M thod of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatm

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M thod of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatm nt, the use of this m ^thod and apparatus for its application.

Patent

Number: EP0052322

Publication date: 1

982-05-26

Application

Number: EP19810109575 19811109

Priority

Number(s): DE19803042360 19801 110 IPC

Classification:

A61 K9/50

EC

Classification:

A61K9/127P

^.

A61K9/50H8B

Equivalents:

Cited

Documents: DE2338503

1.

A method

ofpreparinglipidvesicles

from

biological

membranes

orlipid

suspensions,

in

which

thelipid

suspensions

orlipid particles to

be

desintegrated are ultrasonicallytreated in

a

dispersionfluidinside

a

treatment containerat

a

substantiallyconstant temperature, characterized inthatthesize respectively size distributionofthelipidvesicles, effective forthe desired purpose,

and

the

optimum

ultrasonic

frequency and

intensityinthe dispersionfluid requiredforobtaining thissize respectively^thissizedistribution are determined,

and

thatthethus

determined optimum

ultrasonic

frequency and

intensity,withthe other constantconditions, are maintained constantin

such

a

manner

thatduring theultrasonictreatment the actuelvalueof

frequency and

intensityofthe ultrasonicfield inthereaction

medium

iscontinuously

measured and

theoutput

power and

the

frequency

of theelectricgenerator supplying the

sound

transmitter arecontrolledin

dependence upon

the actuelvalueofthe

frequency and

intensityoftheultrasonicfield.

Inventor(s):

Applicant(s):

Requested

Patent:

SCHAL WILFRIED

DR;;

GERSONDE KLAUS PROF DR MED GERSONDE KLAUS PROF DR (DE)

H _EP0052322

. A3, B1_

Abstract

Data

supplied

from

the

esp@cenet database

^-12

EuropSlsches

Patentamt

@

/fjj)]

European

PatentOffice

®

Verdffentllchungsnummer:

0 052 322

Office

europ6en des

brevets

EUROPAISCHE PATENTSCHRIFT

@

VeroffentlichungstagderPatentschrlft:

©

^Int.CI*:

^{A 61 K 9/50}

27.03.85

@

Anmeldenummer:81109575.1

@

Anmeldetag:^09.11.81

©

^Vertahrenzur HerstellungvonLlpld-VeslkelndurchUltraschallbehandlung,Anwendung desVertahreniundVorrichtung zur DurchfUhrung desVerfahrens.

@

^{Priorltat:10.11.80 DE3042360}

Verdffentlichungstag derAnmeldung

:

26.05.82 Patentblatt 82/21

Bekanntmachungdes Hinwelsesauf die Patenterteilung:

27.03.85 Patentblatt 85/1 3

BenannteVertragsstaaten

;

AT

BE CH DE

^FR

GB

LINL

SE

@

Entgegenhaltungen:

DE-A-2338503

FOLIA BIOCH. ETBIOL GRAECA,Specialissue,Band XIV,1978

M

CM CO CM 10 o

Q

^{Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der} Bekanntmachung des Hinwelses auf die Erteilung des europaischen

9

Pat^nsim Europaischen Patentblattkann jedermann belm Europaischen Patentamtgegendas ertelte

?^f

^c

^^l

*

^{Einspruch elnlegen.} Der Einspruch 1st schriftlich einzureichen und zu begrtinden. Er gilt erst als eingelegt, wenn die

P"

EinspruchsgebOhrentrichtetworden1st(Art.99(1)EuropSlsches Patentuberelnkommen).

BUNDESDRUCKERElBERUN

Patentinhaber:Gerionde,Klaus,Prof.Dr.,Preusweg69, 0-5100Aachen(DE)

@

^{Erfinder:Geraonde,Klaus,Prof.Dr.med.,Preusweg69,}

0-5100Aachen(DE)

FrfInder:Schal.Wllfrled. Dr..Tannenwaldwefl27, D-6380Bad Homburg(DE)

@

^Vertreter:Blermann, Wllhelm,Dr.-lng.,Morlllenhang 39, 0-5100Aachen(DE)

B

schreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- stellungvonuniformen, unilam flar nsogenann- ten kleinen Lipid-Vesikeln, insbesonder ein Verfahren

zum

Oberfuhren von lamellar an- geordneten Lipiden inLipidvesikel,bei

dem

die zu desintegrierenden Lipid-Strukturen (Lamel- len) ineinerSuspensionsf^lussigkeitinnerhalbei- nes BeschallungsgefaBes bei im wesentlichen konstanterTemperatureinerUltraschallbehand- fung unterworfenwerden.Die ErfindungumfaBt ferner geeignete Vorrichtungen zur Durchfuh- rungdesVerfahrens.

Lipid-Vesikel

werden zum

Beispiel furmedizi- nisch-therapeuttsche und wissenschaftliche

Zwecke

benotigt. Arzneimittel, die einen intra- zellularen Wirkort haben,

mussen

die Zell-

Membran

passieren kdnnen. Viele Effektoren, die den intrazellularen Stoffwechsel kontrollie- ren

und

inderZellegebildetwerden, konnendie Zelle

weder

verlassen noch in diese vonauf&en eindringen. Der therapeutische Einsatz dieser Stoff-Klasse

macht

daher einen Transportme- chanismus erforderlich, der es erlaubt, nicht-

membran-permeable

StoffeindieZellen hinein- zuschleusen, ohne

da&

diese Stoffe die Zellen wiederverlassenkonnen.Einsolcher Transport-

mechanismus

soil daruberhinaus moglichst un- abhangig von

dem

zu transportierenden Wirk- stoff sein, alsojede ArtvonEffektor transportie- ren konnen, andererseits aber Zell-spezifisch sein,d. h.denTransport nurinbestimmteZellen ermoglichen. Ein Transport-System mit den obengenannten Eigenschaften stellen Lipid- Vesikeldar, welchedieverschiedensten Stoffe einschliefcen konnen, wie Enzyme,Arzneimittel, Chelat^-bi^ldonde Substanzen, Hormone, Zeil-

Effektoren, Antigene, Antikorper, Interferon- Induktoren und Gene.IndenLipid-Vesikeln sind das LosungsmittelunddieimLosungsmittel ge- losten Stoffe von Phospholipid-Doppelschicht-

membranen

umschlossen. Die Lipid-Membran hat eine Dickevon 4 nm,die Vesikel konnen ei-

nen Durchmesser von 25bis 120

nm

annehmen.

DieGrd&eder Vesikella&t sichmitHilfederLa- ser-Lichtstreuung, durch Ultrazentrifugation, Gelfiltration oder im Raster-Elektronenmikro- skop bestimmen.

Ein wichtiges

Anwendungsgebiet

der Lipid- Vesikel istdie Inkorporierung von Inositolhexa- phosphat(IHP) in rote Blutzellen nach

dem

von Y. C. Nicolau und K. Gersonde beschriebenen Verfahren (US-Patent 4192869), zur Herabset- zungderSauerstoff-Affinitatdes Hamoglobins.

Man

vveiS namlich,

da&

z.B. bei der Lagerung von Blutkonserven die Sauerstoff-Affinitat des Hamoglobinsinden rotenBlutzellenstandigzu- nimmt. Ebenso beobachtet

man

bei bestimmten Krankheiten eine erhohte Sauerstoff-Affinitat des Hamoglobins. Diese erhohte

Sau

^rstoff-

Affinitat fuhrtdazu,daft nurein gering rAnteil des Sauerstoffs, deran Hamoglobin

gebunden

ist

und

imBlutzirkuliert,tatsachlichan das Ge-

webe abgegeben

wird. Diese h he (VAffinitat

des Hamoglobins kann durch Bindung von b ^- stimmtenEffektor n an das Hamoglobin^herab- gesetztwerden.

D

rstarkste Effektordi serArt

istdas Inositolhexaphosphat(IHP).Die inkorpo- 5 rierungvon IHPwirderreichtdadurch,

daS

intak- te ZellenmitIHP-beiadenenLipid-Vesikeln inku- biert werden,

wobei

durch Fusion der Lipid-

Membranen

derZelleundder Vesikel IHPindie Zelleeingeschleust wirdunddortseineWirkung

10 erzielt,namlich dieVeranderungder02-Affinitat des Hamoglobins, mefSbaralsaRechtsverschie- bung« der Hamoglobin-02-Dissoziationskurve.

Nach

RuckkehrdieserIHP-beladenenrotenBlut- zellenindenKreislaufwirdeinerheblich hoherer 15 Anteilderinden roten Blutzellengespeicherten

0

2

-Menge

in der Peripherie abgegeben. Diese Eigenschaft der modifizierten roten Blutzellen bleibt

wahrend

des

gesamten

Lebens derZelle erhalten.

20 Fur die Inkorporierung von Inositolhexapho- sphatinrote Blutzellen

werden

kleine, unilamel- lare iHP-beladene Lipid-Vesikel mit einem Durchmesser von 20 bis 50

nm

benotigt. Es ist

bekannt,Lipid-Vesikeldurch Desintegrationvon 25 Lipid-SuspensionenimUltraschallfeld herzustel- len.DerFortschrittinder

Anwendung

vonLipid- VesikelninderTherapievollzieht sichbisher nur sehr langsam,dadieHerstellungvonfur die Fu- sion mitden roten Blutzellen geeigneten ^Lipid- 30 Vesikeln in ausreichender

Menge

mit erhebli- chenSchwierigkeitenverbundenist.Diefur die- sen

Zweck

geeigneten Lipid-Vesikel

mussen

namlichnicht nuringrolien

Mengen

hergestellt

werden

konnen, sondern auch reproduzierbar 35 von einheitlicher Grolie und somit dosierbar in

der therapeutischen

Anwend

ung^{sein.Die nach-} tragliche

Anwendung

von Trennverfahren

zum

Abtrennen geeigneter Fraktionen der Lipid- Vesikel wirft vielerlei Probleme auf, z.B. Auf- 40 rechterhaltung der Sterilitat und

Anwendung

aufwendiger und zeitraubender Trenn-Techni- ken, die diebiologischeEffektivitatderVesikel, die nureine Halb-Lebenszeit von ca. 1

Tag

ha- ben, stark vermindern.

Das

einzige Verfahren, 45 dasdieHerstellunggroBer

Mengen

vonVesikeln

in kurzer Zeit erlaubt, ist die Desintegration im Ultraschall.

AuSer

von der Art und

Zusammen-

setzung der Lipid-Membrander Vesikel hangen der Erfolg und die Reproduzierbarkeit derwis- 50 senschaftlichen Untersuchung bzw. der thera- peutischenBehandlung,d. h.Einschleusungvon IHPⁱⁿrote Blutzellen,wesentlichvonderGroSe derLipid-Vesikel ab. Die Kontrolle,

ob

sich bei der Desintegration der Lipid-Suspension ^{die Li-} 55 pid-Vesikel in ausreichender Homogenitat und somitQualitat und in ausreichender

Menge

ge- bildethaben, ^erfolgtinderWeise,daft

man

mit den hergestellten Lipid-Vesikelndiegewunsch- ten IHP-Einschleusungsversuch ^{in roteBiutzel-} 60 len durchfuhrt, das intrazellular IHP chemisch nachweist und die Hamoglobin-02-Dissoziati- onskurve ^intakter Zellen miSt bzw. die ge- wunschte biologischeodertherapeutische Wir-

3

0 052

322 4

kungderIHP-beladenenrotenBlutzellenimTier- versuch nachweist. Die Ergebnisse derVersuche bzw. der^ErfolgderBehandlung konnenalso erst nach aufwendigen Exp ^{rimenten beurteilt wer-} den, und der Erfolg der Ultraschallbehandlung, narnlich die Herstellung vonfur die Fusion mit denroten BlutzellenbefahigtenVesikeln, erstim Nachhinein erkanntwerden.

Es hat sich gezeigt,

daB

die Herstellung von Lipid-Vesikeln

—

insbesondere in groBen Volu- mina,wiesiefurtherapeutische Verfahrenerfor- derlich sind

—

mit gleichbleibenden Eigenschaf- tenmitHilfe der bekannten Ultraschall-Technik schwierig ist.TrotzEinhaltunganscheinendvol- liggleicher auBererBedingungenbeider Desin- tegrationder Lipid-Suspensionen imUltraschall- feld gelingt es bisher nicht, stets die gleiche Ausbeute an sogenannten^kleinenunilamellaren und somit fusionswirksamen Lipid-Vesikeln zu erhalten.

DerErfindungliegtdie

Aufgabe

zugrunde,das eingangs genannte ^{Verfahren zur} Herstellung von Lipid-Vesikeln, die erfolgreichEffektoren in Zellen einschleusen, dahingehend weiterzuent- wickeln,

daB

derWirkungsgrad desVerfahrens erhohtwird, und

daB

in reproduzierbarer

Weise

eine

hohe

Ausbeute an fur den jeweils ge- wunschten

Zweck

hochwirksamen Lipid-Vesi- keln erzieltwird.

Die Erfindung besteht^darin,

daB

die fur den gewiinschten

Zweck

wirksamste VesikelgroBe bzw. VesikelgrdBenverteilung, sowiedie fur die Erzielung dieser VesikelgroBe bzw. Vesikelgrd- Benverteilung optimale Ultraschall-Frequenz und -intensitat ermittelt wird, und

daB

die so ermittelteoptimale Ultraschall-Frequenzund-In- tensitat der bei im ubrigen gleichen Behand- lungsbedin

gunge

n

—

^dathtreh

—

konatontg o ha^lte n wird,

daB wahrend

der Ultraschallbehandlung derIstwert derFrequenz und der^Intensitat des Ultraschallfeldesⁱⁿ

dem

Reaktionsmediumfort- laufendgemessen, undinAbhangigkeit von^die-

sem

Istwert die Ausgangsleistung und die Fre- quenz des den

Schwingungsgeber

speisenden elektrischenGenerators geregelt^wird.

DerErfindung liegt die Erkenntnis zugrunde,

daB

bei

Verwendung

der Vesikel zutherapeuti- schen

Zwecken

GroBe bzw. GroBenverteilung der Vesikel ^{fur die} Wirksamkeit derselben von ausschlaggebender Bedeutung^ist und

daB

an- dererseits die

GroBe

und Homogenitat der im Ultraschallfeld erzeugten Vesikel ⁱⁿ empfindli- cher

Weise

^vonder Konstanzund Intensitatdes auf die Lipide einwirkenden Ultraschallfeldes abhangen.

Wahrend

es bisher ublich ^ist, die in

denSchallgeber eingekoppelte Schallenergie zu

messen

^{undkonstantzuhalten,schlagtdieErfin-}

dung

vor, die in

dem

Reaktionsmediumwirksa-

me

Schallenergiezu

messen

undgezielt zu ver- andern,und zwarinder

W

^ise,

^daB

die effektive Schallenergie imR aktionsmediumselbstaufih-

rem

^optimalen

Wert

konstantgehalten wird.

Durch das

Messen

^dereff ktiven Schallenergie im Reaktionsmedium selbst, und durchdie Ver-

wendung

^{di ses Istwertes}

zum Reg

In der ein-

gekoppelten Schallenergie,

werden

alle Einflus- se kompensiert,die die ffektive Schallintensitat und di Schaltfrequenz

am

Vesikel-Bildungsort be ^influssen,wiez.B.unterschi dliche

und

sich 5 verhindernde Absorption der Schallenergie mit fortschreitender Reaktion, sich andernde geo- metrische Verhaltnisse innerhafbdesReaktions-

mediums

bei Auftreten von Gasblaschen

wah-

rend der Ultraschallbehandlung,sowieReflexion 10 eines Frequenzbandes von Schallwellen, das sich mit

den vom

Schallgeber abgestrahlten Schallwellenuberlagert,undgegebenenfalls^bei phasenverschobener Uberlagerung bis zurAus- loschung der Schallenergie^fuhrt.

15

Wenn man

also

gemaS dem

erfindungsgema- BenVerfahren zunachst mit^Hilfederbekannten Untersuchungsmethoden

den

furdenjeweiligen

Zweck

optimalen Vesikeldurchmesser bzw. ^die optimale Verteilungskurveder wirksamsten Ve- 20 sikeldurchmesserfeststellt,sodannineinerwei- teren Versuchsreihe die optimalen Ultraschall- bedingungen wie Frequenz und Schalldrucker- mittelt, die zu der

gewunschten

Verteilungskur- ve fuhren, und dann die so ermittelte optimale 25 Ultraschallintensitatund Ultraschallfrequenzin-

nerhalb des Reaktionsmediums

wahrend

^der Reaktionsdauer konstant halt, erhalt

man

eine sehr

hohe

Ausbeute anfurdenjeweiligen

Zweck

auBerordentlich wirkungsvollenLipid-Vesikeln.

30

Das

erfindungsgemaBe Verfahren ^laBt sich nichtnurfur die Herstellungvon Lipid-Vesikeln, sondern mit

demselben

Erfolg auch

zum

Behan- deln von naturlichen biologischen

Membranen

und deren

Umwandlung

in Vesikel anwenden, 35 beispielsweisebeider ErforschungvonFunktion undStrukturvon

Membran-Enzymen. Auch

^hier-

fiir ist es narnlich erforderlich, die

Membran- Enzyme

reproduzierbar in Vesikel bestimmter

GroBe

zu uberfuhren,

was

nach den bekannten 40 Verfahren ^nicht mit ausreichender Sicherheit

mdglich^ist.

Weitere Einzelheiten und Vorteile des erfin-

dungsgemaBen

Verfahrens

werden

nachfolgend anhand der Zeichnungen und anhand von Aus- 45 fuhrungsbeispielen naher beschrieben. In den

Zeichnungenzeigt

Fig.1 eine fur die Herstellung von kleineren

Mengen

von Lipid-Vesikel-Suspensionen geeig- nete Vorrichtung mit den

Merkmalen

der Erfin- 50 dung, teilweise in schematischer Darstellung,

und

Fig.2eine fur die Herstellungvon Lipid-Vesi- kel-Suspensionen in Steril-Packungen fur

den

klinischen Gebrauch inLiter-Quantitaten geeig- 55 nete Vorrichtung,ebenfallsinteilweiseschema-

tischer Darstellung.

Das

Reaktionsmedium 1 in

Form

einer Sus- pension eines Lipidesⁱⁿ einem geeigneten Dis- persionsmittelbefindet sich in

dem

inneren zy- 60 linderformig n Rohr2 d sdoppelwandigengla- sernen ReaktionsgefaBes 3. Der

Boden

des ReaktionsgefaBes 3 weist eine zu

dem

Reakti- onsraum3durchg

hende

Offnungauf, indie in

Schallaufnehmer5 eingesetztist. DerSchallauf- 65

nehmer

5istmitHilfeeinerEpoxidharzschicht 6

3

mit derdie Offnung

umgeb

nden

Wand

7 ver- klebt

und

abgedichtet.

V

n

oben

taucht in das Reaktionsmedium 1 ein Ultraschall-Schwin- gungsgeber8ein.Der aus d

m

ReaktionsgefaS 3

oben

herausragendeTeil9desSchwingungsge- 5 bers 8istmiteinerKupplung9 furden Stroman- schlu&versehen.

Durchdiedoppelte

Wand

desReaktionsgefa- fceswirdeinHohlraum10 gebildet,dervonKuhl- wasserdurchstromt^ist. Die Rohrstutzen 11 und 10 12dienenzurZuleitungbzw. zurAbfuhrung des Kuhlwassers. Der Rohrstutzen 13 fuhrt in den Reaktionsraum oberhalb des Reaktionsmediums

1 unddientzurZufuhrung eines Inertgaseswie Argon.

Nach oben

istderReaktionsraum abge- 15 schlossendurch einenDeckel14. Durchdie zwi- schen

dem

Deckel 14und

dem

Ultraschallgeber bzw. der

Gefa&wand

verbleibenden Spaltefkann das untergeringem Uberdruck stehende Inert-

gasentweichen. 20

Der Schaltaufnehmer5 weistalseigentlichen Schalldruck- bzw. Schallintensitatsempfanger an

seinem

oberen, mit

dem

Reaktionsmedium 1 in Kontaktstehenden

Ende

eine Piezo-Scheibe 18 auf, die in

dem

dargestellten Fall radial in 25 einemHalterohreingebaut,undindiesemHalte- rohr beispielsweise mit Epoxidharz eingeklebt und abgedichtetist Das vonder Piezo-Scheibe 18 gelieferte eiektrische Signal ist ein

MaR

fur die effektive Schallfrequenz und die effektive 30 Schallintensitat in

dem

Reaktionsmedium. Die- seseiektrischeSignalstellt

den

IstwertdesRe- gelkreisesdarundwirduberdie Leitung20

dem

Regelverstarker21 zugefuhrt Auf

dem

Oszillo-

graphen22 konnengegebenenfallsdie effektive 35 Frequenz und die Schallintensitat visuell ver- folgt, und erforderlichenfallsvon

Hand

Nachre- gulierungen der Frequenz

und

der Ausgangslei- stung deS Hochfrequenzgenerators 23 vorge-

nommen

werden. 40

Dem

Regelverstarker21 wird uber eine Soil- wert-Einstell-Vorrichtung24 der SolI

we

^rtfurdie Ultraschall-lntensitat, und uber eine Sollwert- Einstell-Vorrichtung25der Sollwertfurdie Ultra- schall-Frequenzvorgegeben.Bei

Abweichungen

45

derIstwertederFrequenzundderIntensitatdes Ultraschallfeldes im Reaktionsmedium von den vorgegebenenSollwertenwirduberdie Leitung 26der Ultraschallgenerator 23 angesteuert, des- senFrequenz und/oderAusgangsleistung soIan- 50 geverandertwerden,bisdieinnerhalbdes Reak- tionsmediums 1

gemessenen

effektiven

Werte

mitden vorgegebenen Sollwerten ubereinstim- men*

Von dem

Hochfrequenzgenerator23 wird der Ultraschallgeber 8 uber die Leitung 28 mit 55 der erforderlichen elektrischen

Spannung

ver- sorgt.

Die in Fig.2 dargestellte Vorrichtung eignet sich fur die Herstellung von Lipid-Vesikeln in grolieren Quantitaten.

Das

ReaktionsgefaB ist 60 eine

oben

off nezylindrischerechteckige

Wan-

ne 30 aus korrosionsbestandigem Cr-Ni-Stahl.

DieKuhlungderFlussigkeit 31 in

dem

^Reaktions- gefaS erfolgt durch ein Kuhlschlang nanord- nung32, diein di in der

Wann

30befindlich 65

Flussigkeit 31 eingesetztwird.Unter

dem Boden

der

Wanne

30sindauf der

AuB

nseiteachtelek- tro-akustische

Wandler

33 angeordnetf deren

Schwingungsgeber

34 an

den Boden

der

Wanne

30 angekoppelt sind. Die Schallenergie wird so aufdie Flussigkeit 31 in der

Wanne

30ubertra- gen. In die Flussigkeit 31 tauchtvon

oben

der Schallaufnehmer35 ein.

Das

Reaktionsmedium selbst befindet sich in einem verschlossenen Steril-Beutel 36, der durch die Kuhlschlangen- anordnung32 innerhalb derFlussigkeit 31wenig oberhalbdes Bodensder

Wanne

gehaltenwird.

Der Schallaufnehmer35 wirdso weit abgesenkt,

da&

^der Schallaufnahmekopf, d. h. die Piezo- Scheibe37,

gegen den

Steril-Beutel36 gedruckt wird, und so das Ultraschallfeld in

dem

Reakti-

onsmedium

erfa&t.

Das

von der Piezo-Scheibe 37 ^{gelieferte Si-} gnal steuert uberdie Leitung 38den Regelver- starker39 anundliefertdiesemdie Istwerte fur den Regelvorgang. Die Sollwerte fur die Fre- quenz unddie IntensitatdesUltraschalfs

werden

vorgegebendurchdieSollwert-Vorgabeeinrich- tung 40 bzw. 41. Bei

Abweichung

^der Istwerte vonden vorgegebenenSollwerten wird uberdie Leitung42 der regelbare eiektrische Generator 43 angesteuert, dessen an die elektromagneti- schen

Wandler

33uberdieLeitung44 abgegebe- ne Ausgangsleistung und/oder Frequenz solan-

ge^verandertwerden,bisSollwerteundIstwerte iibereinstimmen. Die von der Piezo-Scheibe 37

gemessene

Frequenz und Amplitude des ^Ultra- schallfeldeskonnen auf

dem

Oszillographen 45 visuellbeobachtet werden,^sodaftauchggf. ein manuellerEingriffindieRegelungmoglich^ist.

Mit Hilfe der beschriebenen Vorrichtungen

werden

beispielsweise folgende Reaktionen durc h gefuhrt^:

Beispiel1

EssollenIHP-beladeneLipid-Vesikelfurthera- peutische

Zwecke

hergestelltwerden,und zwar zurEinschleusungvon IHPinrote Blutzellen mit- tels Fusion zur Verbesserung der 02-Freiset- zungseigenschaften derroten Blutzellen.Diege- nerelle

Methode

zur Preparationvon Lipid-Vesi- keln ist in der US-Patentschrift

4192

869 be- schrieben, auf die insoweit Bezug

genommen

wird. Die Lipid-Vesikel sind aus Phosphatidyl- cholinePhosphatidylserinundCholesterolin

mo-

larenVerhaltnissenvon

8:2:7

aufgebaut. Diese Lipide

werden

zunachst in einem organischen Losungsmittel aus 95Teilen Chloroform und 5TeilenMethanolgelost,urn eine

homogene

Ld- sung und Mischung dieser Lipide zu erreichen.

Dann

wirddasLosungsmittelbei20GradCelsius im Rotationsverdampfer entfernt. Der dann im Rundkoibenv rbleibende Lipid-Filmwird mitei- nerwaSrigenLosung,welch di biologisch ak- tive Substanz (hier IHP) nthalt,

aufgenommen

undgeschuttelt,so

da&

sich

nunmehr

bene Li-

pid-Lamell nindies r

Susp

nsionbild n. Diese Suspensionenthalt LipideⁱⁿeinerKonz ntration

0052

³²²

von ca.

17—

200jig/I. Di Suspension istferner gesattigtan IHP und zwischen

pH

7.0-8.0 gepuf-

fert.

Ineinervorausgehenden Versuchsreihe wur- defestgestellt, daft sichfiirdie Fusion mit Ery- throzytenunddie InkorporierungvonIHPinEry- throzytenVesikeleignen,die die

oben

beschrie- bene

Zusammensetzung haben

^{und die einen} Durchmesser von

25-50 nm

(250—500 A) auf- weisen. Die Wirksamkeit ist urn so grofter, je grofterder Mengenanteildieser Vesikel-Forma- tion in

dem

jeweiligen Praparat ist. Durch eine weitere Versuchsreihe

wurde

sodann ermittelt, daft sich diese gewiinschte Durchmesservertei- lungerreichenlaftt,

wenn

die Lipide bei einerⁱⁿ etwakonstantenTemperatur von37GradCelsius mit einer schmalbandigen Schallfrequenz von 20kHz mit einer effektiven Schallenergie von 3 bis6

W/cm

²beschalltwerden.

Die

oben

beschriebeneLipid-Suspension wird unter Inertgas in das Reaktionsgefaft 3 (Fig.₁₎ eingefuflt. Das Reaktionsgefaft wird durch das Rohr 13 mit Argon gespuit.

An

den Sollwert- Einstellvorrichtungen 24und 25

werden

sodann dieoptimaleSchallintensitatunddiegewiinsch- te Schallfrequenz eingestellt. Die beschriebene Regeleinrichtung sorgt dafur, daft die optimale Schallintensitatalseffektive,aufdie Reaktions- flussigkeit zur vollen Einwirkung

kommende

Schallintensitat

wahrend

der

gesamten

Behand- lungszeit eingehalten wird. Die Behandlung dauert 30 bis 60 Minuten.

Wahrend

dieser Zeit wird durch das Kuhlwasser ^{die in}

dem

Reakti- onsgefaft entwickelte

Warme

abgefuhrt und so dieTemperaturkonstant gehalten.

Die auf diese

Weise

erhaltene Vesikel-Sus- pension wirdnunmitroten Blutzellen bei37Grad

Ce

^lsⁱus 1 h Inkubⁱert.

Da

^{nac h}

we

rden die roten- Blutzellen in isotonischen Puffer

pH

7,4 gewa- schen und die Hamogiobin-02-Dissozlationskur- ve der modifizierten intakten Zellen gemessen.

Der Erfolg der IHP-lnkorporierung wird als

»Rechtsverschiebung« der Hamoglobin-02- Dissoziationskurve erkannt. Der durch IHP- Bindung an Hamoglobin maximalerreichbareO2- Hatbsattigungsdruck betragtbei37GradCelsius und

pH

7.423,5

mbar

(95

mmHg).

Der Erfolg der kontrollierten Ultraschall-

Methode

liegtvor allemdarin, daftdermaximale IHP-lnkorporierungseffekt mit Volumen-Verhalt- nissen

RBC

(Rote-Blutzellen): Vesikel oder mit Lipid-Konzentrationen ^erreicht wird, die nur noch

10%

der

Werte

betragen,die beiderbisher ublichen unkontrollierten Ultraschallanwendung fur eine erfolgreiche IHP-lnkorporierung einge- setzt

werden

muftten. Daraus resultiert ein er- heblicher wirtschaftlicher Vorteil, da Lipide teuer sind und nicht wiederverwendet

werden

konnen. Daruberhinaussindmit der bisherubli-

chen

Methode

keine reproduzierbar n Ergebnis- se zuerzielen, dieunb dingteVoraussetzungfur einesichereDosi runginderTh rapi sind.

Beispiel2

Bei Lipid-Vesikelnfurtherapeutische

Zweck

bestehtdi Forderung nachabsoluter Keimfrei- 5 ^heit.

Da

eine Sterilisation derfertigen Vesikel- SuspensionaufauftersteSchwierigkeitenstoftt,

wird folgendesVerfahren angewandt: Die Aus-

gangskomponenten

entsprechend

dem

Bei- spiel1

werden

zunachst sterilisiert, und unter 10 sterilenKautelenineinen ebenfallssterilisierten Beutel aus Polyathylen oder Weich-PVC-Folie vonetwa0,5

mm ^Wandstarke

^{gefullt.DerBeutel}

wird steril dichtverschlossen und dannin

dem

Uitraschallgefaft nach Fig.2 der Ultraschallwir- 15 kungausgesetzt,wobeider

Raum

zwischen den Gefaftwanden und

dem

Beutel mit

Wasser

aus- gefulltist. Die

Messung

derSchallintensitater- folgtin diesem ^FallanderAuBenseite des Beu-

tels. Unter sonst gleichen Bedingungen wie in 20 Beispiel1 beschrieben

werden

diegleichen Er- gebnisseerzielt,

wenn

dieden Schwingungsge- bern zugefuhrte LeitungetwaurndenFaktor1,65 erhdhtwird. Dieserbei der vorgegebenen Ver- suchsanordnung anhand der

Messungen

experi- 25 mentellermittelteFaktorreprasentiert diedurch die Einbringung des Beutels eintretenden Lei- stungsverluste.

30 Patentanspriiche

1. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesi- keln aus biologischen

Membranen

oder Lipid- Suspenstonen,bei

dem

^diezu desintegrierenden 35 Lipid-Suspensionen oder Lipid-Partikel in einer Dispersionsflussigkeit innerhalb eines Behand- lungsgefafses bei im wesentlichen konstanter

Tempor

atur einer

U

ltrascha^llbehandlung u nter- worfen werden, dadurch gekennzeichnet, daft 40 die furdengewiinschten

Zweck

wirksameVesi- kelgrofte bzw. Vesikelgrdftenverteilung, sowie die fur die Erzielung dieser Vesikelgrdfte bzw.

dieser Vesikelgrdftenverteilung optimale ^Ultra- schall-Frequenz und -Intensitat in der Dispersi- 45 onsflussigkeitermittelt, unddaft diesoermittel- te optimale Ultraschall-Frequenzund -Intensitat bei im ubrigen gleichen Behandlungsbedingun- gen dadurch konstant gehalten wird, daft

wah-

rend der Ultraschallbehandlung der Istwertder 50 Frequenz und ^Intensitatdes Ultraschallfeldesin

dem

Reaktionsmedium fortlaufend gemessen, und in Abhangigkeit von

dem

Istwert die Aus- gangsleistung und die Frequenz des

den Schwingungsgeber

speisenden elektrischen 55 Generators geregeltwird.

2. Verfahren nach Anspruch1, dadurch ge- kennzeichnet, daft die Regelung des den ^Ultra- schallgeberspeisendenGenerators mitHilfe ei- nes automatischen Regelkreises mit Sollwert- 60 lstwert:

V

rgleich

vorgenommen

wird.

3.Verfahrennach Anspruch¹ oder2,dadurch gekennzeichnet, daft zur

Messung

der ^Ultra- schall-lntensitatund-Frequenzeinindie Reakti- onsflussigk ^it eintauchender piezoelektrisch ^r 65 Schallaufnehmer verwendet^wird.

5

4. Verfahren nach

Anspruch3

r dadurch ge- kennzeichnet,

daS

der piezoelektrische Schall- aufnehmer

am Boden

des Reaktionsgefa&esso angeordnetwird,

da&

dieRichtungsein rhoch- sten Empfindlichkeit

gegen

d n Ultraschalfg ^- ber gerichtetist,

wahrend

der Ultraschallgeber indas obereDritteldes

Mediums

eintaucht.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Anspruche1 bis4,dadurchgekennzeichnet,daft dasReaktionsmediumuntereinerInertgasatmo- spharebehandeltwird.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Anspruche1 bis5,dadurchgekennzeichnet,

da&

das Reaktionsmedium sterilisiert und in einem Steril-Beuteleingeschlossen,undderdasReak- tionsmediumenthaltendeSteril-Beutelinnerhalb einer

dem

Ultraschallfeld ausgesetzten Flussig- keitbehandeltwird.

7.

Anwendung

des Verfahrens nach einem odermehrerenderAnspruche1bis6zur Herstel- lungvonfurtherapeutische

Zwecke

bestimmten, mit einem Wirkstoff wie Inositolhexaphosphat beladenen,zur Fusion mit rotenBlutzellen befa- higtenLipid-Vesikeln.

8. Vorrichtung zurDurchfuhrung desVerfah- rensnachAnspruch1,miteinemdieReaktions- flusstgkeit

aufnehmenden

BehandlungsgefaS

und

mindestens einem von

einem

eiektrischen Generatorgespeisten elektroakustischen

Wand-

lerzurErzeugungeinesUltraschallfeldesin

dem

Reaktionsmedium, dadurch gekennzeichnet,

da&

innerhalbdes Behandlungsgefa&es (3; 30) als Schallaufnehmer ein akustisch-elektrischer

Wandler

(18; 37) angeordnet ist, dessen Aus- gangssignal zurRegelung der Ultraschall-lnten- sitat und -Frequenz in der Reaktionsflussigkeit dient.

—

9.

Vo

rrichtungn ach

A

nspruch8,gekennzetcfrfr- rlet durch einenden eiektrischen Generator(23;

43) ansteuernden Regelverstarker (21; 39) mit Sollwert-Jstwert-Vergleich.

10. Vorrichtung nach Anspruch8 und 9, da- durch gekennzeichnet,

dad

der akustisch-elek- trische

Wandler

(18;37)auseiner

am

Endeeines Rohres angeordneten Piezo-Scheibe besteht, diemitihrer

gegen

Schalldruck empfindlichsten Riphtung

gegen

den

Schwingungsgeber

gerich- tetist.

11. Vorrichtung nach Anspruch8 bis 10, da- durch gekennzeichnet,

dad

die Geometrie des Ultraschallgebersund des das

Medium

aufneh-

menden

BehandlungsgefaBes_(3;30)sogewahlt sind,

daS

die durch Reflexion verursachte Bil-

dung

von Ultraschallwellen mit einer von der Sollfrequenz abweichenden Frequenz und/oder mit gegenuber

den

primaren Ultraschallwellen verschobener Phasein

dem

beschallten

Medium

vermiedenwird.

12. Vorrichtung nach Anspruch

8

bis 11, da- durchgekennzeichnet,

da&

das Behandlungsge- faB _(3;30)voneinerKuhlflussigkeitdurchstrom-

t

Doppelwand

aufweist

13. Vorrichtung nach Anspruch8 bis 12, da- durchgekennzeichnet,

da&

das Behandlungsge- fa&(3)

gegen

di

AuR

natmosphireabgeschlos-

senistundeineZuleitung(13)fur dieZufuhrvon Inertgaszu

dem Gasraum

oberhalbdesbeschall- tenReaktionsmediums(l)aufweist.

5

Claims

1.

A method

of preparing lipid vesicles from biological

membranes

or lipid suspensions, in 10 whichthe lipid suspensionsorlipid particlesto be desintegrated are ultrasonicallytreated in a dispersionfluidinside atreatment containerata substantially constant temperature, character- izedinthatthesize respectively size distribution 15 of the lipid vesicles, effective for the desired .

purpose,andthe

optimum

ultrasonicfrequency and intensityinthe dispersion fluidrequiredfor obtainingthissize respectivelythissize distribu- tion are determined, and that the thus deter- 20

mined optimum

^ultrasonicfrequencyand inten- sity, with the other constant conditions, are maintained constantin sucha

manner

that dur- ingthe ultrasonictreatment the actual valueof frequencyandintensity oftheultrasonicfieldin

25 the reaction

medium

is continuously measured andtheoutput

power

andthefrequencyofthe electricgenerator supplying thesoundtransmit- ter are controlledin

dependence

upontheactuel value ofthefrequencyandintensityoftheultra- 30 sonicfield.

2.

A method

as defined inclaim 1,character- ized in that control of the generator supplying theultrasonic transmitterisrealisedby

means

of an automatic control circuit including an actuel 35 value

—

nominal value comparator.

3.

A method

as definedinclaim1 or2,charac- terized in that a piezoelectric sound receiver dippedin thereaction

modium

ⁱs usedfor

me

a- suring theultrasonic intensityandfrequency.

40 4.

A method

as defined in claim3,character- ized in that the piezoelectric sound receiver is

arrangedonthebottomofthereactioncontainer sothatitsdirectionof the

maximum

sensivityis

directed againstthe uitasound transmitter, the 45 ultrasound transmitter being dipped into the

upperthirdofthereaction

medium.

5.

A method

as defined in a or

more

ot he claims1 to4, characterized in thatthe reaction

medium

is treated under on inert gas atmos- 50 phere.

6.

A method

as defined in onor

more

ofthe claims1 to5, characterized in thatthereaction

medium

is sterilised and enclosed in a sterile bag, and thatthe sterile bag with the reaction 55

medium

insideistreatedwithin afluidexposed

totheultrasonicfield.

7.Application ofa

method

as definedⁱⁿonor

more

oftheclaims1 to6forproducinglipidver- sicles for therapeutial purposesloaded with an 60 effective substanc such as inositolhexaphos- phateand capableof fusing with red blood^cells.

8.

An

apparatusforcarrying-outth

m

^thodas

defin d in claim1,comprising a treatment con- tainer including the reaction fluid and at least 85 one electric-acustic, by an electric generator

11

0 052

322 12

suppliedtransmitter forproducingan ^ultrasonic

fi Id in the reaction

medium,

characterized in thatasasoundrec iveranacustic-electric trans- ducer(18; 37) is arranged within the treatment container(3;30),the outputsignal of said trans- ducer ^being,used for controlling the ultrasonic intensityand frequencyinthereaction^fluid.

9.

An

apparatus as definedⁱⁿ claim8,charac- terized byancontrol-amplifier(21; 39)including nominal value

—

actuel value comparator, the amplifier(21;39)beingconnectedwith theelec- tricgenerator(23; 43).

10.

An

apparatur as defined in claim 8and9,

characterized in that the acustic-electric trans- ducer(18;37)is

composed

ofapiezoelectric disk arranged atthe end of a tube so that its most sound-sensitive ^direction faces against the soundgeneratingmeans.

1 1.Apparatusas definedinclaim 8to10,char- acterized in that the ultrasound generating

means

andthe treatment container(3;30) includ- ingthe

medium

have geometries which are se- lectedso astoavoida reflection-caused forma- tion of ultrasonic

waves

in the

medium

with a frequencydeviatingfromthenominalfrequency and/or with a phase which is offsetrelative to thephaseofthe primaryultrasonic

waves

inthe medium.

12.Apparatusas definedⁱⁿclaim8 to11,char- acterized ⁱⁿ that the treatment container(3;30) has double walls with hollow spaces therein throughwhichrunsacoolingmedium.

13.Apparatusas definedinclaim8 to^12,char- acterized in thatthe treatment container (3) is

closed from the outer atmosphere and

com-

prisesinlet

means

(13)forsupplying aninertgas

intothegas-filledspace abovethereaction

me-

dium. ^~~

Revendications

1. Procede pour^preparer de vesicules lipidi-

ques a partirde

membranes

biologiques ou de suspensions lipidiques,dans lequel lessuspen- sionsouparticules lipidiques a desintegrer sont soumisesa un traitement auxultra-sonsdansun liquid

de

dispersion a I'interieure d'un recipient aune temperaturessentiellement constante,ca- racteriseen ce qu'on determine,dansleliquide

de

dispersion, la frequence et Tintensite opti-

malesd'ultra-sonpourobtenirla dimensionres- pectivement la repartition des dimensions des vesicules effectives pour le but souhaite, et qu'on maintient constantes^tafrequence et Tin- tensite d'ultra-son opttmales ainsitrouvees, les autresconditionsdetraitementetantles

memes,

en mesurant continuellementlavaleureffective delafrequenceetde Tintensitedu

champ

ultra- sonicdans^I milieu

de

reaction,etenreglantla

puissanc de sortie etla frequence du genera- tour electriqueaiimentant le g ^nerateurdes ul- tra-sons en

dependance

deladite valeureffec- tive.

2. Procede selon revendication1, caracterise

ence qu'onregiegenerateur aiimentant^I gene- rates d'ultra-sons a Taide d'un circuit de re- glage automatique a comparaison val ur de consigne

—

valeur ffective.

5 3.Procedeselon revendication ¹ou2,caract'- rise ence qu'on ^utilise un capteurpiezoelectri- que de son plonge dans le liquide de reaction, pour mesurer Tintensite et lafrequence des ^ul- tra-sons.

10 4. Procede selon revendication3, caracterise en ce que lecapteur piezoelectrique desonest place au sol du recipient de reaction de telle

maniere

que

ladirectiondesasensibilitelaplus elevee est dirigee versle generateurdesultra- 15 son,ce dernier etantplonge dans^letierssuper-

ieurdumilieu.

5. Procedeselonune ouplusieuresdesreven- dications1 a4,caracteriseen ce quelemilieude reaction esttraite dans une atmosphere

de

gaz 20 inerte.

6.Procedeselonune ouplusieuresdesreven- dications1a5,caracteriseen cequelemilieude reaction eststeriliseetenferme dansun sacste-

rile,et que lesacsterile contenant^le milieude 25 reaction esttraitea I'interieure d'un liquide ex-

poseau

champ

desultra-sons.

7. Application du procede selon une ou plu- sieures des revendications1 a 6 pour preparer desvesiculeslipidiquesdestinees auxbutsthe- 30 rapeutiques,chargeesd'un

medicament comme

inositolhexaphosphatetsusceptibles alafusion avec deglobulesrouges dusang.

8. Dispositif pour la mise en oeuvre du pro- cedeselon revendication1,comprenant unreci- 35 pientpourleliquidede reaction etau moins un transducteur electroacoustique alimente par un generateurelectrique, pourcreerun

champ

des

ultr?-«"r*s dans le milieu

de

reaction, caracte- rise en ce qu'un capteur acoustique-electrique 40 (18;37) estdisposeaI'interieuredurecipientde reaction(3;30), lesignaldesortiedudit capteur (18; 37) servant de regler Tintensite et ^la fre-

quence des ultra-sonsdans le liquide de reac- tion.

45 9. Dispositif selon revendication8, caracte- rise par un amplificateur

de

reglage (21; 39) a comparaisonvaleur

de

consigne

—

valeureffec- tive,Tamplificateurdereglageetantlieaugene- rateur electrique(23; 43).

50 10.Dispositifselon revendication 8et9,carac- teriseen ce quelecapteur acoustique-electrique (18; 37)consisteenunepiezo-disque disposeea I'extremited'untube,ladirection^laplussensible aiapressiondes sonsetant dirigeeverslegene- 55 rateurdesvibrations.

11.Dispositifselon revendication 8a10,carac- teriseence

que

lageometric du^generateurdes ultra-sonsainsi

que

lageometrie durecipientde traitement(3; 30)contenantle milieusontchoi- 60 si sdetell sort qu laformation, alasuitede reflexions, d'ondes ultrasoniques ayaatune fre-

quence differ nte de lafrequence de consign et/ou un phasedevicevis-a-visdelaphase d s ondes ultrasoniqu s primair s, soit evite dans 65 lemilieuexpos' auxultra-sons.

7

•12.Dispositifselonr vendication8a11,carac- teris6qn ce quelerecipientdetraitement(3;30) presents des d uble-paroistraverses par un li-

quids

de

refroidissement.

13.Disp sitifselonrevendicati n 8 a12,carac- teriseen ce que^lerecipientdetraitement(3)est ferme vis-a-vis

de

I'atmosphere exterieure et presenteuneconduite(13)destinee aI'alimenta- tionde gazinertea I'epacede gazaudessus du milieu

de

reaction(1)expose auxultra-sons.

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 5

10

0052 322

9

to >

7*1

39

12