Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.
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(2) 82. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. Stoff hatte noch die meisten Eiweißreaktionen. Die Autoren geben ferner an, das Hypertensin im Urin von Arteriosklerotikern vermißt zu haben. In den Vorschriften von Abelous und Bardier ist einiges befremdlich. So wird z. B. das Urohypertensin bei niederer Temperatur getrocknet, aber in kochendem Wasser gelöst. Eindampfen und Konzentrieren der Ausgangslösungen nehmen sie ebenfalls bei einer Temperatur vor, die für viele biologische Stoffe gefährlich ist. Wir sind dennoch nach ihren Vorschriften vorgegangen. Es gelang uns aber nur die Darstellung des den Blutdruck erniedrigenden Stoffes. Nun haben vor 4 Jahren Kraut und Prey1) in einer Reihe von Arbeiten interessante Ergebnisse veröffentlicht. Es gelang ihnen, aus dem Urin einen Stoff zu erhalten, der sich durch große Reinheit und große Konstanz der Wirkung auszeichnete. Ihre Substanz übt eine blutdrucksenkende Wirkung aus bei gleichzeitiger Amplitudenvergrößerung. Diese Wirkung steht in einer absoluten zahlenmäßigen Abhängigkeit der eingespritzten Stoffmenge derart, daß 0,1 mg den Effekt von 5 ccm Harn haben. Der Stoff gibt außer der Millonschen Probe keine Eiweißreaktionen, ist durch Schwermetallsalze, durch Pikrinsäure, Phosphorwolframsäure fällbar. Die Autoren konnten ferner nachweisen, daß es sich nicht um Histamin und nicht um Cholin handelt. Auch von der Wirkung des Hypophysins war der Effekt verschieden. Kraut und Frey halten ihren Stoff für ein Kreislaufhormon, das sie auf kompliziertem Wege auch im Blute nachweisen konnten. Über Giftwirkungen dieser Substanz wurden wenig Versuche angestellt.. Wir haben nach den Angaben der beiden Autoren Urin von gesunden Menschen verarbeitet und die Ergebnisse in allem bestätigen können. Eine besondere Giftigkeit für weiße Mäuse und Kaninchen fanden wir nicht. Aus Schrumpfnierenharn war eine solche blutdruckbeeinflussende Substanz nicht darstellbar. In unseren eigenen Versuchen schien uns die Tierkohlenadsorption am aussichtsreichsten. Es war längst bekannt, daß man durch Schütteln mit Tierkohle den Urin von den meisten organischen Stoffen befreien kann, daß Zucker, Harnstoff u&d Salze aber als leicht löslich zurückbleiben. Es mußte nur ein Weg gefunden werden, auf schonendste Art die adsorbierten Stoffe wieder abzulösen. Hohe Temperaturen sollten vermieden werden, weil ein Teil der komplizierteren organischen Stoffe sich bei der großen Oberflächenaktivität der Tierkohle sicher verändert hätte. Wir gingen von der Vorstellung aus, daß die Adsorption aus so zahlreichen Gemischen, wie sie Harnlösungen darstellen, verschiedenen Kräften zuzuschreiben seien, chemischen und physikalischen (Lösungsvermögen, Ladung). Es war also bei der Umkehrung der Adsorption, der Elution notwendig, auf diese Faktoren Rücksicht zu nehmen. Wir nahmen (K.) ein Lösungsmittel, das erfahrungsDiese Z. 157, 32 (1926); Arch. f. exper. Path. 138, l (1928).. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(3) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 83. gemäß eine große Anzahl organischer Stoffe gut löst und beeinflußten seine Ladung durch Zusatz von Säure. Nach mannigfachen Versuchen erwies sich der 80—85°/0ige Alkohol mit einem Zusatz von 0,5% reiner Salzsäure als am besten geeignet. Der Zusatz anderer Säuren oder die Wahl anderer Alkoholkonzentrationen war nicht so günstig. Elution in alkalischer Lösung war nicht möglich. Ebenso waren die Erfolge mit Kaolin so schlecht, daß es als konkurrenzfähiges Material nicht in Betracht kam. Wir haben ferner versucht, mit Aluminiumgelen nach Willstätter und Kraut 1 ) mit Gelen von Yttrium- und Lanthanhydroxyd nach Kleeberg 2 ) ergiebige Adsorptionen zu erzwingen, aber ebenfalls ohne Effekt. Endlich erwiesen sich die von Willstätter und Kraut 3 ) bei ihren Fermentuntersuchungen mit so großem Erfolg entwickelten Methoden der Voradsorption, der Adsorption aus verdünnten Lösungen usw. hier als nicht ergiebiger. Wir gingen im Prinzip also stets so vor, daß wir den frischen, filtrierten Mischurin gesunder und kranker Personen mit Tierkohle erschöpfend adsorbierten, bis er völlig farblos war. Die Tierkohle wurde dann ausgewaschen, durch mehrstündiges Stehenlassen und häufiges Schütteln mit salzsaurem Alkohol eluiert und das Eluat im Vakuum eingedampft. Bevor die Eindickung bis zur Sirupdicke geschehen war, wurde bei mäßig dickflüssiger Kppstenz mit Natronlauge bis noch zur schwach lackmussauren Sektion versetzt und durch Ausfrierenlassen oder kurze Dialyse Sir größte Teil der noch vorhandenen Salze entfernt. Nach der ersten Tierkohlenadsorption haben wir in den Fällen, wo das Filtrat in dicker Schicht noch eine Gelbfärbung zeigte, mit einer geringeren Kohlenmenge eine Nachadsorption vorgenommen und beide Kohlenanteile vereinigt. Die mit den verschiedenen Anteilen beladene Kohle muß vor der Elution ausgewaschen werden, damit nicht Substanzen, die rein mechanisch zurückgehalten wurden, Nebenwirkungen entfalten, und damit wirklich der überwiegendste Teil von Harnstoff und von Salzen in die Waschflüssigkeit übergeht. Die Tier kohle selbst stammte von Merck. Man bezieht zweckmäßigerweise gleich ein großes Quantum, um für die Dauer seiner Versuche ein Präparat gleichmäßiger Beschaffenheit zu haben. !) Ber. ehem. Ges. 56, I, 149; II, 1117 (1923); 57, III, 58 (1924). 2 ) Z. Kolloidf. 37, 17 (1925); 38, 226 (1926). 8 ) Untersuchungen über die Adsorption von Enzymen. Stuttgart 1925 (Habilit.-Schrift). 6*. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(4) 84. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. Die Harne stammten von Gesunden und von Schrumpfnierenkranken. Personen (Frauen und Männer), die kein besonderes Leiden hatten, keine Medikamente bekamen, tranken am Abend zwei Becher leichten Tee oder Mineralwasser. Es wurde dann der Harn der Nacht und des Morgens gesammelt und nach Filtrieren sogleich verarbeitet. Nur den Schrumpfnierenurin, der ja nur in geringerem Ausmaß zu erhalten ist, haben wir einige Tage lang unter Toluolzusatz angesammelt und dann erst verarbeitet. Die durch Adsorption und Blution erhaltenen Präparate waren von Sirupdicke, tief braun, von einem durchdringenden aromatischen Geruch und in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung gut löslich. Sie gaben die Phenolreaktion nach Folin, gaben keine Eeaktion mit Millons Reagens, keine Biuretreaktion. Die Extrakte waren in Alkohol absolut, in Chloroform, in Äther, Eisessig, Amylalkohol unlöslich. Extrakte aus Schrumpfnierenharn waren wesentlich heller gefärbt und rochen weniger stark. Über die Entstehung der hellen Harnfarbe bei Schrumpfnieren hat E. Becher 1 ) ebenfalls an dieser Klinik in den letzten Jahren eine Eeihe schöner Versuche angestellt. Diese Extrakte wurden einmal als solche benutzt, dann wurden sie als Ausgangsmaterial genommen, um aus ihnen als den konzentrierten Urinmengen Harnfarbstoffe abzusondern, die von Abelous und Bardier beschriebenen Substanzen herzustellen und das Kreislaufhormon von Kraut und Frey zu isolieren usw. Endlich haben wir aus den Extrakten, aber auch aus dem Urin selbst, Aminosäuren darzustellen versucht, nach Embden und Reese 2 ), mit /9-Naphthalinsulfochlorid und ferner biogene Amine nach Vorschriften von Guggenheim 8 ) und Drexel. 4 ) An Wirkungen wurde die Giftigkeit für Mäuse, Kaninchen, Hunde geprüft und die Veränderung des Blutdrucks. Bei den Untersuchungen über die Toxicität wurden nur akute, höchstens 2 Tage dauernde Versuche gemacht. Die Blutdruckexperimente wurden so vorgenommen, daß gesunden Hunden in Urethan-Morphiumnarkose die Carotis und Jugularis freigelegt wurden. In beide Gefäße wurden Kanülen eingebunden, von denen die eine zur intravenösen Injektion diente, die andere mit Hilfe eines gabelförmigen Glasstücks ein Quecksilbermanometer und den Hy r t Ischen Blutdruckmesser speiste. Um ein Maß für die Wirkung der zu injizierenden Extrakte zu haben, wurden zu Beginn jeden Versuchs 5 ccm normalen Mischurins eingespritzt, ,1) Dtsch. Arch. f. Klin. Med. 148, 46 (1925); Verhandl. d. dtsch. Ges. f. innere Med. XL. Kongreß Wiesbaden, S. 637 (1928). 2 ) Beitr. z. ehem. Phys. u. Pathol. 7, 411 (1906). 8 ) Die biogenen Amine. Springer. 2. Aufl. 4 ) Zit. von Guggenheim.. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(5) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 85. dessen Effekt in überaus typischer Weise als Blutdrucksenkung mit nachfolgender Amplitudenvergrößerung zu erkennen war. Kraut und JFrey, von denen wir diese Standardmethode übernommen haben, weisen mit Recht auf die Konstanz dieser Erscheinung hin. Wir können ihnen auch darin beistimmen, daß die quantitativen Unterschiede der Ausschläge vom Alter der Hunde abhängen. Die Extrakte selbst wurden stets in gleichen Mengen (5—10 ccm), in gleichen Geschwindigkeiten eingespritzt. Alle Versuche wurden so oft wiederholt, bis sie einwandfrei reproduzierbar waren.. Spritzten wir Hunden im blutigen Blutdruckversuch l ccm eines Tierkohlenextraktes in die Vene, so traten regelmäßig Blutdrucksenkung und Amplitudenvergrößerung auf. Das Ausmaß dieser Veränderungen schwankte bei den einzelnen Tieren etwas nach dem Alter, auch wohl nach der Darstellung der Präparate, zwischen 15 und 60% für den Blutdruck und zwischen 20 und 300% bei der Amplitude. Katzen reagierten stärker als Hunde, junge Tiere stärker als ältere. Die Ausschläge bei ein und demselben Tiere mit dem gleichen Präparat waren durchaus abhängig von der eingespritzten Menge, so, daß 2 ccm den doppelten Effekt hatten wie l ccm. Dagegen war über ein gewisses Maß hinaus eine Steigerung des Effektes nicht möglich, ohne daß schwere Giftwirkungen auf Kreislauf und Atmung sich zeigten. Die Effekte waren die nämlichen bei Durchschneidung beider Vagusnerven. Alle von gesunden Menschen stammenden Urine zeigten die beschriebene Erscheinung. Es gab nur eine einzige Ausnahme und das war der Urin von Schrumpfnierenkranken. Wie die abgebildeten Kurven zeigen, verändert sich der Blutdruck durch Schrumpfnierenextrakte gar nicht und die Amplitude kaum. Die dargestellte Aminosäurefraktion und der Anteil der biogenen Amine ergab keinen eindeutigen Effekt auf den Kreislauf. Von den Soxhletextrakten waren die mit Eisessig und Alkohol von starker Wirkung. Der Eisessigextrakt hatte eine Blutdrucksenkung von 30% und eine Amplitudenvergrößerung von 100%, der Alkoholextrakt eine Blutdrucksenkung von 55% und eine Amplitudenvergrößerung von 175%. Wir haben die Stoffe auch intraduodenal einverleibt, ohne daß selbst bei halbstündigem Zuwarten nach jeder Instillation irgendein Effekt auf den Kreislauf zu konstatieren war. Wenn auch von vornherein wenig wahrscheinlich war, daß sich diese Mischung von Stoffen in allem so verhalten würde, wie die stark gereinigten Substanzen von Kraut und Prey, so haben wir doch versucht, zu erfahren, ob Zusammenbringen mit Serum. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(6) 86. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. oder halbstündiges Kochen die Wirksamkeit verändere. Wie die Kurven ergeben, bleibt der Effekt auf Blutdruck und Amplitude nach solchen Prozeduren aber unverändert. Die Giftigkeit aller Substanzen wurde an Kaninchen und Mäusen, zum Teil an Hunden geprüft. Der Extrakt nach Kraut und Frey erwies sich selbst in beträchtlichen Mengen als ungiftig. Ebenso waren die durch Soxhletextraktion gewonnenen Substanzen ungiftig in Dosen, die das Urindeputat von 24 Stunden für die betreffende Tierart um ein Mehrfaches überstieg. Giftig war dagegen der durch Tierkohlenadsorption gewonnene Stoff. Bei der Beurteilung seiner Toxizität muß man zwischen dem akuten Versuch und einer Dauerwirkung unterscheiden. Durch intravenöse Injektion einer entsprechend großen Menge kann man einen 20 kg schweren Hund in Sekunden töten. Es scheint ein Vagustod zu sein, da der Blutdruck abstürzt, die Herzschlagfolge äußerst langsam wird und Speichelfluß eintritt. Verteilt man diese Giftmenge auf 3 oder 4 Tage, dann tritt außer einem leichten Erbrechen unmittelbar nach der Injektion keinerlei Wirkung auf. Bei der Maus waren intraperitoneale Gaben des Tierkohlenadsorbates tödlich, die etwa der 2—3 fachen Menge des für diese Tiere charakteristischen Urindeputates entsprach.. Experimenteller Teil. Die Substanzen nach Abelous und Bardier, wie die von Kraut und Frey wurden nach den Orginalvorschriften der Autoren hergestellt. Soweit Tonerdegele in Frage kamen, sind die Rezepte von Willstätter und Kraut benutzt. Wir gingen nun so vor, daß wir den meist leicht sauren Urin in großen Filtern filtrierten und dann mit Tierkohle schüttelten, 20—30 g Tierkohle pro Liter Harn l/2—l Stunde lang auf der Schüttelmaschine. Das Abnutschen der Aufschwemmungen gelang immer sehr schnell. War das Filtrat in größerer Schichtdicke noch gelblich, so wurde erneut mit 10 g Tierkohle pro Liter geschüttelt und die Tierkohlenrückstände vereinigt. Diese Tierkohlenquanten wurden mit reichlich destilliertem Wasser aufgeschwemmt und erneut auf der Nutsche abgesaugt. Läßt man noch etwa einige 10 Minuten Luft nachsaugen, dann ist die auf dem Filter verbliebene Tierkohlenmenge so trocken, daß man sie ohne Verluste in Stücke brechen kann. Man gibt nun 80%igen Alkohol mit 0,5% Zusatz reiner Salzsäure (36°/0) hinzu und zwar auf 100 g Tierkohle etwa 3/4 Liter, läßt mehrere Stunden, am besten über Nacht stehen, schüttelt. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(7) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 87. einige Male gut um und saugt erneut ab. Das klare Filtrat wird vorsichtig mit NaOH bis zu schwach lackmussaurer Eeaktion versetzt, im Vakuum auf etwa l/Q bis 1/ des Volumens eingedampft, auf 0° abgekühlt, und, falls Salze auskrystallisiert sind, abgenutscht. Das Piltrat wird dann endgültig bis höchstens 40° im Vakuum bis zur Sirupdicke eingedampft. Beispiel l: Verarbeitung von 125 Liter Urin. 6 Flaschen zu 20 Liter werden mit je 200—250 g TierkoMe beschickt und eine Viertelstunde geschüttelt. Es wird in großen Nutschen abgesaugt und dieselbe Prozedur der Adsorption mit je 100 g Tierkohle wiederholt. Die Kohlerückstände werden vereinigt, in 5 Liter Wasser aufgeschwemmt und erneut abgenutscht. Nunmehr wird der gesamte Kohlerückstand mit 3 Liter salzsaurem Alkohol übergössen und unter gelegentlichem Schütteln mehrere Stunden stehen gelassen. Es wird auf der Nutsche abgesaugt und der Kohlerückstand über Nacht nochmals mit 1V2—2 Liter salzsaurem Alkohol eluiert. Das filtrierte Eluat wird bei 35° im Vakuum abgedampft und tropfenweise mit 30%iger Natronlauge bis zur schwach sauren Reaktion versetzt. Es resultieren 250 g eines tiefbraunen, sirupösen, stark riechenden Extraktes. Beispiel 2: 5 Liter Urin wurden filtriert, 100 g Tierkohle zugesetzt und in einer gut verschlossenen Flasche 15 Minuten lang geschüttelt. Hierauf wurde die Kohle abfiltriert und das noch schwach gelblich gefärbte Filtrat nochmals mit 50 g Tierkohle 15 Minuten lang geschüttelt und filtriert. Die beiden Kohlerückstände wurden vereinigt mit 2 Liter destillierten Wassers gewaschen, in eine Flasche gebracht, 500 ccm Salzsäure-Alkohol zugesetzt (95°/0iges Äthanol mit 2% Salzsäure), l Stunde lang eluiert und während dieser Zeit mehrmals geschüttelt. Die Kohle wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum auf 25 ccm eingeengt, mit verdünnter Natronlauge bis zur schwach sauren Reaktion versetzt und 20 ccm davon 5 Stunden im fließenden Wasser dialysiert.. Vor dem Dialysieren zeigte das Präparat einen Gehalt von 10,15 mg Kochsalz pro Kubikzentimeter, nach dem Dialysieren 4,5mg. Die mit diesen Extrakten erzielten Blutdruckkurven sind sehr anschaulich und stimmen qualitativ ganz mit denen überein, die man durch intravenöse Injektion von Urin selbst erhält. Man sieht deutlich die Senkung des Blutdrucks und die Vergrößerung der Amplitude. Darstellung der biogenen Amine. Die Ausgangslösungen, entweder Urin oder wäßrige Lösungen des Tierkohleneluates, wurden mit Bleiacetat versetzt, filtriert und das überschüssige Blei durch Einleiten von Schwefelwasserstoff entfernt. Der überschüssige Schwefelwasserstoff wurde durch langes Luft durchblasen vertrieben. Die Flüssigkeit wurde nun bis zur Sirupdicke eingedampft und mit Methylalkohol aufgenommen. Die eigentliche Ausfällung geschah jetzt weiter nach Drexel mit Phosphor-. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(8) 88. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. wolframsäure in 3%iger schwefelsaurer Lösung. Man läßt 24 Stunden stehen, filtriert, wäscht gut aus und zerlegt die Wolframate mit feingepulvertem Barythydrat. Das überschüssige Barium entfernt man durch Einleiten von Kohlensäure. Injektionen von dieser Lösung waren ohne Einfluß auf den Blutdruck und die Amplitude. Versuche mit Urinfarhstoffen. Das Urobilin in reinster Form verdanken wir der Liebenswürdigkeit von Herrn Professor Hans Fischer in München. Das Urochrom wurde einmal nach Klemperer 1 ), dann nach Hohlweg, Salomonsen und Manzini 2 ) dargestellt. In beiden Fällen, sowohl mit frischem Urin, wie mit wäßrigen Lösungen des Tierkohleneluates als Ausgangsmaterial. Die Injektion eines der beiden Farbstoffe oder auch beider zusammen war wirkungslos auf Blutdruck und Amplitude. 2. Die Bedeutung des Guanidins für die Urämie und den Hochdruck. Es wurde in der Einleitung schon auf zwei Wege hingewiesen, um der Frage nach der Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen näher zu kommen, und wir haben über die Experimente mit Urin berichtet. Im folgenden wollen wir nun die Erfolge einer zweiten Ärbeitsrichtung schildern, ausgehend von der Anschauung, daß abnorme Stoffwechselprodukte und ihre Anhäufung im Blute zur Urämie führen könnten. Hier lag nahe, von klinischen Beobachtungen auszugehen. Kleeberg 3 ) hatte gefunden, daß bei längerer Darreichung von Synthalin bei manchen Personen Symptome auftreten, die denen der Präurämie recht ähnlich sind. Man konnte feststellen: Dyspepsie, Achlorhydrie, Erbrechen, Durchfälle, Kopfschmerz und bisweilen Zunahme des Blutharnstoffgehaltes. Frank, der Entdecker des Synthalins, hat mit seinen Mitarbeitern N o t h m a n n und Wagner 4 ) einen großen Teil dieser Vergiftungserscheinungen schon beschrieben und versucht, im Synthalin B ein weniger gefährliches Präparat zu schaffen.4) Es gibt zahlreiche Arbeiten über die Giftwirkungen des Guanidins. Gerade Prank 6 ) und seine Schüler [Stern und Nothmann 6 )] haben umfangx. ) Berl. Klin. Woch. Nr. 14, S. 313 (1903). ) Biochem. Z. 13, 199 (1908). 8 ) Z. Hin. Med. (1930). 4 ) Klin. Woch. Nr. 45, S. 2100 (1926); Dtsch. med. Woch. Nr. 49, S. 2067 (1926); Nr. 50, S. 2107 (1926). 5 ) Frank, Stern u. Nothmann, Z. ges. exp. Med. 24, 341 (1921). 6 ) Frank u. Stern, Arch. f. exper. Path. 90, 168 (1921). 2. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(9) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 89. reiche Studien darüber angestellt. Sie finden, daß Dimethylguanidin viel giftiger als das einfache Guanidin ist und halten das durch die erstere Substanz verursachte Krankheitsbild der Tetanie ähnlicher als die durch das methylierte Guanidin hervorgerufene Vergiftung. Heyde1) hält das Methylgoanidin für das Toxin des anaphylaktischen Schocks. Aus den Experimenten von Watanabe 2 ) geht hervor, daß bei der Guanidinvergiftung sich eine Herabsetzung des Gehaltes an Calcium und Zucker im Blute findet, eine Vermehrung des Phosphates, vermehrte Ammoniakausscheidung und verminderte Acidosis des Urins. Die übrige große Literatur sei hier weiter nicht angeführt.3) Nun hat Major 4 ) die letzten Jahre Untersuchungen experimentaler Art angestellt, um einen Einfluß zwischen Guanidin und Blutdruck festzustellen und hat mit Weber 5 ) zusammen eine Methode ausgearbeitet, den Guanidingehalt des Blutes gesunder Menschen und Hochdruckkranker zu messen. Die Methode lehnt sich an den Nachweis von Weyl mit Nitroprussidnatrium an. Tiegs, ferner Marston und auch Pfiffner und Meyers 6 ) haben mehrere Modifikationen dieser Methode zum Guanidinnachweis angegeben. Mit ihrer Methode haben Major und Weber eine ganze Anzahl von gesunden Menschen untersucht und einen gewissen Mittelwert von Guanidin im Blute gefunden.. Wir haben genau nach dieser Vorschrift gearbeitet. Aber wir haben uns gefragt, ob außer Kreatin und Kreatinin, welche von Major und Weber schon selbst berücksichtigt werden, andere im Blut vorhandene und mögliche Guanidinverbindungen die Farbreaktion nicht stören können. Weber gibt schon an, daß Dimethylguanidin auch eine solche Reaktion gibt, aber nur 2/3 so stark wie reines Guanidin und Monomethylguanidin. Wir fragten uns vor allem, ob der Guanidinkern durch Ersatz einzelner Atome nicht so geändert werde, daß die neue Verbindung eine andere Farbtiefe gäbe, obwohl die neue Substanz bei entsprechender Konzentration den gleichen Anteil an reinem Guanidin enthält. Wir prüften Guanidincarbonat, Argininsulfat, Methylguanidin, asymmetrisches Dimethylguanidin und Guanidinessigsäure.7) Alle Lösungen waren so hergestellt, daß in l ccm l mg Guanidin ent*) Zbl. f. Physiol. 25, 401 (1911); 2 , 441 (1912). 2 ) J. of biol. Chem. 33, 43, 36. 8 ) Vgl. Guggenheim, „Die biogenen Amine". 4 ) Amer. journ. of the Med. Sciens. 170, 228 (1925). 6 ) Bull, of John Hopkins Hosp. 40, 287 (1927); 42, 207 (1927); Arch, of internat. med. 40, 891 (1927). 6 ) Ausführlichere Lit. vgl. Kleeberg, Z. ges. exp. Med. (1930). 7 ) Die Präparate stammten von der Firma Schering-Kahlbaum, der wir an dieser Stelle unsern ergebensten Dank aussprechen.. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(10) 90. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. halten war. Diese Lösungen wurden genau so behandelt, wie die Major sehe Vorschrift der Guanidinbestimmung im Blute lautet. Bei der Ablesung der Colorimeterwerte ergab sich (von zwei Untersuchern unabhängig bestimmt), daß Guanidincarbonat und Methylguanidin sich fast gleich verhalten, aber Dimethylguanidin, Arginin und Guanidinessigsäure ungefähr die doppelten Colorimeterwerte geben. D. h. mit anderen Worten: dieselbe Konzentration der verschiedenen Guanidinverbindungen, berechnet auf reines Guanidin in mg-°/0, gibt verschiedene Farbtiefe. Es ist demnach nicht ohne weiteres möglich, nach der von M a j o r und Weber angegebenen Methode aus der Veränderung der Parbtiefe der Nitroprussidlösung auf eine Konzentrationsänderung der zu prüfenden Guanidinlösung zu schließen. Vielmehr kann die Änderung der Farbe auch abhängig sein von der Änderung des chemischen JBaues des Guanidinmoleküls ohne Veränderung der Menge des reinen Guanidinkernes. Major und Weber selber sagen übrigens zum Schluß ihrer einen Arbeit, daß sie nicht behaupten, einen Beweis dafür zu haben, daß die Farbreaktion im Blute allein durch Guanidin verursacht ist. Aber die Eeaktion sei eben durch Guanidin tatsächlich gegeben und dieser Stoff sei eine blutdruckerhöhende Substanz. Wir haben trotz der theoretischen Bedenken und auch experimenteller Belege gegen diese Eeaktion von Major und Weber nach ihrer Methode eine Anzahl von Patienten untersucht und die Resultate in zwei Tabellen zusammengestellt. Aus den Tabellen geht hervor, daß tatsächlich bei einer Anzahl von Menschen mit hohem Blutdruck die Guanidinwerte erhöht waren. Die absoluten Zahlen stimmen nicht mit den von Maj or und Weber angegebenen überein. Wir glauben, daß es daran liegt, daß wir mit dem Keil von A u t h e n r i e t h gemessen, während die Amerikaner den Pubosq genommen haben. Im nachfolgenden wollen wir eine Tabelle von Major inhaltsmäßig in verkürzter Form wiedergeben. U. U. Kreatinin Guanidin. ER. 2—5 1,1-2,0 0,1—0,3 110/180—160/100 35 Normale . . 26—40 35 Hypertonien . 30—315 3,0-2,4 1,2—10,0 0,3-2,3 156/110-250/245 12Fällem.Gkian.Erhöhung . . 60—315 5—9 5,10 0,35—2,3 180/160—250/145. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(11) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 91. In dieser Tabelle fehlen die Werte für Cholesterin, für Indican und Xanthoprotein, Substanzen, die in einer bestimmten Abhängigkeit oder zumindesten Zusammengehörigkeit zu Guanidinwerten stehen. Das wird aus der Tabelle hervorgehen, die unsere eigenen Untersuchungen wiedergibt. + U. 30 Normale . . 23—50. U 2-5. Xantho. Indik. Cholest. Kreat.. 0. 0. 100—145. RR. Guan.. 0,4. 0,3—0,5 100/60— 150/90 20 Hypertonien . 33—346 2,4—17 0- + + 0-4-4- 120—285 0,4—0,5 0,6—1,0 175/90— 250/110 12Fällem.Guan.- 60—315 4,5—17 0-4- + 0-4-4- 140—285 0,5 0,7-1,0 175/90— Erhöhung . . 250/110. Aus unserer Tabelle geht hervor, daß, qualitativ betrachtet, auch hier ein großer Teil von Hypertonikern erhöhte Guanidinwerte zeigt. Aber bei genauerem Hinsehen ergibt sich doch, daß von 18 Hypertonikern sechs keine erhöhten Guanidinwerte hatten, und daß umgekehrt 4 Patienten mit beträchtlichen Guanidinmengen keinen Hochdruck hatten [die ausführlichen Tabellen siehe dazu Kleeberg 1 )]. Es geht ferner aus den Untersuchungen hervor, daß stets, wenn das Guanidin wesentlich erhöht ist, auch andere Substanzen in vermehrter Menge sich finden, fast immer Harnstoff und Harnsäure, meistens auch Xanthoprotein und Indican. Wir hatten einen Fall von Kleesalzvergiftung, dessen Blutwerte so wichtig sind, daß wir sie einzeln nennen wollen. Bl. 55 Jahre, Blutdruck 120/40(1), Harnstoff 378 mg-%, Indican +++, Xanthoprotein H—K Guanidin 1,07. Es ist das also einer jener wichtigen Fälle, die zeigen, daß zwischen Guanidin und Blutdruck kein einfacher kausaler Zusammenhang zu bestehen braucht. Dabei war nicht etwa eine schwere Kreislaufinsuffizienz vorhanden. Auffallend ist in gleichem Sinne, daß diejenigen Zuckerkranken, die hohe Cholesterinwerte besitzen, auch hohe Guanidinwerte hatten, unabhängig von der Höhe des Blutdrucks. Nun hat Major als weiteren Beweis für seine Theorie Tierexperimente gemacht, bei denen er durch Injektion verschiedener Guanidinverbindungen Blutdruckerhöhungen feststellt. Auch durch Instillation in das Duodenum erhielt er das gleiche Resultat. In den Experimenten von Herxheimer 2 ) und seiner Schüler er1. ) A. a. O. ) Klin. Woch. , 2268 (1927).. 2. \. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(12) 92. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. gaben sich in dieser Hinsicht negative Resultate, wenn Kaninchen genommen wurden. Auch hier haben wir den experimentellen Weg beschritten und an Katzen und Hunden die Major sehen Versuche nachgemacht. Bei Katzen erhält man je nach der Guanidinverbindung und der Konzentration wechselnde Eesultate und nie sehr gröBe Ausschläge. Was die Hundeversuche anlangt, so war bei alten Hunden mit einem hohen Anfangsblutdruck bei kleinen und mittleren Gaben von Guanidin und seinen Derivaten ebenfalls keine konstante Blutdruckerhöhung zu erzielen. Es gelang dagegen bei jungen Hunden, z. B. mit Dimethyl-Guanidin den Blutdruck zu steigern. Major gibt an, einen gleichen Effekt auch erzielt zu haben, wenn er Guanidin ins Duodenum eingoß. Uns ist das nicht gelungen. Unsere Eesultate weichen auch insofern von denen der Amerikaner ab, als wir meistens erst bei größeren Konzentrationen von intravenös injizierten Guanidinverbindungen Blutdruckerhöhungen fanden, während Major schon Hypertonien hervorrufen konnte mit Quantitäten, die den Normalwert beim Hund nur um das Doppelte überstiegen. Wir haben nunmehr die Frage untersucht, ob im enteiweißten Blute von Gesunden oder von Nierenkranken oder von Menschen mit hohem Blutdruck Stoffe wären, die den Blutdruck im Experiment irgendwie beeinflussen könnten. Wir haben verhältnismäßig große Mengen benutzt, 2—500 ccm. Wir verarbeiteten diese Quantitäten genau so, wie es Major und Weber in ihrer Vorschrift angeben, nur daß wir das schließlich übrigbleibende Produkt nicht zur Anstellung der Nitroprussidreaktion benutzten, sondern zum blutigen Blutdruckversuch. Es gab keine Blutdruckerhöhung. Ebensowenig hatten wir Erfolg mit den Rückständen, die nach Enteiweißungen mit Alkohol oder Trichloressigsäure angestellt wurden. Die meist auftretenden geringen Senkungen (siehe Kurve) sind als Effekt hypertonischer Injektionen in die Blutbahn zu deuten. Endlich verwandten wir die uns im ersten Teile unserer Arbeit so erfolgreiche Tierkohlenadsorption. Niemals war ein Blutdruck erhöhender Effekt zu sehen, in einigen Fällen fanden wir eine geringe Blutdrucksenkung. In 4 Fällen haben wir Blut nach der Enteiweißung so behandelt, wie es Abelous und Bardier für ihr Urin-Urohypertensin angegeben haben; wir konnten aber niemals filtrierbare oder gar krystalline Eückstände erhalten. Da Kleeberg gerade beim Guanidinproblem von den klini-. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(13) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 93. sehen Beobachtungen bei der Synthalindarreichung ausgegangen war, so lag es nahe, ähnliche Experimente an Tieren zu machen. Wir nahmen 4 Hunde, die im ganzen 4 Monate lang im Versuch standen. Es wurden große Tiere gewählt und speziell Fleischfresser, die bei reichlicher Fleischkost gehalten wurden, weil hier Störungen des Eiweißstoffwechsels oder der Schlackenausfuhr durch die Niere am ehesten im Blutchemismus zu erkennen sein mußten. 2 Hunde erhielten täglich l g Guanidincarbonat, 2 andere Hunde täglich 30 mg Synthalin, die Sonntage wurde nichts gereicht. Vor dem Versuch wurden im Blute Harnstoff, Guanidin, Xanthoprotein und Indican bestimmt und diese Untersuchung alle 30 Tage wiederholt. Xanthoprotein und Indican blieben vom Anfang bis zum Ende der Versuchszeit negativ. Der Harnstoff der beiden mit Guanidincarbonat gefütterten Hunde stieg von 21 auf 56 mg-% bzw. von 24 auf 81. Die Harnstoff werte der beiden Synthalintiere kamen von 24 auf 139 bzw. von 24 auf 123. Die Guanidinzahlen aller 4 Tiere wiesen keine wesentlichen Änderungen auf. Alle Tiere verloren in den letzten Wochen an Stimmung, an Eßlust, wurden langsam und träge und bekamen struppiges Fell. Die wichtigen histologischen Befunde an den inneren Organen sind an anderer Stelle ausführlich geschildert.1) Kehren wir noch einmal zu der Problemstellung zurück. Major und Weber sehen im Guanidin eine blutdruckerhöhende Substanz. Freilich sagen sie in einer ihrer letzten Veröffentlichungen selber folgendes: „Das einzige positive Ergebnis, das wir geben können ist, daß gewisse Hypertoniker in ihrem Blute eine Verkehrung jener Stoffe haben, die dieselbe Farbe geben bei einer bestimmten Eeaktion wie Guanidin und gewisse chemische Eigenschaften haben wie jene, wie sie durch Guanidinbasen hervorgerufen werden können." Wir erwähnten dann kurz, daß Frank und seine Schüler große Unterschiede in der Art der Vergiftung fanden, je nach dem Präparat, das verwandt wurde. Aus Franks wie aus Watanabes Experimenten gingen auch schon Beziehungen zum Calciumstoffwechsel und zur Funktion der Epithelkörperchen hervor. An die Namen von Arnold und Gley, Brodd, Fühner, Watson und Burns 2 ) knüpfen sich Gedankengänge, daß Guanidin der Sensibilisator für Jas Adrenalin sei. Wenn wir diese Gedankengänge fremder Autoren, die Eesultate ihrer Untersuchungen und endlich unsere eigenen Ex*) Kleeberg, Z. Hin. Med. (1930) und a. a. 0. 2 ) Lit. vgl. Kleeberg a. a. 0.. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(14) 94. Julius Kleeberg und Wilhelm Schlapp,. perimente zusammenfassend betrachten, so muß gesagt werden., daß für irgendeine der Ansichten ein schlüssiger Beweis nicht existiert. Es wird in der Literatur zum Teil nicht auseinandergehalten, daß Tierart, Charakter der benutzten Guanidinverbindung, kurzfristige oder langdauernde Versuche von entscheidendem Einfluß auf die Resultate solcher Experimente sind. Gegen die Ansicht von M a j o r spricht, daß eine Anzahl von Menschen mit hohem Blutdruck keine Vermehrung von Guanidin zeigen, daß umgekehrt manche Fälle von schwerster Niereninsuffizienz ohne Blutdruckerhöhung hohe Guanidinwerte zeigen und endlich, daß die von ihm und seinen Mitarbeitern angegebene Eeaktion für Guanidin nicht spezifisch zu sein scheint. Freilich müssen auch wir einen gewissen blutdrucksteigernden Effekt unter besonderen Bedingungen zugeben, auch daß nach Guanidininjektionen nachfolgende Adrenalingaben wesentlich wirksamer waren. Die Möglichkeit also einer gegenseitigen Abhängigkeit im Sinne einer Empfindlichkeitssteigerung zwischen Guanidin und Adrenalin scheint zu bestehen. Andererseits erlauben die klinischen, chemischen und histologischen Befunde unserer eigenen Untersuchungen auch eine andere Deutung. Wir fanden in Fällen schwerster Niereninsuffizienz Guanidin erhöht, wenn gleichzeitig Harnstoff, Harnsäure, Xanthoprotein und Indican vermehrt waren. Wir konnten im Tierexperiment durch Guanidinvergiftungen Harnstofferhöhungen erzwingen. Es gelang ferner bei solchen vergifteten Tieren, schwere Veränderungen der Leber nachzuweisen. Wir wollen nicht so weit gehen,- alle diese Tatsachen als einen Beweis für ursächliche und selbständige Giftwirkungen des Guanidins anzusehen. Aber wir glauben, daß die Zufuhr oder die Eigenbildung im Körper oder die Retention von Guanidinmengen ein wichtiges Symptom für einen krankhaften Eiweißstoffwechsel und schwerer Leberschädigung ist und daß dieses Symptom dem Nachweis vermehrten Auftretens von den vorhin genannten Eiweißstoffwechselprodukten gleich zu setzen ist. Die nächste Aufgabe scheint uns zu sein, eine empfindliche und wirklich spezifische Reaktion zum Guanidinnachweis in kleinen Blutmengen zu schaffen.. Experimenteller Teil. Die sehr ausführlichen Angaben von Major und Weber für die Ausführung der von ihnen beschriebenen Nitroprussidreaktion zum Guanidinnachweis müssen im Original nachgewiesen werden.. Brought to you by | Purdue University Librarie Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
(15) Über die Auffindung von urämieerzeugenden Stoffen.. 95. Das Blut wird nach Folin-Wu enteiweißt, das Piltrat schwach alkalisch gemacht, mit Tierkohle adsorbiert und nach dem Filtrieren die Tierkohle samt Filter mit salzsaurem Alkohol ausgezogen. Der alkoholische Auszug wird zur Trockne verdampft, mit genau 7 ccm H20 aufgenommen und 5 ccm davon mit einer besonders hergestellten Standardlösung von Guanidincarbonat im Colorimeter verglichen. AVir möchten nur hinzusetzen, daß folgende Handgriffe sehr wichtig sind: Bei der Enteiweißung mit Phosphor Wolframsäure muß man dem Blute zuerst die Schwefelsäure zusetzen; ferner stellt man sich gleich ein großes Quantum Tierkohle bereit, um ein Material von immer gleich starker und gleichmäßiger Adsorptionskraft zu besitzen. Und endlich muß man sich genau nach den von den beiden Autoren angegebenen Ablesungszeiten richten. Die Untersuchungen mit den verschiedenen Guanidinverbindungen geschahen folgendermaßen. Wir nahmen Arginin, Monomethylguanidin, Dimethylguanidin, Guanidincarbonat und Guanidinessigsäure. Von diesen Stoffen wurden Lösungen hergestellt, derart, daß in l ccm je l mg reines Guanidin1) enthalten war. Nun wurde die von Major und Weber beschriebene Reaktion mit diesen reinen Lösungen angestellt, ferner wurden diese Lösungen mit Tierkohle adsorbiert und endlich wurden genau abgemessene Mengen dieser Lösungen frischem Blut zugesetzt und dann das Blut nach der Originalvorschrift der Autoren behandelt. Die Ablesungen selbst wurden von uns beiden unabhängig voneinander gemacht. Die Verarbeitung der großen Blutmengen geschah nach bekannten Prinzipien. Die- Blutdruckversuche wurden genau so angestellt, wie sie im ersten Teil dieser Arbeit schon beschrieben sind. Erklärungen zu Tafel I.. Tig. 1. Typisches Bild nach Injektion von 5 ccm normalen Urins. Deutliche Blutdrucksenkung, starke AmpUtudenvergrößerung. Fig. 2. Typisches Bild nach Injektion eines durch Tierkohlenadsorption gewonnenen Extraktes. Deutliche Blutdrucksenkung, starke Amplitudenvergrößerung. (Die Lücke in der zweiten Kurvenhälfte unten kam durch ein leichtes Schleudern des Schreibhebels). Hg. 3 zeigt die Wirkung einer durch Tierkohlenadsorption gewonnenen Extraktmenge entsprechend 8/8 Liter Ausgangsurin. Bg. 4 zeigt bei völlig gleichen Mengenverhältnissen und gleicher Gewinnungsweise die wesentlich geringere Wirkung auf den Blutdruck und vor allein auf die Amplitude bei einer beginnenden Niereninsuffizienz. Hg. 6. Wirkung eines durch Kaolin gewonnenen Extraktes. Hg. 6. Wirkng eines durch nachträgliche Tierkoblenadsorption gewonnenen Extraktes, nachdem er z u v o r mit Kaolin behandelt worden war: immer noch deutliche Blutdrucksenkung nnd Amplituden vergrößer u n g. Bg. 7 zeigt die Blutdrucksteigerung und Amplituden Vergrößerung nach Injektion von 0,1 Dimethylguamdin bei einem 9 kg schweren Hunde. Bg. 8 a und 8b zeigen die Wirkungen eines Extraktes, gewonnen aus 100 ccm Blut des Hypertoniekranken B. Es sind Alkoholfällungen und Fällungen durch TrichloreesJgsäure vorausgegangen. l. ) D. h. berechnet auf den vollen Guanidinkern.. Brought to you by | Purdue University Libraries Authenticated Download Date | 6/15/15 6:14 AM.
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