21 2.2.1 Escherichia coli

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Inhaltsverzeichnis

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1 Einleitung ...4

1.1 Peroxisomale Defekte können die Ursache menschlicher Erbkrankheiten sein... 5

1.2 Isolierung und Charakterisierung von Hefemutanten mit Defekten in der Biogenese von Peroxisomen... 7

1.3 Einordnung der Peroxine in die verschiedenen Modellvorstellung von Peroxisomenbiogenese... 10

1.4 AAA-Proteine und AAA-Peroxine – Eine Bandbreite an Möglichkeiten... 13

1.5 NSF – Das ”Vorzeigeprotein” unter den AAA Proteinen... 16

Problemstellung ... 19

2 Material und Methoden...20

2.1 Chemikalien... 20

2.2 Mikroorganismen ... 21

2.2.1 Escherichia coli... 21

2.2.2 Saccharomyces cerevisiae ... 21

2.3 Vektoren ... 22

2.4 Antiseren... 22

2.5 Oligonukleotide ... 23

2.6 Analytische Methoden... 24

2.6.1 Proteinbestimmung ... 24

2.6.2 Konzentrationsbestimmungen von Nukleinsäuren... 24

2.6.3 Bestimmungen von Enzymaktivitäten... 24

2.7 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae... 24

2.7.1 Medien... 24

2.7.2 Wachstum von S. cerevisiae Zellen auf Festagarplatten ... 24

2.7.3 Anzucht zur elektronenmikroskopischen Analyse ... 25

2.7.4 Anzucht für biochemische Analysen... 25

2.7.5 Oleat-Wachstumstest ... 25

2.8 Aufschluß von Saccaromyces cerevisiae Zellen ... 25

2.8.1 Herstellung von S. cerevisiae TCA-Gesamtzellhomogenaten zur immunologischen Analyse (Faber, 1998) ... 25

2.8.2 Zellaufschluß zur biochemischen Charakterisierung... 25

2.8.3 Mechanischer Zellaufschluß mittels Glasperlen... 26

2.9 Molekularbiologische Methoden... 27

2.9.1 Anzucht von E. coli zur DNA Isolierung ... 27

2.9.2 Transformation von E. coli... 27

2.9.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli... 27

2.9.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ... 27

2.9.5 Ligation von DNA-Fragmenten... 27

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Inhaltsverzeichnis

2

2.10 Expression von Fusionsproteinen in Escherichia coli... 28

2.10.1 Bakterielle Überexpression von Glutathion S-Transferase-Fusionsproteinen ... 28

2.10.2 Bakterielle Überexpression von Histidin (His6)-Fusionsproteinen ... 28

2.11 Reinigung von GST-Fusionsproduktion... 28

2.12 Reinigung von Histidin (His6)-Fusionsproteinen... 29

2.13 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese... 29

2.14 Western Blotting und Immundetektion... 30

2.15 Two-Hybrid -System zur Untersuchung von Protein-interaktionen ... 30

2.16 Subzelluläre Fraktionierung durch differentielle Zentrifugation... 30

2.17 Zentrifugation im OptiPrepTM-Dichtegradienten... 31

2.18 Ko-Immunpräzipitation ... 31

3 Ergebnisse...32

3.1 Erstellung der AK gegen Pex1p, Pex6p, Pex15p... 32

3.1.1 Erstellung von spezifischen Antikörpern gegen Pex1p ... 32

3.1.1.1 Bakterielle Überexpression und Aufreinigung von Pex1pD1 mit Hilfe des His6 Genfusions-Systems... 32

3.1.1.2 Spezifitätsüberprüfung der anti-Pex1p-Antikörper und immunologische Detektion des endogenen Pex1-Proteins ... 34

3.1.2 Erstellung von spezifischen Antikörpern gegen Pex6p ... 35

3.1.2.1 Definition einer geeigneten Peptidsequenz von Pex6p zur Erstellung von Peptidantikörpern... 35

3.1.2.2 Spezifitätsüberprüfung der anti-Pex6p-Antikörper und immunologische Detektion des Pex6-Proteins ... 36

3.1.3 Erstellung von spezifischen Antikörpern gegen Pex15p ... 37

3.1.3.1 Bakterielle Überexpression und Aufreinigung von Pex15p(1-315) mit Hilfe des Glutathion S-Transferase (GST) Genfusions-Systems ... 37

3.1.3.2 Spezifitätsüberprüfung der anti-Pex15p-Antikörper und immunologische Detektion des endogenen Pex15-Proteins ... 39

3.2 In vivo Funktionsanalysen von Pex1p, Pex6p und Pex15p ... 40

3.2.1 Funktionsüberprüfung der genutzten GFP und ProteinA-Konstrukte ... 40

3.2.1.1 Oleatwachstumstest / Elektronenmikroskopie... 40

3.2.1.1.1 Genomische Integrationen von GFP oder ProteinA an den C- Terminus von Pex1p, Pex6p oder Pex15p zeigt weiterhin Wachstum auf Oleat und verändert nicht den elektronenmikroskopischen Phänotyp ... 40

3.2.2 Lokalisation von Pex1p, Pex6p und Pex15p im Wildtyp ... 44

3.2.2.1 Differentielle Sedimentationsanalyse ... 44

3.2.2.2 Zellfraktionierung (OptiPrepT M-Gradient)... 47

3.2.3 Charakterisierung der Nullmutanten von Pex1p, Pex6p und Pex15p... 50

3.2.3.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen... 50

3.2.3.2 Zellfraktionierung ... 50

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Inhaltsverzeichnis

3 3.3 Charakterisierung der Mutationen in den WalkerA- und B-Motiven von

Pex1p und Pex6p... 55

3.3.1 Auswirkung der Mutationen... 56

3.3.1.1 Oleat-Wachstumstest ... 56

3.3.1.1.1 Eine Einführ ung der Mutation in WalkerA oder B in die 2.Domäne von Pex1p oder Pex6p führt zu einem kompletten Wachstumsverlust der Mutanten ... 56

3.3.1.2 Elektronenmikroskopische Untersuchungen... 58

3.3.1.2.1 Die Einführung der Mutation in WalkerA- oder B-Motiv der zweiten Domäne von Pex1p oder Pex6p führt zum Verlust von morphologisch nachweisbaren Peroxisomen... 58

3.3.1.3 Zellfraktionierung ... 62

3.4 Interaktionen von Pex1p und Pex6p mit anderen Proteinen (Peroxinen) .... 68

3.4.1 Interaktion von Pex6p mit Pex1p ... 68

3.4.1.1 Two-Hybrid Analyse ... 68

3.4.1.1.1 Pex6p interagiert mit Pex1p... 68

3.4.1.1.2 Die Interaktion von Pex6p mit Pex1p erfolgt über die 1.Domäne von Pex1p und Pex6p ... 69

3.4.1.1.3 Die ATP-Bindung der 2. Domäne (WalkerA) von Pex1p bewirkt eine Verstärkung der Interaktion ... 71

3.4.2 Interaktion von Pex6p mit Pex15p ... 72

3.4.2.1 Two-Hybrid Analyse ... 72

3.4.2.1.1 Pex6p interagiert mit Pex15p... 72

3.4.2.1.2 Die Interaktion von Pex6p mit Pex15p erfolgt über den N-Terminus von Pex6p ... 74

3.4.2.1.3 Die ATP-Bindung der 1. Domäne (WalkerA) von Pex6p bewirkt eine Verstärkung der Interaktion ... 74

3.4.2.2 In vitro Bindungstest... 75

3.4.2.2.1 Die Bindung zwischen Pex6p und Pex15p ist direkt ... 75

3.4.2.3 Immunfluoreszenz ... 76

3.4.2.3.1 Ein Fehlen von Pex15p führt zu einer veränderten Verteilung von Pex6p ... 76

3.4.3 Identifizierung weiterer Interaktionspartner ... 78

3.4.3.1 Ko-Immunpräzipitation ... 78

4 Diskussion...81

4.1 Warum gibt es 2 AAA-Kassetten? ... 81

4.2 Warum gibt es 2 AAA-Peroxine?... 85

4.3 Was könnte die Dissoziation des Pex6p/Pex15p-Komplexes bedeuten? ... 88

4.4 Wo im Konzept der Biogenese von Peroxisomen sind Pex1p und Pex6p wiederzufinden? ... 93

4.5 Aus blick ... 98

5 Zusammenfassung... 100

6. Literatur... 102

7. Anhang... 118

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