Neurodegeneration und Neuroprotektion

(1)

Neurodegeneration und Neuroprotektion – ein Dialog zwischen Immunsystem und

Gehirn auf Zellebene

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biologin Susanne Wolf, geborene Peter, geboren am 23.06.69

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin: Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I: Prof. Dr. B. Ronacher

Gutachter:

1. Prof. Dr. R. Lucius 2. Prof. Dr. R. Nitsch

3. Assist. Prof. Dr. T. Möller eingereicht am: 29.09.2001

Datum der Promotion: 10. 12.2001

(2)

Zusammenfassung

Die Infiltration von T Zellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein Charakteristikum neuroinflammatorischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) und ihrem Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), und führt zur Aktivierung intrinsischer Hirn- makrophagen, den Mikrogliazellen, zu axonaler Schädigung sowie zum Zusammenbruch der Blut- Hirnschranke. Die T Zellen, welche als erste im Gehirn erscheinen, sind vom Subtyp Th1, spezifisch für Bestandteile der Myelinscheide, wie das myelinbasische Protein (MBP), produzieren inflammatorische Zytokine und rekrutieren andere unspezifische T Zellen und Makrophagen. Da sich diese Zellen des Immunsystems gegen körpereigene Bestandteile richten, spricht man von autoreaktiven T Zellen und einer autoimmunen Erkrankung. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich den Einfluss dieser autoreaktiven T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen mit Hil- fe muriner Schnittkulturpräparate von Hippocampus und entorhinalem Kortex untersucht, welche den myelinisierten Fasertrakt Tractus perforans mit seinen Ursprungsneuronen und Zielzellen enthielten. Gering aktivierte MBP-spezifische T Zellen induzierten die Expression der Aktivitätsmarker MHC-II und ICAM-1 auf den Mikroglia und die damit verbundene axonale Schädigung (Phagozyto- se) im gleichen Maße wie hochaktivierte unspezifische T Zellen. Nur Th1 Zellen konnten Mikroglia aktivieren. MBP-spezifische Th2 Zellen hingegen reduzieren die Th1 induzierte Mikrogliaaktivie- rung (ICAM-1) auf Kontrollniveau. MBP-spezifische Th1 Zellen konnten die Expression von B7 auf Mikrogliazellen modulieren, während die MBP-spezifischen Th2 Zellen diese Eigenschaft nicht be- saßen. Durch diese Befunde kann die prominente Rolle von autoreaktiven Th1 Zellen beim Auslö- sen neuroinflammatorischer Prozesse auf ihre einmalige Fähigkeit, Mikrogliazellen zu aktivieren und deren kostimulatorische Moleküle zu modulieren, zurückgeführt werden. Gleichzeitig bieten die Daten eine mögliche Erklärung für die protektive Rolle von Th2 Zellen bei MS und EAE.

Es ist bekannt, dass autoreaktive T Zellen, wie die MBP-spezifischen Th1 Zellen, auch im gesunden Zustand im humanen und murinen T-Zell-Repertoire vorhanden sind. Die physiologische Funk- tion dieser Zellen ist unklar. Untersuchungen am Nervus opticus sowie im Rückenmark in vivo be- legen, dass autoreaktive T Zellen und Makrophagen die Reorganisationsprozesse im ZNS nach traumatischer Schädigung positiv beeinflussen. Diese bei neuroinflammatorischen Erkrankungen so destruktiv wirkenden autoreaktiven T Zellen verhindern nach einem experimentell gesetzten Primärschaden im ZNS das Fortschreiten der Schädigung und es kommt zu einer fast vollständi- gen Regeneration des Gewebes. Im zweiten Teil meiner Promotionsarbeit habe ich versucht, die Mechanismen, welche hinter dieser Protektion stecken aufzuspüren. Dazu habe ich ebenfalls das in vitro Hirnschnittmodell benutzt. Für diese Fragestellungen wurden Akutschnitte verwendet, die ein Modell für primäre Schädigung im ZNS darstellen. MBP-spezifische Th2 Zellen hatten ein grö- ßeres protektives Potential als MBP-spezifische Th1 Zellen. Die nicht ZNS-spezifischen Th1 und Th2 Zellen benötigten ihr Antigen (OVA-Peptid), um signifikant protektiv zu wirken. Durch eine Su- perstimulation der OVA- und MBP-spezifischen T Zellen wurde eine Neuroprotektion auf gleichem Niveau erreicht. Die Neuroprotektion nach primärer Schädigung von ZNS Gewebe ist somit antigen- und stimulationsabhängig und wird hauptsächlich von Th2 Zellen unterstützt.

(3)

Abstract

The invasion of T cells into the central nervous system (CNS) is a hallmark of neuro inflammatory diseases like multiple sclerosis (MS) and its rodent model, experimental autoimmune encephalo- myelitis (EAE), leading to activation of intrinsic macrophages, the microglia, axonal damage and break down of the blood brain barrier. The initial invading T cells are of the Th1 subtype and specific for parts of the myelin sheet like myelin basic protein (MBP). They produce inflammatory cyto- kines and recruit peripheral non-specific T cells and macrophages. Because these T cells are di- rected against a self antigen, they are called auto reactive T cells and the phenomenon an autoimmune disease. In the first part of my study I investigated the influence of auto reactive T cells on microglial cells' utilizing an organotypic slice culture system of hippocampus and entorhinal cortex.

The slice culture contains a myelinated fibre tract – the tractus perforans – with its original and tar- get neurons. Low activated MBP-specific T cells induced the expression of the activation markers ICAM-1 and MHC-II on microglia as well as microglial phagocytosis in the same manner as highly activated non-specific T cells. Only Th1 cells were able to activate microglia, while Th2 cells re- duced the Th1 induced activation (ICAM-1 expression). MBP-specific Th1 cells could modulate the expression of co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2, whereas MBP-specific Th2 cells could not.

These findings could show why Th1 cells are responsible for EAE induction while Th2 cells can be protective.

Auto reactive T cells like MBP-specific T cells have been found in the normal human and murine T cell repertoire. The physiological function of these cells is still unclear. Studies using the models of optic nerve crush or spinal cord crush have shown that macrophages and auto reactive T cells are involved in reorganisation and regeneration after CNS trauma. These auto reactive T cells, which are usually known to be destructive, could prevent CNS tissue from secondary degeneration. In the second part of my study I tried to identify the mechanisms involved in this phenomenon. I also used the organotypic slice culture system. Immediately after preparation causing the primary injury the slices were cultivated with T cells. Th2 cells were found to be more potent to prevent form secondary damage than Th1 cells. The non-CNS specific OVA Th1 and Th2 cells required their antigen to be fully protective. When over stimulated, MBP- and OVA-specific Th1 and Th2 cells proved to be protective to the same extend. Neuroprotection after primary injury depends on the T cell’s state of activation and their antigen specificity. Among the cells examined I found Th2 cells were most effective in preventing CNS tissue from secondary injury.

Schlagworte

Mikroglia, T Zellen, Th1, Th2, Neurodegeneration , Neuroprotektion, Multiple Sklerose Keywords

microglia, T cells, Th1, Th2, neurodegeneration, neuroprotection, multiple sclerosis

(4)

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 6

1.1 Destruktive Autoimmunität im Zentralen Nervensystem (ZNS) – das

Zusammenspiel von T Zellen und Mikrogliazellen 6

1.1.1 Multiple Sklerose 6

1.1.2 Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) 7

1.1.3 Die T Zellen und Kostimulation 8

1.1.4 Die Mikrogliazelle – die lokale APC des ZNS 8

1.1.5 Das Immunprivileg des ZNS 9

1.2 Benigne Autoimmunität — Die Rolle von autoreaktiven T Zellen bei der Verhinderung von sekundären neuronalen Schäden nach einer Verletzung

des ZNS 11

2 HYPOTHESEN 12

3 MATERIAL UND METHODEN 13

3.1 Die Hirnschnittkulturen – ein Modell für Neuroinflammation und

Primärschaden von ZNS Gewebe 13

3.1.1 Zusammensetzung der Medien 13

3.1.1.1 Präparationsmedium (steril) 13

3.1.1.2 Kulturmedium (steril) 13

3.1.1.3 0.1 M Phosphatpuffer (PB) 14

3.1.2 Die entorhinal-hippocampale Hirnschnittkultur 14 3.1.2.1 Die Anatomie der entorhinal-hippocampalen Formation 14

3.1.2.2 Präparation 15

3.1.2.3 Kultivierung 16

3.1.2.4 Tracen mit Mini Ruby 16

3.1.2.5 Färben der toten Zellen im lebenden Hirnschnitt mit Propidiumjodid 17

3.1.2.6 Fixierung 17

3.1.2.7 Kryostatschnitte 18

3.2 T Zellen 19

3.2.1 Zusammensetzung der Medien 19

3.2.1.1 Phosphatpuffer/Saline (PBS) 19

3.2.1.2 FACS-Puffer 19

3.2.1.3 MACS-Puffer (steril) 19

3.2.1.4 T Zell Medium (cRPMI) für die Mauszellen (steril) 19 3.2.1.5 Propagationsmedium für die Rattenzellen (steril) 19 3.2.1.6 Proliferationsmedium für die Rattenzellen (steril) 20 3.2.1.7 Antigene zur Stimulation der Rattenzellen 20

3.2.1.8 Antigene zur Stimulation der Mauszellen 20

3.2.1.9 Zytokine 20

3.2.2 Die transgenen Mausstämme – Test auf Transgenität 21 3.2.3 Präparation der T Zellen aus Milz und Lymphknoten 22 3.2.4 Das MACS-System zum Sortieren der Zellen vor der Kokultivierung 23

3.2.5 Intrazelluläres Markieren von T Zellen 24

3.2.6 MBP-spezifische und unspezifisch aktivierte T Zellen 25

3.2.7 MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen 25

3.2.8 MBP-, Copaxone 1- und OVA-spezifische T Zelllinien 26

3.3 Diagnostische Methoden 28

3.3.1 Immunhistochemie 28

3.3.1.1 Bildgebende Verfahren – Mikroskopie 30

3.3.1.1.1 Konfokale-Laserscanner-Mikroskopie 30

3.3.1.1.2 Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie 30

3.3.2 Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) 30

3.3.3 Fluorescence activated cell sorting (FACS) 31

(5)

4 ERGEBNISSE 33 4.1 Unterschiedlicher Einfluss von MBP spezifischen und unspezifischen

T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen in der

Hirnschnittkultur 33

4.1.1 Der Aktivierungsstatus der T Zellen 33

4.1.2 Die Zytokinproduktion der aktivierten T Zell-Populationen 34 4.1.3 Die Einwanderung der T Zellen in den Hirnschnitt 34 4.1.4 Das allgemeine Überleben des neuronalen Gewebes nach T Zell-

Invasion 35 4.1.5 Die Mikrogliale Phagozytose von vormarkierten Axonen 35 4.1.6 Die Expression von MHC-II und ICAM-1 auf Mikrogliazellen 37 4.1.7 Der Einfluss von TNF-α und IFN-γ auf die Aktivierung und

Phagozytoseaktivität von Mikrogliazellen 39

4.2 Das Potential von Th1 und Th2 Zellen, Mikrogliazellen zu aktivieren und die

Expression von kostimulatorischen Molekülen zu modulieren 41 4.2.1 Aktivierungsstatus, Zytokinproduktion und Transmigration der Th1 und

Th2 Zellen 41

4.2.2 Erhöhte GFS-IB4 Reaktivität der Mikrogliazellen wird von Th1 Zellen

induziert 44 4.2.3 Th1 und Th2 Zellen induzieren beide die CD40 Expression 44 4.2.4 ICAM-1 wird durch Th1 Zellen induziert und durch Th2 Zellen supprimiert 44 4.2.5 Die Expression von B7-1 und B7-2 wird von Th1 Zellen moduliert, von

Th2 Zellen nicht 47

4.2.6 Die Abhängigkeit der Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1

und B7-2 von der Antigenspezifität der T Zellen 49 4.3 Haben Th1 und Th2 Zellen ein unterschiedliches Potential, nach einer

Verletzung von Hirngewebe den Sekundärschaden zu verhindern? 52 4.3.1 MBP-spezifische und Copaxone 1-spezifische T Zellen schützen vor

neuronalem Schaden 52

4.3.2 MBP-spezifische Th2 Zellen können den Sekundärschaden stärker

verhindern als MBP-spezifische Th1 Zellen 54

4.3.3 MBP-spezifische T Zellen regen die Mikroglia nicht zur Phagozytose an 56 4.3.4 Die Neuroprotektion der OVA-spezifischen T Zellen nach einem

Primärschaden des ZNS wird durch antigenspezifische Stimulation

verstärkt 57 4.3.5 Die Protektion ist vom Aktivierungsgrad der eingesetzten T Zellen

abhängig 58

5 DISKUSSION 60

5.1 Neuroinflammation 60

5.1.1 CD4+ T Zellen invadieren Hirngewebe und induzieren axonalen Schaden: unspezifisch aktivierte T Zellen versus MBP-spezifisch

aktivierte T Zellen 61

5.1.2 Der Einfluss der Subtypspezifität auf den Aktivierungszustand der

Mikroglia: Th1 versus Th2 62

5.1.3 Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2: Th1 versus

Th2 und der Einfluss der Antigenspezifität 64

5.2 Neuroprotektion 66

6 ANHANG 69

(6)

1 Einleitung

1.1 Destruktive Autoimmunität im Zentralen Nervensystem (ZNS) – das Zusammenspiel von T Zellen und Mikrogliazellen

Das Immunsystem ist die Polizeitruppe des Organismus. Seine wichtigste Funktion besteht darin, den Körper vor eingedrungen Mikroorganismen zu schützen, sowie vor Zellen, die bösartig gewor- den sind. Die angeborene Immunität ist unspezifisch und sehr effizient. Erst wenn diese durch Pa- thogene überwunden wurde, entfaltet die erworbene Immunität ihre volle Wirksamkeit. Diese ver- fügt über fünf wichtige Eigenschaften: Sie ist spezifisch, muss erworben werden, hat ein Gedächt- nis und kann zwischen Selbst- und Nicht-Selbst oder/und gefährlich/ungefährlich unterscheiden.

Die angewandte immunologische Forschung war und ist zu einem erheblichen Teil darauf aus, diese Eigenschaften der erworbenen Immunität zu manipulieren. Transplantationsbiologen und Chi- rurgen würden das Immunsystem gerne von der Ungefährlichkeit oder Selbstheit der Transplantate überzeugen, damit diese nicht durch das Immunsystem angegriffen und zerstört werden. Tumor- immunologen hingegen würden die Immunantwort gerne so abwandeln, dass die Gefahr durch körpereigene, bösartige Tumorzellen erkannt wird und diese aus dem Körper beseitigt werden. Das Immunsystem hält aber eine Ausnahme von den Regeln Selbst/Nicht-Selbst bereit: Das Phänomen der Autoimmunität, das durch Paul Ehrlich 1899 als horror autotoxicus erstmals beschrieben wurde. Das Immunsystem erkennt einen körpereigenen Bestandteil (das Autoantigen) und reagiert darauf; die Folge ist eine Autoimmunkrankheit. Dies ist auch der Fall bei Multipler Sklerose (MS) und ihrem Tiermodell, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE). Hier erkennt das Immunsystem Bestandteile der Myelinscheide (z.B. das Myelinbasische Protein - MBP), welche die Axone ummantelt und es kommt zur Demyelinisierung und axonalen Schädigung.

1.1.1 Multiple Sklerose

Das verblüffendste epidemiologische Merkmal der MS besteht darin, dass ihre Prävalenz in Ab- hängigkeit von der geographischen Breite schwankt. Mit Ausnahme Japans (wo die Prävalenz gering ist), wird die Krankheit auf der Nord- und Südhalbkugel mit zunehmender Entfernung vom Ä- quator immer häufiger. Die höchste Prävalenz findet man auf den Orkney- und Shetland-Inseln (brit.). In Westeuropa liegt die Inzidenz bei 30-60/100 000. Die Krankheit tritt zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr und häufiger bei Frauen auf (w:m = 1,2-2:1). Weitere Befunde lieferten Untersu- chungen wandernder Bevölkerungsgruppen. Bei Immigranten, die vom indischen Subkontinent, der Karibik und Afrika nach Großbritannien kamen, ist das MS-Risiko gering. Bei ihren in Großbritan- nien geborenen Kindern ist es jedoch genauso hoch wie bei der übrigen britischen Bevölkerung.

Diese und andere Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass ein Erreger die MS verursacht, der in kühleren Klimazonen vorhanden ist und den man sich in der Kindheit zuzieht. Man hat vielen Viren diese Rolle zugeschrieben, darunter dem Masernvirus und verschiedenen Retroviren, aber die Befunde sind nicht schlüssig. Einen genetischen Einfluss vermutet man bei der MS schon seit vielen Jahren. In zirka 3-12% der Fälle gibt es eine familiäre Häufung. Bei Angehörigen ersten Grades ist das Erkrankungsrisiko 15mal höher als im Bevölkerungsdurchschnitt. Es besteht eine

(7)

Die ersten Gewebeschäden zeigen entzündliche Veränderungen mit eingewanderten, einkernigen Leukozyten. Ältere Entzündungsherde enthalten Plasmazellen und Lymphozyten. In späteren Sta- dien findet man Vernarbungen der Glia (Sklerose). Die MS-Herde bleiben auf das ZNS beschränkt, können aber überall im ZNS entstehen. Vorwiegend treten sie in der weißen Gehirnsubstanz und besonders häufig in den Sehnerven, im Bereiche um die Gehirnventrikel, im Hirnsstamm und im oberen Teil des Rückenmarks auf. Die klinischen Symptome des einzelnen Patienten sind abhän- gig von der Lage der Herde. In der Regel beginnt die Krankheit mit einem einzigen Symptom. Am häufigsten beobachtet man Sehstörungen, Doppelsehen, taubes oder prickelndes Gefühl oder Muskelschwäche. Vom ersten Anfall erholt der Patient sich meistens vollständig. Die späteren Schübe sind nicht vorhersehbar und hinterlassen meist dauerhafte Schäden, so dass der Patient im Verlauf der Erkrankung immer stärker behindert wird. Häufige Krankheitszeichen einer fortge- schrittenen MS sind ungleichmäßiger Gang, Verlust der Blasenkontrolle, Lähmung und veränderte Wahrnehmung. Die Krankheit kann sehr unterschiedlich verlaufen. Die durchschnittliche Lebens- erwartung vom Ausbruch an liegt bei 20 bis 30 Jahren. Besonders schlecht ist die Prognose, wenn die Krankheit nach dem 40. Lebensjahr auftritt, wenn es zu frühzeitigen Rückfällen kommt, wenn es in der Familie schon andere Fälle von MS gab oder wenn der Patient zu einer niedrigen sozia- len Schicht gehört. Wegen relativ häufiger Spontanremission sind therapeutische Erfolge nur schwer zu beurteilen. Als gesichert gilt die Wirksamkeit von Adrenocorticotrophic hormone (ACTH) und Glukokortikoiden zur Verkürzung der Schubdauer und von Azathioprin zur Verringerung der Schubfrequenz. (Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch 1994; Autoimmunität, Spektrum Lehrbuch 1995). Bei einigen Formen der MS greift eine Therapie mit IFN-β, was hauptsächlich auf dessen immunsupressive Wirkung zurückgeführt wird. Ein neues vielversprechendes Medikament gegen schubweise MS ist Copaxone 1, dessen Wirkung hauptsächlich auf der Rekrutierung von Th2 Zel- len und spezifischer Immunsuppression beruht (Aharoni et al. 2000; Johnson et al. 2001; Neuhaus et al. 2001).

1.1.2 Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE)

Diese MS-ähnliche Erkrankung kann bei Nagetieren durch die Injektion von Peptiden des Myelins (MBP, PLP, MOG, MAG) in komplettem Freund’schen Adjuvans und Boostern mit Pertussistoxin oder Zellwandbestandteilen von Tuberkelbakterien ausgelöst werden. Dies spricht für eine Beteili- gung durch eine systemische Aktivierung des Immunsystems beim Auslösen der EAE. Weiterhin kann die Krankheit auf nicht immunisierte Tiere durch den adoptiven Transfer von Th1 Zellen aus immunisierten Tieren übertragen werden. Auch durch die Injektion von voraktivierten ZNS-spezifischen T Zellen kann EAE induziert werden. Es gibt die verschiedensten Modelle von EAE (akut- chronisch, schubweise), die mehr oder weniger den MS-Formen entsprechen. Einige Maus- und Rattenstämme sind besonders empfänglich für EAE (wie z.B. der in dieser Arbeit verwendete transgene Tg4 Stamm), während in anderen Stämmen EAE gar nicht oder sehr schwer auszulösen ist. Dies spricht für eine genetische Komponente der EAE. Die genannten Parallelen zur MS (Assoziation mit einer peripheren Immunreaktion, Th1 Abhängigkeit, genetische Komponente) lassen die EAE zu einem weit verbreiteten Modell in der MS Grundlagenforschung werden.

(8)

1.1.3 Die T Zellen und Kostimulation

Die T Zellen sind Zellen des Immunsystems, die zur Verteidigung gegen körperfremde Eindringlin- ge dienen. Für eine komplette Aktivierung einer T Zelle sind zwei Signale notwendig. Das erste Signal bekommt sie über ihren T Zellrezeptor (TCR) nach dem Kontakt mit einer Fresszelle, die einen körperfremden Bestandteil (Antigen) in sich aufgenommen und auf ihrer Oberfläche als MHC-II-Komplex präsentiert hat. Das zweite Signal wird über kostimulatorische Rezeptoren zwischen Fresszelle und T Zelle übertragen. Zwei dieser kostimulatorischen Moleküle, die von Antigen präsentierenden Zellen (APC) expremiert werden, sind B7-1 und B7-2. Man unterscheidet cluster of differentiation (CD)4 und CD8 positive Zellen. Die CD8+ Zellen wirken hauptsächlich direkt zyto- toxisch, während die CD4+ Zellen am ehesten dem Helfer-Typ (Th) entsprechen. Die CD4+ Zellen werden in zwei Subtypen unterteilt – die vorwiegend proinflammatorisch wirkenden Th1 Zellen und die Th2 Zellen, denen ein antiinflammatorisches Potential zugeschrieben wird. Die beiden T-Zell- Subtypen unterscheiden sich in ihrem Zytokinmuster: Th1 Zellen produzieren vornehmlich IFN-γ, IL-2 und TNF-α; Th2 Zellen lassen sich durch die Produktion von IL-4, IL-5 und IL-13 charakterisie- ren. Treffen naive T Zellen auf B7-1 expremierende APCs, entwickeln sie sich in Richtung Th1;

nach der Ligation mit B7-2 kommt es zur Differenzierung von Th2 Zellen (Freeman et al. 1995;

Kuchroo et al.1995). Trägt eine T Zellen auf ihrer Oberfläche einen Rezeptoren, der mit Bestandtei- len von körperfremden Zellen oder Organismen reagiert, werden beide Signale von der Antigen präsentierenden Zelle bereitgestellt. Die T Zelle wird aktiviert und kann den Kampf gegen das Pa- thogen aufnehmen. Trägt eine T Zelle einen Rezeptor für einen körpereigenen Bestandteil - wie zum Beispiel das MBP - wird sie normalerweise nicht aktiviert, sondern wird anergisch oder schon im Thymus aussortiert. In MS und EAE scheint dieser Mechanismus nicht mehr zu greifen. Das T Zell Repertoire in akuten MS-Läsionen ist sehr heterogen. Unspezifische T Zellen bilden die Mehrheit innerhalb der T-Zell-Infiltrate bei Autoimmunkrankheiten (Steinmann et al. 1996). Interes- santerweise werden die unspezifisch aktivierten T Zellen von einer geringen Anzahl autoreaktiver T Zellen rekrutiert und kontrolliert. Die klassische Vorstellung des Krankheitsbildes der MS ist das T Zell vermittelte Abschälen der Myelinscheide durch Makrophagen und Mikrogliazellen.

1.1.4 Die Mikrogliazelle – die lokale APC des ZNS

Mikroglia sind die immunkompetenten Zellen des ZNS. Sie machen 5-15 % der humanen ZNS- Zellen aus und sind damit etwa so zahlreich wie die Neurone. Es wird heute allgemein akzeptiert, dass Mikroglia nicht neuroektodermalen Ursprungs sind, sondern zu den Zellen des mononukleä- ren Makrophagen-Systems gerechnet werden können. Schon Virchow und andere der frühen Neu- ropathologen wie Alzheimer und Nissl hatten über die Existenz von nicht neuroektodermale Zellen im ZNS spekuliert. Del Rio Hortega erkannte in seinen grundlegenden Arbeiten vom Anfang des vergangenen Jahrhunderts als erster die wichtigen Rollen, die diese Zellen bei vielen akuten und chronischen pathologischen Prozessen im ZNS spielen. Durch die Verfügbarkeit von neuen Me- thoden, insbesondere von spezifischen Antikörpern (Ak), konnte in den letzten Jahren die Bedeu- tung dieser Zellen bei allen wichtigen ZNS-Pathologien aufgezeigt werden (zur Übersicht: Kreutz- berg et al. 1996).

(9)

Normalerweise befinden sich die Mikroglia im gesunden adulten Gehirn in einem Ruhezustand, der

„resting microglia“ genannt wird. Sie stellen eine sehr stabile Population dar mit - im Vergleich zu anderen Makrophagen - niedriger Zellumsatzrate. Bei einer Schädigung des ZNS, seien es trauma- tische, ischämische, inflammatorische oder neurodegenerative Prozesse, wandeln sich die ruhen- den Mikroglia als „Sensoren pathologischer Ereignisse“ (Gehrmann et al. 1995) sehr schnell in aktivierte Mikroglia um und greifen in das Krankheitsgeschehen ein. Die Aktivierung ist ein stufenwei- ser Prozess, der relativ unabhängig von der auslösenden Noxe fast stereotyp abläuft. In einem ersten Schritt werden die Mikroglia aktiviert, ohne phagozytisch zu werden. Sie proliferieren und ex- premieren bestimmte Aktivierungsmarker, von denen besonders die Zelladhäsionsmoleküle und die MHC I und II Antigene gut beschrieben sind. In einem zweiten Schritt transformieren die aktivierten Mikroglia zu intrinsische Gehirnmakrophagen, die in der Lage sind, Zelltrümmer und ge- schädigte Zellen zu phagozytieren.

Die aktivierten Mikrogliazellen produzieren eine Vielzahl von Botenstoffen (Zytokine) und können über diese oder über Rezeptoren auf der Zelloberfläche wiederum mit infiltrierenden T Zellen kommunizieren (Kreuzberg 1996; Hailer 1997; Aloisi et al. 1999, 2000a,b). Es ist also möglich, dass sowohl eine T Zelle von einer APC als auch eine APC von einer T Zelle durch Zytokine oder Kostimulation aktiviert und in ihrer Funktion moduliert werden kann. Welche Faktoren von aktivierten Mikrogliazellen freigesetzt werden, scheint letztendlich von der zugrundeliegenden Noxe mit- bestimmt zu werden.

In vivo Studien mit blockierenden B7-1 und B7-2 monoklonalen Antikörpern (mAK) zeigen, dass die Kostimulation von T Zellen durch B7-1 und B7-2 auf APCs den Beginn und Verlauf von EAE unterschiedlich beeinflussen kann (Miller et al. 1995; Lenschow et al.1995a; Perrinet al. 1999). In einer Studie mit knock out Tieren, denen entweder B7-1 oder B7-2 oder beide Moleküle fehlten, waren die klinischen Symptome der EAE Erkrankung bei B7-2 defizienten Tieren weniger schwer als bei B7-1 defizienten Tieren. Konnte der B7/CD28-Weg bei CD28 knock out Tieren gar nicht beschritten werden, war es nicht möglich, EAE auszulösen (Girvin et al. 2000). Es wurde berichtet, dass in MS-Läsionen B7-1 auf den Hirnmakrophagen hochreguliert wird (Williams et al. 1994; De Simone et al. 1995; Windhagen et al. 1995). Es gibt einige Hinweise, die vermuten lassen, dass die Regu- lation von B7-1 durch die Expression von B7-2 gesteuert wird. In NOD/B7-2 defizienten Tieren wird nach dem Einsetzen der für Diabetes typischen Neuropathie B7-1 hochreguliert, während es bei einfachen NOD Tieren nicht zu einer solchen Hochregulation von B7-1 kommt (Jordan und Bluestone, persönliche Mitteilung).

1.1.5 Das Immunprivileg des ZNS

Aber nicht nur bei pathologischen Prozessen gibt es einen Austausch zwischen den Zellen des Immunsystems und des ZNS. Auch im physiologischen Zustand des Körpers kommunizieren diese beiden Organsysteme miteinander. Bis in den letzten Teil des vergangenen Jahrhunderts glaubte man, das Gehirn wäre vom Immunsystem abgeschirmt und würde von ihm ignoriert, da ins Gehirn transplantierte Haut nicht abgestoßen wurde (Shirai 1921; Medawar 1948). Man nahm an, dass erstens die Blut-Hirn-Schranke keine Immunzellen passieren lässt und zweitens kein Abflussweg vom Gehirn zum Lymphsystem existiert. Beide Behauptungen konnten in den 90er Jahren wider-

(10)

legt werden. Im normalen T Zell Repertoire wurden ZNS-spezifische autoantigene T Zellen gefunden (Schlüsener 1985; Anderson et al. 2000). Aktivierte T Zellen können die Blut-Hirn-Schranke passieren (Wekerle et al. 1986; Hickey et al. 1991). Cserr und Knopf beschrieben 1992 den Ab- flussweg vom Gehirn in das Lymphsystem. Außerdem wurden in den zervikalen Lymphknoten ins ZNS injizierte Antigene gefunden (Harling-Berg et al. 1989). Trotz dieser Befunde bleibt das Phä- nomen des „Immunprivilegs“ für das ZNS erhalten. Dieses Privileg gründet sich aber nicht auf Igno- ranz, sondern auf Toleranz. Durch Harold Weiner wurde das Phänomen oral tolerance in MS und EAE beschrieben. Durch die orale Gabe von myelinassoziierten Peptiden und Proteinen in einer niedrigen Dosis, wird EAE verhindert und in bestimmten Fällen die MS gelindert. Durch das Auf- tauchen des ZNS-Antigens im Darm wird in den T Zellen eine Toleranz gegenüber diesem Antigen erzeugt so dass sie nicht mehr darauf reagieren, wenn sie es im ZNS wiederfinden (Higgins und Weiner 1988; Weiner et al. 1997; Weiner et al. 2000). Man vermutet, dass es nach einer Applikati- on eines ZNS-Antigens in der Peripherie zur Produktion von regulatorischen T Zellen kommt (Chen et al. 1994). Eine Kostimulation über B7-2, aber nicht über B7-1 ist notwendig, um eine orale Tole- ranz auszulösen (Liu et al. 1999). Im gesunden Zustand ist vermutlich das Immunsystem ohne vorherige Stimulation den ZNS-Antigenen gegenüber tolerant. Der Sinn des Immunprivilegs wird damit erklärt, dass eine Schädigung des nicht regenerationsfähigen ZNS durch eine entzündliche Reaktion unter allen Umständen vermieden und das fremde Antigen vom Immunsystem toleriert werden soll. Ähnlich wird der immunprivilegierte Status anderer Organe, wie des Hodens, der vor- deren Augenkammer und der Plazenta begründet. Das Eingreifen des Immunsystems nach trau- matischen Schäden des ZNS kann jedoch durchaus wünschenswert sein, wie zahlreiche Studien zum Einfluss von autoreaktiven T Zellen auf sekundäre De-/und Regeneration im ZNS zeigen.

(11)

1.2 Benigne Autoimmunität — Die Rolle von autoreaktiven T Zellen bei der Verhinderung von sekundären neuronalen Schäden nach einer Verletzung des ZNS

Die Verletzung des ZNS von Säugetieren resultiert in einem primären Schaden der direkt betroffe- nen Neurone und ist meist von einem graduellen, sekundären Verlust nicht-geschädigter Neurone begleitet (Faden und Salzman 1992; Faden 1993; McIntosh 1993; Yoles und Schwartz 1998). Die primäre Läsion verursacht Veränderungen der extrazellulären Ionenkonzentration, erhöht die Zirku- lation von freien Radikalen, das Ausschütten von Neurotransmittern, die Depletion von Wachs- tumsfaktoren und die lokale Inflammation (Liu et al. 1994). Diese Veränderungen lösen eine Kas- kade von intrazellulären, destruktiven Vorgängen aus, die zu einem verzögerten neuronalen Tod führen (Villegas-Perez et al. 1993; Berkelaar et al. 1994; Gracia-Valenzuela et al. 1994). Studien über die Wirkung von ZNS-spezifischen T Zellen in verschiedenen Hirntraumamodellen in Maus und Ratte zeigen, dass bei mechanischer Schädigung autoreaktive T Zellen protektiv wirken kön- nen (Zur Übersicht: Cohen und Schwartz 2000). Autoimmune T Zellen, die spezifisch für einen Teil des Myelins (MBP) sind, können verletzte Nervenzellen vor einem sekundären Fortschreiten des primären Schadens schützen (Moalem et al. 1999; Hauben et al. 2000a). Auch T Zellen, die spezifisch für das zur MS-Therapie eingesetzte Copaxone 1 sind, konnten den Sekundärschaden nach Quetschläsion des Nervus opticus verringern (Kipnis et al. 2000). Die passive und aktive Immuni- sierung mit Peptiden des Myelins (MBP, PLP, MOG) schützte sowohl bei einer Wirbelsäulenverlet- zung (Hauben et al. 2000b) als auch im Modell des optic nerve crush (Fisher et al. 2001) vor dem Fortschreiten des primär gesetzten Schadens. Bei einer Läsion der Wirbelsäule konnte durch MBP spezifische T Zellen die Zystenbildung verhindert werden. Gleichzeitig wurde die Expression von B7-2 auf T Zellen und Mikrogliazellen beobachtet (Butovsky et al. 2001). Auch nach entorhinaler Läsion im Hippocampus wurde die Expression von B7-2 auf Mikrogliazellen beschrieben (Bech- mann et al. 2001). Von den Autoren wird eine neuroprotektiv wirkende Immunität vermutet, die durch die Expression von B7-2 begleitet wird. Ob die Expression des B7-2 Moleküls die Ursache oder die Wirkung der Protektion ist, bleibt jedoch unklar. In verschiedenen Hirntraumamodellen wird von einer starken T-Zell-Akkumulation in den Zonen der primären Degeneration und sekundä- ren Regeneration berichtet (Hirschberg et al. 1998;Raivich et al. 1998, Moalem et al. 1999; Bu- tovsky et al. 2000). Als potentielle Mediatoren der Neuroprotektion werden neurotrophe Faktoren genannt (Brain derived neurotrophic factor (BDNF), Neurotrophic factor (NT) 4 und 5, Nerve growth factor (NGF)), die von verschiedenen T-Zell-Subsets produziert werden können (Kerschensteiner et al. 1999; Schwartz et al. 1999; Hohlfeld et al. 2000; Flügel et al. 2001).

Die Wirkungsweise von MBP-spezifischen T Zellen scheint nahezu konträr: Im Kontext einer Auto- immunkrankheit wie der MS sind sie unerwünschte Mediatoren; nach einer mechanischen Schädi- gung haben sie protektives Potential. Die dahinter liegenden Mechanismen versuchte ich mit dieser Arbeit aufzuspüren und habe im Folgenden fünf Arbeitshypothesen formuliert.

(12)

2 Hypothesen

1. MBP spezifische T Zellen können die Mikrogliazellen stärker aktivieren als unspezifisch aktivierte T Zellen.

2. Th1 Zellen können Mikrogliazellen stärker aktivieren als Th2 Zellen. Beide Zellen können jedoch die kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 modulieren.

3. Die Modulation der kostimulatorischen Moleküle B7-1 und B7-2 ist von der Antigenspezi- fität der T Zellen abhängig. ZNS-spezifische T Zellen (MBP) können B7-1 und B7-2 in stärkerem Maße modulieren als nicht ZNS-spezifische T Zellen (OVA).

4. Th2 Zellen haben ein höheres Potential als Th1 Zellen, nach einer Verletzung von Hirn- gewebe den Sekundärschaden zu verhindern.

5. Die Neuroprotektion durch die T Zellen nach einem Primärschaden des ZNS hängt von der Antigenspezifität der T Zellen ab. Der Aktivierungsstatus spielt eine untergeordnete Rolle.

(13)

3 Material und Methoden

3.1 Die Hirnschnittkulturen – ein Modell für Neuroinflammation und Primärschaden von ZNS Gewebe

Sollte die Hirnschnittkultur zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurodegeneration dienen, wurden die Schnitte für 6 Tage kultiviert bevor sie mit den T Zellen kokultiviert worden sind. In der inneren Schicht der Hirnschnitte konnte nach 6 Tagen in Kultur (div) eine Runterregulation von Aktivitätsmarkern auf Mikrogliazellen beobachtet werden (Hailer et al. 1996). Diese innere Zone der Hirnschnitte wurde als unverletztes Hirngewebe angesehen, das alle Zellkompartimente in ihrer ursprünglichen Architektur und teilweisen Funktionalität enthielt.

Als Akutschnitt war die Hirnschnittkultur ein Modell für primären mechanischen Schaden von Hirn- gewebe, der durch die Präparation gesetzt wurde. Die Schnitte wurden dann unmittelbar nach der Präparation mit den entsprechenden T Zellen kokultiviert.

3.1.1 Zusammensetzung der Medien 3.1.1.1 Präparationsmedium (steril)

Agens Menge auf 100 ml Firma

Aqua bidest 98 ml Selbst hergestellt

MEM 25 MM Hepes 1,6 g Gibco, Life Technologies, UK

L-Glutamin 200mM 1 ml Gibco

Trisbasis 800 µl Stammlösung* Sigma, D

3.1.1.2 Kulturmedium (steril)

Agens Menge auf 100ml Firma

Penicillin/Streptomycin 1 ml Sigma

Glucose20 1,2 ml Braun, D

L-Glutamin 200 mM 2 ml Gibco

MEM 25 MM Hepes 0,8 g Gibco

Bikarbonat 580 µl Gibco

Trisbasis 500 µl Stammlösung* Sigma

L-ascorbic-acid (Vitamin C) 80 µl Stammlösung** Sigma

Insulin 100 µl Stammlösung*** Gibco

normal horse serum (hitzeinaktiviert) 25 ml Gibco

HBSS 25 ml Gibco

*Stammlösung Trisbasis: 0.2 M Trispuffer: 24,23 g Tris in 500 ml Aqua bidest lösen, mit konzentrierter HCL pH 7.6 einstellen, mit Aqua bidest auf 1 l auffüllen. Um 0.05 M Trisbasis zu bekommen, verdünnt man 250 ml von 0.2 M Trispuffer mit 750 ml Aqua bidest.

**Stammlösung Vitamin C: 0,1 g Vitamin C in 100 ml Aqua bidest lösen.

***Stammlösung Insulin: 5 mg Insulin in 5 ml Aqua bidest lösen.

(14)

3.1.1.3 0.1 M Phosphatpuffer (PB)

Agens Menge Firma

Na2HPO4x7H2O 21,71 g Sigma

Na2HPO4xH2O 2,62 g Sigma

Aqua bidest 1 l Selbst hergestellt

3.1.2 Die entorhinal-hippocampale Hirnschnittkultur

3.1.2.1 Die Anatomie der entorhinal-hippocampalen Formation

Der Hippocampus ist ein phylogenetisch altes Gehirnareal, das sich aus dem Archipallium entwi- ckelt hat und die zentrale Struktur des limbischen Systems bildet. Die Hippocampusformation er- streckt sich längs vom septalen Kerngebiet des basalen Vorderhirns bis zum ventrocaudalen Pol des Temporallappens. Am temporalen Pol der Formation schließt sich der entorhinale Kortex an, der vom Isokortex durch die rhinale Fissur abgegrenzt wird. Ein Querschnitt durch den Hippocam- pus senkrecht zu seiner Längsachse zeigt zwei u-förmig gebogene, ineinander greifende Hirnwin- dungen, das Cornu ammonis (CA) und den Gyrus dentatus (DG) (Abb.1 folgende Seite). Im Cornu ammonis bilden die Pyramidenzellen ein schmales Band von Neuronen mit basalen und apikalen Dendriten. Aufgrund der unterschiedlichen Morphologie und Verschaltung werden die Neurone in zwei Regionen, CA1 und CA3, eingeteilt. Die Körnerzellen im DG sind ebenfalls in einer schmalen Schicht angeordnet. Die Dendriten sind jedoch ausschließlich apikal in der Molekularschicht lokali- siert (Amaral und Witter 1995). Über den entorhinalen Kortex wird der Hauptanteil der isokortikalen Informationen an den Hippocampus weiter geleitet. Mehrere Areale des Isokortex innervieren Neu- rone im entorhinalen Kortex. Einige wenige Verbindungen bestehen auch zwischen dem Isokortex und dem Subikulum oder der SA1-Region. Der Fasertrakt, der den entorhinalen Kortex mit dem Hippocampus verbindet, wird als Tractus perforans bezeichnet. Neurone aus den Schichten II und III des entorhinalen Kortex projizieren über diesen Trakt zur Molekularschicht des DG und zum Stratum lacunosum-moleculare der CA1-Region. Die Körnerzellen des DG, deren Axone als Moos- fasern bezeichnet werden, innervieren die proximalen apikalen Dendriten der Pyramidenzellen in der CA3-Region. Die Axon-Kollateralen der Pyramidenzellen in der CA3-Region, die Schaffer- Kollateralen, terminieren an den apikalen Dendriten der Neurone in der CA1-Region. Die Pyrami- denzellen in dieser Region projizieren über das Subikulum zurück zum entorhinalen Kortex. Zu- sätzlich zu den Afferenzen aus dem entorhinalen Kortex erreichen den Hippocampus auch Affe- renzen vor allem aus dem Septum und dem jeweils kontralateralen entorhinalen Kortex und Hippo- campus (Amaral und Witter 1995). Diese letztgenannten Afferenzen sind in der Schnittkultur nicht mehr vorhanden, da die Hemisphären voneinander getrennt wurden.

(15)

Abb. 1: Schematische Darstellung des entorhinalen Kortex und Hippocampus

in einem horizontalen Schnitt durch den temporalen Pol der Hippocampus-Formation. Graue Flächen beinhalten hauptsäch- lich Zellkörper, weiße Flächen kennzeichnen die Bereiche, in denen vor allem Zellfortsätze vorkommen. Im Gyrus dentatus und im Cornu ammonis ist beispielhaft die Morphologie der Dendriten von Projektionsneuronen (principal cells) wiederge- geben. F, Fimbria; CA1, Cornu ammonis Region 1; CA3, Cornu ammonis Region 3; So, Stratum oriens; Sp, Stratum pyra- midale; Sl, Stratum lucidum; Sr, Stratum radiatum; Slm, Stratum lacunosum moleculare; Sg, Stratum granulosum; Sm, Stra- tum moleculare; Pm, Pia mater; Fh, Fissura hippocampi; A, Alveus S, Subiculum; Fr, Fissura rhinalis.

3.1.2.2 Präparation

Alle folgenden Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Organotypische entorhinal-hippocampale Schnittkulturen wurden aus Hirnen dekapitierter, 6 Tage alter Lewis Ratten (für MBP, OVA und Copaxone 1 spezifische T Zellen) oder B10.PL (für MBP und unspezifische T Zellen) oder BALB/c (für OVA T Zellen) 9 Tage alter Mäuse angelegt. Der den Hippocampus und entorhinalen Kortex enthaltende Hirnanteil wurde nach rostral vom restlichen Neokortex sowie nach kaudal vom Hirnstamm und vom Kleinhirn abpräpariert und in eiskaltes Präparationsmedium überführt. Nach Aufkleben des Hirnteils mit Gewebekleber (Braun) auf einen mit Agarblöckchen zur Stabilisation versehenen Sektionsblock wurden mit einem Vibratom (Technical Products Internatio- nal, USA) 350 µm dicke Koronarschnitte durch die kaudalen Hirnanteile angefertigt. Der Sektions- block und das Hirngewebe waren von Präparationsmedium bedeckt. Die Schnitte erfolgten mit einer in das Vibratom eingespannten Rasierklinge und wurden nach dem Schneiden mit einer Pas- teurpipette in Petrischalen überführt, die eiskaltes Präparationsmedium enthielten. Unter dem Bi- nokular wurden die den DG enthaltenden Schnitte mit Hilfe zweier Skalpelle so zurechtgeschnitten, dass sie Hippocampus und entorhinalen Kortex enthielten (Abb. 2). Diese Schnitte wurden mit ei-

(16)

ner Pasteurpipette zu je vier Stück auf einen Zellkultureinsatz (Falcon, UK), welcher in einer 6-well- Platte mit auf 37°C vorgewärmtem Kulturmedium saß, aufgebracht. Die Ausbeute lag zwischen 10- 12 Hirnschnittpräparaten pro Tier.

Abb. 2: Schematische Darstellung der Lage des Hippocampus

im Gehirn (graue Flächen im linken Bild) und der Lage des Tractus perforans im Hirnschnittpräparat (rote Fasern im rechten Bild). CA1, Cornu ammonis Region 1; CA3, Cornu ammonis Region 3; DG, Gyrus dentatus; EC, entorhinaler Kortex.

Nach Einführung einer neuen Präparationstechnik durch Dr. B. Heimrich, wurden die Schnitte für die Beobachtung von Neuroprotektion alle mit dieser neuen Technik angefertigt. Das aus dem Schädel der 9 Tage alten Mäuse präparierte Gehirn wurde ebenfalls vom Hirnstamm und Kleinhirn sowie von 1/3 des Frontalkortex befreit, die Hemisphären getrennt und in eiskaltes Präparations- medium überführt. Mit Hilfe eines Binokulars wurde der Hippocampus inklusive entorhinalem Kor- tex herauspräpariert und mit einem Spatel auf die Unterlegscheibe eines Gewebeschneiders (Bachhofen, D) überführt. Mit dem Gewebeschneider, in dessen Schneidearm eine Rasierklinge eingespannt war, wurden 350 µm dicke Schnitte angefertigt, die mit einem Spatel in eiskaltes Prä- parationsmedium überführt und unter dem Binokular ausgewählt wurden. Die Schnitte, die den DG enthielten, wurden mit einer Pasteurpipette je vier Stück auf einen Zellkultureinsatz (Millipore, USA), welcher in einer 6-well-Platte mit auf 35°C vorgewärmtem Kulturmedium saß, aufgebracht.

Mit der zweiten Hirnhemisphäre, die bis dahin in eiskaltem Präparationsmedium lagerte, wurde e- benso verfahren. Die Ausbeute lag zwischen 15-20 Hirnschnittpräparaten pro Tier.

3.1.2.3 Kultivierung

Die 6-well-Platten mit den Hirnschnitten wurden in einem Inkubator bei 35°C und 5% CO2 entspre- chend dem experimentellen Ansatz 1-6 Tage kultiviert. Am Tag unmittelbar nach der Präparation und danach jeden zweiten Tag wurde das Kulturmedium unter sterilen Bedingungen gewechselt.

3.1.2.4 Tracen mit Mini Ruby

Für die Phagozytose-Experimente wurde das Faserbündel Tractus perforans, das vom entorhinalen Kortex in die Molekularschicht des Gyrus dentatus des Hippocampus projiziert, mit einem Farb- stoff, der nur von lebenden Axonen anterograd transportiert wird, unmittelbar nach der Präparation markiert (Kluge et al. 1998) (Abb. 3). Dieser Farbstoff Mini Ruby (10kDA dextran amine; MoBiTec,

(17)

als auch mit einem Avidin-Biotin-Complex (Vector Laboratories, USA) und dem Chromogen 3,3’Diaminobenzidine (DAB; Sigma) für die Durchlichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Ein bis drei Kristalle Mini Ruby wurden unter dem Mikroskop zwischen die Schicht II und III des entorhinalen Kortex jedes Hirnschnitts platziert. Im lebenden Hirnschnitt konnte die Mini-Ruby- Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 520-550 nm mit einem inversen Licht- und Fluo- reszenz-Mikroskop beobachtet und digital dokumentiert wurden (siehe Abschnitt 3.3.1.1.1.). Um die Kolokalisation von phagozytiertem axonalem Material und Mikrogliazellen zu zeigen, wurden die Mikrogliazellen mit dem Makrophagenmarker GFS-IB4 auf 20 µm dünne Kryostatschnitten ge- färbt und mit einem konfokalen Laserscannermikroskop und der entsprechenden Hard- und Soft- ware dargestellt (siehe Abschnitt 3.3.1.1.2.).

Abb. 3: Schematische Darstellung der Tracing-Technik:

Im ersten Schritt wurden die Mini-Ruby-Kristalle in der Schicht I oder II des EC platziert. Nach 2 Tagen in Kultur (div) wurde der Farbstoff von den intakten Axonen des TP bis in die äußere Molekularschicht des DG transportiert. Dies konnte unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Im dritten Schritt wurden nach der Fixierung Kryostatschnitte angefertigt und diese unter dem Fluoreszenzmikroskop oder nach einer ABC-DAB-Konvertierung unter einem Durchlicht- mikroskop betrachtet. Die Mikrogliazellen waren, wenn sie axonales Material phagozytiert hatten, ebenfalls mit dem Tracer markiert. DG, Gyrus dentatus; ec, entorhinaler Kortex.

3.1.2.5 Färben der toten Zellen im lebenden Hirnschnitt mit Propidiumjodid

Der Farbstoff Propidiumjodid (PI) gelangt ausschließlich durch die geschädigte Membran von toten Zellen, lagert sich dort an die DNA an und färbt die Zellen — respektive die Zellkerne — von toten Zellen. Es wurde PI (Sigma) verwendet, um den Zelltod im Hirnschnitt nach Behandlung mit T Zellen gegenüber der unbehandelten Kontrolle darzustellen.

In der Konzentration von 5 µg/ml wurde PI direkt in das Kulturmedium unter die Membran, auf der die Hirnschnitte kultiviert wurden, gegeben und für 30 min im Brutschrank inkubiert. Jeder Zellkul- tureinsatz wurde dreimal in frisches Kulturmedium, das sich in Petrischalen befand, eingetaucht und danach in eine neue 6-well-Platte mit frischem Kulturmedium überführt. Die Hirnschnitte wurden für 10 min im Brutschrank gewaschen. Der Waschschritt wurde mit frischem Kulturmedium wiederholt. Nach insgesamt 30 min Färbung und 20 min Waschen konnten die Hirnschnitte mit dem inversen Fluoreszenzmikroskop betrachtet und digitale Aufnahmen von den kompletten lebenden Hirnschnitten gemacht wurden.

3.1.2.6 Fixierung

Die Hirnschnittkulturen wurden je nach experimentellem Ansatz am Tag 0, 1, 6 oder 7 der Kultivie- rung mit 4% Paraformaldehyd (Sigma) in Aqua bidest über Nacht im Kühlschrank fixiert. Die fixier-

(18)

ten Kulturen wurden mit 0,1 M PB für je 10 min auf dem Schüttler gewaschen und danach in 0,8 M Saccharose überführt und bei 4°C gelagert. Nach 3 Tagen wurde die 0,8 M Saccharose gegen 1 M Saccharose und nach weiteren 3 Tagen gegen 1,4 M Saccharose ausgetauscht. Die Schnitte wurden dadurch in ihrer Dichte dem Gefriermedium angeglichen womit ein besserer Gewebeerhalt garantiert werden konnte.

Die Schnitte, welche mit den Antikörpern ICAM-I, MHC-II, CD40, B7-1 und B7-2 gefärbt werden sollten, wurden mit einem speziellen Fixationsmedium, das erfahrungsgemäß geeigneter für diese Antikörper ist, fixiert. Das Fixationsmedium bestand aus 4% Paraformaldehyd und 15% Pikrinsäure in 0,1 M PB. Unter Zusatz von 0,1% Glutaraldehyd (Serva, D) wurden die Schnitte für 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixiert und für zweimal 10 min auf dem Schüttler mit 0,1 M PB gewaschen.

Es folgte ein weiterer Fixationsschritt für 1 h aber ohne Glutaraldehyd. Abschließend wurden die Schnitte wieder 2 Mal für 10 min auf dem Schüttler bei RT mit 0,1 M PB gewaschen und wie oben beschrieben bis zum Schneiden mit dem Kryostaten bei 4°C in Saccharose gelagert.

3.1.2.7 Kryostatschnitte

Nach einer Lagerungszeit von mindestens 6 Tagen konnten die Schnitte am Jung Kryostaten 2800 Frigocut-E (Cambridge Instruments, D) bei –31°C 20 µm dick geschnitten werden. Diese Dünn- schnitte wurden sofort auf gelatinierte Objektträger aufgebracht und über Nacht bei RT getrocknet.

Die Immunhistochemie wurde an diesen Schnitten auf dem Objektträger durchgeführt.

(19)

3.2 T Zellen

3.2.1 Zusammensetzung der Medien 3.2.1.1 Phosphatpuffer/Saline (PBS)

Agens Menge Firma

0,1 M Phosphatpuffer (PB) 50 ml Selbst hergestellt

NaCl 8,76 g Sigma

KCL 200 mg Sigma

3.2.1.2 FACS-Puffer

Agens Konzentration Firma

PBS Selbst hergestellt

Bovine Albumin Serum (BSA) 0,5% Serva

Natriumazid NaN3 0,01% Sigma

3.2.1.3 MACS-Puffer (steril)

PBS Selbst hergestellt

fetal calf serum (FCS) 1% Gibco

EDTA 2 mM Sigma

3.2.1.4 T Zell Medium (cRPMI) für die Mauszellen (steril)

RPMI-1640 Gibco

L-Glutamin 200mM 2 mM Gibco

2-Mercaptoethanol 50 µM Sigma

Penicillin/Streptomycin 100 U/ml 100 µg/ml Sigma

FCS 10% Gibco

3.2.1.5 Propagationsmedium für die Rattenzellen (steril)

DMEM 500 ml Biological Industries, Israel

L-Glutamin 200mM 2 mM Biological Industries Penicillin/Streptomycin 100 U /100 µg/ml Biological Industries β-Mercaptoethanol 50 µM Biological Industries Sodium Pyruvate 1 mM Biological Industries non-essential amino acids 1% Biological Industries

FCS 10% Gibco

(20)

T cell growth factor (TCGF) konditioniertes Medium

10% selbst hergestellt aus dem Überstand von Convalin-A stimulierten Milzzellen (Mor et al. 1990)

3.2.1.6 Proliferationsmedium für die Rattenzellen (steril)

DMEM 500 ml Biological Industries, Israel

L-Glutamin 200mM 2 mM Biological Industries Penicillin/Streptomycin 100 U /100 µg/ml Biological Industries β-Mercaptoethanol 50 µM Biological Industries Sodium Pyruvate 1 mM Biological Industries non-essential amino acids 1% Biological Industries

autologes Rattenserum 1% selbst hergestellt (Mor et al. 1990) 3.2.1.7 Antigene zur Stimulation der Rattenzellen

Antigen Form Konzentration Firma

OVA komplettes Protein 10 µg/ml Sigma, Israel

MBP komplettes Protein 10 µg/ml isoliert aus dem Rü-

ckenmark von Meer- schweinchen (Ben-Nun und Cohen 1982) Copaxone 1 synthetisches Peptid

(Teitelbaum et al. 1971)

10 µg/ml Teva Pharmaceuticals, Israel

3.2.1.8 Antigene zur Stimulation der Mauszellen

Für die primäre Aktivierung und jede folgende Restimulation wurden 3 µg/ml MBP-Peptid Ac1-11 (MGNHSGKRELS) (Pepscan Immunoanalytic, D) oder 1 µg/ml cOVA323-339 (ISQAVHAAHAEI- NEAGR) (Pepscan Immunoanalytic, NL) in cRPMI eingesetzt.

3.2.1.9 Zytokine

Um Th1 Zelllinien zu erhalten, wurden 1 µg/ml rekombinantes Maus IL-12 (R&D Systems, UK) und anti-Maus IL-4 (Pharmingen) in cRPMI benutzt. Um Th2 Zelllinien zu erhalten, wurden 1 mg/ml rekombinantes Maus IL-4 (Biosource, SA) und 1 µg/ml anti-Maus IL-12 (R & D Systems) in cRPMI benutzt.

Um die Wirkung von Zytokinen auf die Hirnschnittkultur zu testen, wurden diese mit rekombinan- tem, murinem IFN-γ in den Konzentrationen 2, 10 und 50 ng/ml oder mit TNF-α in den Konzentrati- onen 100 und 500 pg/ml am Tag 6 der Kultur behandelt (beide Zytokine Pepro Tech Inc., USA;

spezifische Aktivität: >10⁷ U/mg).

(21)

3.2.2 Die transgenen Mausstämme – Test auf Transgenität

Reine Th1 und Th2 Zelllinien wurden aus transgenen Tieren gewonnen, deren T Zellen einen Re- zeptor (TCR) spezifisch für das entsprechende Antigen tragen. Die DO11.10 Tiere, deren TCR spezifisch für Ovalbumin (OVA) ist (Murphy et al. 1990), sind freundlicherweise von Frau Brunner- Weinzierl aus dem Rheumaforschungszentrum Berlin zur Verfügung gestellt worden. Die Tiere, die wir für unsere Experimente verwendet haben, wurden im Rheumaforschungszentrum mit der dort etablierten Standardmethode (RT-PCR) auf ihre Transgenität hin getestet.

Die transgenen MäuseTg4, deren T Zellen einen TCR spezifisch für das myelinbasische Protein (MBP) tragen, haben wir von David Wraith aus Bristol erhalten (Lui et al. 1995). Die letztgenannten Tiere wurden im hauseigenen Tierstall gezüchtet und von uns in einem Alter von 6-8 Wochen auf Transgenität getestet. Dazu wurden jeder Maus 50 µl Blut aus der Schwanzvene entnommen und in 500 µl 2 mM EDTA in einem Eppendorfgefäß aufgenommen. Zwei B10.PL Mäusen, dem genetischen Hintergrundstamm der Tg4 Tiere, wurde ebenfalls Blut abgenommen, das als Kontrolle bei der FACS Messung verwendet wurde. Diese Lösung wurde mit 500 µl Histopaque-1083 (Sigma) unterschichtet, um einen Dichtegradienten zu erzeugen und Erythrozyten von Leukozyten zu tren- nen. Nach einer 20minütigen Zentrifugationszeit bei 2000 rpm konnte der Lymphozytenring vor- sichtig abpipettiert und in 1 ml FACS-Puffer in einem FACS-Röhrchen aufgenommen wurden. Die übrigen Proben wurde 6 min bei 1200 rpm zentrifugiert, der Überstand dekantiert und die Zellen im Pellet mit 2 primären Antikörpern gefärbt. Die Färbungen erfolgten immer in einem Volumen von 50 µl FACS-Puffer. Der biotinyliertem Antikörper Vß8.1/2 markiert alle T Zellen, die einen TCR spezifisch für MBP tragen und der direkt mit Fluoresceine Isothiocyanate (FITC) gekoppelte CD4 Antikörper alle CD4+ Zellen. Beide AK wurden in der Konzentration 1 µg/ml eingesetzt. Die Inkuba- tionszeit betrug 10 min bei Raumtemperatur (RT). Alle FACS-Röhrchen wurden mit 1 ml FACS- Puffer aufgefüllt, 6 min bei 1200 rpm zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Der Waschvor- gang wurde wiederholt. Da der Vß8.1/2AK nicht direkt an eine Fluoreszenz gebunden ist, wurde er mit Avidin-Strepavidin -Phycoerythrin (PE) gekoppelt, das bei einer Anregung von 568nm rote Flu- oreszenz emittiert. Die Zellen wurden im Dunkeln bei RT für 10 min mit dem AK inkubiert. Es folg- ten zwei Waschschritte und das resultierende Zellpellet wurde in 300 µl FACS-Puffer aufgenommen. Die Zellen wurden mit einem FACStrac^TM-Gerät (Becton Dickinson, San Jose, USA) gemes- sen. Die Abb. 4 auf der folgenden Seite zeigt ein typisches Verteilungsmuster der Zellen für ein positiv transgenes Tier: Die meisten T Zellen befinden sich im Quadranten UR, der doppelt markierte Zellen beinhaltet. Im Quadranten LL ist die Autofluoreszenz der Zellen dargestellt, die mit der ungefärbten Probe eingestellt wurde. Zum Einstellen der Einzelfluoreszenzen wurden die einzeln gefärbten Proben verwendet: in UL sieht man alle nur Vß8.1/2 positiven und in LR alle nur CD4 positiven Zellen.

(22)

Abb. 4: Schematische Darstellung eines Dotplots für zwei Fluoreszenzen (FITC für z.B. CD4+ und PE für z.B. Vß8.1/2).

UL, upper left (oben links); UR, upper right (oben rechts); LL, lower left (unten links); LR, lower right (unten rechts). Im LL:

Autofluoreszenz; LR: nur FITC-gefärbte Zellen (CD4+, Vß8.1/2-); UL: nur PE-gefärbte Zellen (Vß8.1/2+, CD4-); UR: doppelt positive Zellen (Vß8.1/2+, CD4+).

3.2.3 Präparation der T Zellen aus Milz und Lymphknoten

Alle folgenden Arbeiten sind unter sterilen Bedingungen und mit sterilen Arbeitsmaterialien durch- geführt worden. Die Tiere wurden in einem verschließbaren Glasgefäß, welches saugfähiges Pa- pier mit Äther (Braun) enthielt, für 30-60 Sekunden betäubt. Durch kräftigen Gegenzug von Kopf und Schwanz wurde ihnen das Genick gebrochen. Unter einer Sterilbank (Lamina Flow) wurden die Tiere mit 70% Alkohol äußerlich gereinigt und mit der Bauchseite nach oben fixiert. Mit einer Operationsschere und –pinzette wurde die äußere Bauchhaut vom Schwanz bis zum Kopf aufprä- pariert. Die Lymphknoten wurden mit einer spitzen Pinzette herauspräpariert und in eiskaltes RPMI-Medium überführt. Mit einer zweiten Operationsschere wurde die innere Bauchhaut geöffnet und die Milz in ein separates Gefäß mit RPMI überführt. Die Kapseln der Lymphknoten wurden mit einer Schere leicht aufgeschnitten und mit dem Stempel einer sterilen Spritze durch ein Sieb (Fal- con) in ein neues Gefäß mit RPMI gedrückt. Die Milz wurde ebenfalls durch ein Sieb in ein weiteres Falconröhrchen mit RPMI gedrückt. So konnte der Gewebeverband aufgelockert und die Zellen vereinzelt werden.

(23)

Arbeitsschritt Medium/Puffer Menge Zeit Temperatur Zentrifugation Komprimieren

der Milzzellen

RPMI 5 ml 6 min 4°C 1100 rpm

Lysieren der E- rythrozyten

0,83% NH4Cl 5 ml 5 min RT

Stoppen der Lyse RPMI 15 ml RT

Komprimieren RPMI 20 ml 6 min 4°C 1100 rpm

Zusammenführen der Zellen aus Milz und Lymph- knoten

RPMI 10 ml Auf Eis

Zählen der Zellen mit Neubauer- Zählkammer

1:2 RPMI und Try- panblau (färbt tote Zellen)

10 µl RT

Komprimieren RPMI 10 ml 6 min 4°C 1100 rpm

Aussäen der Zel- len in 6-well- Platten

cRPMI + Antigene oder Zytokine oder PMA/Ionomycin

1x bis 2x 10⁶ Zellen/ml 5ml / well

3.2.4 Das MACS-System zum Sortieren der Zellen vor der Kokultivierung

Das Magnetic Activated Cell Sorting (MACS; Miltenyi Biotech GmbH, D) arbeitet mit submikrosko- pisch kleinen, super-paramagnetischen, antikörpergekoppelten Kügelchen, die keinen Einfluss auf die Funktionalität der Zellen haben (Schumm et al. 1999). Das Zelleluat wird über eine Säule geleitet, die in einen Magneten eingespannt ist. Zellen, die mit dem AK markiert waren, wurden von diesem Magneten in der Säule zurückgehalten, die anderen Zellen flossen durch die Säule durch. Bei einer Negativselektion wurden die Zellen, die durch die Säule gelaufen waren, aufgefangen. Bei einer Positivselektion musste die Säule aus dem Magnetfeld entfernt, und die markierten Zellen mit einem Stempel und ca. 5 ml MACS-Puffer aus der Säule gedrückt werden. Für meine Experimente habe ich die Positivselektion mit dem Antikörper für CD4+ T Zellen verwendet. Für unterschiedliche Zelltypen. (Th1, Th2, MBP, OVA) wurden verschiedene steril einzelverpackte Säulen verwendet.

Nachfolgend ist der experimentelle Ablauf dargestellt:

(24)

Arbeitsschritt Medium/Puffer Menge Zeit Temperatur Zentrifugation

Komprimieren cRPMI Gesamtes Vo-

lumen

6 min 4°C 1100 rpm

Waschen MACS-Puffer 5 ml 6 min 4°C 1100 rpm

Zählen der Zellen 1:2 MACS-Puffer und Trypanblau

10 µl RT

Komprimieren MACS-Puffer 10 ml 6 min 4°C 1100 rpm

Inkubation mit dem Antikörper

MACS-Puffer :AK 10:1

10 µl AK x 10⁷ Zellen

15 min 4°C

Komprimieren MACS-Puffer 5 ml 6 min 4°C 1100 rpm

Säule(n) waschen

MACS-Puffer 3 ml 4°C

Zellpellet(s) auf die Säule(n) geben

MACS-Puffer 1 ml 4°C

Säule(n) waschen

MACS-Puffer 3 x 1 ml 4°C

Positivselektion Eluat aus der Säule auffangen

RPMI 10 ml RT

Zählen der Zellen 1:2 RPMI und Try- panblau

10 µl RT

Komprimieren RPMI 10 ml 6 min RT 1100 rpm

2 x Waschen Kulturmedium Hirn- schnitte

5 ml 6 min RT 1100 rpm

Kokultur der T Zellen mit den Hirnschnitten

Kulturmedium Hirn- schnitte

5 µl mit 3 x 10⁴ Zellen

24-48 h 37°C

3.2.5 Intrazelluläres Markieren von T Zellen

Unmittelbar vor der Kokultivierung wurden in einigen Versuchsansätzen die T Zellen vormarkiert, um sie später im Hirnschnitt als eingewanderte T Zellen zu identifizieren. Dazu wurde das Zellpellet nach der MACS-Aufreinigung in einem Volumen von 300 µl PBS mit 50 µM Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (5(6)-CFDA-SE, mixed isomers, MoBiTec) für 5 min bei RT inkubiert, zweimal mit Hirnschnitt-Kulturmedium gewaschen und darin in der entsprechenden Konzentration aufgenommen. Für die Invasion wurden die Zellen in einer Konzentration von 30.000 Zellen in 5 µl und für die Subkultivierung unter den Membranen mit den Hirnschnitten in einer Konzentration von 10⁶/ml eingesetzt.

(25)

3.2.6 MBP-spezifische und unspezifisch aktivierte T Zellen

Dem Medium für die Zellen aus den MBP transgenen Tieren wurde 3 µg/ml MBP-Peptid zugesetzt, um nur die MBP spezifischen T Zellen zur Proliferation anzuregen.

Zur unspezifischen Stimulation wurden die Zellen aus den B10.PL-Mäusen in T Zell Medium (5 ml/

well) mit 5 ng/ml phorbol myristate acetate (PMA) (Sigma) und 1 µg/ml Ionomycin (Sigma) für 2-12 Stunden inkubiert. Danach wurden durch zwei Zentrifugationsschritte die Agenzien wieder ausge- waschen.

Nach 48 Stunden wurde ein Teil der spezifischen und unspezifischen Zellen mit dem MACS- System nach CD4+ sortiert und die Kokultur mit den Hirnschnitten gestartet. Zur Charakterisierung der T Zellen wurden zum selben Zeitpunkt ca. 1 Millionen Zellen in 2% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei RT fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und in FACS-Puffer bis zur FACS-Analyse bei 4°C aufbewahrt. Die Überstände aus der Zellkultur wurden bei –20°C bis zum Test mit ELISAs (Punkt 3.3.2.) gelagert.

3.2.7 MBP- und OVA-spezifische Th1 und Th2 Zellen

Die Vorteile von OVA spezifischen gegenüber unspezifischen T Zellen bestehen darin, dass eine ZNS-Kreuzreaktion absolut ausgeschlossen werden kann, dass die Zellen antigenspezifisch stimu- liert werden können und mit einer zusätzlichen Gabe des OVA-Antigens während der Experimente die nicht-ZNS-spezifische Antigenabhängigkeit getestet werden kann.

Arbeitsschritt Medium/Puffer Menge Zeit Temperatur Zentrifugation Inkubation

(Proliferation)

Th1/Th2 Zytokine + 3 µg/ml MBP oder + 1 µg/ml OVA

5 ml pro well 2-3 Tage 37°C

Inkubation (Propagation)

cRPMI 100 U/ml IL-2

Die spezifische Restimulation erfolgt über die Präsentation von MBP- oder OVA-Peptid durch Anti- gen präsentierende Zellen aus den Milzen von Tieren des entsprechenden genetischen Hinter- grundstammes B10.PL oder BALB/c (siehe Punkt 3.2.3).

Bestrahlung, RPMI 10 ml ca. 15 min Auf Eis 26 Gray Zählen der APCs 1:2 RPMI und Try-

panblau

10 µl RT

Komprimieren der T Zellen

cRPMI 6 min RT 1100 rpm

Zählen 1:2 RPMI:Trypanblau 10 µl RT

Zusammenführen der APCs mit den kultivierten T Zellen (min 2:1)

cRPMI 10 ml Auf Eis

Komprimieren cRPMI 10 ml 6 min 4°C 1100 rpm

(26)

Aussäen der Zel- len in 6-well- Platten

1 x bis 2 x 10⁶Zellen/ml

Inkubation (Proliferation)

Inkubation (Propagation)

cRPMI 100 U/ml IL-2

2. Restimulation

Inkubation cRPMI + Antigen 24-48 h 37°C

Die zweite Restimulation erfolgt nur mit dem entsprechenden Antigen ohne Zytokine, da die T Zellen zu diesem Zeitpunkt schon in Th1 oder Th2 Richtung ausdifferenziert sind. 24-48 h nach der zweiten Restimulation wurden mit dem MACS-System die CD4+ Zellen separiert und mit den Hirnschnitten kokultiviert. Ein geringer Teil der Zellen wurde fixiert, in FACS-Puffer aufgenommen und bis zur Analyse mit dem Durchflusszytometer (FACS) bei 4°C gelagert. Der Überstand der Zel- len wurde für ELISA Tests (Punkt 3.3.2.) auf IFN-γ (Th1) und IL-4 (Th2) bei -20°C gelagert. Wurden die Zellen nicht sofort verwendet, konnten sie zum Zeitpunkt der Restimulation für spätere Versu- che in Gefriermedium (PBS, 1% FCS, 1% DMSO) eingefroren und bei –80°C (bis zu einer Woche) oder in flüssigem Stickstoff (mehrere Monate) gelagert werden.

3.2.8 MBP-, Copaxone 1- und OVA-spezifische T Zelllinien

Die T Zelllinien wurden aus Zellen generiert, die aus den abfließenden Lymphknoten von mit MBP, OVA oder Copaxone 1 immunisierten erwachsenen Lewis Ratten isoliert wurden (Ben-Nun 1982;

Moalem 1999). Das entsprechende Antigen wurde in PBS gelöst (1 mg/ml), mit incomplete Freunds adjuvant (Difco Laboratories, USA) emulgiert und mit 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (Difco) angereichert. Zehn Tage nach der Injektion in die Hinterläufe der Ratten (100 µl Emulsion), wurden die Ratten getötet, die abfließenden Lymphknoten entfernt und die Zellen vereinzelt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit dem entsprechenden Antigen aktiviert (10 µg/ml) und in Proliferationsmedium kultiviert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen in Propagationsmedium für weitere 4-10 Tage überführt. Anschließend erfolgte eine Restimulation mit ihrem Antigen (10 µg/ml) in Anwesenheit von bestrahlten Thymuszellen (10⁷ Zellen/ml; 2000 rad) in Proliferationsmedium.

Die Zelllinien konnten durch wiederholte Stimulation und Propagation expandiert werden. Die in diesem Experiment verwendeten Zelllinien wurden in Israel eingefroren, auf Trockeneis hierher transportiert, bei 37°C im Wasserbad aufgetaut und über Nacht in Propagationsmedium kultiviert.

Erst unmittelbar vor dem Beginn der Kokultur mit den Hirnschnitten, erhielten die Zellen ihr ent- sprechendes Antigen und bestrahlte Thymuszellen einer adulten Lewis Ratte als APCs. Die Kon- zentration der T Zellen auf dem Hirnschnitt betrug 30 000/5 µl und unter dem Hirnschnitt 500 000/ml. Der Versuchsablaufs ist auf der folgenden Seite in Abb. 5. zusammengefasst.

(27)

Abb. 5: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs.

(28)

3.3 Diagnostische Methoden

3.3.1 Immunhistochemie

Die Immunhistochemie nutz das Antigen-Antikörper-Prinzip. Der Antikörper für ein bestimmtes An- tigen einer Tierart (z.B. Maus-CD80) wird in einer anderen Tierart (z.B. Ratten) hergestellt. Dafür werden die Ratten mit dem Maus-Antigen immunisiert. Es findet eine Immunreaktion statt und die produzierten Antikörper (anti-Maus-CD80) können aus dem Blut der Ratten isoliert und aufgereinigt werden. Antikörper werden entweder direkt mit einer Fluoreszenz oder Biotin gekoppelt oder sie werden ungekoppelt angeboten. Die an ihr Antigen gebundenen biotinylierten AK wurden bei den Untersuchungen über einen Avidin-Biotin-Complex und das Chromogen 3,3’Diaminobenzidine (DAB) für die Durchlichtmikroskopie als schwarz/brauner Niederschlag sichtbar gemacht. Unge- koppelte primäre AK wurden mit einem sekundären, fluoreszierenden AK markiert, der sich gegen Immunglobuline der Tierart richtete, in welcher der primäre AK hergestellt wurde. Es folgt der Ab- lauf einer immunhistochemischen Färbung am Beispiel des Antikörpers Ratte-anti-Maus-B7-1 (CD80):

Arbeitsschritt Medium/Puffer Menge Zeit Temperatur Blockieren der endo-

genen Peroxidase

3% H2O2 in 0.1 M PB

150 ml in Küvette 20 min RT

Waschen 0.1 M PB 150 ml in Küvette 2 x 10 min RT/Schüttler Blockieren unspezifi-

scher Fc Bindungs- stellen

Fc-Block CD16/32 1:10 in 0.1 M PB

je 40 µl pro Schnitt auf Ob- jektträgern (OT)

30 min RT

Fc-Block entfernen ablaufen lassen RT

Inkubation mit primä- rem Antikörper

CD80, biotinyliert 1:100 in 0.1 M PB

40 µl pro Schnitt auf OT

über Nacht RT

Waschen 0.1 M PB 150 ml in Küvette 3 x 10 min RT/Schüttler sekundäre Kopplung

Avidin-Biotin- Komplex (ABC)

je 15 µl A und B Reagenz auf 1ml 0.1 M PB

1 h RT

Waschen 0.1 M PB 150 ml in Küvette 2 x 10 min RT/Schüttler Farbsubstratreaktion DAB 0,7 mg/ml;

H2O2 0,1%

in 0.1 M PB

ca. 10 min RT unter dem Ab- zug (DAB gilt als kanzerogen) Reaktion stoppen 0.1 M PB 150 ml in Küvette RT

Waschen 0.1 M PB 150 ml in Küvette 2 x 10 min RT/Schüttler Eindeckeln der OT Immumount,

Deckgläschen

2-3 Tropfen pro OT

RT

Trocknen über Nacht RT

(29)

Die folgenden Antikörper und Reagenzien wurden in meiner Arbeit verwendet:

Primäre Anti- körper

Host species Kopplung Verdünnung Firma Funktion

CD40 Ratte keine 1:100 Pharmingen,

USA

Kostimulation

ICAM-1 Ratte keine 1:100 Serotech,

USA

Adhäsion, Kostimulation

MHC-II Ratte Keine 1:100 Serotech Antigenpräsentati-

on/Aktivierung

B7-1 (CD80) Hamster Biotin 1:100 Pharmingen Kostimulation/Aktivierung B7-2 (CD86) Hamster Biotin 1:100 Pharmingen Kostimulation/Aktivierung CD16/32 Hamster keine 1:10 Pharmingen Fc-Rezeptor Block

Sekundäre AK und Reagen- zien

Host species Kopplung Verdünnung Firma

Anti-rat-Ig- Alexa 568

Ziege PE 1:200

(10 µg/ml)

MoBiTech

Strepavidine keine Texas Red

1:200 MoBiTech

ABC-Kit keine horse reddish peroxidase (HRP)

Vector Laboratories, UK

DAB keine keine 0.7 µg/ml Sigma

Marker Kopplung Verdünnung Firma Funktion

Mini Ruby Rhodamin und Biotin keine MoBiTech Anterograder Transport in Axonen im lebenden Schnitt

Propidiumjodid keine 5 µg/ml Sigma Marker für tote Zellen (DNA-Fragmente) – im lebenden Schnitt GFS-IB4 FITC oder Biotin 1:40 Sigma Mikrogliamarker

(30)

3.3.1.1 Bildgebende Verfahren – Mikroskopie

3.3.1.1.1 Konfokale-Laserscanner-Mikroskopie

Die Kolokalisation von Signalen wurde mit einem Leica DM IRBE inversen konfokalen Laserscan- ner-Mikroskop (Leica Camera AG, D), das mit einem Argon/Kryptonlaser, halbapochromatischen Objektiven (Plan Fluotar, Leica) mit numerischen Aperturen von 0,3 (10x), 1,0 (40x) und 1,3 (100x) und der Software ScanWare 5.10. ausgestattet war, dokumentiert. Die doppelt gefärbten und ein- gedeckelten 20 µm Schnitte wurden gleichzeitig durch zwei Filter mit den exitatorischen Wellenlän- gen 488nm und 568nm gescannt. Die Einstellungen der Detektionssysteme wurde mit Kontroll- schnitten überprüft, um auszuschließen, dass die Emissionen der kurzwelligen Fluochrome auch im langwelligen Bereich detektiert wurden und vice versa. Dazu wurden einfach-markierte Gewe- beschnitte mit beiden Anregungswellenlängen analysiert. Die Sensitivität der beiden Filter wurde so eingestellt, dass sie die Fluorochrome selektiv einzeln detektierten.

3.3.1.1.2 Fluoreszenz- und Durchlichtmikroskopie

Durchlicht- und Einzelfluoreszenzaufnahmen wurden mit einem Fluoreszenz- und Durchlichtmikro- skop aufgenommen, das mit drei Filtern (für grüne, rote und Doppeltfluoreszenz) und Objektiven mit 2,5x, 10x, 20x, 40x, 60x, 100x Vergrößerung ausgestattet war. An das Mikroskop (Olympus, BX50, Japan) war eine digitale Kamera (Olympus) angeschlossen, die mit der Software SensiCam 3.0 gesteuert wurde. Alle Aufnahmen wurden im Schwarz/Weiß Modus entweder mit 200x oder 400x Vergrößerung erstellt und als Bitmaps gespeichert. Die Bilder wurden in Photoshop 5.0 in den RGB-Modus umgewandelt und – wenn Kolokalisationen beobachtet werden sollten - übereinan- dergelagert.

Zur Dokumentation des Tracings oder der PI Färbung im lebenden Hirnschnitt wurde ein inverses Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskop (Olympus, IX70) verwendet, an das eine digitale Kamera (Olympus) angeschlossen war, die mit der Software SensiCam 3.0 gesteuert wurde. Die farbigen Aufnahmen wurden mit 25x oder 100x Vergrößerung durch einen Filter mit der exitatorischen Wel- lenlänge von 520-550nm gemacht. Sollte die Emission der Fluoreszenzen ausgewertet werden, wurden alle RGB-Bilder in Graustufenbilder umgewandelt (Photoshop 5.0) und mit dem Bildverar- beitungsprogramm Metamorph analysiert.

3.3.2 Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA)

Zur Detektion freigesetzter Zytokine wurden sogenannte „Sandwich-ELISAs“ eingesetzt. „Sand- wich-ELISAs“ bestehen im Prinzip aus zwei Antikörpern gegen dasselbe Antigen. Einer der beiden Antikörper ist als „capture“-Antikörper an ein Reaktionsgefäß (üblicherweise eine 96-well Zellkul- turplatte) gebunden. Nach Zugaben des zu vermessenden Zellkulturüberstandes fängt dieser Anti- körper das Antigen (hier Zytokine) aus der Lösung heraus. Nach Auswaschen des Zellkulturüber- standes wird der zweite „detecture“-Antikörper zugegeben, der das Antigen an einem anderen Epi- top bindet. An den zweiten Antikörper ist Horseradishperoxidase (HRP) gekoppelt. Nach der Zuga- be eines Chromogens, das durch HRP und ebenfalls zugesetztes Wasserstoffperoxyd zu einem