Untersuchungen über den Einfluss von Chloroquin und Desethylchloroquin auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Malariaerreger Plasmodium yoelii nigeriensis und Plasmodium falciparum (Coccidia: Plasmodiidae)

(1)

Untersuchungen über den Einfluss von Chloroquin und Desethylchloroquin auf die verschiedenen Entwicklungsstadien

der Malariaerreger Plasmodium yoelii nigeriensis und Plasmodium falciparum (Coccidia: Plasmodiidae)

Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

vorgelegt von Jonathan Chul-Hwan Kang

aus Seoul, Südkorea

Bonn Juni 2002

(2)

Angefertigt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

1. Referent: Professor Dr. W. A. Maier 2. Referent: Professor Dr. K. P. Sauer

Tag der Promotion: 16.12.2002

(3)

1 Einleitung ...6

1.1 Malaria und Plasmodium...6

1.2 Probleme bei der Malariabekämpfung ...9

1.3 Chloroquin...10

1.4 Zielsetzung der Versuche ...12

2 Material und Methoden ...13

2.1 Versuche mit Plasmodium yoelii nigeriensis...13

2.1.1 Mückenzucht ...13

2.1.2 Mäuse-Haltung ...14

2.1.2.1 Betäubung der Mäuse ...14

2.1.2.2 Tierversuchsgenehmigung...14

2.1.3 Plasmodium yoelii nigeriensis...15

2.1.3.1 Infektion der Mäuse mit Plasmodium yoelii nigeriensis...15

2.1.3.2 Kryokonservierung (nach Trager & Jensen 1980) ...16

2.1.4 Infektion der Mücken mit Plasmodium yoelii nigeriensis...17

2.1.5 Applikation von Chloroquin und Monodesethylchloroquin...17

2.1.5.1 Injektion von Chloroquin in die infizierten Mäuse (Versuchsreihe 1)...17

2.1.5.2 Applikation von Chloroquin in Glukoselösung (Versuchsreihe 2) ...18

2.1.5.3 Applikation von Chloroquin über gesunde Mäuse (Versuchsreihe 3) ...18

2.1.5.4 Applikation von Chloroquin und Monodesethylchloroquin über eine Membranfütterungsanlage (Versuchsreihe 4)...20

2.1.5 Auswertung des Infektionsverlaufs in den Mücken ...21

2.1.5.1 Oozystenzahl ...21

2.1.5.2 Sporozoitenzahl ...22

2.1.5.3 Statistische Auswertung ...22

2.2 Versuche mit Plasmodium falciparum...22

2.2.1 in vitro-Kultur von Plasmodium falciparum...23

2.2.1.1 Bestandteile des Kulturmediums ...23

2.2.1.2 Kontinuierliche Kultur von Plasmodium falciparum...24

2.2.1.3 Kryokonservierung ...25

(4)

2.2.2 Bestimmung der Chloroquin- und Monodesethylchloroquinempfindlich-keit der

asexuellen Stadien...25

2.2.2.1 Medikamenten-Stammlösungen ...25

2.2.2.2 Bestimmung der ED50-Werte...26

2.2.2.3 Kombinationsversuche mit Chloroquin und Monodesethylchloroquin...27

2.2.2.4 Bestimmung der Parasitämie ...27

3 Ergebnisse...28

3.1 Versuche mit Plasmodium yoelii nigeriensis...28

3.1.1 Fotografische Darstellungen...28

3.1.2 Applikation von Chloroquin in infiziertem Blut (Versuchsreihe 1)...30

3.1.3 Applikation von Chloroquin im Zuckerwasser (Versuchsreihe 2)...35

3.1.4 Applikation von Chloroquin in nicht infiziertem Blut (Versuchsreihe 3)...38

3.1.5 Applikation von Chloroquin und Monodesethylchloroquin in menschlichem Blut (Versuchsreihe 4) ...47

3.2 Versuche mit Plasmodium falciparum...51

3.2.1 ED50 von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin ...51

3.2.2 Applikation von Chloroquin und Monodesethylchloroquin in Kombinationen...52

4 Diskussion...55

4.1 Einfluss der Behandlung infizierter Mäuse mit subtherapeutischen Medikamentendosen auf die Infektiosität der Parasiten für die Mücken (zur Versuchsreihe 1)...55

4.2 Einfluss nachträglicher Aufnahme von unverstoffwechseltem Medikament auf den Infektionsverlauf in der Mücke (zur Versuchsreihe 2)...56

4.3 Einfluss nachträglicher Aufnahme des verstoffwechselten Medikamentes auf den Infektionsverlauf in der Mücke (zur Versuchsreihe 3)...58

4.4 Einfluss unterschiedlicher Konzentrationskombinationen von Medikament und dessen Metaboliten auf den Infektionsverlauf der Malariaerreger (zur Versuchsreihe 4 und Untersuchungen mit Plasmodium falciparum)...60

4.5 Ausblick...61

5 Zusammenfassung ...63

6 Literaturverzeichnis ...65

(5)

7 Anhang...71

7.1 Originaldaten der vorliegenden Arbeit ...71

7.2 Untersuchungen zur Wirkung von Halofantrin, Mefloquin bzw. Chinin auf Gamogonie und Sporogonie...115

7.2.1 Applikation von Halofantrin in infiziertem Blut ...115

7.2.1.1 Behandlung der infizierten Mäuse 6 Stunden vor Infektion der Mücken ...115

7.2.2 Applikation von verstoffwechseltem Halofantrin in nicht infiziertem Blut...116

7.2.2.1 Behandlung gesunder Mäuse mit Halofantrin 6 Stunden vor der zweiten Blutmahlzeit ...116

7.2.3 Applikation von Mefloquin in infiziertem Blut...117

7.2.4 Applikation von verstoffwechseltem Mefloquin in nicht infiziertem Blut ...117

7.2.4.1 Behandlung gesunder Mäuse mit Mefloquin 2 Stunden vor der zweiten Blutmahlzeit ...118

7.2.4.2 Behandlung gesunder Mäuse mit Mefloquin 24 Stunden vor der zweiten Blutmahlzeit ...118

7.2.5 Applikation von Chinin in infiziertem Blut...118

7.2.6 Applikation von verstoffwechseltem Chinin in nicht infiziertem Blut ...119

Danksagung...121

(6)

1 Einleitung

1.1 Malaria und Plasmodium

Malaria ist eine Krankheit, die durch parasitische Protozoen (Gattung Plasmodium, Stamm:

Apicomplexa) im Blut des Vertebratenwirtes hervorgerufen wird und durch Stechmücken (Gattung Anopheles) übertragen wird. Die Erreger befallen nicht nur Menschen, sondern auch Säuger, Vögel, Reptilien oder Amphibien, wobei sie streng wirtsspezifisch sind.

Die folgenden vier Arten von Plasmodium sind für den Menschen medizinisch bedeutend und nach den Abständen der Fieberschübe wie folgt zu gruppieren :

Art Name erythrozytärer

Schizogoniezyklus Fieber-Tage P. vivax

P. ovale Malaria tertiana 48 h 1 Fieber-Tag und 1 fieberfreier Tag P. malariae Malaria quartana 72 h 1 Fieber-Tag und

2 fieberfreie Tage P. falciparum Malaria tropica 48 h ständiges, unregelmäßiges,

hohes Fieber

In Abb. 1 ist der Entwicklungszyklus von Plasmodium sp. dargestellt: Durch den Stich einer infizierten weiblichen Mücke werden Sporozoiten (a) auf den Wirbeltierwirt übertragen. Die Sporozoiten dringen über die Blutbahn in Leberzellen ein und wachsen dort intrazellulär zu Gewebeschizonten heran (b). Dieser Vorgang wird als „präerythrozytäre Schizogonie“ bezeichnet. Bei Plasmodium vivax und P. ovale überleben in Leberzellen einige eingedrungene Sporozoiten bzw. produzierte Merozoiten der ersten Generation als sog.

Dormozoiten bzw. Hypnozoiten (c), vermehren sich erst nach Monaten oder Jahren und führen so zu neuen Malaria-Anfällen (Rezidive). In den Schizonten bilden sich zahlreiche Merozoiten (d). Beim Platzen der Leberzellen gelangen diese in den Blutstrom und befallen Erythrozyten (Trophozoiten, e). In den Erythrozyten wachsen die Merozoiten zu Schizonten (f) heran, die wieder 8 bis 16 Merozoiten ausbilden. Danach zerfallen die befallenen Erythrozyten. Dabei werden u.a. Reste des abgebauten Hämoglobins, das sogenannte

„Malariapigment“, frei, wodurch die Fieberanfälle verursacht werden.

(7)

Einige Merozoiten differenzieren sich zu männlichen bzw. weiblichen Gamonten, die jeweils Mikro- bzw. Makrogametozyten (g, h) oder Mikro- bzw. Makrogamonten (Synonym) heißen und für die Mücke die infektiösen Stadien darstellen. Nach der Blutaufnahme der Mücke entwickeln sich die Mikrogametozyten zu Mikrogameten (i) und die Makrogametozyten zu Makrogameten (j). Sie verschmelzen und bilden die Zygote (k). Aus der ovoiden Zygote entsteht ein längliches Stadium, der Ookinet (l), der durch die peritrophische Membran hindurch in die Epithelzellen des Mückendarmes eindringt. Nach der Passage siedelt sich der Ookinet als Oozyste (m) zwischen Darmwand und Basallamina an.

Der Kern zerfällt in mehrere Tochterkerne und zahlreiche Sporozoiten in einer dünnen, von den Wirtzellen abgeschiedenen Schicht. Die reifen Sporozoiten (a) verlassen die Oozysten aktiv, gelangen über die Hämolymphe in die Speicheldrüse und können beim nächsten Stich der Mücke abgegeben werden.

(8)

Abb. 1: Entwicklungszyklus von Plasmodium sp. (aus PETERS,1987, geändert) a: Sporozoiten, b: Gewebeschizonten, c: Hypnozoiten, d: Merozoiten, e: Trophozoiten, f: Schizonten, g: Mikrogametozyt, h: Makrogametozyt, i: Mikrogamet, j: Makrogamet, k: Zygote, l: Ookinet, m: Oozysten

(9)

1.2 Probleme bei der Malariabekämpfung

Nach der Entdeckung des Chloroquins gelang sowohl die prophylaktische als auch die kurative Behandlung der Malaria in den meisten Fällen. In den letzten Jahren sind jedoch resistente Erreger in fast allen Malariagebieten der Erde entstanden. Insbesondere haben sich chloroquin-resistente Stämme von Plasmodium falciparum in Asien, Süd- und Mittelamerika, West- und Ostafrika ausgebreitet (RIECKMANN et al., 1989. BJÖRKMAN et al., 1990.

GARVAVELLI et al., 1992. KOZARSKY et al., 1994. Abb. 2).

Abb. 2: Verbreitung der Malaria und Chloroquin-resistenter Plasmodium falciparum, 1994 (aus K^OZARSKY et al., 1994)

Zur Zeit gibt es weltweit jährlich 1,5 bis 2,7 Millionen Todesfälle hauptsächlich unter Kindern im Alter unter 5 Jahren und schwangeren Frauen im Sub-Sahara-Afrika (P^HILLIPS, 2001). In einigen Gebieten dieses Kontinentes scheint Chloroquin kaum mehr Wirksamkeit zu haben (N^UWAHA, 2001).

Es ist fraglich, ob man Chloroquin zur Prophylaxe weiter benutzen sollte, da es Hinweise gibt, dass dieses Medikament sogar zur Steigerung der Infektiosität der Erreger beitragen kann: Bereits 1969 wiesen RAMKARAN UND P^ETERS nach, dass die Infektiosität des chloroquin-resistenten Mäusemalariaerregers Plasmodium berghei durch Chloroquin- Aufnahme der Mücken (Anopheles stephensi) gesteigert wurde (R^AMKARAN et al., 1969).

Später fanden C und seine Kollegen, dass die Aufnahme von medikamenthaltigem

(10)

Blut durch die Mücken im Falle von Mefloquin und Artemisinin bei geringer Dosis zu einer beschleunigten Entwicklung der Sporozoiten von P. berghei führte (COLEMAN et al., 1988).

Bei ähnlichen Versuchen mit Chloroquin bei Anopheles stephensi fanden DO ROSARIO und seine Kollegen zwar keine Veränderung der Infektiosität von Plasmodium falciparum und P.

berghei bei Anopheles stephensi und A. freeborni; als aber A. freeborni Mücken am 10. und 12. Tag nach Infektion mit P. berghei zusätzlich Chloroquin erhielten, zeigte sich eine hohe Invasionsrate der Erreger in die Speicheldrüsen (um 60 und 70%, DO ROSARIO et al., 1988).

Eine erhöhte Infektiosität fanden auch ICHIMORI und seine Kollegen bei Plasmodium yoelii nigeriensis bei Chloroquin-behandelten Anopheles stephensi (ICHIMORI et al., 1990).

Je nach Autor waren die in den Versuchen eingesetzten Methoden jedoch sehr unterschiedlich. So war z.B. der zeitliche Abstand der Gabe des Medikamentes nach der Infektion, die Dosierung des Medikamentes etc. verschieden, so dass die Ergebnisse nicht direkt miteinander zu vergleichen sind. Es ist dringend notwendig, solche Versuche in einem bestimmten Schema systematisch durchzuführen, um das Problem der Resistenzentwicklung der Malariaerreger besser beurteilen zu können. Die Chemoprophylaxe mit Medikamenten müsste radikal geändert werden, wenn sich bestätigen sollte, dass die Resistenzentwicklung und –ausbreitung durch den Einsatz eines Medikamentes gefördert würde.

1.3 Chloroquin

Chloroquin wurde erstmalig 1939 in Deutschland beschrieben und ab 1941 in größeren Umfang in den USA hergestellt (Andersag et al., 1939, H^ARTKE et al., 1991, Abb. 3).

Chloroquin mit Handelsnamen Resochin® gehört zur Gruppe der 4-Aminoquinoline, deren Angriffspunkte auf die Stadien der Parasiten beschränkt sind, die aktiv in Abbau des Hämoglobins beteiligt sind. Chloroquin hemmt die Reifung der erythrozytären Formen der Parasiten und damit die mit dem Fieberanfall verbundene Freisetzung der Merozoiten. Das Wirkungsspektrum umfasst alle Formen der Malariaerreger des Menschen (Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale und P. malariae). Gegen Gewebeschizonten, Hypnozoiten sowie Gametozyten von P. falciparum ist Chloroquin dagegen unwirksam (H^ARTKE et al., 1991, B^UTCHER, 1997).

(11)

Abb. 3: Strukturformel von Chloroquin (7-chloro-4-[4´-(diethylamino)-1´-methylbutyl]

aminoquinolin, links) und Monodesethylchloroquin (7-chloro-4-[4´-(ethylamino)- 1´-methylbutyl] aminoquinolin, rechts) (nach A^NSARI, 1994)

Der Mechanismus der Chloroquin-Wirkung gegen Plasmodien besteht in der Hemmung der Hämpolymerase nach Anreicherung des Wirkstoffs in Erythrozyten mit Parasitenbefall. Da Plasmodien einen starken Hämoglobinabbau zur Gewinnung essentieller Aminosäuren induzieren, sind sie auf die Entgiftung toxischer Häm-Metaboliten angewiesen. Diese erfolgt durch Polymerisation des freien Häm (Ferriprotoporphyrin IX, FPIX) zu Hämozoin. Eine Anreicherung toxischer Häm-Abbauprodukte durch Chloroquin bedingt die blutschizontozide Wirkung (H^ARTKE et al., 1991, O’N^EILL et al., 1998).

Der Hauptmetabolit des Chloroquins ist Monodesethylchloroquin, dessen hemmende Wirkung gegen Chloroquin-sensitive Plasmodium falciparum-Stämme stark wie Chloroquin aber gegen Chloroquin-resistente P. falciparum viel geringer ist (V^ERDIER et al., 1984, F^U et al, 1986, TRAORE, 1997, Abb. 3). Hierbei stellt sich eine Frage, ob und inwiefern Monodesethylchloroquin an der Inhibition bzw. Stimulation der Infektiosität der Malariaerreger beteiligt ist. A^DEROUNMU (1984) wies nach, dass eine 4:1 Konzentrationskombination von Chloroquin und Monodesethylchloroquin mehr hemmende Wirkung auf die Schizogonie der chloroquin-resistenten P. falciparum hatte als Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin allein. Unterschiedliche Ergebnisse liegen vor, wenn Chloroquin den mit Plasmodium infizierten Mücken appliziert wurde. Hierdurch wurde die Infektiosität der Parasiten erhöht (WILKINSON et al., 1976, PETERS et al., 1970, ICHIMORI et al., 1990), verringert (JEFFREY, 1958, HOGH et al., 1995) oder es gab keine Änderung der Infektiosität (GERBERG, 1971, CHUTMONGKONKUL et al., 1992a,b). Da Chloroquin hierbei je nach der Untersuchung verstoffwechselt von den Mücken aufgenommen wurde, ist zu bedenken, dass Monodesethylchloroquin bzw. weitere Metaboliten des Chloroquin, z.B.

Bisdesethylchloroquin, eine Rolle spielen könnten.

(12)

1.4 Zielsetzung der Versuche

Mit der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob und gegebenenfalls wie Chloroquin und Monodesethylchloroquin Gamogonie und Sporogonie von Plasmodium yoelii nigeriensis (Nagermalariaparasiten) und Plasmodium falciparum beeinflussen, und zwar mit folgenden vier Fragestellungen:

a. Welchen Einfluss hat die Behandlung infizierter Mäuse mit subtherapeutischen Medikamentendosen auf die Infektiosität der Parasiten. Hierdurch sollte erklärt werden, ob das Medikament, das zur Chemotherapie eingenommen wurde, die Entwicklung der Malariaerreger in den Mücken beeinflusst.

b. Wie beeinflusst die nachträgliche Aufnahme von unverstoffwechseltem Medikament den Infektionsverlauf in der Mücke.

c. Welchen Einfluss hat die nachträgliche Aufnahme des verstoffwechselten Medikamentes auf den Infektionsverlauf in der Mücke. Dadurch sollte ermittelt werden, wie das Medikament, das zur Prophylaxe eingenommen wurde, die Entwicklung der Malariaerreger in den schon infizierten Mücken beeinflusst.

d. Wie beeinflussen unterschiedliche Konzentrationskombinationen von Chloroquin und Monodesethylchloroquin den Infektionsverlauf der Malariaerreger. Durch diese Versuche sollte erklärt werden, ob eventuell die inhibierende, stimulierende bzw. fehlende Wirkung des Chloroquins auf die Malariaparasiten im Zusammenhang mit dem Konzentrationsverhältnis von Chloroquin und dessen Metabolit Monodesethylchloroquin im Blut steht.

Zusammenfassend sollte überprüft und diskutiert werden, ob sich eine Steigerung der Mückeninfektion durch den Einsatz von Chloroquin ergibt und ob Chloroquin zur Prophylaxe weiter verwendet werden sollte.

Da diese Versuche Teil eines Projektes am Institut für Medizinische Parasitologie Bonn sind, mit dem der Einfluss anderer wichtigen Malariamedikamente (Halofantrin, Mefloquin) auf die Malariaparasiten überprüft wird, sollten die Ergebnisse dieser Arbeit mit den Ergebnissen der

(13)

2 Material und Methoden

2.1 Versuche mit Plasmodium yoelii nigeriensis 2.1.1 Mückenzucht

Verwendet wurden Mücken einer Anopheles stephensi – Kolonie, die seit 1985 im Institut für Medizinische Parasitologie der Universität Bonn gezüchtet wird. Die derzeit existierende Kolonie geht auf Laborstämme aus London, Basel und Zürich zurück.

Die Mücken wurden bei 26°C, 80% relativer Luftfeuchtigkeit und einem regelmäßigem Hell- Dunkel-Wechsel von 16 Stunden Kunstlicht und 8 Stunden Dunkelheit gehalten.

Für die Aufzucht der Larven wurden die abgelegten Eier in Makrolonschalen (20 x 15 x 15 cm, Fa. Ebeco) in Leitungswasser bei einem Wasserstand von 1 cm gelegt, wobei die inneren Wände der Makrolonschalen mit einem Band Filterpapier ausgelegt wurden, um ein Austrocknen der Eier zu verhindern. In den folgenden Tagen wurden die Larven in größere Makrolonschalen (42 x 26 x 15 cm) mit einem Wasserstand von 5 cm aufgeteilt, so daß jede Schale mit etwa 400 Larven besetzt wurde. 1-2mal pro Tag wurde soviel Futter (Tetra Standard Mix, Fa. Tetra, zermörsert) auf die Wasseroberfläche aufgebracht, dass es sich durch die Oberflächenspannung des Wassers gut verteilte. Täglich wurden die vorhandenen Puppenstadien in wassergefüllte Schalen in die Einflugkäfige (40x40x40 cm) überführt. Als Nahrungsquelle für die Adultmücken diente eine alle zwei Tage frisch angesetzte 10%ige Glukoselösung in Erlenmeyerkölbchen, die über Filterpapierröllchen den Mücken angeboten wurde. Außerdem enthielt jeder Käfig eine Schale mit autoklaviertem Leitungswasser.

Zur Gelegeproduktion wurde einmal wöchentlich eine Blutfütterung durchgeführt. Zur Stimulation der Saugaktivität der Mücken wurde 24 Stunden zuvor das Zuckerwasser aus den Käfigen entfernt. NMRI-Mäuse wurden wie unter 2.2 beschrieben betäubt und auf die Mückenkäfige gelegt, so dass die Mücken durch die Gaze Blut saugen konnten.

(14)

2.1.2 Mäuse-Haltung

Als Wirbeltierwirte für Plasmodium yoelii nigeriensis und als Fütterungsmäuse für die Anopheles stephensi-Gelegeproduktion dienten weiße Labormäuse. Es handelte sich um insititutseigene Nachzuchten des NMRI-Stammes (Hannover bzw. Charles River GmbH, Sulzfeld). Die Tiere wurden in Makrolonschalen bei Zimmertemperatur und Tageslicht gehalten. Sie wurden mit Altromin Standard-Diät und Wasser ad libitum gefüttert. Das Gewicht zum Zeitpunkt der Versuche betrug 20-40 g.

2.1.2.1 Betäubung der Mäuse

Zur Betäubung der Mäuse für die Fütterung und Infektion der Mücken wurde eine Ketamin- Xylazin-Betäubung durchgeführt. Hierzu wurde zunächst Atropinsulfat (0,2 mg/kg Körpergewicht, KG, Fa. Braun, mit 0,9% NaCl verdünnt) subcutan appliziert und nach einer Wartezeit von 15-30 Minuten wurden Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg KG, von Ketanest

Fa. Parke-Davis) und Xylazinhydrochlorid (16 mg/kg KG, von Rompun Fa. Bayer) zusammen injiziert. Die Schlafzeit der Mäuse betrug ca. 30 Minuten.

2.1.2.2 Tierversuchsgenehmigung

Die Versuche an Mäusen wurden nach § 8 des Tierversuchsgesetzes nach Antrag von der Bezirksregierung Köln (Aktenzeichen: 23.203.2 BN 15, 19/93) genehmigt. Das gesamte Vorhaben trug den Titel: „Untersuchungen über den Einfluss ausgewählter Malariamedikamente auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Gamogonie und Sporogonie von Plasmodium yoelii nigeriensis und Plasmodium berghei“ (Kurzbezeichnung:

Malariavektor / Malariamedikamente).

(15)

2.1.3 Plasmodium yoelii nigeriensis

Plasmodium yoelii nigeriensis wurde 1968 in Buschratten (Thamnomys rutilans) aus Nigeria entdeckt und von K^ILICK-K^ENDRIK (1973) genauer beschrieben. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Stamm handelt es sich um den Klon N67, der 1983 von Dr. D. Walliker (Institute of Animal Genetics, Edinburgh) zur Verfügung gestellt wurde. Seit dem wurde er durch mechanische Passage oder zyklisch durch Anopheles stephensi übertragen oder in Mäuseblut kryokonserviert aufbewahrt. Nach etwa sechs mechanischen Passagen erfolgte eine zyklische Passage, um die Fähigkeit von Plasmodium yoelii nigeriensis zur geschlechtlichen Vermehrung aufrecht zu erhalten.

2.1.3.1 Infektion der Mäuse mit Plasmodium yoelii nigeriensis

Die für die Versuche verwendeten Mäuse wurden entweder von kryokonserviertem parasitiertem Blut (0,3 ml pro Maus, 1:1 verdünnt mit physiologischer NaCl-Lösung) oder frischem Blut einer mit Plasmodium yoelii nigeriensis infizierten Maus injiziert. Zur besseren Standardisierbarkeit der Infektion wurden für die Versuche lediglich über „Blutpassagen“

infizierte Mäuse verwendet. Von einer aufgetauten Probe wurden außerdem nicht mehr als fünf Mäusepassagen durchgeführt, um eine gleichbleibende hohe Produktion und Infektiosität der Gametozyten zu gewährleisten. 5 Tage nach der Infektion wurde eine Maus (Parasitämie ca. 15-20%) dekapitiert und das Blut in einem Becherglas aufgefangen, das 0,3 ml Liquemin und 1,5 ml NaCl-Lösung (0,9%) als Antikoagulans enthielt.

Die Parasitendichte wurde wie folgt bestimmt:

10 µl der Blut-Liquemin-Mischung wurden 1:100 mit phys. NaCl-Lösung verdünnt. In einer Thoma-Zählkammer wurde die Zellzahl dieser Suspension nach der Formel ermittelt:

X × 10⁶ Z = 

Y × 4

(16)

Z : Zellzahl / ml Suspension X: Zellzahl in den B-Feldern Y: Anzahl der gezählten B-Felder

Unter Einbeziehung der vorher ausgezählten Parasitämie (PÄ) und des Verdünnungsfaktors der Suspension wurde dann die Parasitendichte der Blut-Liquemin-Mischung errechnet:

X × 10⁶ × 100 × PE P = 

Y × 4 × GE

P: Parasitenzahl / ml

PE: parasitierte Erythrozyten

GE: gesamt ausgezählte Erythrozyten PE

PÄ =  × 100 (%) GE

PÄ: Parasitämie

Mit phys. NaCl-Lösung wurde die Blut-Liquemin-Mischung auf 1×10⁶ Parasiten pro Inokulumvolumen (0,3 ml) eingestellt und intraperitoneal (i.p.) injiziert. Der Infektionsverlauf der Mäuse wurde täglich anhand Giemsa-gefärbter Schwanzblut-Ausstriche kontrolliert.

2.1.3.2 Kryokonservierung (nach T^RAGER&J^ENSEN1980)

Infiziertes Mäuseblut wurde wie unter 2.3.1 beschrieben gewonnen und mit physiologischer NaCl-Lösung auf 4 × 10⁷ parasitierte Erythrozyten pro 0,25 ml eingestellt. Diese Suspension wurde mit dem gleichen Volumen Einfrierlösung versetzt. Jeweils 0,25 ml wurden in Kryoröhrchen portioniert und in flüssiges N2 (-170°C) eingebracht.

(17)

Herstellung der Glycerin-Sorbitol-Einfrierlösung:

0,9 g NaCl 4,2 g Sorbitol

mit aqua dest. auf 100 ml auffüllen mit 38,9 ml Glycerin vermischen

2.1.4 Infektion der Mücken mit Plasmodium yoelii nigeriensis

Für die Versuche wurden ca. 1500 Puppen von Anopheles stephensi in Wassergläsern in einen großen Einflugkäfig (40x40x40 cm) eingestellt und wie in [2.1] beschrieben behandelt. Am dritten Tag nach der Infektion der Mäuse mit Plasmodium yoelii nigeriensis wurden saugwillige weibliche Mücken in mehrere kleinere Käfige (20x20x20 cm) aufgeteilt und konnten 20 Minuten an den Mäusen saugen. Die Mücken, die nicht voll gesaugt hatten, wurden mit Exhaustor entnommen und verworfen. 24 Stunden vor dem Blutmahl wurde das Zuckerwasserglas weggestellt, um die Saugaktivität der Mücken zu erhöhen. Die Mücken waren 6 bis 8 Tage vor dem Blutmahl geschlüpft.

2.1.5 Applikation von Chloroquin und Monodesethylchloroquin

Chloroquin wurde als Chloroquin-Diphosphat bei der Fa. Sigma gekauft;

Monodesethylchloroquin wurde von der Fa. Rhône-Poulenc Rorer GmbH, Köln freundlicherweise kostenlos zur Verfügung gestellt. Diese Chemikalien wurden über vier unterschiedliche Wege in die Mücken appliziert:

2.1.5.1 Injektion von Chloroquin in die infizierten Mäuse (Versuchsreihe 1)

Den Mäusen, die wie unter [2.3.1] beschrieben mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren, wurde Chloroquin mit unterschiedlichem Zeitabstand bis zum Blutmahl (6 h, 30 h bzw. 54 h) intraperitoneal appliziert. Die Dosierungen betrugen 1, 10 bzw. 50 mg Chloroquin-Base pro kg Körpergewicht der Maus. Dazu wurde eine Stammlösung aus 100 mg Chloroquin-diphosphat in 10 ml aqua dest hergestellt und mit physiologischer

(18)

Kochsalzlösung so verdünnt, daß ein Inokulum von 0,3 ml entsprechend dem Gewicht der Mäuse die gewünschte Menge Chloroquin enthielt. Kontrollmäuse erhielten eine Injektion von 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung. Am dritten Tag nach der Infektion der Mäuse konnten die Mücken wie unter [2.4] beschrieben an diesen Mäusen saugen.

2.1.5.2 Applikation von Chloroquin in Glukoselösung (Versuchsreihe 2)

Chloroquinhaltige Glukoselösung wurde in den Konzentrationen von 15, 150 und 750 µg/ml hergestellt. Dazu wurde eine Stammlösung von Chloroquin in aqua dest hergestellt, die über mehrere Wochen bei 4°C aufbewahrt wurde. Aus dieser Stammlösung wurde mit frisch angesetzter 10%iger Glukoselösung die gewünschte Konzentration eingestellt und den Mücken angeboten. Die Mücken der Kontrollgruppe erhielten nur 10%ige Glukoselösung.

2.1.5.3 Applikation von Chloroquin über gesunde Mäuse (Versuchsreihe 3)

Die Mücken, die durch ein infektiöses Blutmahl mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren, erhielten Chloroquin durch ein zweites Blutmahl. Dies erfolgte an gesunden Mäusen, denen Chloroquin 0,5 h, 2 h, 6 h, 24 h, 48 h bzw. 72 h zuvor intraperitoneal appliziert worden war. Die Chloroquin-Inokula wurden wie unter [2.5.1] beschrieben vorbereitet. Die Dosierungen betrugen ebenfalls 1, 10 bzw. 50 mg/kg Körpergewicht.

Unmittelbar nach der Fütterung wurden diese Mäuse dekapitiert; deren Blut wurde entweder je 250 µl in flüssigem Stickstoff aufbewahrt oder je 50 µl auf Filterpapier getrocknet und später zur Bestimmung der Konzentrationen von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin mit HPLC analysiert.

Die HPLC-Analyse wurde freundlicherweise durch Dr. J. F. Chaulet und Herrn Cyril Mounier im Hôpital d`Instruction des Armées Desgenettes, Lyon, Frankreich, durchgeführt (nach CHAULET et al., 1993, CROES et al., 1994). Zur Extraktion der Medikamente aus den Blutproben wurden NaOH und Diethylether bei eingefrorenen Blutproben bzw. HCl und Dichloromethan bei Blutproben auf Filterpapier verwendet (Abb. 4). Zur Mobilphase diente eine Mischlösung aus Acetonitril und Methanol/Ammoniak (Abb. 5).

(19)

Abb. 4: Chloroquin-Extrakt in Dichloromethan (im unteren durchsichtigen Bereich) und Filterpapier mit Blutzellen (im oberen dunklen Bereich).

Abb. 5: Das HPLC-Analysegerät bestand aus einer Waters 600 E multi- solvent delivery Pumpe (Fa.

Millipore, USA), einem Waters 715 Ultrawisp Injektor (Fa.

Millipore, USA), einer 5 µm silica intersil Säule und einem Waters 470 Scanning Flourescence Detektor (Fa. Millipore, USA).

(20)

2.1.5.4 Applikation von Chloroquin und Monodesethylchloroquin über eine Membranfütterungsanlage (Versuchsreihe 4)

Mit Hilfe einer Membranfütterungsanlage erhielten die infizierten Mücken ein zweites Blutmahl, das aus Kombination von Chloroquin und Monodesethylchloroquin bestand (Abb.

6 und 7). Dazu wurden eine Stammlösung aus 100 mg Monodesethylchloroquin in 10 ml 50%

Methanol hergestellt und eine Stammlösung aus 100 mg Chloroquin in 10 ml aqua dest.. Aus diesen beiden Stammlösungen wurden drei Kombinationen der beiden Chemikalien in Humanblut hergestellt, nämlich Chloroquin : Monodesethylchloroquin = 10:0, 5:5 bzw. 0:10 (Base in Gewicht). Das hierfür benutzte Humanblut wurde zuvor von dem Autor frisch entnommen, in eine Glasflasche überführt und durch zwölfminütiges Schütteln mit Glaskugeln defibriniert. Die Dosierungen der beiden Chemikalien betrugen gepoolt 1,5; 7,5 bzw. 15 µg/ml Totalblut. Während der zwanzigminütigen Fütterung wurde die Temperatur des Blutes bei 38°C konstant gehalten. Zur Stimulierung der Saugaktivität wurde durch einen Schlauch vorsichtig um die Gefäße mit dem Blut in die Käfige hineingehaucht.

Abb. 6: Die Membranfütterungsanlage bestand aus einer Warmwasserpumpe, mehreren Fütterungskämmerchen und an die Pumpe angeschlossenen Schläuchen. Die Fütterungskämmerchen waren jeweils an ihrer Unterseite mit einer Paraffinmembran überzogen. Die Wasserpumpe hielt das fließende Wasser auf 38°C, damit das in eine Schicht zwischen unterer Kammerfläche und der Membran eingespritzte Blut auch warm bleiben konnte.

(21)

Abb. 7: Die Mücken in jedem Käfig konnten durch die Netze und die Membran das Blut saugen. Mücken, die nicht vollgesogen waren, wurden mit einem Exhaustor beseitigt.

2.1.5 Auswertung des Infektionsverlaufs in den Mücken

2.1.5.1 Oozystenzahl

Am 7. Tag nach der Infektion der Mücken mit Plasmodium yoelii nigeriensis wurden die Mücken mit einem Exhaustor aus den Käfigen gefangen und mit Äther betäubt oder im Eis deaktiviert. Die Präparation erfolgte in einem Tropfen 0,9%iger NaCl-Lösung : Der Thorax wurde mit einer Pinzette fixiert, während die beiden letzten Abdominalsegmente mitsamt dem Verdauungstrakt mit einer zweiten Pinzette langsam abgezogen wurden. Der Mitteldarm wurde mit einer Nadel von den anderen Körperteilen der Mücke abgeschnitten und mit einem Deckglas bedeckt, dann wurde mit Fließpapier vorsichtig soviel Flüssigkeit abgezogen, daß der Darm gut ausgebreitet lag. Mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskopes wurde die Anzahl der Oozysten pro Mitteldarm bestimmt.

(22)

2.1.5.2 Sporozoitenzahl

Am 14. Tag nach der Fütterung erfolgte die quantitative Untersuchung der Speicheldrüseninfektion anhand der Bestimmung der Sporozoitenzahlen in Thoraxhomogenaten. Die Mücken wurden mit Äther betäubt, und auf einem Objektträger wurden Kopf, Flügel, Beine und Abdomen entfernt. Die gewonnenen Thoraces (ca. 20 Stück pro Versuchsansatz) wurden in einer Eppendorfreagenzgefäß in 0,9%iger NaCl-Lösung zermörsert. Die groben Bestandteile des Homogenats wurden bei 1500 Umdrehung/Minute 5 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und bei 13000 Umdrehung/Minute 10 Minuten zentrifugiert. Danach wurde der Überstand verworfen und die Sedimente wurden mit 50 µl 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Mit Hilfe einer Thoma- Zählkammer im Phasenkontrast wurde die Zahl der Sporozoiten bestimmt. Die Berechnung der durchschnittlichen Sporozoitenzahl pro infizierter Mücke erfolgte unter Berücksichtigung der Infektionsrate (prozentualer Anteil der infizierten Mücken).

2.1.5.3 Statistische Auswertung

Aufgrund der starken Schwankungen der Oozystenzahlen pro Mitteldarm der Mücke erfolgte die statistische Absicherung mit Hilfe des Mann-Whitney-U-Testes (LAMPRECHT, 1992): Die Oozystenzahlen wurden in einer Rangreihenfolge angeordnet, und mit diesen Rangfolgewerten wurde die Infektionsintensität der Mitteldärme (Anzahl der Oozysten pro Mitteldarm) auf signifikante Abweichungen überprüft. Die Stärke der Speicheldrüseninfektion mit Sporozoiten konnte nicht statistisch ausgewertet werden, da pro Versuchsansatz nur ein Thoraxhomogenat angefertigt worden war.

2.2 Versuche mit Plasmodium falciparum

Die Versuche wurden mit dem Plasmodium falciparum-Stamm NF54 durchgeführt. Dieser Stamm wurde 1979 am Institut für Medizinische Parasitologie der Universität Nimwegen von einem an Flughafen-Malaria erkrankten Patienten isoliert („Amsterdam air port strain“).

Stabilate dieses Stammes wurden dem Institut für Medizinische Parasitologie in Bonn

(23)

2.2.1 in vitro-Kultur von Plasmodium falciparum

Die in vitro-Kultur von Plasmodium falciparum erfolgte im Prinzip nach der Methode von T^RAGER&J^ENSEN (1976), wurde jedoch in einigen Punkten modifiziert. Alle Lösungen, die in der Kultur Verwendung fanden, wurden sterilfiltriert (0,22 µm Einwegfilter, Fa. Milipore und Fa. Schleicher & Schuell). Antibiotika wurden nicht eingesetzt. Sämtliche Arbeit wurden an einer auf 37°C aufgeheizten sterilen Werkbank (Fa. Biochrom) durchgeführt. Alle Medien und Gerätschaften wurden vor der Verwendung bei der Kultivierung auf 37°C erwärmt.

2.2.1.1 Bestandteile des Kulturmediums

Die Kultivierung wurde in RPMI 1640-Medium durchgeführt, das mit 25 mM HEPES-Puffer und 50 mg/l Hypoxanthin versetzt wurde. Zu dieser RPMI-Stammlösung wurden kurz vor der Verwendung 10% Humanserum und 0,275% NaHCO3 zugegeben und als Komplettmedium (KM) verwendet.

RPMI-Stammlösung

10,41 g RPMI 1640-Trockenpulver (Fa. Sigma) 5,95 g HEPES-Buffer (Fa. Roth)

50 mg Hypoxanthin (Fa. Sigma) ad 1000 ml Aq. demil.

pH = 7,0 (mit NaOH bzw. HCl eingestellt)

Die RPMI-Stammlösung wurde bei +4°C höchstens bis zu zwei Wochen aufbewahrt.

Humanserum

Das verwendete Humanserum wurde freundlicherweise vom Institut für Experimentelle Hämatologie und Bluttransfusionswesen der Universitätskliniken Bonn zur Verfügung gestellt. Das Humanserum wurde ohne Verwendung von Antikoagulantien gewonnen. Hierzu wurde frisch entnommenes Spenderblut (A⁺) bei Zimmertemperatur zur Koagulation stehengelassen, und das Serum wurde abzentrifugiert und bei –20°C tiefgefroren. Die Zentrifugation erfolgte bereits eine Stunde nach der Blutentnahme, um eine möglichst

(24)

schnelle Kühlung zu sichern und die durch Wärme begünstigte Entstehung toxischer Substanzen im Serum zu verhindern. Das Serum von mindestens zehn Spendern wurde gepoolt, in Aliquots von je 50 ml bei –20°C gelagert und erst unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut. Eine Inaktivierung des Serums erfolgte nicht.

Erythrozyten

Zur Erythrozytengewinnung wurde Spenderblut der Blutgruppe A bzw. O im Institut für Medizinische Parasitologie in Bonn ohne Antikoagulantien entnommen und sofort steril in eine Glasflasche überführt und durch zwölfminütiges Schütteln mit Glaskugeln defibriniert.

Das Blut wurde abzentrifugiert (2000 U/min, 4 min), der Überstand verworfen, zweimal in RPMI-Stammlösung resuspendiert und jeweils wieder abzentrifugiert. Anschließend wurden die abzentrifugierten Erythrozyten 3:1 mit Humanserum versetzt, bei +4°C gelagert und nicht länger als eine Woche benutzt.

2.2.1.2 Kontinuierliche Kultur von Plasmodium falciparum

Die kontinuierliche Kultur der erythrozytären Stadien erfolgte in Kunststoff-Petrischalen (35x10 mm bzw. 60x15 mm, Fa. Nunc) bei einem Hämatokrit von 7 %, dies entspricht 0,375 ml Erythrozyten plus 5 ml Komplettmedium. Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt, indem das alte Mediuim über den sedimentierten Erythrozyten abgesaugt und durch frisches Medium ersetzt wurde. Wenn die Parasitämie einer Schale 5 % erreichte, wurde die kontinuierliche Kultur entweder auf die Hälfte verdünnt oder auf zwei Schalen aufgeteilt, so daß die Parasitämie auf 0,5 % eingestellt wurde. Die Kulturen wurden in Inkubationskammern (Fa. Billus-Rothenberg) mit einem Gasgemisch aus 5% CO2, 3% O2 und 92% N2 ca. zwei Minuten lang begast und anschließend im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert. Tempraturschwankungen und Aufenthaltsdauer der Kulturen an der Raumluft wurden möglichst minimal gehalten.

(25)

2.2.1.3 Kryokonservierung

Sobald ausreichend Kulturmaterial vorhanden war, wurde ein Teil der Kulturen eingefroren, um die Parasiten in kryokonserviertem Zustand lange aufbewahren und später wieder auftauen und benutzen zu können. Diese Kryokonservierung erfolgte nach D^IGGS et al. (1977) mit einigen Modifikationen:

Eine Kultur in mehreren Schalen mit einer Parasitämie von etwa 5% (überwiegend Ringstadien) wurde in Zentrifugeröhrchen umgefüllt, zentrufugiert (2000 Umdrehung/min, 4 min) und der Überstand wurde verworfen. Jeweils 0,2 ml des Pellets wurde in 1,8 ml- Kryoröhrchen (Fa. Nunc) portioniert und das gleiche Volumen kalter 30%iger Glycerinlösung in 0,01 M PBS (Kryolösung) wurde zugegeben. Die Proben wurden zuerst 30 min lang bei - 4°C abgestellt und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt.

Um von kryokonseviertem Material eine Kultur anzulegen, wurde eine Probe bei 37°C im Wasserbad schnell aufgetaut und sofort für einige Minuten lang auf Eis gelegt, dann in ein Zentrifugeröhrchen überführt und mit dem gleichen Volumen kalter 3,5%iger NaCl-Lösung suspendiert. Die Erythrozyten wurden abzentrifugiert (2000 Umdrehung/min, 4 min), mit 20 ml Komplet-Medium resuspendiert und in eine 20 ml-Schale überführt. Anschließend wurde 0,4 ml frische Erythrozyten dazugegeben. In den ersten zwei Tagen erfolgte kein Mediumwechsel.

2.2.2 Bestimmung der Chloroquin- und Monodesethylchloroquinempfindlich- keit der asexuellen Stadien

2.2.2.1 Medikamenten-Stammlösungen

Zur Bestimmung der Medikamentempfindlichkeit der asexuellen Stadien von Plasmodium falciparum wurden von den verwendeten Wirkstoffen Stammlösungen hergestellt. Diese wurden in Glasgefäßen bei + 4°C über mehrere Monate lang aufbewahrt.

Chloroquin-Stammlösung:

100 mg Chloroquin-Diphosphat (Fa. Sigma)

(26)

Monodesethylchloroquin-Stammlösung:

100 mg Monodesethylchloroquin (Fa. Rhône-Poulenc Rorer) in 10 ml 50%iger Methanollösung

Für jeden Versuch wurde aus diesen Stammlösungen jeweils eine Stocklösung hergestellt, indem die Chloroquin- bzw. Monodesethylchloroquin-Stammlösung mit RPMI-Stammlösung auf 1/500 verdünnt und sterilfiltriert wurde. Je nach Versuchsansatz wurden diese Stocklösungen wiederum mit RPMI-Stammlösungen auf 1/10 bis 1/10000 verdünnt, um nach Komplettierung mit Humanserum und NaHCO3 die gewünschten finalen Konzentrationen erreichen zu können.

2.2.2.2 Bestimmung der ED50-Werte

Hierzu wurden asexuelle Stadien über einen Zeitraum von 96 Stunden verschiedenen Chloroquin- bzw. Monodesethylchloroquin-Konzentrationen ausgesetzt. Die Kultivierung erfolgte in 3 x 4-Loch-Platten (Fa. Costar). Jede Vertiefung erhielt 2 ml Komplettmedium mit der jeweiligen Medikamentenkonzentrationen und wurde mit 0,2 ml infizierten Erythrozyten beimpft. Die Ausgangsparasitämie betrug 0,3% und der finale Hämatokrit-Wert 10%. Alle 24 Stunden wurde das Medium gewechselt, Blutausstriche wurden dabei angefertigt und die Parasitenzahlen wurden bestimmt. Die eingesetzten Chloroquin- bzw.

Monodesethylchloroquin-Konzentrationen betrugen 1, 10 bzw. 100 ng/ml. Die Kontrollgruppen wurden mit medikamentenfreiem Komplettmedium angesetzt. Die Kontrollgruppen für Monodesethylchloroquin-Versuchsgruppen erhielten dieselbe Menge Methanol wie sie nach der Verdünnungsreihe in den Versuchsgruppen noch verblieben (von 0,0005 bis 0,000005% v/v). Die Stocklösungen, Serum und NaHCO3 wurden kurz vor dem Mediumwechsel zur Verwendung zusammengesetzt. Alle Versuche wurden mit drei Parallelansätzen durchgeführt. Die ED50-Werte („effective d ose“, Wirkstoffkonzentration, bei der eine 50%ige Hemmung des Parasitenwachstums erreicht wird) wurden nach dem Probit- Verfahren ermittelt.

(27)

2.2.2.3 Kombinationsversuche mit Chloroquin und Monodesethylchloroquin

Aufgrund der unter 2.2.2.2 ermittelten ED50-Werte wurden eine Reihe von Kombinationsversuche durchgeführt, wobei Chloroquin und Monodesethylchloroquin in verschiedenen Verhältnissen im Komplettmedium kombiniert wurden und so auf die asexuellen Stadien gesetzt wurden. Hierzu wurden jeweils eine Stocklösung von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin mit einer Wirkstoffkonzentration hergestellt, die dem jeweiligen ED50-Wert entsprach. Die beiden Stocklösungen wurden dann 10:0, 8:2, 5:5, 2:8 bzw. 0:10 (w:w, Base; „w“ steht für Gewicht) zusammengesetzt und zur Behandlung der Kultur verwendet. Die Bedingungen der Kultivierung, z.B. Kulturplatten, Parallelansätze, Ausgangsparasitämie, Hämatokrit, Mediumwechsel sowie Blutausstriche, waren wie unter 2.2.2.2 beschrieben. Die Kontrollgruppen erhielten medikamentenfreies Komplettmedium.

2.2.2.4 Bestimmung der Parasitämie

Die Parasitämie, nämlich der prozentuale Anteil der durch asexuelle Stadien parasitierten Erythrozyten an der Gesamtzahl der ausgezählten Erythrozyten, wurde durch Auswertung von Ausstrichen bestimmt. Die Ausstriche wurden kurz mit 100%igem Methanol fixiert und dann 12 Minuten mit Giemsa-Lösung (1 Teil Giemsa-Stammlösung auf 19 Teile Phosphatpuffer mit pH 7,2) gefärbt. Die Präparate wurden im Lichtmikroskop (Hellfeld) bei 1000facher Vergrößerung ausgewertet. Die Parasitämie wurde durch Auszählen von mindestens 1000 Erythrozyten ermittelt.

(28)

3 Ergebnisse

3.1 Versuche mit Plasmodium yoelii nigeriensis

3.1.1 Fotografische Darstellungen

In den folgenden Bildern sind verschiedene Entwicklungsstadien von Plasmodium yoelii nigeriensis dargestellt: Schizogonie (Abb. 8) und Gamogonie (Abb. 9) im Mäuseblut sowie Sporogonie in der Mücke (Abb. 10).

Abb. 8: Plasmodium yoelii nigeriensis im Blutausstrich einer infizierten Maus, in die drei Tage zuvor 1x10⁶ parasitierte Erythrozyten injiziert worden waren. Tropozoiten (TR), Merozoiten (MZ) sowie Schizonten (SZ) waren zu erkennen (1000fach, Hellfeld, Lichtmikroskop).

(29)

Abb. 9: Männlicher Gametozyt (Mikrogametozyt, MI) und weiblicher Gametozyt (Makrogametozyt, MA) von Plasmodium yoelii nigeriensis im Blutausstrich drei Tage nach der Infektion (1000fach, Hellfeld, Lichtmikroskop).

Abb. 10: Oozysten (OZ) von Plasmodium yoelii nigeriensis im Mitteldarm einer Mücke sieben Tage nach der Infektion und darin bzw. freiliegende Sporozoiten (SP) (250fach, Phasenkontrast).

(30)

Abb. 11: Sporozoiten (SP) von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Speicheldrüsen (SD) einer Mücke 17 Tage nach der Infektion (250fach, Phasenkontrast).

3.1.2 Applikation von Chloroquin in infiziertem Blut (Versuchsreihe 1)

In dieser Versuchsreihe (VR) wurden die Mäuse mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert, mit unterschiedlichem Zeitabstand bis zum Blutmahl (6 h, 30 h bwz. 54 h) mit Chloroquin (CQ) behandelt und am dritten Tag nach der Infektion den Mücken zu einem infektiösen Blutmahl angeboten. Am 7. Tag nach dem Blutmahl erfolgte die Mitteldarmpräparation zur Auswertung der Oozysten.

Im Versuch mit einer Dosis von 1 mg/kg erwies sich eine signifikante Verringerung der Oozystenzahlen bei 30 h (16 ± 3,4) im Vergleich zur Kontrollgruppe (110 ± 23,4) (Tabelle 1 und Abb. 12). Obwohl die Parasitämie der Maus zum Zeitpunkt des Blutmahls bei 6 h bzw.

54 h niedriger (0,8 % bzw. 2,8 % jeweils) als die bei der Kontrollgruppe (4,2 %) war, wichen die Oozystenzahlen von der Kontrolle nicht stark ab (96 ± 14,1 bzw. 133,5 ± 20,5 gegenüber 110,5 ± 23,4). Deshalb ist der hemmende Effekt des Chloroquins bei 30 h allein mit der Parasitämie der Maus (1,3 %) schwer zu erklären. Der Korrelationskoeffizient der Oozystenzahlen und Parasitämien von den vier Gruppen betrug auch nur 0,53.

(31)

Wahrscheinlich müsste die Chloroquin-Gabe zu diesem Zeitpunkt (30 Stunden vor dem infektiösen Blutmahl bzw. 42 Stunden nach der Infektion der Maus) günstig gewirkt haben, nämlich auf die Schizogonie und Gamogonie der Parasiten in der Maus bzw. auf die Sporogonie der Parasiten in der Mücke (vgl. Abb. 1).

Im Versuch mit einer Dosis von 10 mg/kg waren die Oozystenzahlen bei 6 h, 30 h sowie 54 h signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe (Tabelle 2 und Abb. 13). Die Oozystenzahlen bei 30 h (6 ± 1,3) schienen niedriger zu sein als bei 6 h (46 ± 9,4) bzw. 54 h (21 ± 7,4), welches zur Überlegung führte, ob die Chloroquin-Gabe in diesem Zeitpunkt ebenso günstiger gewirkt hätte als die Chloroquin-Applikationen zu anderen Zeitpunkten, jedoch diese Unterschiede waren statistisch nicht signifikant.

Im Versuch mit einer Dosis von 50 mg/kg zeigten die Oozystenzahlen ebenso signifikante Unterschiede bei 6 h, 30 h und 54 h gegenüber der Kontrolle (Tabelle 3 und Abb. 14).

Wahrscheinlich war die Dosis von 50 mg/kg hoch genug, um zu sehr niedrigen Parasitämien der Mäuse (0,1% bis 0,7 % im Vergleich zu 2,4 %) zu führen und eindeutlich geringe Oozystenzahlen bei den Mücken (0 ± 0,1 bis 2 ± 1,1 gegenüber 115 ± 35,1) zu verursachen.

Besonders war die Maus bei der Versuchsgruppe von 6 h durch die Chloroquin-Behandlung mit dieser relativ hohen Dosis zu dem Zeitpunkt des Blutmahls so gut wie „geheilt“

(Parasitämie = 0,1 %), so dass die Infektionsrate der voll gesogenen Mücken auch sehr niedrig war (22,2 %). Im Vergleich dazu konnten die Parasiten bei den Versuchsgruppen von 30 h und 54 h wahrscheinlich nach der Chloroquin-Behandlung bis zum Blutmahl mehr Zeit haben, sich zu erholen und für die Mücken infektiöser zu sein, so dass die Infektionsrate der Mücken nicht gravierend abnahm (75,0 % bzw. 88,2 % gegenüber 88,9 % bei der Kontrolle).

(32)

Tabelle 1: Anzahl der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an infizierten Mäusen. Die Mäuse wurden drei Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert (jeweils 1x10⁶ infizierte Erythrozyten, i.p.) und mit unterschiedlichem Zeitabstand bis zum Blutmahl mit Chloroquin behandelt (i.p.). Die Dosis betrug 1 mg/kg Körpergewicht der Maus.

Zeit zwischen

CQ-Behandlung und Blutmahl 6 h 30 h 54 h Kontrolle Oozystenzahl (Median)

± Standardfehler 96 ± 14,1 16 ± 3,4 133,5 ± 20,5 110,5 ± 23,4

Anzahl der Mücken 11 14 16 18

Infektionsrate (%) 81,8 100,0 93,8 88,9

Mortalität der Mücken (%) 28,9 42,0 39,2 44,6

Parasitämie / Gamätozitämie der Maus

zum Zeitpunkt des Blutmahls (%) 0,8 / 0,029 1,3 / 0,004 2,8 / 0,052 4,2 / 0,043 Mann-Whitney U-Test (einseitig) n.s. p < 0,001 n.s. -

VR1: Mäuseblutfütterung CQ-Konzentration = 1 mg/kg

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

6 h 30 h 54 h Kontrolle

Zeit zwischen CQ-Behandlung und Blutmahl

Anzahl der Oozysten

∗

Abb. 12: Mittlere Anzahl (Median + Standardfehler) der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in Anopheles stephensi am 7. Tag nach der Infektion durch Blutmahl an Chloroquin-behandelten Mäusen, die drei Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Die Chloroquin-Behandlung erfolgte 6 h, 30 h bzw. 54 h vor dem Blutmahl (i.p.). Die Dosis betrug 1 mg/kg Körpergewicht der Maus.

(33)

Zeit zwischen

± Standardfehler 46 ± 9,4 6 ± 1,3 21 ± 7,4 209 ± 29,7

Infektionsrate (%) 94,1 94,4 89,5 85,7

zum Zeitpunkt des Blutmahls (%) 3,8 / 0,067 2,2 / 0,048 1,6 / 0,031 4,7 / 0,167 Mann-Whitney U-Test (einseitig) p < 0,003 p < 0,001 p < 0,001 -

VR1: Mäuseblutfütterung CQ-Konzentration = 10 mg/kg

0 50 100 150 200 250 300

∗

∗ ∗

* signifikant gegenüber Kontrolle (Mann-Whitney U-Test, einseitig)

(34)

Zeit zwischen

± Standardfehler 0 ± 0,1 1,5 ± 0,3 2 ± 1,1 115 ± 35,1

Infektionsrate (%) 22,2 75,0 88,2 88,9

zum Zeitpunkt des Blutmahls (%) 0,1 / 0,0 1,1 / 0,0 0,7 / 0,0 2,4 / 0,048 Mann-Whitney U-Test (einseitig) p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 -

VR1: Mäuseblutfütterung CQ-Konzentration = 50mg/kg

0 20 40 60 80 100 120 140 160

∗ ∗ ∗

* signifikant gegenüber Kontrolle (Mann-Whitney U-Test, einseitig)

(35)

3.1.3 Applikation von Chloroquin im Zuckerwasser (Versuchsreihe 2)

Hierzu wurde eine Maus mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert (1x10⁶ infizierte Erythrozyten) und drei Tage danach den Mücken zur Blutfütterung angeboten. Die vollgesogenen Mücken wurden mit Hilfe eines Exhausters vorsichtig auf vier Gruppen aufgeteilt. Die Mücken von drei Gruppen erhielten 0,9 % Glukoselösung mit Chloroquin in einer Konzentration von 15, 150 bzw. 750 µg/ml. Die Kontrollgruppe erhielt nur 0,9 % Glukoselösung. Die Oozystenzahlen wurden am 7. Tag nach der Blutfütterung ausgewertet.

Im ersten Versuch zeigte sich eine signifikante Verringerung der Oozystenzahl bei einer Chloroquin-Konzentration von 750 µg/ml (131 ± 17,1) gegenüber der Kontrollgruppe (229,5

± 11,9) (Tabelle 4, Abb. 15; p<0,003). Da Chloroquin nicht verstoffwechselt in der Glukose- Lösung blieb und so den infizierten Mücken verabreicht wurde, könnte diese Verringerung eine signifikante sporontozide Wirkung von nicht verstoffwechseltem Chloroquin in dieser Konzentration auf die Sporogonie von Plasmodium yoelii nigeriensis in Anopheles stephensi bedeuten. Eine hohe Mortalität der Mücken bei 750 µg/ml (75,0 %) im Vergleich zu den anderen Gruppen führte zu der Überlegung, ob es sich um eine Toxizität dieser relativ hohen Konzentration des Chloroquins handelt. Bei einem Wiederholungsversuch mit einem größeren Mückenansatz war jedoch eine solch hohe Mortalität bei 750 µg/ml nicht zu sehen (Tabelle 5).

In dem Wiederholungsversuch war die Verringerung der Oozystenzahlen bei 150 µg/ml (216

± 22,0) und 750 µg/ml (162 ± 22,3) gegenüber der Kontrolle (268 ± 22,5) signifikant (Tabelle 5, Abb. 16; p<0,025 bzw. 0,05 jeweils). Nach diesen Ergebnissen scheint ein nicht verstoffwechseltes Chloroquin in einer Konzentration von 150 µg/ml bzw. 750 µg/ml eine signifikante sporontozide Wirkung auf Plasmodium yoelii nigeriensis in Anopheles stephensi zu haben.

(36)

Tabelle 4. Anzahl der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an einer Maus, die drei Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert wurde (1x10⁶ infizierte Erythrozyten, i.p.). Chloroquin-Applikation erfolgte durch Chloroquin haltige Glukoselösung, die die Mücken beliebig saugen durften. Die Chloroquin-Konzentration betrug 15 µg/ml, 150 µg/ml bzw. 750 µg/ml Glukoselösung (Base).

Chloroquin-Konzentration 15 µg/ml 150 µg/ml 750 µg/ml Kontrolle Oozystenzahl (Median)

± Standardfehler 203,5 ± 11,9 204 ± 14,2 131 ± 17,1 229,5 ± 11,9

Infektionsrate (%) 100 100 100 100

Parasitämie der Maus zum

Zeitpunkt des Blutmahls (%) 7,3

Mann-Whitney U-Test (einseitig) n.s. n.s. p < 0,003 - VR2a: Glukoselösung

0 50 100 150 200 250 300

15 150 750 Kontrolle

CQ-Konzentration (µg/ml)

∗

Abb. 15: Mittlere Anzahl (Median + Standardfehler) der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion.

Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an einer Maus, die drei Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert wurde (1x10⁶ infizierte Erythrozyten, i.p.).

Chloroquin-Applikation erfolgte durch Chloroquin haltige Glukoselösung, die die Mücken beliebig saugen durften. Die Chloroquin-Konzentration betrug 15 µg/ml, 150 µg/ml bzw. 750 µg/ml Glukose-Lösung (Base).

(37)

Tabelle 5. Anzahl der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an einer Maus, die drei Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert wurde (1x10⁶ infizierte Erythrozyten, i.p.). Chloroquin-Applikation erfolgte durch Chloroquin haltige Glukoselösung, die die Mücken beliebig saugen durften. Die Chloroquin-Konzentration betrug 15 µg/ml, 150 µg/ml bzw. 750 µg/ml Glukose-Lösung (Base). Wiederholungsversuch.

Chloroquin-Konzentration 15 µg/ml 150 µg/ml 750 µg/ml Kontrolle Oozystenzahl (Median)

± Standardfehler 215 ± 19,8 216 ± 22,0 162 ± 22,3 268 ± 22,5

Infektionsrate (%) 100,0 100,0 100,0 96,0

Parasitämie der Maus zum

Zeitpunkt des Blutmahls (%) 8,2

Mann-Whitney U-Test (einseitig) n.s. p < 0,025 p < 0,05 -

VR2b: Glukoselösung

0 50 100 150 200 250 300 350

15 150 750 Kontrolle

CQ-Konzentration (µg/ml)

∗

Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an einer Maus, die drei Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert wurde (1x10⁶ infizierte Erythrozyten, i.p).

Chloroquin-Applikation erfolgte durch Chloroquin haltige Glukoselösung, die die Mücken beliebig saugen durften. Die Chloroquin-Konzentration betrug 15 µg/ml, 150 µg/ml bzw. 750 µg/ml Glukose-Lösung (Base). Wiederholungsversuch.

(38)

3.1.4 Applikation von Chloroquin in nicht infiziertem Blut (Versuchsreihe 3)

Je nach Versuch wurden 1 bis 4 Mäuse mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert (je 1x10⁶ infizierte Erythrozyten) und drei Tage danach zur Infektion der Mücken verwendet. Am dritten Tag nach diesem Blutmahl, an dem die meisten Mücken ihre Eier abgelegt hatten, wurden die Mücken mit Hilfe eines Exhaustors auf 4 bis 5 Gruppen aufgeteilt, und anschließend erfolgte ein zweites Blutmahl (2.BM). Hierzu dienten 4 bzw. 5 Mäuse, die 0,5 h, 2 h, 6 h (Experiment I) bzw. 6 h, 24 h, 48 h, 72 h (Experiment II) zuvor mit Chloroquin behandelt worden waren. Die hierbei verwendeten Dosierungen betrugen 1, 10 bzw. 50 mg/kg Körpergewicht der Maus. Unmittelbar nach dem zweiten Blutmahl wurden die Mäuse dekapitiert, die Blutproben wurden eingefroren und später mit HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysiert, um Chloroquin- und Monodesethylchloroquin- Konzentrationen im Blut zu bestimmen.

Experiment I:

Bei der Dosis von 1 mg/kg schienen die Oozystenzahlen bei 6 h (180 ± 22,0) höher als in der Kontrolle (122 ± 17,1) zu sein, jedoch war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (Tabelle 6 und Abb. 17). Mit zunehmender Zeit (0,5 h ◊ 2 h ◊ 6 h) nahm die Konzentration von Chloroquin im Blut der gesunden Mäuse zum Zeitpunkt des zweiten Blutmahls stetig ab (175,7 ◊ 87,8 ◊ 40,9 ng/ml), während sich die Monodesethylchloroquin-Konzentration langsam erhöhte (43,5 ◊ 76,2 ◊ 67,3 ng/ml). Dies zeigt, dass Chloroquin nach der Injektion (i.p.) im Mäuseblut stark abgebaut wurde, so dass sich dessen Metabolit, Monodesethylchloroquin, bereits 30 Minuten nach der Injektion nachweisen ließ und die Blutkonzentration etwa 1/5 von Chloroquin betrug. Nach 2 Stunden war das Verhältnis der Blutkonzentrationen von Chloroquin und Monodesethylchloroquin ungefähr 1:1 (87,8 ng/ml : 76,2 ng/ml). Nach 6 Stunden konnte auch bei Monodesethylchloroquin ein Abbau zu weiteren Metaboliten bzw. eine Ausscheidung festgestellt werden. Zwischen Blutkonzentrationen von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin und den Oozystenzahlen der jeweiligen Versuchsgruppe war jedoch kein Zusammenhang aufzuweisen.

Bei einer Dosis von 10 mg/kg ergab sich kein signifikanter Unterschied der Oozystenzahlen

(39)

Konzentrationen von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin im Blut war ähnlich wie bei 1 mg/kg. Zwischen den Konzentrationen von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin im Blut und den Oozystenzahlen war ebenso kein erklärbarer Zusammenhang zu finden.

Eine signifikante Verringerung zeigte sich jedoch bei einer Dosierung von 50 mg/kg, wobei Chloroquin 2 h vor dem zweiten Blutmahl appliziert worden war (Tabelle 8, Abb. 19, p<0,015). Dies weist darauf hin, dass Chloroquin und Monodesethylchloroquin mit diesen Konzentrationen im Blut (4,99 µg/ml und 2,41 µg/ml jeweils) zusammen eine signifikant hemmende Wirkung auf die Sporogonie von Plasmodium yoelii nigeriensis in Anopheles stephensi haben könnten. Bei 0,5 h und 6 h scheinen die Oozystenzahlen höher als in der Kontrolle zu sein, als ob Chloroquin und Monodesethylchloroquin in diesen Konzentrationen zusammen eine stimulierende Wirkung auf die Sporogonie haben würden; diese Unterschiede waren jedoch statistisch nicht signifikant.

(40)

Tabelle 6: Anzahl der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an 4 Mäusen im Pool, die 3 Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Chloroquin-Applikation erfolgte durch ein zweites Blutmahl an gesunden Mäusen, denen zuvor zu verschiedenen Zeiten (0,5 h, 2 h bzw. 6 h) Chloroquin injiziert worden war. Die Dosis betrug 1 mg/kg Körpergewicht der gesunden Mäuse.

Zeit zwischen

CQ-Behandlung und 2.Blutmahl 0,5 h 2 h 6 h Kontrolle Oozysten (Median) ± Standardfehler 105 ± 20,6 98 ± 18,6 180 ± 22,0 122 ± 17,1

Infektionsrate (%) 88,9 90,7 93,5 94,5

Parasitämie der Maus (%) 8,2 = (6,4 + 9,2 + 7,6 + 9,5) / 4 Mann-Whitney U-Test (einseitig) n.s. n.s. n.s. -

CQ-Konzentration (ng/ml) * 175,7 87,8 40,9 -

MDCQ-Konzentration (ng/ml) * 43,5 76,2 67,3 -

* Die Konzentration von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin im Blut der gesunden Mäuse zum Zeitpunkt des 2. Blutmahls wurde mit HPLC bestimmt.

VR3, Exp. I: Mäuseblutfütterung CQ-Konzentration = 1 mg/kg

0 50 100 150 200 250

0,5 h 2 h 6 h Kontrolle Zeit zwischen CQ-Gabe und 2.BM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

CQ-, MDCQ- Konzentration (ng/ml)

Oozysten CQ MDCQ

Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an 4 Mäusen im Pool, die 3 Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Chloroquin-Applikation erfolgte durch ein zweites Blutmahl an gesunden Mäusen, denen zuvor zu verschiedenen Zeiten (0,5 h, 2 h bzw. 6 h) Chloroquin injiziert worden war (i.p.). Die Dosis betrug 1 mg/kg Körpergewicht der gesunden Mäuse. Die Konzentration von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin im Blut der gesunden Mäuse zum Zeitpunkt des 2. Blutmahls wurde mit HPLC bestimmt.

(41)

Tabelle 7: Anzahl der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an 4 Mäusen im Pool, die 3 Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Chloroquin-Applikation erfolgte durch ein zweites Blutmahl an gesunden Mäusen, denen vorher zu verschiedenen Zeiten (0,5 h, 2 h bzw. 6 h) Chloroquin injiziert worden war. Die Dosis betrug 10 mg/kg Körpergewicht der gesunden Mäuse.

Zeit zwischen

CQ-Behandlung und 2.Blutmahl 0,5 h 2 h 6 h Kontrolle Oozysten (Median) ±

Standardfehler 49 ± 11,6 25 ± 7,2 23 ± 7,1 35 ± 11,1

Infektionsrate (%) 98,7 94,3 94,3 93,1

Parasitämie der Maus (%) 2,9 = (3,2 + 2,6 + 2,4 + 3,5) / 4

Mann-Whitney U-Test (einseitig) n.s. n.s. n.s. -

CQ-Konzentration (ng/ml) * 1598 1069 696 -

MDCQ-Konzentration (ng/ml) * 503 994 865 -

0 10 20 30 40 50 60 70

0,5 h 2 h 6 h Kontrolle Zeit zwischen CQ-Gabe und 2.BM

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

CQ-, MDCQ- Konzentration (ng/ml)

Oozysten CQ MDCQ

Abb. 18: Mittlere Anzahl (Median + Standardfehler) der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach der Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an 4 Mäuse gepoolt, die 3 Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Chloroquin- Applikation erfolgte durch ein zweites Blutmahl an gesunden Mäusen, denen vorher zu verschiedenen Zeiten (0,5 h, 2 h bzw. 6 h) Chloroquin injiziert worden war (i.p.).

Die Dosis betrug 10 mg/kg Körpergewicht der gesunden Mäuse. Die Konzentration von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin im Blut der gesunden Mäuse zum Zeitpunkt des 2. Blutmahls wurde mit HPLC bestimmt.

(42)

Tabelle 8: Anzahl der Oozysten von Plasmodium yoelii nigeriensis in den Mitteldärmen von Anopheles stephensi am 7. Tag nach Infektion. Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an 4 Mäusen im Pool, die 3 Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Chloroquin-Applikation erfolgte durch ein zweites Blutmahl an gesunden Mäusen, denen vorher zu verschiedenen Zeiten (0,5 h, 2 h bzw. 6 h) Chloroquin injiziert worden war. Die Dosis betrug 50 mg/kg Körpergewicht der gesunden Mäuse.

Zeit zwischen

CQ-Behandlung und 2.Blutmahl 0,5 h 2 h 6 h Kontrolle Oozysten (Median) ± Standardfehler 107,5 ± 17,1 23 ± 15,8 121,5 ± 17,9 61 ± 15,7

Infektionsrate (%) 92,0 91,1 100,0 100,0

Parasitämie der Maus (%) 3,4 = (3,5 + 4,1 + 2,9 + 3,2) / 4 Mann-Whitney U-Test (einseitig) n.s. p < 0,015 n.s. -

CQ-Konzentration (µg/ml) * 4,89 4,99 2,17 -

MDCQ-Konzentration (µg/ml) * 1,25 2,41 2,91 -

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0,5 h 2 h 6 h Kontrolle

Zeit zwischen CQ-Gabe und 2.BM

0 1 2 3 4 5 6

CQ-, MDCQ- Konzentration (µg/ml)

Oozysten CQ MDCQ

∗

Die Infektion erfolgte durch ein Blutmahl an 4 Mäusen im Pool, die 3 Tage zuvor mit Plasmodium yoelii nigeriensis infiziert worden waren. Chloroquin-Applikation erfolgte durch ein zweites Blutmahl an gesunden Mäusen, denen vorher zu verschiedenen Zeiten (0,5 h, 2 h bzw. 6 h) Chloroquin injiziert worden war (i.p.). Die Dosis betrug 50 mg/kg Körpergewicht der gesunden Mäuse. Die Konzentration von Chloroquin bzw. Monodesethylchloroquin im Blut der gesunden Mäuse zum Zeitpunkt des 2. Blutmahls wurde mit HPLC bestimmt.

* signifikant gegenüber der Kontrolle (p < 0,015)