (Krebsgenen) aktiviert. Eine Änderung eines Allels genügt, um eine unkontrollierte Genexpression auszulösen.
Veränderungen, die zu ihrer Aktivierung und damit zur Bildung von Onkoproteinen mit transformierendem Potential führen, sind Punktmutationen, chromosomale Translokation, Genamplifikation und Deregulation (unkontrollierte Expression durch autokrine Selbststimulation der Zelle oder Virusinsertion, Abkoppelung von physiologischem Gegenspieler). Zu den Onkoproteinfunktionen gehören: Wachstums- faktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, transmembranöse Signalübertragung,
spezifische Proteinkinasen, G-Proteine, Replikationsfaktoren und Transkriptions- faktoren.
1.2 Genregulation und Transkriptionsfaktoren
Bei den eukaryontischen Zellen existieren vielfältige Mechanismen zur Regulation der Genexpression: Aktivierung und Repression von Genen, Initiation der Transkription, Hemmung der Transkription, RNA-Editing, alternatives Splicing der RNA sowie deren Transport und Abbau. Eine wichtige Rolle bei der Regulation kommt dabei den regulierbaren Transkriptionsfaktoren zu. Sie benötigen wenigstens zwei Domänen, eine für die DNA-Bindung (DNA-Bindungsdomäne) und eine, die die Transkription aktiviert (Transaktivierungdomäne). Ferner können Transkriptionsfaktoren eine Ligandenbindungsdomäne besitzen. Die Bindungsdomänen binden an Enhancer-, seltener auch Silencer-Elemente der DNA, die meist palindromisch aufgebaut sind. In der Regel sind sie nicht länger als 20 Basenpaare. Strukturen der Bindungsdomäne sind die Helix-Turn-Helix- oder Helix-Loop-Helix-Struktur und das Zinkfingermotiv. Im Helix- Turn-Helix Motiv findet sich meist eine Anordnung von drei alpha-Helices, von denen mindestens eine an DNA bindet, während die andere(n) Protein-Protein- Wechselwirkungen eingehen. Im Leucin-Zipper zeigt sich gehäuft eine Anordnung von Leucinen in jeder 7. Position auf einer Seite der Helix, so dass es zu hydrophoben Wechselwirkungen mit dem Partnermolekül kommt. N-Terminal sind vermehrt basische Aminosäuren zu finden, welche die Bindung an DNA ermöglichen (Landschulz et al., 1988; Busch et al., 1990).
1.3 Das Myb-Onkoprotein
Die Myb-Genfamilie besteht aus den drei kernständigen Transkriptionsfaktoren A-, B- und c-myb. In der Entdeckung der Myb-Proteinfamile wurde zunächst das virale Proto- Onkogen v-myb bei zwei Vogelviren gefunden: AMV (Avian Myeloblastosis Virus) (Hall et al., 1941) und E26 (Ivanov et al., 1965). Diese Retroviren induzieren bei Tieren eine
akute Leukämie mit Myeloblastenexzess. Die Abkürzung Myb leitet sich ab von dem Begriff der Myeloblastose.
Die Myb-Proteine besitzen eine N-terminale DNA-Bindungsdomäne, eine zentrale Transaktivierungsdomäne und eine C-terminale regulatorische Domäne. Die C-terminale Domäne von c-Myb zeigt einen negativ-regulatorischen Effekt.
Die viralen v-myb-Gene (AMV, E26) exprimieren verkürzte Versionen von c-Myb. Diesen Formen fehlen die negativ-regulierende Domäne (NRD), der erste Repeat und die Casein-Kinase-II-Phosphorylierungsstelle. Zur onkogenen Aktivierung scheinen ein Verlust der NRD und eine konstitutive Expression in der verkürzten Variante notwendig zu sein. Für die Transformation sind der Repeat 2 und 3 sowie die Transaktivierungsdomäne (TAD) hinreichend.
Die Expression der c-myb-Gene ist zellzyklusabhängig und erreicht sein Maximum in der späten G1- und S-Phase. C-myb wird überwiegend in Vertebraten in unreifen hämatopoetischen Zellen exprimiert und ist an der Regulation der Produktion des fetalen Hämoglobins bei Erwachsenen beteiligt (Jiang et al., 2006). Unterschiedliche Stadien der Hämatopoese sind abhängig von dem Expressionsniveau des c-myb-Gens (Emambokus et al., 2003; Vegiopoulos et al., 2006).
Überexpression von c-myb oder Aktivierung durch retrovirale Insertion oder Gen- Rearrangement blockieren die Differenzierung einiger hämatopoetischer Zellinien. Ein embryonaler Verlust führt zur Lethalität, die auf ein Versagen der fetalen hepatischen Hämatopoese zurückzuführen ist (Il-Hoan Oh et al., 1999; Mucenski et al., 1991).
Das Haupttranskriptionsprodukt des c-myb-Protoonkogens ist ein 75 kDa Kernprotein mit einer Länge von 636 Aminosäuren (Gonda et al., 1982) Das c-myb-Gen ist hochkonserviert und findet sich in in allen Vertebraten und einigen Invertebraten, Pilzen, Pflanzen und Insekten (Lipsick 1996, Review).
1.4 Die DNA-Bindungsdomäne
Die DNA-Bindungsdomäne ist 154 Aminosäuren lang und befindet sich am Aminoterminus des Proteins an Positionen 38-193. Sie besteht aus drei unvollständigen hintereinandergelegenen Repeats von 51 oder 52 Aminosäuren. Jeder Repeat enthält 3 Tryptophane mit einem Abstand von 18 oder 19 Aminosäuren. Dieses Motiv ist hoch konserviert zwischen Maus, Mensch, Huhn und Drosophila. Die regelmäßige Abfolge der Tryptophanreste wurde in ähnlicher Weise auch in einigen anderen Proteinen der Myb-Familie entdeckt. Zu ihnen gehören der eukaryontische Transkriptionsterminationsfaktorfaktor TTF-1 (Evers et al.; 1995) oder der “Telomerase related binding factor“ (TRBF) (Chong et al., 1995). Die Repeats der homologen Familie besitzen untereinander eine stärkere Übereinstimmung als die Repeats innerhalb eines Proteins. Als Kriterium für die Familienzugehörigleit gilt die folgende Konsensussequenz der Repeats:
W-[ST]-(X)2-E-[DE]-(X)2-[LIV]
Diese Konsensussequenz entstammt der Datenbank Prosite im Verbund der Swiss- Protein-Bank. Eckige Klammern bezeichnen alternative Aminosäure. Indizes geben die Anzahl der beliebigen Aminosäure X an.
Jeder der Repeats besteht aus zwei bis drei alpha-Helices (Ogata et al., 1992; McIntosh et al., 1998). Die Rolle des ersten Repeats ist unklar. R1 konnte in Denaturierungsexperimenten als thermodynamisch stabilster Repeat identifiziert werden. R1 fehlt in den meisten Myb-Proteinen von Invertebraten und v-Myb.
Mutagenese und strukturelle Untersuchungen haben in vitro gezeigt, dass die Entfernung von R1 die Bindungsaktivität nicht drastisch beeinflusst (Howe et al., 1990).
R1 kann vermutlich als ergänzende Bindungsdomäne dienen, die die Bindungsaffinität von Myb an DNA verbessert. Desweiteren wird diskutiert, dass R1 eine Rolle als Protein-spezifische Bindungsdomäne spielt (Ogata et al., 1992; McIntosh et al., 1998).
Abbildung 1.1: Dreidimensionale Struktur der DNA-Bindungsdomäne (R2 und R3) im Komplex mit
DNA (Ogata et al., 1994, Daten aus Brookhaven-Datenbank, Darstellung mit RasMol) Die Abbildung zeigt die von Ogata postulierte Struktur der Repeats R2 und R3 der Bindungsdomäne, die
aus jeweils drei α-Helices bestehen, hervorgehoben: Tryptophan-Reste
Der Repeat R2 besitzt die flexibelste Struktur von allen (Sarai et al., 1993). Das Helix- Turn-Helix Motiv in R2 wird vermutlich erst während der Bindung an DNA ausgebildet.
R2 enthält einen hochkonservierten Cysteinrest (Cys-130), dessen Thiol-Gruppe frei zugänglich ist. Es ist essentiell für die Bindung von c-Myb an DNA, dass der Cysteinrest reduziert vorliegt. Ein oxidiertes Cys-130 verhindert offenbar die korrekte Faltung des zweiten Repeats bei der Bindung an DNA. Die Reduktion wird durch den Redoxfaktor REF-1 kontrolliert (Jamin et al., 1993; Guehmann et al., 1992). Ferner wird diskutiert, dass die Repeats R2 und R3 sowohl an DNA und an zelluläre Proteine binden können (Ness et al., 1996)
Die Struktur des dritten Repeats, der essentiell für die DNA-spezifische Bindung ist, enthält drei Helices. Sie werden durch die hydrophobe Tasche, die die 3 Tryptophane und 2 Histidine enthält, aufrechterhalten. NMR Studien der aus den Repeats R2 und R3 bestehenden Domäne im Komplex mit DNA haben gezeigt, dass sich diese Repeats in
die große Furche der doppelsträngigen DNA lagern und dass Asparagin-183 (R3), Lysin-182 (R3) und Lysin-128 (R2) spezifisch mit den Basen AAC des Erkennungsmotivs T/C A A C G/T G interagiert. (Ogata et al., 1992).
Abbildung 1.2: Struktur der DNA-Bindungsdomäne (R2 und R3) (McIntosh et al., 1998, Daten aus Brookhaven-Datenbank, Darstellung mit RasMol). Die Abbildung zeigt die von McIntosh
postulierte Struktur der Repeats R2 und R3 der Bindungsdomäne, die aus jeweils zwei α-Helices und einem unstrukturierten Bereich bestehen, hervorgehoben sind die konservierten Tryptophanreste
Diese Abbildung zeigt im Gegensatz zu der von Ogata postulierten Struktur, dass die Repeats aus nur zwei α-Helices und einem unstrukturierten Bereich bestehen. Ogata forderte, dass die Repeats aus jeweils drei α-Helices bestehen.
Die spezifische Bindung von c-Myb führt, wie auch für andere Transkriptionsfaktoren beschrieben, zu einer Biegung der DNA (Saikumar et al., 1994). Die Sekundärstruktur der Repeats 2 und 3 ändert sich bei Bindung an die DNA um 10% (Ebneth et al., 1994).
1.5 Die Transaktivierungsdomäne TAD
Die weiteren funktionellen Domänen von Myb sind zwischen den homologen Proteinen wenig oder gar nicht konserviert. Die Transaktivierungsdomäne befindet sich im zentralen Bereich des Proteines zwischen den Aminosäuren 275 und 325 und und ist in
der Lage, die Transkription zu aktivieren. Diese Region gleicht anderen Transkriptionsfaktoren und enthält viele geladene Aminosäuren. An der Transaktivierung ist offenbar ein auf zehn Aminosäuren eingegrenzter Bereich, mit den Aminosäuren EFATLQF(I/L)D, das sogenannte FAETL-Motiv (AS 392-396) beteiligt (Fu et al., 1996).
So dient z.B. das Protein CBP (CREB-Binding Protein) als Kofaktor für die c-Myb Transaktivierungsdomäne. CBP kann mit dem Transkriptionsfaktor CREB (cAMP Response Element Binding Protein) interagieren, welcher für die Interaktion durch Proteinkinase A phosphoryliert werden muss (Ness et al., 1996; Lüscher et al, 1990).
1.6 Der N-Terminus
N-terminale Modifikationen, die durch alternatives Splicing der c-myb-mRNA entstehen, sind in der Lage das Transformationspotential zu erhöhen. Die Aminosäuren 13-18 nahe des N-Terminus sind zwischen A-, B- und c-Myb konserviert und bilden Erkennungs- und Phosphorylierungsstellen für Caseinkinase II. Caseinkinase beeinflusst die DNA- Bindungsaffinität von c-Myb (Ness et al., 1996; Lüscher et al, 1990).
1.7 Die negativ-regulatorische Domäne NRD
Die negativ-regulatorische Domäne liegt am C-Terminus im Bereich der Aminosäuren 350 bis 500. Im diesem Bereich liegt das EVES Motiv mit den Aminosäuren Glutaminsäure (E), Valin (V) und Serin (S) (Dash et al., 1996; Lipsick et al., 1996).
Dieses Motiv enthält eine Phosphorylierungsstelle. Kinasen regulieren durch Phosphorylierung die Aktivität in vivo herunter und inhibieren das Zellwachstum. Eines der ersten Proteine, dass identifiziert wurde und in der Lage ist spezifisch an die DNA- Bindungsdomäne zu binden, ist neben NFM oder cEBPβ (Kowenz-Leutz et al., 1996) die hochkonservierte Region der c-Myb-NRD selbst (Dash et al., 1996). Das EVES Motiv ist ebenfalls hochkonserviert in allen Vertebraten. Möglich ist, dass die Aktivität von c-Myb durch intramolekulare Interaktion zwischen seinen beiden Enden reguliert ist (Ness et al., 1999).
Abbildung 1.3: Modell der Regulierung der Aktivität von c-Myb durch Konformationsänderung.
Phosphorylierung des EVES Motivs inhibiert die Aktivität (modifiziert nach Ness 1986).
DNA-BD: DNA-Bindungsdomäne, TAD: Transaktivierungsdomäne, NRD: Negativ-regulatorische Domäne, P: phosphoryliert
Eine andere Komponente der NRD ist ein Leucin-Zipper ähnliches Motiv, das zwischen einer konservierten Region der NRD (Aminosäuren TPTPFK T: Threonin, P: Prolin, F:
Phenylalanin, K: Lysin) und der Transaktivierungsdomäne liegt. Deletion dieser Region erhöht die Aktivierung der Transkription. Die NRD wirkt im Zellkern als Inhibitor der Transkription (Ness et al., 1986).
Abbildung 1.4: Schematische Darstellung des c-Myb-Proteins (636 Aminosäuren) mit den funktionellen Domänen (modifizert nach S. A. Ness, Myb binding proteins: regulators and cohorts in transformation, Oncogene 1999, 18, p. 3039-3046). DNA-BD: DNA-Bindungsdomäne, R1-R3:
Repeats 1-3, TAD: Transaktivierungsdomäne, LZ: Region des FAETL-Motivs, EVES: Aminosäuren EVES Motiv, C-Term: C-terminales Ende, P: Phosphorylierungsstellen
1.8 Phosphorylierungsstellen
Zellzyklusspezifische Phosphorylierungen, insbesondere während der Mitose, beeinflussen die Myb-Proteine. Drei Phosphorylierungen sind inzwischen
nachgewiesen, nämlich die durch die Casein-Kinase II (Oelgeschläger et al., 1995), die durch die zellzyklusspezifische p34cdc2-Kinase (Lüscher et al., 1990; Lüscher et al., 1992) sowie die durch die p42mapk-Kinase (Aziz et al., 1993).
Phosphorylierungen können ein Protein auf zwei Arten beeinflussen. Da jede Phosphatgruppe zwei negative Ladungen trägt, kann die Addition einer Phosphatgruppe durch elektrostatische Anziehung oder Abstoßung größere Konformationsänderungen bewirken. Dies wiederum kann die Bindung von Liganden an anderen Stellen beeinflussen. Ferner kann eine angefügte Phosphatgruppe einen Strukturteil darstellen, der direkt von Bindungsstellen anderer Proteine erkannt wird.
Das kernständige Onkoprotein c-Myb wird in vivo und in vitro an seinem N-Terminalen Ende in der Nähe der Bindungsdomäne durch die Casein-Kinase II (CK II) phosphoryliert. Die in vitro Phosphorylierung am Ser-11 bzw. Ser-12 inhibiert die sequenz-spezifische Bindung von c-Myb an DNA reversibel. Diese Phosphorylierungs- stelle fehlt in allen ontogenetisch aktivierten Myb-Proteinen. Dadurch bedingt ist die Bindung von c-Myb an DNA unabhängig von CK II. Da die CK II - Aktivität durch Wachstumsfaktoren moduliert wird, macht das Fehlen der Phosphorylierungsstelle c-Myb von seinem normalen physiologischen Regulator unabhängig (Lüscher et al, 1990). Weiterhin ist auch eine Steuerung des Myb-Proteins durch die im Bereich der negativ-regulierenden Domäne vorhandenen Phosphorylierungsstellen (Serin- und Threoninreste) möglich.
1.9 Myb reguliert das Zellwachstum 1.9.1 c-Myb reguliert Gene
Alle Myb-Proteine haben die Fähigkeit, Zellwachstum- und Differentiation zu regulieren.
Die meisten Myb-regulierten Gene besitzen Promotoren mit Myb-Bindungsstellen und werden durch Bindung aktiviert, obwohl auch einige inhibiert werden. Das am besten charaktisierte Gen ist mim-1 (Myb induced myeloid protein 1). Mim-1 wurde als Acetyltransferase identifiziert (Allen et al., 2003). Es wird durch eine Kombination von c-Myb und NF-M (Kowenz-Leutz et al., 1996), einer Hühnerversion des bei Säugern
anzutreffenden Transkriptionsfaktors NF-IL6, aktiviert. Das mim-1-Gen wird in differenzierenden Granolozyten exprimiert, die als einziger Zelltyp auch NF-M herstellen. Weitere durch Myb regulierte Gene besitzen Myb-Bindungsstellen: CD34, c- myb, c-myc, CD4, HSP 70 und IGF-1 beispielsweise werden durch Myb aktiviert (Ness et al., 1996). Die Expression von Myb reprimiert hingegen die Transkription von c-erbB2 (Mizuguchi et al., 1995) und c-fms (Reddy et al., 1994). Im Falle von c-erbB2, einem Faktor der die Epithelproliferation reguliert und dessen Produkt der EGF-Rezeptor (epidermal growth factor) ist, überlappt die Myb-Bindungsstelle mit der TATA-Box, an die auch der Transkriptionsfaktor TFIID bindet. C-fms hingegen codiert für CSF-1 (colony stimulating factor-1), einem Proliferationsfaktor in der Hämatopoese. C-Myb bindet stromaufwärts vom c-fms-Promotor und reprimiert dort die Transkription. Dazu wird sowohl die DNA-Bindungsdomäne als auch die negativ-regulatorische Domäne benötigt. Experimente haben gezeigt, dass eine C-Terminal verkürzte Version von c- Myb keinen Effekt mehr mehr auf die c-fms-Promotorregion hat.
Das c-myb-Gen wird nicht nur in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Es wurde auch in primären Fibroblasten, endothelialen Zellen, Sertoli Zellen gefunden (Ness et al., 1996).
Überexprimierte oder neu umgeordnete c-myb-Gene wurden beim Mamma-Karzinom (Guerin et al., 1990) und beim Colon-Karzinom (Greco et al., 1994) gefunden.
Weiterhin scheint c-Myb Gene zu aktivieren, die eine Schlüsselrolle in Tumorausbreitung und Metastasierung bilden. Zu diesen gehören Cyclooxygenase-2 (COX-2), Bcl-2, BclX(L) und c-myc. Diese haben Einfluss auf die Angiogenese, Proliferation und Apoptose. Klinisches Potential besteht darin, nuklease-resistente Oligonukleotide oder andere gegen c-myb gerichtete Substanzen zu finden und therapeutisch einzusetzen (Ramsey et al., 2003).
In zwei Fällen von pädiatrischer T-ALL wurde eine Translokation t(6;7)(q23;q32 through 36) gefunden, die einen Bruch in einer 150 kb großen Region bewirkt. Diese Region enthält die Gene AHI1 und c-myb (Sinclair P. et al., 2005).
1.9.2 Regulation von c-Myb
C-Myb wurde als ein Teil eines Proteinkomplexes aus humanen T-Zellen identifiziert, der auch die “Cyclin dependent kinase“ (CDK) CDK6 enthält. Die c-Myb-Aktivität wird direkt durch Cyclin D1 plus CDK4 oder CDK6 inhibiert, hingegen stimuliert durch die CDK-Inhibitoren p16 Ink4a, p21 Cip1 oder p27 Kip1. Dies impliziert, dass die c-Myb- Aktivität während des Zellzyklus in hämatopoetischen Zellen reguliert wird (Lei W. et al., 2005). Außerdem wird c-myb während der T-Zellentwicklung im Thymus exprimiert.
Dies ist essenziell für die Entwicklung von Thymozyten im doppelt negativen Stadium, für das Überleben und die Proliferation von doppelt positiven (CD8+, CD4+) Thymozyten, für die Differenzierung von CD4 und CD8 positiven Zellen und für die weitere Proliferation reifer T-Lymphozyten (Lieu et al., 2004; Bender et al., 2004).
Das Tumorsuppressorgen p53 reprimiert die Transkription bestimmter Gene, der Mechanismus ist unbekannt. p53 inhibiert die von c-Myb induzierte Transkription und Transformation durch direkte Bindung. Die Bindungsaffinität von c-Myb bleibt dabei unbeeinflusst, allerdings bildet sich dabei ein ternärer Komplex aus p53, Corepressor mSin3A und c-Myb (Tanikawa J. et al., 2004).
1.9.3 Kofaktoren von c-Myb
Transkriptionsfaktoren unterliegen einer sehr strengen Kontrolle. Bei c-Myb wird diese Kontrolle unter anderem durch Wechselwirkung mit Kofaktoren erreicht. Viele Proteine konnten inzwischen identifiziert werden (Armstrong et al., 1998). Es gibt direkt und indirekt bindende Kofaktoren. Indirekt bindene Faktoren wie z.B. Ets-12 aktivieren Promotoren oder Enhancer. Der direkt bindende Faktor C/EBPβ interagiert sowohl mit DNA-bindenen Faktoren als auch mit der Transkriptionsmaschinerie (Ness et al., 1996).
Die direkte Bindung an c-Myb führt zur Aktivierung des mim-1-Promotors. Die Interaktion erfolgt über die DNA-Bindungsdomänen der beiden Proteine, was nahe legt, dass die DNA-Bindungsdomäne weitere Funktionen über die DNA-Bindung hinaus besitzt. Der Kofaktor CBP bzw. p300 ist Koaktivator, besitzt Histonacatyltransferase-Aktivität und ist am Chromosomen-Remodeling beteiligt (Ogryzko et al., 1996). Inzwischen konnte als
weiterer Kofaktor Rcd-1 entdeckt werden. Rcd-1 reprimiert die Aktivierung des mim-1- Promotors durch Herabregulation von c-myb. Rcd-1 wird durch Erythropoietin positiv reguliert (Haas et al., 2004).
1.10 Ziel der Arbeit
Es soll zunächst als Modellsystem DNA-Bindungsdomäne von c-Myb untersucht werden, von der bekannt ist, dass sie im pGEXTM System (Amersham) exprimiert werden kann. Die DNA-Bindungsdomäne soll aus dem pGEX-2T Plasmid in den pGEX- 6P-1 Vektor umgesetzt werden. Der pGex-6P-1 Vektor bietet den Vorteil, dass das Fusionsprotein mit der PrescissionTM Protease gespalten werden kann, die keine proteolytischen Abbauprodukte des Proteins generiert. Die Prescission Protease erkennt spezifisch eine Sequenz von 8 Aminosäuren.
Weiterhin soll die c-Myb-Bindungsdomäne biophysikalisch untersucht werden. Als Hauptmethode der biophysikalischen Studien wird die Fluoreszenzkorrelations- spektroskopie (FCS) dienen, die die Beobachtung einzelner Moleküle erlaubt. Da bisher die Gleichgewichtskonstante in Lösung noch nicht bestimmt werden konnte, soll ein System etabliert werden, mit dem die Gleichgewichtskonstante für die Bindungsreaktion an DNA ermittelt werden kann. Zur Etablierung dieses Systems gehören die biophysikalische Untersuchung der Bindungspartner sowie die Entwicklung geeigneter Messbedingungen. Außerdem sollen zur biophysikalischen Charakterisierung der Bindungsdomäne Verfahren der CD-Spektroskopie angewandt werden.
Fernziel ist die Untersuchung kinetischer und thermodynamischer Parameter der Wechselwirkung von c-Myb mit DNA und mutmaßlichen Kofaktoren in einem System, in dem sich die beteiligten Reaktionspartner im Gleichgewicht, in Lösung befinden.
2. Materialien und Methoden
2.1 Mikrobiologische Methoden 2.1.1 Arbeiten mit Escherichia coli
Bei sämtlichen Arbeiten mit Plasmid-DNA wurden folgende Escherichia coli K12- Sicherheitsstämme eingesetzt:
LK111()
Genotyp: rk- mk-, thi-1, thr-1, leuB6, tonA21, suppE44, lac Iq ZM15, Hfr, +
Rosetta (DE3)
Genotyp: F-, ompT, hsdSB(rB-mB-), gal, dcm, lacY1
2.1.2 Transformation von E. coli
Die kompetenten E.coli-Bakterien (RbCl2-Methode, Biolabs 1996) werden nach der Hitzeschockmethode transformiert. Eine bei –70°C gelagerte Bakteriensuspension mit einem Volumen von ca. 200 µl wird aufgetaut und mit 0,1-1 µg Plasmid-DNA 30 min auf Eis und anschließend 90 sek bei 42°C inkubiert.
Zur Steigerung der Effektivität können 800 µl LB-Medium zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert werden. Die Zellen werden 1 min bei 1000 rpm abzentrifugiert, der Großteil des Überstand verworfen. Die Zellen werden über Nacht auf einer Ampicillin- haltigen Agarplatte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
2.1.3 Kulturmedien
Luria Bertani-Kulturmedium (LB) für E.coli:
1%(w/v) Pepton 1%(w/v) Hefeextrakt 0,5%(w/v) NaCl
pH 7,0 einstellen und autoklavieren
vor der Verwendung evtl. 100 mg/l Ampicillin zusetzen
LBAMP-Agarplatten:
1%(w/v) Pepton 1%(w/v) Hefeextrakt 0,5%(w/v) NaCl
2%(w/v) Agar
pH 7,0 einstellen und autoklavieren, auf <50°C abkühlen lassen, 75mg/l Ampicillin, 20ml Medium/Platte
2.1.4 Vektor pGEX-6P-1
Um ein GST-Fusionsprotein (Glutathion-S-Transferase) zu konstruieren, inseriert man ein Gen oder ein Genfragment in die “multiple cloning site“ eines pGEX Vektors. Die Expressionskontrolle erfolgt über den tac-Promotor, der durch IPTG induziert werden kann. Außerdem enthalten pGEX-Vektoren ein lacIq Gen, dessen Produkt das Repressorprotein ist, das an die Operator-Region des tac-Promotors bindet und die Expression bis zur Induktion mit IPTG verhindert. Die mittels pGEX-PreScission- Protease-Vektoren exprimierten Proteine binden über den GST-Fusionsanteil an GSH- Sepharose und besitzen nach dem GST-Anteil eine Spaltstelle für die PreScission- Protease. Ferner enthält der Vektor zur Selektion eine Ampicillin-Resistenz. Das “GST Gene Fusion System“ wurde von der Firma Amersham bezogen.
Abbildung 2.1: pGEX-6P-1 Vektor der Firma Amersham
Es wurde jedoch nicht mit dem Originalplasmid gearbeitet, sondern mit einem pGex-6P- 1 Vektor ohne EcoR I und Sma I Schnittstelle. Die genaue Sequenz der “multiple cloning site“ lautet:
BamH I Not I
CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC CTG G▼GA TCC ACT AGT TCT AGT CGA CTC GAG C▼GG CCG CAT
2.1.5 Expression von Proteinen 2.1.5.1 Expressionstest
Eine 20 ml LBAMP-Kultur wird mit dem Expressionsplasmid versetzt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Probenentnahme wird mit IPTG induziert (0,1 mM bei pGex Plasmiden). Nach 1-4 Stunden wird wieder eine Probe entnommen. Beide Proben werden bei 500 rpm 5 min zentrifugiert, das Pellet in 20 µl Laemmliauftragspuffer (LAP)
aufgenommen, resuspendiert und 10 min bei 95°C inkubiert. Die Analyse erfolgt über SDS-PAGE.
2.1.5.2 Fermentation und Proteinexpression
Um größere Proteinmengen aufzureinigen, erfolgt eine Kulturvierung in einem 10L Fermenter. Der Fermenter wird mit 8L ddH2O befüllt und über Nacht bei 120°C inkubiert.
Nach Abkühlen auf ca. 45°C werden 1L steriles 10 x LB-Medium, 2 ml Entschäumer (Extran AP 31, Merck) und Antibiotikum hinzugegeben. Es wird eine 25 ml Kultur in LBAMP angesetzt und nach Inkubation für 4 h bei 37°C in 500 ml LBAMP überführt. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wird damit der Fermenter angeimpft (75 µg/ml Ampicillin) und bei 37°C bis zu einer OD600nm = 1-2 inkubiert. Die Abluft des Fermenters wird durch zwei Waschflaschen mit 2 M NaOH geführt. Nach Induktion mit IPTG für 1-4 Stunden zentrifugiert man 10 min bei 6000 x g (Heraeus Megafuge 1.0 R). Das Pellet wird in 6 x 30 ml PBS/1% Triton X-100 resuspendiert und in Falconröhrchen bei –20°C tiefgefroren.
2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 Plasmidpräparation
Midi-/Maxipräparation:
Die Präparation von Plasmid-DNA aus Escherichia Coli erfolgt mit einem Plasmid Kit der Firma Qiagen nach einer von Birnboim und Doly (1979) entwickelten Methode.
Ein Zellkulturvolumen von 25 bzw. 100 ml wird bei 3000 U/min zentrifugiert, wodurch die Zellen sedimentiert werden. Das Pellet wird in 4 ml / 10 ml P1 Puffer aufgenommen.
Dieser Puffer enthält EDTA, das durch Komplexierung der Kationen die Zellwand destabilisiert, und RnaseA, die die RNA spaltet. Anschließend erfolgt mit Zugabe von 4 ml / 10 ml P2 Puffer, vorsichtigem Schütteln und 5 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur die alkalische Zelllyse (NaOH, SDS). Puffer P3 enthält Kaliumacetat, das mit denaturierten Proteinen, hochmolekularer RNA und chromosomaler DNA Komplexe bildet. Nach vorsichtigem Schütteln mit 4 ml / 10 ml P3 wird sofort 15 bzw. 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wird bei > 20000 x g (ca. 12000 rpm) für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wird nochmals für 15 min zentrifugiert. Zur Isolierung der
DNA werden Qiagen-tip 100 / 500 Säulen mit 4 ml / 10 ml QBT Puffer äquilibriert. Der Überstand wird auf die Säule gegeben und mit 2 x 10 bzw. 30 ml QC Puffer gewaschen.
Nach Elution mit 5 ml oder 15 ml OF Puffer wird die DNA 3,5 bzw. 10,5 ml Isopropanol gefällt. Nach weiterer Zentrifugation bei > 9000 rpm für 30 min wird der Überstand dekantiert und das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in EB Puffer aufgenommen.
Minipräparation:
Die Zellen einer 4 ml Suspensionskultur werden bei 3000 rpm sedimentiert und in 250 µl P1 resuspendiert. Dazu werden 250 µl P2 gegeben und vorsichtig geschüttelt. Nach Zugabe von 350 µl N3 Puffer und Umschwenken wird für 10 min bei 13000 rpm zentrifugiert. Die DNA im Überstand wird über eine QIAprep-spin-Säule aufgereinigt, indem man mit Puffer PB wäscht (30-60 sek zentrifugieren). Mit 50 µl Puffer EB wird die DNA eluiert.
Puffer P1:
50 mM Tris pH 8,0 10 mM EDTA 100 µg/ml RNase A Lagerung bei 4°C
Puffer P2:
200 mM NaOH 1%(w/v) SDS
Puffer P3:
3 M Kalium-Acetat, pH 5,5
Puffer N3:
4,09 M Guanidiniumhydrochlorid 0,759 M Kalium-Acetat, pH 4,2
Puffer PE
70%(v/v) Ethanol, pH 7,0 100 mM NaCl
10 mM Tris-HCl 1mM EDTA, pH 7,5
Puffer EB:
10 mM Tris-HCl, pH 8,5
Puffer QBT:
750mM NaCl
50 mM MOPS, pH 7,0 15%(v/v) Isopropanol 0,15%(w/v) Triton X-100
Puffer QC:
1 M NaCl 50 mM MOPS 15%(v/v) Isopropanol
Puffer QF:
1,25 M NaCl
50 mM Tris-HCl, pH 8,5 15%(v/v) Isopropanol
2.2.2 Restriktionsspaltung
Bei der Restriktionsspaltung eines Plasmids wird mit Restriktionsenzymen ein Insert aus einem Vektor herausgeschnitten bzw. der Vektor geöffnet. Dies wird sowohl für analytische als auch präparative Zwecke genutzt. Zur Restriktionsspaltung werden
Restriktionsendonukleasen der Firmen MBI-Fermentas und New England Biolabs in den vom Hersteller mitgelieferten Puffern und Reaktionsbedingungen eingesetzt.
Bei analytischen Spaltungen beträgt das Ansatzvolumen 1 µg DNA mit 5 Units Enzym in 10 µl Volumen. Das Volumen für präparative Zwecke beträgt 50 µl mit 10 µg DNA und 30 Units Enzym. Die mitgelieferten 10xPuffer sind entsprechend zu verdünnen. Die Inkubation erfolgt bei der angegebenen Temperatur. Werden zwei Restriktionsenzyme im selben Ansatz verwendet ist der Reaktionspuffer so zu wählen, dass optimale Bedingungen für beide Enzyme vorliegen. Die Temperatur ist während der Reaktion zu verändern.
2.2.3 Dephosphorylierung
Soll nach der Restriktionsspaltung eine Ligation durchgeführt werden, ist es notwendig die Religation des Vektors zu verhindern. Mit der alkalischen Phosphatase (Calf Intestine Alkalic Phosphatase CIAP, MBI Fermentas) werden die beiden endständigen Phosphatgruppen des Vektors entfernt. Die für die Ligation notwendigen Phosphatgruppen werden dann vom Insert bereitgestellt. Die CIAP arbeitet in gängigen Reaktionspuffern. Es wird 30 min bei 37°C inkubiert bei einem Verhältnis von 1-2 Units CIAP/20 pmol DNA. Die Phosphatase wird durch 20 minütiges Erhitzen auf 85°C inaktiviert oder die DNA sofort über ein Agarosegel präpariert.
2.2.4 Phosphorylierung
Bei dephosphoryliertem Rahmen ist es für die Ligation unbedingt notwendig, dass die DNA-Inserts Phosphat-Gruppen an ihrem 5‟-Ende tragen. Die verwendeten Fragmente liegen bereits phosphoryliert vor.
2.2.5 Ligation
100 – 500 ng dephosphorylierter Vektor werden mit 1-2 µg Linker-Oligonukleotid bzw.
entsprechender Menge des zu inserierenden Genfragments 1 h bei 22°C inkubiert. Das Ansatzvolumen beträgt 20 µl mit 2 µl 10x Ligations-Puffer und 5 Units T4 DNA-Ligase
(MBI Fermentas). Der DNA-Ligase-Komplex wird durch 10 minütiges Erhitzen auf 65°C zerstört. Der Ansatz kann direkt zur Transformation eingesetzt werden.
T4 DNA-Ligase-Puffer 10x 400 mM Tris-HCl, pH 7,8 100 mM MgCl2
100 mM DTT 5mM ATP
2.2.6 Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Konzentration kann über ein Agarosegel bestimmt, indem eine definierte Menge Plasmidlösung bei der Elektrophorese aufgetrennt wird. Als Standard dienen je nach Größe der DNA DNA-Fragmente mit definierter Länge, z.B. der “Massruler High Range“oder “Low Range“ (MBI Fermentas).
Zur spektroskopischen Konzentrationsbestimmung wird die Absorption bei 260 nm herangezogen, wobei 1 OD ungefähr einer Konzentration von 50 µg/ml entspricht.
Alternativ kann der Extinktionskoeffizient der Oligonukleotide entsprechend ihrer Sequenz mit dem Programm: “oligo nucleotide properties calculator“ berechnet und damit die exakte Konzentration ermittelt werden.
2.2.7 DNA-Isolierung aus Agarosegelen
Die Gelextraktion erfolgt mittels eines Qiagen-Kits. DNA wird aus dem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel ausgeschnitten. Das Gelstück (max. 0,4 g) wird mit dem 3-fachen Volumen QG-Puffer versetzt und 10 min bei 50°C inkubiert. Zur Beschleunigung des Lösungsvorgangs wird mehrmals gemixt. Anschließend versetzt man den Ansatz mit dem 1-fachen Gelvolumen an Isopropanol. Die DNA wird dann an eine QIAquick Säule gebunden, mit 0,75 ml PE Puffer gewaschen und mit 50 µl EB Puffer eluiert.
2.2.8 Gelelektrophorese
Polyacrylamidgele entstehen durch Polymerisation von Acrylamid und Vernetzung der Polymere durch N,N‟- Methylenbisacrylamid. Die Polymerisation wird durch Ammonium- peroxodisulfat (APS) initiiert, als Katalysator dient N,N,N‟,N‟-Tetramethylethylendiamid (TEMED). Die Acrylamidkonzentration im Polymerisationsansatz bestimmt die Länge der Polyacrylamidketten, die Bisacrylamidkonzentration den Vernetzungsgrad. Dadurch werden Porengröße, Elastizität und Dichte des Gels bestimmt
Agarosegele hingegen eignen sich zur präparativen und analytischen Auftrennung von DNA-Molekülen > 250bp.
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Lämmli
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wird sowohl zur Molekulargewichtsbestimmung als auch zur Reinheitsbestimmung bei der Proteinaufreinigung verwendet. Natriumdodecylsulfat (engl.: sodium dodecyl sulfate, SDS) bindet an die hydrophoben Domänen des Proteins, wobei das Molekül denaturiert und negative Ladungen erhält. Wird es anschließend auf einem Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen, so ist die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine dem Molekulargewicht proportional und kann mit Hilfe von Eichproteinen bekannten Molekulargewichtes bestimmt werden.
Das Gel besteht aus zwei Teilen. Im Sammelgel (6%) werden die Proteine zunächst fokussiert um schärfere Banden zu erhalten die im Trenngel (15%) dann aufgetrennt werden. Die Gele sind wie folgt zusammengesetzt:
Volumen [ml]
30%
Acrylamid [ml]
1 M Tris pH 8,8
[ml]
1 M Tris pH 6,8
[ml]
1%
SDS [ml]
H2O [ml]
TEMED [µl]
APS [µl]
Trenngel 17,5%
10 5,80 2,80 - 1,00 0,4 20 20
Trenngel 15% 10 5,00 2,80 - 1,00 1,2 20 20
Trenngel 12,5%
10 4,20 2,80 - 1,00 2,0 20 20
Trenngel 10% 10 3,30 2,80 - 1,00 2,9 20 20
Sammelgel 6% 1,5 0,30 - 0,19 0,15 0,91 3 3
Sammelgel 5%
1,5 0,25 - 0,19 0,15 0,96 3 3
Die Elektrophorese erfolgt in Laemmli-Laufpuffer bei 30 mA für etwa 90 min. Die Proben von 10 µl werden in 10 µl Laemmli-Auftragspuffer (3x) aufgenommen und für 5 min bei 95°C inkubiert. Die Färbung erfolgt mit Coomassie Blue. Nach dem Entfärben mit 7%iger Essigsäure wird das Gel mit H2O gewaschen und getrocknet.
Lösungen für die Laemmligel-Elektrophorese Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung:
30%ige Lösung von Acrylamid enthält 0,8% Bisacrylamid Laemmli-Laufpuffer (10x):
250 mM Tris/HCl, pH 8,3 1,9 M Glycin
1 % SDS
Laemmli-Auftragspuffer (LAP) (3x):
0,2 M Tris-Base 33 % Glycerin
3 % SDS
auffüllen auf 60 ml; pH 6,8 einstellen,
3,2 % β-Mercaptoethanol 0,0016 % (w/v) Bromphenolblau ad 62 ml H2O
Coomassie-Färbelösung:
5 g Coomassie-Blue R 250 1,25 g Coomassie-Blue G 250 1065 ml Ethanol (95%)
125 ml Methanol
250 ml Essigsäure (100%) ad 2,5 L H2O
“Protein Molecular Weight Marker“ SM0431 (MBI Fermentas)
Banden: 116.0 kDa (-Galaktosidase), 66.2 kDa (Rinderserumalbumin), 45.0 kDa (Ovalbumin), 35.0 kDa (Lactatdehydrogenase), 25.0 kDa (Restriktionsendonuklease Bsp98I), 18.4 kDa (-Lactoglobulin) und 14.4 kDa (Lysozym)
Agarose-Gelelektrophorese
Zusammensetzung des Agarosegels (1%) zur DNA-Präparation:
1,2 g Agarose 120 ml TPE (1x)
In der Mikrowelle kurz aufkochen, unter Rühren abkühlen lassen und gießen. Die Proben werden mit Auftragspuffer versetzt und aufgetragen. Der Gellauf erfolgt bei 100 mA für 2 h. Das Gel wird anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt, mit H2O entfärbt und unter UV-Licht abfotografiert.
Lösungen für Agarose-Gelelektrophorese TPE 10x :
108 g Tris-Base
15,1 ml o-Phosphorsäure (85%) 40 ml EDTA 0,5M pH 8
ad 1 L H2O
Agaroseauftragspuffer (6x) 50 mM EDTA
0,25% (w/v) Bromphenolblau 0,25% (w/v) Xylencyanol FF 30% (w/v) Glycerin
DNA-Standard
MBI Fermentas GeneRuler 1kb mit Fragmentgrößen: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 und 200 bp
New England Biolabs 1 kb mit Fragmentgrößen: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 500 bp
2.2.9 Electrophoretic-Mobility-Shift-Assay (EMSA)
Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen werden im nativen Zustand untersucht.
Diese Wechselwirkungen werden sichtbar, in dem man eines der Makromoleküle radioaktiv markiert. Findet DNA-Bindung statt, wird der Komplex retardiert, läuft im Gel also langsamer.
Zusammensetzung des nativen Gels:
Größe Volumen 30%
Acrylamid
TTE 20-fach
H2O TEMED APS
20 cm * 20 cm 50 ml 10ml 2,5 ml 37,5 ml 150 µl 150 µl
Die Elektrophorese kann über Nacht erfolgen. Die Laufgeschwindigkeit bei 25 Volt beträgt ca. 0,2cm/h. Maximal darf eine Spannung von 150 Volt angelegt werden. Um die Lauffront zu sehen trägt man den Farbstoff Azorubin mit auf. Zur Untersuchung der Bindung von c-Myb an DNA werden 33P-markierte Oligonukleotide verwendet. Die Darstellung der radioaktiven Banden erfolgt über einen Phosphoimager.
Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden Ansatz der 3‟-Phosphorylierung;
10 µl Oligonukleotid (50µM)
4 µl 5 x Terminale Transferase-Puffer 1 µl 33P[dATP] (10µCi/µl, Amersham]
1 µl Terminale Transferase (5U/µl, Fermentas) 4 µl ddH2O
Der Reaktionsansatz wird bei 37°C für 5h inkubiert. Anschließend erfolgt eine Aufreinigung mit dem Nukleotide Removal Kit der Firma Qiagen.
Alternativ wird der Electrophoretic-Mobility-Shift-Assay mit den nicht radioaktiv markierten Oligonukleotiden durchgeführt. Das native Gel wird mit Ethidiumbromid gefärbt, mit H2O entfärbt und unter UV-Licht abfotografiert.
Lösungen für EMSA TTE 20x
1,8 M Tris-Base 0,575 mM Taurin 2,7 mM EDTA
Hamburger-Shift-Puffer
10 mM Tris/HCl pH 7,9 50 mM NaCl
1 mM ß-Mercaptoethanol 0,05 % (w/v) Magermilchpulver 5% (v/v) Glycerin
10mM 1,4-Dithiothreitol
2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.3.1 Proteinaufreinigung: Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen
Bei der Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen werden die induzierten Zellen nach dem Ernten und Zentrifugation (siehe 2.1.5.2 ) aufgetaut und in PBS mit 1% Triton X- 100 und 400 µl PMSF aufgenommen. Der Aufschluss der Zellen erfolgt im Ultraschallbad auf Eis (Branson-Sonifier 250, Stufe 6) 3 x 30 Sekunden mit jeweils 45 Sekunden Pause. Die Zelltrümmer werden bei 6000g und 4°C für 60 min (alternativ 40 min bei 10000g) sedimentiert. Die GST-Fusionsproteine befinden sich im Überstand.
150 ml Zelllysat werden mit 7 ml GSH-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech) versetzt und unter Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wird in eine Säule gefüllt und mit 30 ml PBS gewaschen. Das Fusionsprotein wird erhalten, indem man mehrmals mit 1 ml 50 mM Glutathion eluiert. Um das Glutathion vom Protein zu trennen, wird anschließend über Nacht bei 4°C gegen 2000 ml PBS dialysiert. Möchte man nur die Bindungsdomäne erhalten, wird diese mit der Prescission Protease durch Spaltung von der GSH-Säule gelöst. Dazu wird die Säule mit mit dem 10-fachen Volumen Cleavage Puffer gewaschen. Danach werden 40 µl (80 Units) Prescission-Protease pro ml Cleavage Puffer hinzugefügt und das Säulenmaterial für 4 Stunden mit demselben Volumen dieses Puffers bei 5°C inkubiert. Das Eluat enthält das gewünschte Protein, wohingegen GST und die Prescission-Protease am Säulenmaterial gebunden bleiben. Die Aufarbeitung kann auch, sofern das Fusionsprotein mit GSH eluiert wurde, in Lösung erfolgen. Dazu werden 40 µl (80 Units) Prescission-Protease pro ml Cleavage-Puffer auf dasselbe Volumen an GSH-Sepharose-Lösung gegeben.
Das c-myb-Protein kann nun, gegebenenfalls auch als Fusionsprotein, über DNA- Zellulose weiter gereinigt werden. Das Protein wird dazu mit 1 ml DNA-Zellulose inkubiert und einem NaCl-Gradienten von 75 mM bis 1,5 M eluiert.
”Cleavage”-Puffer
50 mM Tris/HCl pH 7 150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM Dithiothreitol
2.3.2 Proteinmarkierung
Alexa Fluor594 Protein Labeling Kit
Mit dem Farbstoff Alexa Fluor 594 markierte Proteine haben ein Absorptions- und Fluoreszenzemissionsmaximum von 590nm und 617nm. Der reaktive Alexa 594 Farbstoff (MW~820 Da) besitzt einen Succinimidyl-Rest, der effizient mit primären Aminen von Proteinen ein stabiles Farbstoff-Protein Konjugat bildet.
N
N O N
SO3H COOH SO3H
O O O
O
NH2 R
N OH O
O
+ N O N+
SO3H COOH SO3H
N O H
R
+
pH = 7,5 - 8,5
Abbildung 2.2: Nucleophile Additions-Eliminierungsreaktion des freien Elektronenpaars freier NH2- Gruppen an den Succinimidyl-Ester Rest des reaktiven Alexa 594 Farbstoffes
2.3.2.1 Markierungsreaktion
Es wird eine 1 M Natriumbicarbonatlösung hergestellt. Bicarbonat (pH~8,3) ist wichtig, da Succinimidyl-Ester bei einem pH-Wert von 7,5 – 8,5 effizient reagieren.
Für die Präparation sollte sich das Protein in PBS oder 0,1 M Natriumbicarbonat befinden und ungefähr eine Konzentration von 2 mg/ml besitzen. Zu 0,5 ml einer 2 mg/ml Proteinlösung werden 50 µl 1M Bicarbonat-Lösung zugegeben.
Diese Lösung wird in ein auf Raumtemperatur erwärmtes Fläschchen mit “Alexa 594 reactive dye“ gegeben. Das Fläschchen enthält einen Magnetrührstab. Das Gefäß wird einige Male umgeschwenkt und für 1h bei Raumtemperatur gerührt.
Sollte sich das Protein nicht auf ~2 mg/ml aufkonzentrieren lassen, erhöht sich die Schwierigkeit, unkonjugierten Farbstoff vom Farbstoff-konjugierten Protein in akzeptabler Ausbeute abzutrennen, sofern die Proteinverdünnung in großem Volumen eingesetzt wird. Die hier eingesetzte Proteinkonzentration betrug ~0,15 mg/ml.
2.3.2.2 Aufreinigung des markierten Proteins
Die Aufreinigung erfolgt mittels Gelfiltration. Bei dieser Methode werden die Moleküle ihrer Größe nach aufgetrennt. Als Gelmaterial wird SephadexTM G-25 von Amersham Biosciences verwendet. Die Größe der Gelkügelchen beträgt 170 µm – 520 µm und es können Moleküle der Größe 100 – 5000 Da fraktioniert werden.
Zur Aufreinigung wird der Elutionspuffer auf Raumtemperatur erwärmt. Das Granulat wird mit einer Pipette in eine 20 cm hohe Säule gefüllt bis 3 cm unter den Rand. Der Überschuss an Puffer wird eluiert und ein beständiger Fluss sichergestellt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf die Säule gegeben und das Reaktionsgefäß mit 100 µl Elutionspuffer gespült. Dann wird mit ca. 10 ml Elutionspuffer eluiert. Es zeigen sich zwei verschiedenfarbige Banden, eine violettfarbene und eine rosafarbene. Die violette Bande läuft zuerst und enthält den Hauptteil des gelabelten Proteins.
Das markierte Protein wird bei 4°C in PBS, pH 7,2 und 2 mM Natriumazid lichtgeschützt gelagert. Das Konjugat kann auch eingefroren werden, mehrfaches Auftauen und Einfrieren wird nicht empfohlen.
Da durch diese Prozedur wegen der hohen Proteinverdünnung jedoch nur ein Bruchteil des freien Alexa 594 -Farbstoffes abgetrennt wird, erfolgt eine weitere Aufreinigung über DNA-Zellulose. Dazu wird die Proteinlösung mit 1ml DNA-Zellulose für 1h inkubiert und 10x mit 0,5 PBS gewaschen. Das Protein wird mit 3x 200µl 1,5 M NaCl in 0,5 PBS eluiert. Anschließend erfolgt zur Abtrennung des Salzes eine Dialyse gegen 1x PBS über Nacht. Zur Dialyse werden Schläuche der Firma Serva mit einer Ausschlussgrenze von 12.000 – 14.000 Da verwendet.
2.3.2.3 Berechnung der Proteinkonzentration und des Markierungsgrads
Zunächst werden von den Eluaten am Spektrophotometer DU800 der Firma Beckman Coulter Spektren über einen Bereich von 220 nm – 620 nm aufgenommen. Der Farbstoff hat sein Absorptioonsmaximum bei 590 nm und einen Extinktionskoeffizienten von 73000 cm-1M-1. Der Extinktionskoeffiztient der Bindungsdomäne ist 59250 cm-1M-1.
Die Proteinkonzentration lässt sich berechnen nach:
1 590
280
59259 56 , 0
M
sfaktor Verdünnung
A c A
0,56 ist ein Korrekturfaktor für die Absorption bei 280 nm. Der Korrekturfaktor ergibt sich aus den Absorptionen des freien Farbstoffes A280nm / A590nm.
Der Markierungsgrad ergibt sich zu:
ntration oteinkonze
M
sfaktor Verdünnung
otein A Farbstoff
Pr 73000
Pr
/ 590 1
Er gibt an, wie viel Mol Farbstoff pro Mol Protein gebunden sind. 73.000 cm-1M-1 ist der molare Extinktionskoeffizient des Alexa 594 -Fluoreszenzfarbstoffes.
2.3.3 Konzentrierung der Proben
Um in der letzten Fraktion den freien Farbstoff vom markierten Protein zu trennen (benötigt für die Kalibrationsmessung bei der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie), wird die Fraktion ultrafiltiriert. Dazu wird ein Vivaspin 6 Zentrifugalröhrchen der Firma VIVASCIENCE sartorius group verwendet mit einer Ausschlussgrenze von 5.000 Da.
Die Probe wird bei 3000 x g für 20 min zentrifugiert.
Alternativ werden für die Aufkonzentrierung des Proteins werden Centricon Zentrifugalrörchen YM-10 MW der Firma Amicon verwendet. Die Ausschlussgrenze ist 10.000 Da. Dazu werden die Proben 50 min bei 5000 x g zentrifugiert.
2.4 Biophysikalische Methoden
2.4.1 Schmelzkurven von Oligonukleotiden
Die Aufnahme der Schmelzkurven erfolgt an einem Spektralphotometer der Firma Zeiss (DMR10). Das Schmelzen der DNA kann durch Messen der Extinktion bei 260 nm über einen Temperaturbereich von 10-60°C bei einer Heizrate von 10°C/h verfolgt werden.
Diese nimmt mit Fortschreiten der Denaturierung zu, da einzelsträngige DNA das UV- Licht besser absorbieren kann als doppelsträngige (Hyperchromie). Die Steuerung der Messung erfolgt über das Programm Schmelz2, die Auswertung mittels BPCFIT.
2.4.2 Aufnahme von CD-Spektren
Die meisten Biomoleküle zählen zu den optisch aktiven Substanzen. Sie absorbieren Licht unterschiedlicher Polarisationsrichtung unterschiedlich stark. Diese Erscheinung wird Dichroismus genannt.Alle in der Natur vorkommenden Aminosäuren außer Glycin besitzen asymmetrische -Kohlenstoffatome. Optische Aktivität kann auch durch eine asymmetrische Mikroumgebung induziert sein, wenn chirale Zentren mit achiralen Zentren wechselwirken. Die optische Aktivität der DNA beruht auf der Stapelbildung der Nukleinsäuren.
Die Absorption bzw. der Extinktionskoeffizient ε einer optisch aktiven Substanz unterscheiden sich für links und rechts zirkular polarisiertes Licht. Der Unterschied Δε kann positiv oder negativ sein (positiver bzw. negativer Cotton-Effekt). Als Messgröße ergibt sich die wellenlängenabhängige Elliptizität Θ zu:
L R
L R
I I
I I
tan
IL, IR: Intensität des links bzw. rechts zirkular polarisierte Licht nach der Absorption, λ: Wellenlänge
Die Lichtintensitäten sind über das Lambert-Beersche-Gesetz mit ε verknüpft. Für kleine Θ gilt dann folgende Gleichung:
d cm
R
L
.( )
4 10 180
ln
εL, εR: Extinktionskoeffizienten für links bzw. rechts zirkular polarisierte Licht, cm: Konzentration, d: Schichtdicke
Die Elliptizität trägt ihren Namen, weil beim Bestrahlen optisch aktiver Proben mit linear polarisiertem Licht elliptisch polarisiertes Licht entsteht. Die Hauptschwingungsachse der Ellipse ist gegenüber dem einfallenden Licht gedreht. Das Verhältnis der kurzen zur langen Ellipsenachse ist als tan Θ definiert.
Mittels Circulardichroismus (CD) kann die Sekundärstruktur von Proteinen ermittelt werden. Es werden die Merkmale α-Helix, β-Faltblatt und random coil (rc) unterschieden. Man geht davon aus, dass sich ein CD-Spektrum additiv aus den Beiträgen der einzelnen Strukturelemente zusammensetzt. Hier dienen Modellsubstanzen wie z.B. Myoglobin als Referenz.
M M rc rcM
M
f f f
mit f f frc 1
fα, fβ, frc: Anteil an der jeweiligen Konformation, ΘM: Molare Elliptizitäten der reinen Strukturmerkmale
Abbildungen 2.3 und 2.4: li: CD-Spektrum von B-DNA (modifiziert nach: I.D. Campbell, R.A.Dwek, Biological Spectroscopy, p. 265, Benjamin/Cummings Publ. Co., Menlo Park, 1984), re: CD-Spektren der drei Sekundärstrukturen (modifiziert nach: N.Greenfield, G. Fasman, Biochemistry 8, 1969, p. 4108)
Alternativ lässt sich der α-Helixgehalt nach Fasman et al. (1969) berechnen mit der Formel:
33000 4000
100 208 4000
Helix nm
oder nach Scholz et al. (1991):
helix
coil
coil
Helix nm
100 222
mit:
40000 (1 ) 100 T[ C]n x
helix
und
coil
64045T[C]wobei n die Anzahl der Aminosäuren n=154 für c-Myb-Bindungsdomäne und x = 2,5 ist.
2.4.3 Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)
Die FCS ist eine Methode, die auf der Beobachtung von einzelnen Molekülen in einem kleinen Volumen beruht. Die spezifische Detektion von Bindungspartnern und die quantitative Bestimmung der Bindungsparameter stehen im Vordergrund. Fluktuationen der Moleküle, die auf Brownscher Bewegung oder chemischer Reaktion beruhen, werden detektiert. Aus ihrer Amplitude und ihrem zeitlichen Verhalten kann man makroskopische Größen wie Konzentration und Diffusionskoeffizienten erhalten. Große Komplexe z.B. bleiben sehr viel länger im Beobachtungsvolumen als kleine, schnellere Moleküle. Fluktuationen des Komplexes korrelieren über eine längere Zeitperiode als die seiner Komponenten. Die Fluktuationen werden in einem fokalen Volumen detektiert, das von einem hoch fokussierten Laser definiert wird. In diesem Volumen werden die Moleküle angeregt und emittieren Fluoreszenz. Das Volumen liegt bei unter 1 femtoliter und die Konzentrationen im nanomolaren Bereich.
Fluoreszenz heißt, dass ein Photon ein Molekül vom S0 in den S1 Zustand anhebt, von dem nach der Fluoreszenzlebensdauer von 10-9 sec. wieder ein Photon emittiert wird und das Molekül wieder relaxiert. Während der Anregungsphase verliert das Fluorophor Energie, so dass das emittierte Licht im Rot- bzw. Stokes-verschoben ist. Außerdem kann das Fluorophor von S1 aus in einen Triplettzustand übergehen, aus dem es nach üblicherweise einigen µs in den Grundzustand zurückkehrt. Während dieser Zeit bleibt das Molekül dunkel.
Hat man eine Konzentration von 10 nM eines Fluorophors, enthält 1 µl im Schnitt 6000 Moleküle. Die Fluktuationen, die man beobachtet wenn einige dieser Moleküle aus dem Beobachtungsvolumen diffundieren, liegen im Bereich von 1 Prozent. Beträgt das Volumen hingegen nur einen halben Femtoliter, der dann im Schnitt 3 Moleküle enthält, also mal 2, 1 oder 4 Moleküle zu erkennen sind, erhält man Fluktuationen von ungefähr 30 %. Die Größe und Form des Beobachtungsvolumens hängen u.a. ab von der Laserstärke, der Wellenlänge, der Vergrößerung und der numerischen Apertur des Mikroskops. Die Fluoreszenz wird mit sehr sensitiven Avalanche Photodioden detektiert.
Die mittlere Länge der Fluktuationen hängt von Zeit ab, in der die Moleküle sich im fokalen Volumen aufhalten, die Amplitude hingegen hängt ab von der Konzentration. Bei der Autokorrelationsanalyse wird die fluktuierende Fluoreszenzintensität I über einen definierten Zeitbereich aufgenommen. Mit der Abweichung ΔI (t) = I (t) - < I > dieses
Signals von der Fluoreszenzintensität im Mittel < I > lautet die Definition der Autokorrelationsfunktion:
2
) ( ) ) (
(
I t I t
G I t
Das bedeutet, dass die Signalabweichung vom Mittelwert ΔI (t) mit sich selbst multiplizert wird, nur ist der zweite Term ΔI (t+) um die Zeit verschoben. Dieses Produkt wird zeitlich gemittelt über die gemessenen Datenpunkte <...>t und auf das Quadrat der mittleren Intensität normalisiert, damit das Signal unabhängig von der Laserstärke ist.
Wenn die Zeit kürzer ist als die Fluktuationszeitspanne, ergibt sich ein signifikant größerer Wert als Null. Steigt weit über die typische Verweildauer eines Moleküls im fokalen Volumen an, fällt die Autokorrelationsfunktion auf Null ab, da die emittierten Photonen hauptsächlich von unterschiedlichen Molekülen stammen und daher nicht miteinander korrelieren.
Aus der Amplitude der Autokorrelationsfunktion G(0) = 1/ <N> entsprechend 1/c kann man die Teilchenanzahl N beziehungsweise die Konzentration c erhalten. Die Korrelationszeit bei G() = G(0)/2 hängt ab von der mittleren Verweilzeit im fokalen Volumen und ist dem Diffusionskoeffizienten umgekehrt proportional. Moleküle mit unterschiedlichen Diffusionskoeffizienten werden über ihre unterschiedliche Korrelationszeit unterschieden (Haustein et al., 2003; Bacia et al., 2003, Craenenbroeck et al., 2000; Földes-Papp et al., 2002; Thompson et al., 2002 ).
Die Messungen werden bei Raumtemperatur mit dem Leica DM IRE2, Leica TCS SP2 AOBS confocal laser scanning Mikroskop mit FCS-Applikationen (Leica microsystems) durchgeführt. Das für die Messungen verwendete Objektiv ist das HCX PL APO 63x/1.20 W CORR CS von Leica Germany.
Zur Anregung des Fluoreszeins wird die 488 nm Linie des Ar-Lasers verwendet. Für die Anregung des Alexa 594 -Fluorophors wird die 594 nm Linie des HeNe-Lasers benutzt.
Die Fluoreszenz der beiden Fluorophore wird durch den AOBS (acusto optical beam splitter) vom anregenden Laserlicht getrennt und über Filter in zwei Kanäle geleitet die, ausgestattet mit Avalanche Photodioden, die emittierten Photonen zählen. Der erste
Kanal detektiert im blauen Wellenlängenbereich emittierte Photonen. Der Detektions- bereich ist 500 - 530 nm. Der zweite Kanal detektiert im roten Wellenlängenbereich emittierte Photonen. Der Detektionsbereich ist 607 - 683 nm.
Die Messungen werden in PBS pH = 8,0 oder Hamburger Shift Puffer (siehe EMSA) (jedoch ohne Glycerin) durchgeführt. Die Sampling Frequency beträgt 750 kHz, die Messzeit beträgt 10 sec. Die Messungen wurden 3-5 mal wiederholt. Die Auto- korrelationen und Kreuzkorrelationen werden aquiriert, korreliert und ausgewertet mit der Leica/ISS FCS Software. Weiterhin wird das Programm Origin für die Auswertung benutzt. Zur Anpassung der Funktionen wird der Marquardt-Levenberg Algorithmus verwendet.
2.4.4 Kreuzkorrelation
Um die molekulare Interaktion zweier Makromoleküle sensitiv zu untersuchen, kann man beide Bindungspartner mit spektral getrennten Fluorophoren markieren. Die Fluktuationen werden in zwei separaten Kanälen detektiert.
Für die Kreuz-Korrelationsfunktion wird die mittlere Signalabweichung des ersten Kanals multipliziert mit der zeitversetzten mittleren Signalabweichung des zweiten Kanals (anstatt eines Duplikats des ersten Kanals wie bei der normalen Autokorrelation).
Anschließend erfolgt die Mittelung und Normierung.
Wenn zwei Makromoleküle nicht miteinander interagieren, sind die Signale nicht synchron und es resultiert keine Kreuzkorrelation. Im Falle der Interaktion ergibt die synchrone Diffusion ein synchrones Signal und damit eine Kreuz-Korrelationsamplitude, die mit dem Grad der Bindung ansteigt.
2.5 Verwendete Computerprogramme 2.5.1 CDPro
CDPro ist ein Programm zur Auswertung von Protein CD-Spektren. Es enthält drei populäre CD-Analyse Programme: CONTIN, CDSSTR und SELCON3. Die Software und eine Bedienungsanleitung sind im Internet frei erhältlich unter http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/FAQ.html
2.5.1 RasMol
RasMol / RasWin Molecular Graphics Vers. 2.7.1.1 ist ein Programm zur Darstellung von Molekülen. Mit ihm wurden die Daten der c-Myb-Reapeats R2 und R3 aus der Brookhaven-Datenbank dargestellt.
2.5.2 BPCFIT
BPCFIT Fitting Software der Abteilung Biophysikalische Chemie an der Medizinischen Hochschule Hannover, verwendet für die Anpassung der Schmelzkurven der Oligonukleotide
2.5.3 ISS® Inc. Vista Fluorescence Correlation Spectrometry Software
Software der Firma ISS® Inc. zur Steuerung der FCS Applikationen des Leica Confocal Microscope und Datenauswertung der Autokorrelationsfunktionen
2.5.4 Origin®
Software zur Datenanalyse und graphischen Darstellung 2.5.6 Oligonucleotide Properties Calculator
Software u.a. zur Berechnung des Molekulargewichts von Oligonukleotide, im Internet unter http://www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html verfügbar
