Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften Studiengang Lebensmitteltechnologie
Wintersemester 2015/2016
Bachelorarbeit
Untersuchungen zur Inaktivierung
von Alicyclobacillus acidoterrestris durch Kaltplasma
URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis2015-0664-1Verfasser: Jessica Theelke
Erstgutachter: Prof. Dr. Karl Steffens
Zweitgutachter: Prof. Dr. Leif-Alexander Garbe
spore-forming bacterium. The spores are not destroyed by the pasteurization process. As a result this spoilage organism is responsible for contamination of juices and causes major economic losses to the fruit juice industry.
After the characteristics of A. acidoterrestris, like the heat resistance and the Guaiacol synthesis, the general characteristics and the effect of cold plasma are described in this work. Cold plasma is a non-thermal plasma and generated at the near of room temperature. As a consequence no thermal damages to food are caused and it could be a good alternative to use it for heat-sensitive food.
The aim of this work is to study the influence of cold plasma on the growth of
A. acidoterrestris. Therefore the skin of grapefruits are coated with this bacterium and treated
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 5
2 Stand der Wissenschaft und Technik ... 6
2.1 Alicyclobacillus acidoterrestris ... 6
2.1.1 Charakterisierung ... 6
2.1.2 Eigenschaften der Endosporen ... 7
2.1.3 Stoffwechselprodukt Guaiacol ... 8
2.2 Kaltplasma zur Dekontamination von Lebensmitteln ... 9
2.3 Grapefruits ... 11
3 Material und Methoden ... 12
3.1 Materialien ... 12
3.2 Methoden ... 13
3.2.1 Zusammensetzung und Herstellung der Nährmedien ... 13
3.2.2 Herstellung der Bakteriensuspension zur Belegung der Grapefruitschalen ... 13
3.2.3 Belegung von Grapefruitschalen mit A. acidoterrestris und anschließender Plasmabehandlung ... 14
3.2.4 Mikroskopische Darstellung von A. acidoterrestris ... 15
4 Ergebnisse ... 16
4.1 Ergebnisse der Plasmabehandlung ... 16
4.2 Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung... 21
5 Diskussion ... 23
6 Zusammenfassung ... 25
7 Literatur ... 26
8 Verzeichnis der verwendeten Abbildungen und Tabellen ... 28
9 Anlagen ... 30
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A. acidoterrestris Alicyclobacillus acidoterrestris
Caso-Agar Casein-Soja-Pepton-Agar
DBE dielektrisch behinderte Entladungen
dest. Wasser destilliertes Wasser
E. coli Escherichia coli
KbE Koloniebildende Einheiten
ppb parts per bilion
rpm revolutions per minute – Umdrehungen pro
Minute
1 Einleitung
Endosporen stellen die Lebensmittelindustrie häufig vor eine schwierige Aufgabe. Durch ihre ausgeprägten Resistenzen, z.B. gegenüber Hitze, lassen sie sich schwer inaktivieren. Somit können große ökonomische Verluste entstehen.
Fruchtsäfte stellen aufgrund ihres niedrigen pH-Wertes im Allgemeinen eine geringe Kontaminationsquelle dar. Jedoch ist Alicyclobacillus acidoterrestris einer der meisten Verderbniserreger in der Fruchtsaftindustrie. Bereits eine geringe Anzahl dieses Bakteriums kann große Mengen Saft kontaminieren und somit einen erheblichen finanziellen Schaden hervorrufen. Der Verderb des Produktes kann bereits lange vor dem Verfallsdatum auftreten, ohne jedoch optisch erkennbar zu sein. Dieser wird erst beim Öffnen des Produktes und somit oft beim Verbraucher deutlich. Die Anzeichen für den Verfall sind ein medizinischer,
phenolartiger Geruch, ausgelöst durch von A. acidoterrestris gebildete Metabolite, wie z.B. Guaiacol.
A. acidoterrestris wird nicht durch den Pasteurisationsschritt während der Herstellung
abgetötet. Es handelt sich um einen thermoacidophilen Mikroorganismus, der hitzeresistente Endosporen bildet, welche nach der Pasteurisation im Produkt auskeimen und das Produkt somit sensorisch ungenießbar machen.
Ziel dieser Arbeit ist es daher zu versuchen, das Wachstum von A. acidoterrestris mithilfe von Kaltplasma einzudämmen bzw. zu verhindern. Plasmen sind ionisierte Gase, die letale Schädigungen bei Mikroorganismen hervorrufen können. Durch den Einsatz von Kaltplasma werden Lebensmittel schonend behandelt, da das Plasma in der Nähe der Raumtemperatur erzeugt wird.
In dieser Arbeit werden die Inaktivierungsversuche des Bakteriums auf Grapefruitschalen durchgeführt. Dies erfolgt in dem die Schalen mit A. acidoterrestris belegt und anschließend für eine bestimmte Zeit mit Plasma behandelt werden.
2 Stand der Wissenschaft und Technik
2.1 Alicyclobacillus acidoterrestris
2.1.1 Charakterisierung
Alicyclobacillus acidoterrestris zählt zu den thermophilen stäbchenförmigen Bakterien. Es
wächst in einem Temperaturbereich von 20-70 °C. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 40-60 °C. Desweiteren ist der Mikroorganismus acidophil. Er wächst in
pH-Bereichen von 2-6. Das Optimum befindet sich zwischen pH 3,5 und 4,5 (Yokota et al., 2007).
Laut Wisotzkey et al. (1992) besitzen die Stäbchen eine Länge von 2,9 bis 4,3 μm und sind 0,6 bis 0,8 μm breit. A. acidoterrestris ist ein grampositives Bakterium. Herrschen ungünstige Umwelt- und Nahrungsbedingungen vor, bildet es Endosporen. Sie sind oval, besitzen eine Länge von 1,5 bis 1,8 μm und eine Breite von 0,9 bis 1,0 μm (Wisotzkey et al., 1992). Das Bakterium ist obligat aerob, nicht pathogen und ubiquitär verbreitet. Auf YSG-Agar erreichen die Kolonien, bei optimalen Wachstumsbedingungen, eine Größe von 2-5 mm. Sie sind rund, beige und erscheinen mit zunehmendem Alter dunkler (Yokota et al., 2007).
1982 wurde in Deutschland erstmalig der Verderb von pasteurisiertem Apfelsaft in großem Ausmaß festgestellt. Zu diesem Zeitpunkt war jedoch noch nicht bekannt, dass es sich um
A. acidoterrestris handelt. Durch Forschungen wurde der Mikroorganismus zunächst als Bacillus acidoterrestris betitelt. Jedoch stellte sich nach weiterführenden Untersuchungen
heraus, dass er besondere Fettsäuren in seiner Membran enthält, welche als ω-cyclisch bezeichnet werden. Aufgrund dieser Tatsache erfolgte die Umbenennung in Alicyclobacillus
acidoterrestris. Der Name Alicyclobacillus verweist auf diese speziellen Fettsäuren (Yokota
et al. 2007; Chang, Kang 2004).
Bei den ω-cyclischen Fettsäuren handelt es sich bei A. acidoterrestris um ω-cyclohexane Fettsäuren. Sie bilden die Hauptkomponenten der Lipide in der Zellmembran und werden mit der Hitze- und Säureresistenz in Zusammenhang gebracht. Laut Kannenberg et al. (1984) stabilisieren Lipide, die Fettsäuren mit einem Cyclohexanring enthalten, die Membranstruktur und unterstützen die Aufrechterhaltung der Barrierefunktionen von Prokaryoten bei höheren Temperaturen. Der Schutz ist durch die dichtere Packung der Membranlipide gegeben. Dies geschieht in dem Fettsäuren eine schützende Umhüllung mit starken hydrophoben
Verbindungen formen. Durch diese Bindungen wird ein stabilerer Membranaufbau und eine geringere Membranfluidität unter extrem sauren Bedingungen und hohen Temperatur erzeugt (Kannenberg et al., 1984; Wisotzkey et al. 1992).
2.1.2 Eigenschaften der Endosporen
Unter ungünstigen Umweltbedingungen können Mikroorganismen Dauerformen bilden. Bei einigen grampositiven Bakterien erfolgt die Differenzierung der vegetativen Zellen zu Endosporen, wie auch bei A. acidoterrestris (Munk, 2001; Wisotzkey et al., 1992).
Endosporen sind sehr widerstandsfähig. Dies wird deutlich durch eine hohe Hitzeresistenz, sie können über Jahre Trockenperioden überdauern, sind resistent gegenüber Radioaktivität und chemischem sowie physikalischem Stress (Fritsche, 2002; Munk, 2001).
Zurückzuführen sind diese Eigenschaften auf eine starke Dehydratisierung der Proteine, eine Hüllenbildung und den vorherrschenden Dipicolinsäuregehalt (Fritsche, 2002).
Der Schutz der DNA ist durch spezielle Proteine, sogenannte SASP’s (small acid soluble spore protein) gegeben (Munk 2001). Die Hitzestabilität wird durch die Bildung von Dipicolinsäure herbeigeführt, die von einer erhöhten Aufnahme von Ca 2+ begleitet ist (Fritsche, 2002).
Durch die extreme Hitze- und Säureresistenz der Endosporen von A. acidoterrestris sind diese schwer zu inaktivieren (Yokota, 2007). Zur Beurteilung der Hitzeresistenz wird der D-Wert herangezogen. Mit diesem Wert wird ausgedrückt, in welcher Zeit, bei einer bestimmten Temperatur, die Keimzahl um 1/10 verringert werden kann. Je hitzeresistenter ein
Mikroorganismus, desto größer ist der D-Wert bei konstanter Temperatur. Bei einer Erhöhung der Temperatur wird dieser Wert kleiner (Krämer, 2011).
Die D-Werte für A. acidoterrestris Sporen schwanken zwischen 16 und 23 min bei 90 °C sowie 0,06 bis 5,3 min bei 95 °C (Clotteau, 2014). Bei der Fruchtsaftproduktion erfolgt die Pasteurisation bei Temperaturen zwischen 86 und 96 °C für eine Dauer von 15 s bis zu 2 min. Somit werden die Endosporen dieses Bakteriums nicht ausreichend inaktiviert. Sie keimen aus und führen somit zum Verderb der Fruchtsäfte (Clotteau, 2014).
Auch die umgebende Matrix spielt eine Rolle bei der Inaktivierung. Der pH-Wert des Mediums beeinflusst die Resistenz der Endosporen während der Hitzebehandlung.
Anhand der Tabelle eins wird dies in unterschiedlichen Matrixen verdeutlicht. Bei einem pH-Wert von 3,9 (Orangensaft) wurden höhere D-Werte erreicht. In Grapefruitsaft mit einem niedrigerem pH-Wert von 3,42 ergaben sich geringere D-Werte (Yokota et al. 2007).
Tabelle 1 Einfluss des pH-Wertes des Medium auf die Hitzeresistenz der Endosporen (Yokota et al. 2007)
Fruchtsaft pH-Wert Temperatur (°C) D-Wert (min
)
Orangensaft 3,9 80 54,3 90 10,3 95 3,6 Grapefruitsaft 3,42 80 38,9 90 6 95 2
Das Auskeimen der Sporen wird durch Hitze aktiviert und geschieht bei einem
Nährstoffangebot in wenigen Minuten. Von der Dauerform erfolgt die Umwandlung in die vegetative Zellenform (Fuchs, 2014).
2.1.3 Stoffwechselprodukt Guaiacol
Alicyclobacillus acidoterrestris ist der Hauptverursacher für Fehlaromen in der
Fruchtsaftindustrie. Ursache dafür sind die von ihm gebildeten chemischen Komponenten Guaiacol, 2,6-Dibromphenol und 2,6-Dicchlorphenol. Die Hauptkomponente bildet Guaiacol (Abb.1). Diese Substanz ist verantwortlich für den medizinischen, phenolischen oder auch als rauchig beschriebenen Geruch der Produkte (Yokota et al., 2007; Chang, Kang; 2004). Neben Säften wird dieses Fehlaroma z.B. in Wein oder Vanillejoghurt wahrgenommen. Jedoch nicht immer ist Guaiacol als Fehlaroma anzusehen. In gerösteten Lebensmitteln trägt dieser Stoff zu dem charakteristischen Geruch der Produkte bei. Er wird durch die thermische Zersetzung von phenolischen Vorläufern gebildet (Merle et al., 2014).
In Fruchtsäften erfolgt die Bildung von Guaiacol u.a. durch die Umwandlung von
Vanillinsäure. Diese Säure kommt auf natürlicher Weise in der Pflanze vor und kann somit in den Saft gelangen. Aus diesem Grund versuchen Hersteller diese Verbindung auszuschließen, um somit der Bildung von Guaiacol vorzubeugen. Dennoch existieren andere Substanzen aus denen Guaiacol synthetisiert werden kann. In Apfelsaft befindet sich z. B. Tyrosin. Diese
Aminosäure ist ein weiter möglicher Vorläufer für die Bildung von Guaiacol (Chang, Kang; 2004, Jensen 1999).
Abbildung 1 Strukturformel Guaiacol (Yokota et al., 2007)
Geringe Mengen an Guaiacol sind bereits sensorisch nachweisbar. Die Schwellenwerte betragen in Wasser 0,01 ppb und in Orangensaft 10 ppb. In verdorbenen Säften konnten Konzentrationen zwischen 10 und 200 ppb nachgewiesen werden. Daran wird deutlich, dass diese Werte die Nachweisgrenze erheblich übersteigen und somit merklich geruchlich wahrnehmbar sind (Yokota et al., 2007).
Die Guaiacolsynthese ist abhängig von den Temperaturverhältnissen. Der Keim wächst schlechter bei Raumtemperatur, demnach ist auch die Bildung des Guaiacols geringer. Die Synthese kann außerdem in unterschiedlichen Wachstumsphasen des Bakteriums stattfinden. Nachgewiesen werde konnte die Substanz, wenn die stationäre Phase erreicht ist oder die Zellzahl sinkt (Yokota et al., 2007; Clotteau, 2014).
2.2 Kaltplasma zur Dekontamination von Lebensmitteln
Häufig wird Plasma als vierter Aggregatzustand angesehen. Es handelt sich um ein ionisiertes Gas, das Ionen, Neutralteilchen und freie Elektronen beinhaltet (Theel et al., 2013; DFG, 2012). Kaltplasma zählt zu den nicht-thermischen Plasmen. Es wird bei bzw. in der Nähe von Raumtemperatur erzeugt und verursacht keinen thermischen Schaden bei Lebensmitteln (Niemira, 2012).
Plasma entsteht durch die Zufuhr von Energie und besitzt eine elektrische Leitfähigkeit, die technologisch genutzt werden kann. Dafür sind freie Elektronen verantwortlich. Sie koppeln elektrische Energie ein und führen zu einem Beschleunigen der elektrischen Ladungsträger. Durch Kollisionen der freien Elektronen mit anderen Molekülen oder Gasatomen kann ihre Energie auf diese Atome oder Moleküle übertragen werden. Dadurch entstehen hochreaktive
Spezies, wie Radikale, Ionen, angeregte Elektronen und Moleküle, die u.a. UV-Strahlung aussenden können (Theel et al., 2013; DFG, 2012).
Die Energie der Elektronen ist stark genug, um kovalente Bindungen organischer Moleküle zu trennen. Neben der UV-Strahlung wirken z.B. Stickoxide oder Ozon auf die
Mikroorganismen ein. Dadurch kommt es zu einer Beschädigung von diversen Makromolekülen, wie DNA, Lipopolysacchariden und Proteinen. Beim Einsatz von
atmosphärischem Plasma wird als Hauptgrund der Inaktivierung von Mikroorganismen das Ätzen mit Radikalen betrachtet. Durch den Einsatz von Luft als Prozessgas entstehen OH· und NO· Radikale. Diese senken durch Reaktionen im wässrigen Milieu den pH-Wert herab. Desweiteren können Schädigungen an der Zelloberfläche durch eine Anlagerung von geladenen Teilchen, Oxidationen einiger Zellkomponenten oder durch den Zusammenbruch der Energiegewinnung und des Membranpotenzials hervorgerufen werden (DFG, 2012).
Einfluss auf die Effektivität einer Plasmabehandlung haben produkttypische Eigenschaften, wie z.B. die Zusammensetzung, Geometrie oder Oberflächenbeschaffenheit. Untersuchungen ergaben, dass bei Lebensmitteln eine Reduktion der Keimzahl um 6, in einzelnen Fällen um 8 Log-Einheiten stattfand (DFG, 2012).
Der Einsatz von Plasmen erfolgt z. B. in der Medizin sowie Pharma- und
Lebensmittelindustrie, um Materialien zu dekontaminieren. Des Weiteren besitzen sie die Eigenschaften zu feinreinigen oder die Benetzbarkeit von Oberflächen zu verändern. Durch den Einsatz von Plasma erfolgt die Behandlung der Produkte schonend und
rückstandsfrei, wie es bei thermischen oder chemischen Verfahren nicht der Fall ist (Theel, 2013). Jedoch liegen laut der Deutschen Forschungsgemeinschaft (2012) nicht genügend mikrobiologische Daten vor, um eine Beurteilung auf gesundheitlicher Ebene vorzunehmen. In der Lebensmittelindustrie findet bevorzugt die Anwendung von Kaltplasma bei
Atmosphärendruck statt. Sie gestattet eine kontinuierliche Prozessführung und es erfolgt keine Beschleunigung unerwünschter Phasenübergänge, wie beim Einsatz von Unter-bzw.
Niederdruck. Beispielweise wird die dielektrisch behinderte Entladung (DBE) genutzt. Die Erzeugung der DBE erfolgt zwischen Elektroden, wobei mindestens eine isoliert ist (DFG, 2012).
Untersuchungen zur Wirkung von atmosphärischem Plasma auf Bacillus subtilis Sporen stellten heraus, dass die Gaszusammensetzung eine ausschlaggebende Rolle spielt. Bei einer
Dauer von 60 min konnte mit Helium und Sauerstoff eine Senkung von 2 Log-Einheiten erzielt werden. Dagegen wurde mit Helium und Stickstoff gezeigt, dass bereits 180 sec ausreichen, um eine Reduktion um 1 bis 2 Log-Einheiten und bei 20 min um 5 bis 6 Log-Einheiten zu erreichen (DFG, 2012).
2.3 Grapefruits
Grapefruits zählen zu den Zitrusfrüchten. Es handelt es sich um runde, feste Früchte mit einem Durchmesser von 10-15 cm. Das süß-säuerliche bis säuerliche Fruchtfleisch ist in 11-14 Segmente unterteilt, die von einer dünnen Haut umgeben sind. Außerhalb ist das Fleisch von einer ca. 1 cm dicken Schale umgeben. Einzelne Früchte weisen einen unterschiedlich starken Bittergeschmack auf. Diese bittere Note wird durch
Flavanonglykoside hervorgerufen. Hauptverursacher ist Naringin, gefolgt von Narirutin. Hohe Konzentrationen der Flavanonglykoside befinden sich in den Segmenthäutchen und in der Schale. Neben diesen Bestandteilen befinden sich zahlreiche Öldrüsen in der Außenschale, die mit ätherischen Ölen gefüllt sind. In Zitrusschalenölen zählt D-Limonen mit 70-95 % zu den Hauptbestandteilen (Acker et al., 1968; Acker et al. 1965; Liebster, Levin, 1988). Untersuchungen ergaben, das Limonen keine hemmende Wirkung auf die Sporenkeimung von A. acidoterrestris (Bevilacqua et al., 2008) hat.
Natürlicherweise besitzen Zitrusfrüchte eine Wachsschicht. Jedoch geht diese nach der Ernte durch Reinigungsschritte verloren. Dadurch verlieren die Früchte ihren Schutz vor
Austrocknung und werden mit bestimmten Überzugsmitteln, wie Montansäureester oder Carnaubawachs, überzogen. Carnaubawachs ist auch für Bio-Lebensmittel zugelassen
(Horlemann, 2015). Des Weiteren wird die Oberfläche der Früchte mit Konservierungsstoffen behandelt, um dem frühzeitigen Verderb durch Mikroorganismen entgegenzuwirken.
Zugelassen ist beispielsweise Thiabenzol. Bei Früchten aus dem ökologischen Anbau wird auf diese Stoffe verzichtet (Liebster, Levin, 1988).
3 Material und Methoden
3.1 Materialien
Die für die Untersuchungen verwendeten Mikroorganismen stammen aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
x Alicyclobacillus acidoterrestris (DMS-Nr. 3922) x Escherichia coli K12 (DSM-Nr. 498)
Bei den Grapefruits handelte es sich um Bio-Früchte aus Spanien.
Die genutzten Chemikalien und Geräte werden nachfolgend aufgelistet.
Chemikalien
x Natriumchlorid (Appli Chem) x Hefeextrakt (Oxoid)
x Glucose (Roth)
x Stärke löslich (Sigma-Aldrich) x Agar-Agar (Roth)
x Chlorwasserstoff (Riedel-de Haën) x Malachitgrün-Oxalat (Roth) x Kristallviolett (Merck) x Lugolsche Lösung (Roth) x Entfärbelösung (Merck) x Safraninlösung (Roth)
Geräte
x Wasserbad (Gesellschaft für Labortechnik) x Schüttler (Edmund Bühler)
x Schüttler (Sartorius Certomat IS Typ 8864926) x Brutschrank (Heraeus Instruments Typ B 6200, 70°C) x Brutschrank (Heraeus Instruments Typ B 15, 50°C) x Zentrifuge (Sigma Laborzentrifuge GmbH 3K30) x Rotor 12158-H
x Rotor 12159-H
x Plasmaapparatur (Leibniz-Instituts für Plasmaforschung und Technologie e.V. Greifswald mit Spannungswandler)
x DBE-Elektroden
x Mikroskop (Nicon Eclipse E400)
3.2 Methoden
3.2.1 Zusammensetzung und Herstellung der Nährmedien
Für die YSG-Bouillon werden 2 g Hefeextrakt, 1 g Glucose und 2 g Stärke in einem Liter dest. Wasser gelöst. Anschließend wird der pH-Wert mit HCL auf pH 3,7 eingestellt. Das Autoklavieren erfolgt bei 121 °C für 15 min.
Zur Herstellung des YSG-Agars werden zwei Lösungen hergestellt. Dazu werden 2 g
Hefeextrakt, 1 g Glucose und 2 g Stärke mit 500 ml dest. Wasser vermengt und der pH auf 3,7 mit HCL eingestellt. Für die andere Lösung werden 15 g Agar Agar und 500 ml dest. Wasser zusammengegeben. Das ganze wird mit einem Rührfisch versehen. Beide Lösungen werden separat autoklaviert (121 °C, 15 min). Danach lässt man die Lösungen auf 50-60 °C abkühlen und vermischt sie miteinander. Dann können die Platten gegossen werden.
3.2.2 Herstellung der Bakteriensuspension zur Belegung der Grapefruitschalen Zunächst wurde ein mit 450 ml YSG-Bouillon befüllter Erlenmeyerkolben mit
Alicyclobacillus acidoterrestris inokuliert. Bei dem ersten Versuch wurde ein 500 ml
Erlenmeyerkolben verwendet. Bei den nachfolgenden Experimenten erfolgte die Nutzung eines 1 l Kolbens, um den Mikroorganismen mehr Sauerstoff zur Verfügung zu stellen und somit möglicherweise die Anfangskeimzahl zu erhöhen. Die Inkubation erfolgte in einem Schüttler bei 45 °C für 5 Tage bei 110 rpm/min.
Nach dieser Zeit wurde die Boullion auf 6 Zentrifugenröhrchen a 75 ml aufgeteilt und bei 8000 g für 10 min zentrifugiert.
Nach dem Abgießen des Überstandes erfolgte die Zugabe von jeweils 15 ml sterilem dest. Wasser in die einzelnen Röhrchen. Ein zehnsekündiges Durchmischen im
Reagenzglasschüttler löste den entstandenen Absatz. Dieses Gemisch wurde anschließend in ein kleineres Zentrifugenröhrchen (25 ml) überführt und das 75 ml Röhrchen mit 10 ml dest.
Wasser gespült und danach in das kleinere überführt. Dieser Vorgang fand bei allen sechs Röhrchen statt.
Die nun mit 25 ml befüllten Zentrifugenröhrchen wurden bei 8000 g für 10 min zentrifugiert. Erneut wurde der Abstand abgegossen, 25 ml dest. Wasser in das Röhrchen gegeben, 10 s gevortext und unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Danach erfolgte eine Wiederholung dieses Prozesses. Im Anschluss daran wurde der Abstand abgegossen, jeweils 2 ml Aqua dest. zu den sechs Zentrifugenröhrchen hinzugefügt, der Absatz mit dem Reagenzglasschüttler gelöst und alles in einem Röhrchen zusammengeführt. Die restlichen fünf Röhrchen wurden mit 2 ml dest. Wasser gespült und zu dem sechsten hinzugefügt. So entstanden 22 ml
Bakteriensuspension, um damit die Belegung der Schalen durchzuführen.
3.2.3 Belegung von Grapefruitschalen mit A. acidoterrestris und anschließender Plasmabehandlung
Bevor die Schalenstücke der Grapefruits in Petrischalen, mit einem Durchmesser von 6 cm, gelegt wurden, fand eine zweiminütige Behandlung der Petrischalen mit Plasma statt. Dadurch wurde die Oberfläche benetzbar gemacht, um eine gleichmäßige Verteilung der später dazugegebenen Natriumchloridlösung zu ermöglichen.
Von den Grapefruits wurden sieben Stücken, je 3x3 cm, aus der Schale herausgeschnitten und auf eine Dicke von 2-3 mm eingestellt. In die Petrischalen kam jeweils ein 9 cm2 großes Schalenstück.
Von den zuvor hergestellten 22 ml der Bakteriensuspension wurden jeweils 0,3 ml auf eine Schale mit einer Eppendorfpipette verteilt. Das Auftragen geschah so dünn wie möglich, ohne dabei etwas an den Seiten hinunter laufen zu lassen. Im Anschluss erfolgte das Trocknen der Suspension auf der Schale (in geöffneten Petrischalen) im Brutschrank bei 45 °C für ca. 45 min.
Für die einzelnen Versuche fand die Plasmabehandlung der Schalen für eine Dauer von 1, 2, 5 10, 20 und 30 min statt. Außerdem wurde zur Bestimmung des Anfangskeimgehaltes eine belegte Grapefruitschale nicht mit Plasma behandelt, um einen Referenzwert zu erhalten. Zur Durchführung der Behandlung kamen die geöffneten Petrischalen mit der Schale unter die Elektrode und es erfolgte die Bestrahlung für die entsprechende Zeit. Luft diente als Gasgemisch. Danach wurde die Grapefruitschale mit einer Pinzette senkrecht über die Petrischale gehalten und mit 3 ml 0,85 %-iger Natriumchloridlösung gespült. Daraufhin wurde das Schalenstück mit der Oberseite nach unten zurück in die Petrischale gelegt und im Schüttler für eine Stunde bei 100 rpm/min bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend
wurden die 3 ml Natriumchloridlösung in ein leeres steriles Reagenzglas überführt. Davon wurden für jede einzelne Behandlung Verdünnungen bis 105 hergestellt und je 0,1 ml auf YSG-Agar im Oberflächenausstrichverfahren aufgetragen. Die Verdünnungen wurden im Anschluss für 10 min in ein 80°C heißes Wasserbad gestellt und danach erneut auf ein YSG-Agar aufgetragen, um somit das Wachstum der Sporen zu beurteilen.
Die Inkubation erfolgte 24 h bei 45 °C.
3.2.4 Mikroskopische Darstellung von A. acidoterrestris
Um A. acidoterrestris mikroskopisch zu betrachten, wurde ein Nativpräparat erstellt sowie eine Gram- und Sporenfärbung durchgeführt.
Für die Gramfärbung wird der Objektträger mit dem hitzefixierten Ausstrich in mehrere Lösungen getaucht. In Tabelle zwei wird die Durchführung veranschaulicht.
Tabelle 2 Durchführung der Gramfärbung
Lösung Einwirkzeit
Kristallviolett 2-3 min
Spülen mit fließendem Leitungswasser
Lugolsche Lösung 2 min
Spülen mit fließendem Leitungswasser, trocknen
Entfärbelösung 2 sec
Spülen mit fließendem Leitungswasser
Gegenfärbung mit Safraninlösung 5 min
Spülen mit fließendem Leitungswasser, trocknen
Für die Sporenfärbung werden einige Tropfen Malachitgrünlösung auf einem hitzefixierten Ausstrich verteilt und der Farbstoff über einer Brennerflamme bis zu einer metallisch glänzenden Färbung eingedampft. Im nächsten Schritt wird der Farbstoff mit fließendem Leitungswasser 2-3 min abgespült. Anschließend erfolgt ein zehnminütiges Eintauchen des Objektträgers in Safraninlösung. Dadurch wird eine Gegenfärbung der vegetativen Zellen vorgenommen, um sie von den grün eingefärbten Sporen abzugrenzen. Zum Abschluss wird das Safranin mit Leitungswasser abgespült und das Präparat an der Luft getrocknet (Schröder, 1991).
Die Software NIS-Elements D 3.2 wurde genutzt, um die mikroskopischen Bilder auf dem Computer anzuzeigen und Kontraste zu verstärken.
4 Ergebnisse
4.1 Ergebnisse der Plasmabehandlung
Zur Darstellung der Ergebnisse werden die ermittelten Daten in KbE/ml und % angegeben. Diese Daten befinden sich im Anhang in den Tabellen 7-10 (KbE/ml) und 11-14 (%).
Bei der ersten Versuchsreihe zur Plasmabehandlung, bei der das Wachstum von A. acidoterrestris in 450 ml Bouillon im 0,5 l Erlenmeyerkolben stattfand, lag die
Anfangskeimzahl der vegetativen Zellen bei 3,97*103 KbE/ml. Bei den Sporen wurden 3,12*103 KbE/ml ermittelt. Somit liegen diese Werte relativ nah beieinander. Bereits nach einer Minute wurde eine Verringerung der Keimzahl festgestellt (Abb. 2). Die vegetativen Zellen wurden dabei stärker gehemmt als die Sporen. So waren nach dieser Zeit noch 31,74 % Zellen und 53,21 % Sporen vorhanden.
Abbildung 2 Erste Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma
Die ermittelten Daten ergaben nach zwei Minuten geringere Keimzahlen als nach fünf bzw. zehn Minuten. Eine mögliche Ursache sind Fehler beim Ausplattieren. Vermutlich durch
fehlerhaftes Durchmischen der Verdünnungen, wodurch nur ein geringer Teil Mikroorganismen mit der Pipette erfasst und auf YSG-Agar aufgebracht wurde. Nach fünf Minuten liegen 26,4 % vegetative Zellen und 33,33 % Sporen vor. Bei der Betrachtung der Behandlungsdauer von zehn Minuten fällt auf, dass die vegetativen Zellen weiter um ca. 6 % und die Sporen um ca. 7 % reduziert wurden.
Nach 20 und 30 Minuten befanden sich <10 KbE/ml Sporen auf den Platten. An vegetativen Zellen waren nach 20 Minuten noch 40 KbE/ml und nach 30 Minuten 50 KbE/ml vorhanden. Fehler beim Ausplattieren sind wahrscheinlich.
Für die nachfolgenden drei Versuche wurden die 450 ml Bouillon mit A. acidoterrestris in einem 1 l Erlenmeyerkolben kultiviert.
Bei Versuch zwei (Abb. 3) wurden zu Beginn 5,48*103 KbE/ml vegetative Zellen und
4,35*103 KbE/ml Sporen erzielt. Nach einer Minute konnte die Anzahl von A. acidoterrestris bereits auf 7*102 KbE/ml Zellen (12,77 %) und 5,7*102 KbE/ml Sporen (13,1 %) gesenkt werden. Betrachtet man im Gegenzug die zwei- und fünfminütige Behandlung, so wird deutlich, dass kein großer Unterschied zwischen den einzelnen Behandlungszeiten besteht. Nach zwei Minuten wuchsen noch 11,68 % vegetative Zellen und 12,41 % Sporen sowie nach der fünfminütigen Anwendung 10,95 % vegetative Zellen und 10,34 % Sporen. Die
Unterschiede zwischen Zellen und Sporen waren somit gering. Auch nach zehn Minuten war der Anteil an vegetativen Zellen (0,73 %) und Sporen (0,46 %) ziemlich gleich.
Nach einer Zeit von 20 Minuten wurden für die vegetativen Zellen 2*101 KbE/ml ermittelt und weniger als 10 KbE/ml für die Sporen. Die Behandlung von 30 Minuten lieferte für vegetativen Zellen und Sporen < 10 KbE/ml.
Beim dritten und vierten Versuch wurden die höchsten Anfangskeimzahlen erreicht. Bei Versuch drei (Abb. 4) liegen diese Werte bei 2,83*104 KbE/ml (vegetative Zellen) und bei 3,4*104 KbE/ml (Sporen).
Abbildung 4 Dritte Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma
Nach einer Minute erfolgte eine geringfügige Absenkung der Zellzahl auf 96,11 %, bei den Sporen auf 67,06 %. Durch die Plasmabehandlung von zwei Minuten verringerte sich die Keimzahl um ca. eine Zehnerpotenz bei den vegetativen Zellen als auch bei den Sporen. Das 20-minütige Verfahren sorgte für ein Herabsetzen der vegetativen Zellen auf 6,68 % und bei den Sporen auf 0,62 %. Durch die Behandlung mit einer Dauer von 30 Minuten lagen 3,3*102-KbE/ml (veg. Zellen) und 2,9*102 KbE/ml (Sporen) vor.
Die Sporen wurden in diesem Versuch während der einzelnen Behandlungszeiten deutlich stärker gehemmt als die vegetativen Zellen. So befanden sich z.B. nach zwei Minuten 14,35 % und nach fünf Minuten 12,33 % Zellen. Für die Sporen wurden Werte von 4,53 % (2 min) und 2,94 % (5 min) ermittelt.
1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 0 5 10 15 20 25 30 A . aci d oterres tris [K bE /ml] Zeit [min]
Vegetative Zellen [KbE/ml] Sporen [KbE/ml]
Die Anfangskeimgehalte beim vierten Versuch (Abb. 5) zeigten Werte von 6,21*104 KbE/ml (vegetative Zellen) und 1,7*104 KbE/ml (Sporen) auf. Bereits nach einer Minute fand eine Senkung der Keimzahl auf 8,31 % bei den vegetativen Zellen und bei den Sporen auf 26 % statt.
Abbildung 5 Vierte Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma
Wird die Behandlung weiter auf zwei Minuten ausgedehnt, lässt sich die Anzahl an
A. acidoterrestris weiter herabsenken. Nach 10 Minuten überlebten 3,96 % vegetative Zellen
und 1,59 % Sporen. Für den weiteren Behandlungsverlauf lässt sich herausstellen, dass der Gehalt an Sporen nach 20 Minuten auf <10KbE/ml sank. Der Anteil der vegetativen Zellen betrug 0,61 %. Die 30 Minuten Behandlungsdauer senkten die Zellzahl weiter auf 0,03 %.
Vergleicht man alle Versuche miteinander so wird deutlich, dass bei allen Versuchen das Wachstum von A. acidoterrestris gehemmt wurde, sowohl für die vegetativen Zellen als auch für die Sporen. Die Ausgangskeimzahlen waren bei allen Versuchen eher gering. Die
höchsten Werte wurden im dritten und vierten Versuch erzielt. Dort lag der
Anfangskeimgehalt bei 104 KbE/ml. In den anderen Experimenten lag dieser Wert bei 103 KbE/ml. Jedoch konnte bei allen Versuchen eine Reduktion um zwei bis drei log-Stufen erzielt werden.
Von den vier durchgeführten Versuchen konnten nur bei einem Experiment Sporen nach 20 und 30 Minuten Plasmabehandlung ausgezählt werden. Aus diesem Grund endet der Graph, der die prozentualen Mittelwerte der vorhandenen Sporen darstellt, in Abb. sechs, nach zehn Minuten.
Abbildung 6 Durchschnittlicher prozentualer Anteil von A. acidoterrestris nach den einzelnen Behandlungszeiten mit Kaltplasma
Das Diagramm verdeutlicht, dass der Keimgehalt nach einer Plasmabehandlung von nur einer Minute im Durchschnitt auf 37,23 % (vegetative Zellen) und 39,84 % (Sporen) herabgesenkt wurde. Jedoch ist hier die Standardabweichung mit 24,67 am größten (Tab. 15 Anlage). Nach zwei Minuten wurde eine durchschnittliche Absenkung auf 9,5 % Zellen und 14,57 % Sporen erzielt. Im Durchschnitt liegen nach zehn Minuten noch 5,58 % Sporen und 9,30 % vegetative Zellen vor. Die Standardabweichung beträgt dabei 5,82 (Sporen) und 8,74 (Zellen).
Die Behandlung von 20 Minuten reduziert die vegetativen Zellen auf durchschnittlich 2,17 % und bei 30 Minuten auf 0,82 %. Die Abweichungen sind nach dieser Zeit am niedrigsten.
4.2 Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung
Um die Erscheinungsformen und die Zelldichte von A. acidoterrestris nach 0 und 30 min Plasmabehandlung zu beurteilen, wurden mikroskopische Untersuchungen durchgeführt. Durch den geringen Anteil von A. acidoterrestris, nach 30 min, wurden unter dem Mikroskop keine Bakterien bei der Sporen- und Gramfärbung entdeckt.
Die durchgeführten Sporenfärbungen der Referenzproben lieferten ebenfalls keine aussagekräftigen Ergebnisse, um vegetative Zellen von Sporen zu unterscheiden. Dieser Tatsache geschuldet erfolgte die Erstellung eines Nativpräparates von
A. acidoterrestris von einer YSG-Platte. Diese lagerte nach der Inkubation von 24 h bei 45°C
bereits 15 Tage bei 4°C (Abb. 7).
Abbildung 7 Nativpräparat von A. acidoterrestris von einer YSG-Platte (400x Vergrößerung)
Die Bildung von Endosporen ist an diesen Präparat ersichtlich. Der überwiegende Teil der Zellen hat Sporen gebildet.
Mit der Gramfärbung (Abb. 8) konnte gezeigt werden, dass A. acidoterrestris auf den Schalen zu finden ist.
Abbildung 8 Gramfärbung von A. acidoterrestris
Es ist deutlich zu erkennen, dass es sich bei A. acidoterrestris durch die Blaufärbung um grampositive Bakterien handelt. Durch den niedrigen Ausgangskeimgehalt sind nur wenige Zellen unter dem Mikroskop zu erkennen. Bei den anderen angefärbten Bestandteilen handelt es sich um Schmutzpartikel, die sich durch das Schütteln der Grapefruitschalen in der
Natriumchloridlösung abgelöst haben.
Zum Vergleich wurde diese Färbung mit E. coli durchgeführt (Abb. 9). Die Kolonien wurden von einer Caso-Agar-Platte entnommen. Es wird ersichtlich, dass es sich hierbei um
gramnegative Bakterien handelt und durch die Entnahme von der Agarplatte deutlich mehr Kolonien zu finden sind.
5 Diskussion
In den durchgeführten Versuchen wurden Bio-Grapefruits verwendet, um auszuschließen, dass eingesetzte Behandlungsmittel, wie Thiabendazol, Orthophenylphenol und Imazalil, einen Einfluss auf das Wachstum der Mikroorganismen haben.
Außerdem kann ausgeschlossen werden, dass durch eventuell ausgetretenes Limonen, beim zurecht schneiden der Grapefruitschalenschalen, die Sporenkeimung gehemmt wird. Laut Bevilacqua et al. (2008) zeigt Limonen keinen Einfluss.
Die erste Versuchsreihe stellte heraus, dass die vegetativen Zellen nach einer Minute geringfügig stärker gehemmt wurden als die Sporen. Diese Werte glichen sich jedoch mit steigender Behandlungsdauer an, sodass am Ende der Sporenanteil minimal geringer ausfiel. Daran lässt sich verdeutlichen, dass die Empfindlichkeit der Zellen im Vergleich zu den Sporen gegenüber Plasma annähernd konstant ist.
Noch stärker wird dies bei der zweiten Versuchsreihe ersichtlich.
Die Anteile vorhandener Zellen und Sporen näherten sich noch weiter an. Die Differenzen zwischen Zellen und Sporen, während der einzelnen Behandlungszeiten im ersten Versuch, lagen zwischen ca. 7 und 22 %. In der zweiten Versuchsreihe sanken sie auf <1 %. So lagen nach z.B. 1 min 12,77 % vegetative Zellen und 13,10 % Sporen vor.
Die dritte Versuchsreihe zeigte auf, dass die Sporen stärker gehemmt wurden als die
vegetativen Zellen. Im vierten Versuch war die Hemmung ähnlich wie im ersten. Die Zellen wurden mit annähernd gleicher Intensität geringfügig stärker gehemmt.
Somit kann zusammengefasst werden, dass vegetative Zellen und Sporen von
A. acidoterrestris annähernd gleich auf die Einwirkung von Plasma reagieren. Erwartet wurde
jedoch, dass die Sporen resistenter gegenüber Plasma sind als die Zellen und somit schwieriger zu inaktivieren. Die Annahme beruht auf der Tatsache, dass die Dauerformen üblicherweise resistenter gegenüber bestimmten Einflüsse sind. Dieser Mikroorganismus wächst jedoch in vegetativer Form bei hohen Temperaturen (20-70 °C) und niedrigen pH-Werten (2-6). Daher kann es möglich sein, dass dieses thermoacidophile Bakterium eine relativ geringe Anfälligkeit gegenüber Plasma aufweist. Zu dem ist es möglich, dass sich in der Bakteriensuspension, die auf die Schalen aufgetragen wurde, neben den vegetativen Zellen Sporen befanden. Die nach der Plasmabehandlung auskeimten und daraufhin zu fälschlichen Ergebnissen führten und somit zur Annahme der geringen Empfindlichkeit der vegetativen Zellen. Um diesen Aspekt genauer zu untersuchen, wäre eine voreingehende
mikroskopische Untersuchung ratsam, um eventuell vorhandene Sporen in die Auswertung mit einzubeziehen.
Es wäre außerdem ratsam, Experimente mit reinen Sporensuspensionen durchzuführen, da diese den Pasteurisationsprozess überstehen. Dies könnte mithilfe von Lysozym erfolgen. Durch den Einsatz dieses Stoffes werden die vegetativen Zellen abgetötet und Sporen bleiben zurück.
An allen Versuchen konnte verdeutlicht werden, dass durch den Einsatz von Kaltplasma eine Senkung der Keimzahl möglich ist. Je länger die Behandlung erfolgt, umso stärker ist die Reduktion. In den durchgeführten Experimenten konnten sie um zwei bis drei log-Stufen gesenkt werden. Um jedoch zu prüfen, ob eine weitere Reduktion des Keimgehaltes möglich ist, müsste in weiteren Experimenten versucht werden die Ausgangskeimzahl erhöhen.
Bei der Durchführung des ersten Versuches wurde A. acidoterrestris in einem 0,5l
Erlenmeyerkolben kultiviert. Jedoch war der Luftraum durch die 450 ml Bouillon sehr gering. Aus diesem Grund fand die Kultivierung des aeroben Bakteriums in den restlichen Versuchen im 1 l Kolben statt, um mehr Sauerstoff zur Verfügung zu stellen. Dieser Aspekt hatte jedoch keinen feststellbaren Einfluss auf das Wachstum.
Desweiteren stellt sich die Frage, welchen Einfluss andere Gasgemische anstelle von Luft auf die Inaktivierung von A. acidoterrestris haben. In Versuchen mit Gemischen aus Helium und Stickstoff konnten Bacillus Sporen um 5 bis 6 log-Stufen, bei einer Behandlungsdauer von 20 min, gehemmt werden (DFG, 2012). Jedoch muss geprüft werden, inwiefern sich der Einsatz anderer Gase aus finanzieller Hinsicht für ein Unternehmen lohnt. Dazu ist eine entsprechende Kosten-Nutzen-Analyse durchzuführen.
6 Zusammenfassung
A. acidoterrestris ist ein thermo- und acidophiles Bakterium, das sehr hitze- und
säureresistente Endosporen bildet. Eine Inaktivierung der Sporen durch die Pasteurisation in der Fruchtsaftindustrie ist nicht gegeben. Folglich keimen sie aus und verderben die
Fruchtsaftprodukte. Dadurch entsteht dem Unternehmen ein erheblicher ökonomischer Schaden. Aus diesem Grund wird an Möglichkeiten der Inaktivierung dieses Bakteriums geforscht.
Eingesetzt wurde in dieser Arbeit Kaltplasma. Als Plasma bezeichnet man ionisierte Gase, die eine technologisch nutzbare elektrische Leitfähigkeit besitzen. Durch die geringen
Temperaturen, die bei der Nutzung von Kaltplasma auftreten, werden die Lebensmittel keiner thermischen Schädigung unterzogen und dennoch Mikroorganismen inaktiviert. So stellt es ein schonendes Behandlungsverfahren dar.
Ziel dieser Bachelorarbeit war es, eine Inaktivierung von A. acidoterrestris durch die Behandlung mit Plasma vorzunehmen. Dazu wurden Grapefruitschalen mit diesem Mikroorganismus belegt und für eine bestimmte Zeitspanne mit Plasma behandelt.
Bei allen Versuchen stellte sich heraus, dass es möglich ist, eine Verringerung der Keimzahl mit Plasma zu erzielen. Es konnte eine Senkung um zwei bis drei log-Stufen erzielt werden. Jedoch lagen die Ausgangkeimzahlen bei max. 104 KbE/ml, sodass ungewiss bleibt, ob bei anfänglich höheren Zelldichten stärkere Reduktionsraten erzielt werden können.
Abschließend ist zu sagen, dass es möglich ist eine Hemmung des Wachstums von
A. acidoterrestris durch den Einsatz von Kaltplasma vorzunehmen. Jedoch besteht weiterer
7 Literatur
Acker, L., Bergner, K.-G., Diemar, W., Heimann, W., Kiermeier, F., Schormüller, J., Souci, S. (Hrsg.): Handbuch der Lebensmittelchemie: Band 1: Die Bestandteile der Lebensmittel. Berlin: Springer, 1965
Acker, L. Bergner, K.-G., Diemar, W., Heimann, W., Kiermeier, F., Schormüller, J., Souci, S. (Hrsg.): Handbuch der Lebensmittelchemie: Band 5/2.Teil: Obst, Gemüse, Kartoffeln, Pilze. Berlin: Springer, 1968
Bevilacqua A., Corbo M. R., Sinigaglia M.: Inhibition of Alicyclobacillus acidoterrestris spores by natural compounds. International Journal of Food Science and Technology (2008), Nr. 43, S.1271-1275
Chang, S.S., Kang, D.H.: Alicyclobacillus spp. in the Fruit Juice Industry: History,
Characteristics, and Current Isolation/Detection Procedures. Critical Reviews in Microbiology (2004), Nr.30, S.55-74
Clotteau, M: Alicyclobacillus spp. Control in Fruit Juice Industry. Pall Food and Beverage, 2014
Fritsche, W.: Mikrobiologie. 3. Auflage. Berlin: Spektrum, 2002
Fuchs,G. (Hrsg.): Allgemeine Mikrobiologie. 9. Auflage. Stuttgart: Thieme, 2014
Horlemann, G.: Zitrusfrüchte - Schalen immer vor dem Verzehr waschen!. 10.11.2015. http://www.vis.bayern.de/ernaehrung/lebensmittel/gruppen/zitrusfruechte.htm. 25.01.2016
Jensen, N.: Alicyclobacillus—a new challenge for the food industry. Food Australia (1999), Nr. 51, S. 33–36
Kannenberg, E.; Blume, A.; Poralla, K.: Properties of ω-cyclohexane fatty acids in membranes. FEBS (1984), Nr. 172, S. 331-334
Liebster, G. Levin, H.-G.: Warenkunde Obst und Gemüse: Obst. 2. Auflage. Weil der Stadt: Hädecke, 2002
Merle, J.; Montville, T.: Alicyclobacillus Acidoterrestris: The Organism, the Challenge, Potential Interventions. Journal of Food Processing and Preservation (2012), Nr 38, S 153-158
Munk, K. (Hrsg.): Grundstudium Biologie: Mikrobiologie. 1. Auflage. Berlin: Spektrum, 2001
Niemira, B.: Cold Plasma Decontamination of Foods. Annual Review of Food Science and Technology (2012), Nr. 3, S.125-142
Schröder, H.: Mikrobiologisches Praktikum, 1. Auflage. Berlin: Volk und Wissen, 1991
Wisotzkey, J.; Jurtshuk, P.; Fox, G.; Deinhard, G.; Poralla, K.: Comparative Sequence Analyses on the 16s rRNA (rDNA) of Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidotenestris, and
Bacillus cycloheptanicus and Proposal for Creation of a New Genus, Alicyclobacillus gen.
nov. International Journal of Systematic Bacteriology (1992), Nr. 42, S. 263-269
Yokota, A.; Fujii T.; Goto K. (Hrsg.): Alicyclobacillus: Thermophilic Acidophilic Bacilli. 1. Auflage. Tokyo: Springer, 2007
8 Verzeichnis der verwendeten Abbildungen und Tabellen Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Strukturformel Guaiacol (Yokota et al., 2007) ... 9
Abbildung 2 Erste Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma ... 16
Abbildung 3 Zweite Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma .. 17
Abbildung 4 Dritte Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma .... 18
Abbildung 5 Vierte Versuchsreihe zur Behandlung von A. acidoterrestris mit Kaltplasma ... 19
Abbildung 6 Durchschnittlicher prozentualer Anteil von A. acidoterrestris nach den einzelnen Behandlungszeiten mit Kaltplasma ... 20
Abbildung 7 Nativpräparat von A. acidoterrestris von einer YSG-Platte (400x Vergrößerung) ... 21
Abbildung 8 Gramfärbung von A. acidoterrestris ... 22
Abbildung 9 Gramfärbung von E. coli ... 22
Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Einfluss des pH-Wertes des Medium auf die Hitzeresistenz der Endosporen (Yokota et al. 2007) ... 8
Tabelle 2 Durchführung der Gramfärbung ... 15
Tabelle 3 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die erste Versuchsreihe ... 30
Tabelle 4 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die zweite Versuchsreihe ... 30
Tabelle 5 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die dritte Versuchsreihe ... 31
Tabelle 6 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die vierte Versuchsreihe ... 31
Tabelle 7 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der ersten Versuchsreihe ... 32
Tabelle 8 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der zweiten Versuchsreihe ... 32
Tabelle 9 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der dritten Versuchsreihe ... 32
Tabelle 10 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der vierten Versuchsreihe ... 32
Tabelle 11 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die erste Versuchsreihe ... 33
Tabelle 12 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die zweite Versuchsreihe ... 33
Tabelle 13 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten
Plasmabehandlungszeiten für die dritte Versuchsreihe ... 33 Tabelle 14 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten
Plasmabehandlungszeiten für die vierte Versuchsreihe ... 33 Tabelle 15 Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Plasmabehandlungen... 34
9 Anlagen
Tabelle 3 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die erste Versuchsreihe
Tabelle 4 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die zweite Versuchsreihe
10^0 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 veg. Zellen 425 12 0 0 0 0 Sporen 318 26 0 0 0 0 veg. Zellen 107 19 0 0 0 0 Sporen 141 25 0 0 0 0 veg. Zellen 19 0 0 0 0 0 Sporen 79 0 0 0 0 0 veg. Zellen 105 0 0 0 0 0 Sporen 104 0 0 0 0 0 veg. Zellen 80 0 0 0 0 0 Sporen 40 0 0 0 0 0 veg. Zellen 4 0 0 0 0 0 Sporen 0 0 0 0 0 0 veg. Zellen 50 0 0 0 0 0 Sporen 0 0 0 0 0 0 30
Ausgezählte Kolonien bei der entsprechenden Verdünnungsstufe Zeit [min] Erscheinungsform
0 1 2 5 10 20 10^0 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5 veg. Zellen 480 121 6 2 0 0 Sporen 440 40 3 0 0 0 veg. Zellen 48 29 0 0 0 0 Sporen 61 2 0 0 0 0 veg. Zellen 31 28 12 0 0 0 Sporen 47 12 0 0 0 0 veg. Zellen 62 4 0 0 0 0 Sporen 45 5 0 0 0 0 veg. Zellen 4 0 0 0 0 0 Sporen 2 0 0 0 0 0 veg. Zellen 2 0 0 0 0 0 Sporen 0 0 0 0 0 0 veg. Zellen 0 0 0 0 0 0 Sporen 0 0 0 0 0 0 20 30
Zeit [min] Erscheinungsform Ausgezählte Kolonien bei der entsprechenden Verdünnungsstufe
0
1
2
5
Tabelle 5 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die dritte Versuchsreihe
n.a. nicht auszählbar
Tabelle 6 Ausgezählte Kolonien von A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die vierte Versuchsreihe
n.a. nicht auszählbar
10^0 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5
veg. Zellen n.a. 253 50 11 0 0
Sporen n.a. 290 65 19 0 0
veg. Zellen n.a. 272 0 0 0 0
Sporen n.a. 228 0 0 0 0 veg. Zellen 286 61 0 0 0 0 Sporen 164 5 0 0 0 0 veg. Zellen 303 81 0 0 0 0 Sporen 94 6 0 0 0 0 veg. Zellen 264 121 0 0 0 0 Sporen 243 0 0 0 0 0 veg. Zellen 189 0 0 0 0 0 Sporen 21 0 0 0 0 0 veg. Zellen 33 0 0 0 0 0 Sporen 29 0 0 0 0 0
Zeit [min] Erscheinungsform Ausgezählte Kolonien bei der entsprechenden Verdünnungsstufe
0 2 5 1 10 20 30 10^0 10^1 10^2 10^3 10^4 10^5
veg. Zellen n.a. 650 38 2 0 0
Sporen n.a. 113 75 1 0 0 veg. Zellen 563 8 2 0 0 0 Sporen 464 25 2 0 0 0 veg. Zellen 496 23 3 0 0 0 Sporen 291 8 0 0 0 0 veg. Zellen 452 69 0 0 0 0 Sporen 259 41 32 0 0 0 veg. Zellen 263 8 2 0 0 0 Sporen 27 0 0 0 0 0 veg. Zellen 38 0 0 0 0 0 Sporen 0 0 0 0 0 0 veg. Zellen 2 0 0 0 0 0 Sporen 0 0 0 0 0 0
Ausgezählte Kolonien bei der entsprechenden Verdünnungsstufe
0
30
Zeit [min] Erscheinungsform
1
2
5
10
Tabelle 7 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der ersten Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [KbE/ml]
Sporen [KbE/ml] 0 3,97*103 3,12*103 1 1,14*10³ 1,5*10³ 2 1,9*10² 7,9*10² 5 1,05*10³ 1,04*10³ 10 8*10² 4,1*10² 20 4*101 <10 30 5*101 <10
Tabelle 8 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der zweiten Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [KbE/ml]
Sporen [KbE/ml] 0 5,48*10³ 4,35*10³ 1 7*10² 5,7*10² 2 6,4*10² 5,4*10² 5 6*10² 4,5*10² 10 4*101 2*101 20 2*101 <10 30 <10 <10
Tabelle 9 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der dritten Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [KbE/ml]
Sporen [KbE/ml] 0 2,83*104 3,4*104 1 2,72*104 2,28*104 2 4,06*10³ 1,54*10³ 5 3,49*10³ 1*10³ 10 3,5*10³ 2,43*10³ 20 1,89*10³ 2,1*10² 30 3,3*10² 2,9*10²
Tabelle 10 Errechnete KbE/ml für die Plasmabehandlung der vierten Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [KbE/ml]
Sporen [KbE/ml] 0 6,21*10^4 1,7*10^4 1 5,16*10³ 4,42*10³ 2 4,7*10³ 2,72*10³ 5 4,73*10³ 3*10³ 10 2,46*10³ 2,7*10² 20 3,8*10² <10 30 2*10^1 <10
Tabelle 11 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die erste Versuchsreihe
Tabelle 12 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die zweite Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
1 12,77 13,10 2 11,68 12,41 5 10,95 10,34 10 0,73 0,46 20 0,36 -30 -
-Tabelle 13 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die dritte Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
1 96,11 67,06 2 14,35 4,53 5 12,33 2,94 10 12,37 7,15 20 6,68 0,62 30 1,17 0,85
Tabelle 14 Prozentualer Anteil vorhandener A. acidoterrestris nach festgelegten Plasmabehandlungszeiten für die vierte Versuchsreihe
Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
1 8,31 26,00 2 7,57 16,00 5 7,62 17,65 10 3,96 1,59 20 0,61 -30 0,03
-Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
1 31,74 53,21 2 4,79 25,32 5 26,45 33,33 10 20,15 13,14 20 1,01 -30 1,26
-Tabelle 15 Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Plasmabehandlungen
Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%] Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
1,00 31,74 53,21 2,00 4,79 25,32 1,00 12,77 13,10 2,00 11,68 12,41 1,00 96,11 67,06 2,00 14,35 4,53 1,00 8,31 26,00 2,00 7,57 16,00 Mittelwert 37,23 39,84 Mittelwert 9,59 14,57 Standardabweichung 40,55 24,67 Standardabweichung 4,25 8,62
Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%] Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
5,00 26,45 33,33 10,00 20,15 13,14 5,00 10,95 10,34 10,00 0,73 0,46 5,00 12,33 2,94 10,00 12,37 7,15 5,00 7,62 17,65 10,00 3,96 1,59 Mittelwert 14,34 16,07 Mittelwert 9,30 5,58 Standardabweichung 8,31 12,98 Standardabweichung 8,74 5,82
Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%] Zeit [min] Vegetative Zellen [%] Sporen [%]
20,00 1,01 - 30,00 1,26 -20,00 0,36 - 30,00 - -20,00 6,68 0,62 30,00 1,17 0,85 20,00 0,61 - 30,00 0,03 -Mittelwert 2,17 - Mittelwert 0,82 -Standardabweichung 3,02 - Standardabweichung 0,68
-Erklärung über die selbstständige Anfertigung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Ich erkläre weiterhin, dass die abgegebene elektronische Fassung mit der eingereichten Arbeit identisch ist.
_________________________ ________________________