Die Bedeutung von E p s t e i n - B a r r - V i r u s - A n t i k ö r p e r n für Diagnose und Verlauf des Nasopharynxkarzinoms*

Laryng. Rhinol. 58(1979) 911-915

© Georg Thieme Verlag, Stuttgart

Die Bedeutung von E p s t e i n - B a r r - V i r u s - A n t i k ö r p e r n für Diagnose und Verlauf des Nasopharynxkarzinoms*

E. Wilmes, H. Wolf, F. Deinhardt, H. H. Naumann

HNO-Klinik (Direktor: Prof. Dr. H. H. Naumann) und Max-von-Pettenkofer-lnstitut (Direktor: Prof. Dr. F. Deinhardt) der Universität München

Zusammenfassung

Es besteht eine evidente K o r r e l a t i o n zwischen Nasopharynxkarzinomen u n d dem Auftreten von Epstein - B a r r - V i r u s - spezifischen Antikörper- mustern. U m d i e Aussagekraft derartiger A n t i - körperspektren näher zu überprüfen, wurden Seren von Patienten mit einem histologisch gesicherten Nasopharynxkarzinom ( N P C ) untersucht. U n t e r V e r w e n d u n g der indirekten u n d antikomplemen- tären Immunfluoreszenz wurden d i e T i t e r v o n Antikörpern verschiedener Klassen ( I g A , I g G , IgM) gegen EBV-spezifische Antigene überprüft.

D i e EBV-spezifischen Antikörperspektren unter- scheiden sich signifikant von denen gesunder P e r - sonen sowie von Patienten, die an einem anderen malignen T u m o r i m K o p f - H a l s - B e r e i c h erkrankt sind. V o n besonderer Aussagekraft - auch i m E i n - zelfall - sind IgA-Antikörper gegen das frühe A n t i g e n ( E A ) und gegen V i r u s - K a p s i d - A n t i g e n ( V C A ) . So bietet die Bestimmung von I g A - A n t i - körpern gegen E B V - V i r u s - K a p s i d - A n t i g e n bei der Primärtumorsuche bei Halslymphknotenmetastasen einen weiteren wertvollen H i n w e i s auf das V o r - liegen eines N P C . Es scheint, daß diese Antikör- per nach erfolgreicher Behandlung des N P C a b - sinken, ein Wiederanstieg k a n n daher für das Auftreten eines Rezidivs sprechen.

Significance of Virus-Specific Antibodies to EBV-Antigens in Patients with Nasopharyngeal Carcinoma

Sera collected from patients w i t h nasopharyngeal Carcinoma, patients w i t h other head a n d neck neoplasms, patients with infectious mononucleosis (IM), and healthy donors were titrated for a n t i - bodies ( I g M , I g G , IgA) against E p s t e i n - B a r r - V i r u s ( E B V ) specific antigens ( V C A , E A , E B N A ) by indirect and by antikomplementary i m m u n - fluorescence. N P C - p a t i e n t s develop significantly high a n t i - E B V titers of I g G and I g A . I n contrast patients with neoplasms (mainly carcinomas) aris- i n g i n sites of the head and neck other than the nasopharynx revealed a lower incidence of high titers. O u r results emphasize the remarkable pre- dominance of IgA-antibodies to V C A and E A i n N P C - p a t i e n t s and shows that Europeans do not differ i n that respect from A s i a n patients. T h e significance and implications of these findings are discussed.

Einleitung

Durch Arbeiten von Old (8) und Henle (2, 3, 4, 5, 6), die hohe Antikörpertiter gegen E p - stein-Barr-Virus ( E B V ) bei Patienten mit

* Auszugsweise vorgetragen auf der 63. Jahres- tagung der V e r e i n i g u n g Südwestdeutscher H a l s - Nasen-Ohrenärzte i n Freiburg, 21.-23. 9. 1979.

D i e A r b e i t e n wurden unterstützt durch die deut- sche Krebshilfe (Tumorzentrum München), durch Stiftungsmittel der Universität München u n d die D F G ( W o 227/2).

D i e A u t o r e n danken F r a u G . Pleyl für ihre v o r - zügliche technische H i l f e .

Karzinomen des Nasopharynx ( N P C ) fanden, haben sich die Indizien für eine Assoziation von Epstein-Barr-Virus u n d Nasopharynx- karzinomen gehäuft. Molekularbiologische Untersuchungen, wie der Nachweis viraler D N A durch Wolf u . Mitarb. i n den epi- thelialen Zellen des N P C (12, 13), unterstüt- zen die Annahme, daß E B V ein entscheiden- der Faktor i n der Entstehung des Naso- pharynxkarzinoms ist.

Während bisher hauptsächlich I g G - A n t i - körper gegen E B V untersucht wurden, berich-

teten G . und W. Henle 1976 zum ersten M a l e auch über erhöhte IgA-Antikörpertiter gegen E B V bei dieser Erkrankung (2).

U m die Aussagekraft solcher serologischen Untersuchungen zu prüfen und um deren G ü l - tigkeit auch für eine nicht asiatische P o p u l a - tion zu kontrollieren, haben wir Patienten mit frisch erfaßten Nasopharynxkarzinomen so- wie behandelte und klinisch rezidivfreie P a - tienten untersucht. A l s serologische Parame- ter wurden die T i t e r von I g G , I g M u n d I g A - Antikörpern gegen Kapselantigene ( F i r u s - Capsid-^lntigen = V C A ) , von I g G und I g A - Antikörpern gegen das frühe Antigen (Early Antigen = E A ) und von IgG-Antikörpern gegen das £pstein-ßarr-spezifische mikleäre Antigen ( E B N A ) bestimmt.

Z u m Vergleich wurden drei Kontrollgrup- pen untersucht:

1. Patienten mit anderen malignen T u m o r e n im Kopf-Hals-Bereich,

2. Patienten mit infektiöser Mononukleose, 3. Patienten mit ähnlicher Alters- und G e -

schlechtsverteilung wie die Patienten mit Nasopharynxkarzinomen.

Methodik

Für den Test der Seren auf Antikörper gegen V C A und gegen das frühe A n t i g e n ( E A ) wurden indirekte Immunfluoreszenzteste verwendet (7).

A l s V C A - A n t i g e n dienten 3 T a g e alte P 3 - H R 1- Z e l l e n mit 5 - 1 0 % V C A positiven Z e l l e n . A l s E A wurden aktiv wachsende R a j i - Z e l l e n verwendet, die vor der Präparation 2-3 T a g e mit 25u.g/ml Joddesoxyuridin u n d 0,5 °/o eines Schafserums mit Antikörpern gegen menschliches I g M behandelt wurden (8). D i e antigentragenden Z e l l e n w u r d e n auf Objektträger mit aufgesprühten T e f l o n a b g r e n - zungen gebracht, mit einem Gebläse luftgetrock-

net und 10 m i n bei 20° i n A c e t o n fixiert. A l s Konjugat für den V C A - T e s t wurde eine 1:50 v e r - dünnte Lösung v o n fluoreszenzmarkiertem A n t i - H u m a n - I g A v o m Kaninchen verwendet. A l s K o n - jugat für den E A - T e s t wurde eine 1:50 verdünnte Lösung v o n fluoreszenzmarkiertem A n t i - H u m a n - I g G vom Kaninchen verwendet. Antikörper gegen E B N A wurden nach der Methode v o n Reedman und Klein (9) bestimmt.

A l s A n t i g e n w u r d e n R a j i - Z e l l e n verwendet, die 3 m i n mit A c e t o n / M e t h a n o l 1:1 fixiert wurden.

A l s Konjugat wurde eine 1:50 verdünnte Lösung

von fluoreszenzmarkiertem A n t i - H u m a n - K o m p l e - ment C³ (produziert i n Ziegen, H y l a n d / D i v . T r a - venol/Cost M e s a / C a l i / U S A ) verwendet. D e r I g A - Test wurde wie der I g G - T e s t durchgeführt. A l s K o n j u g a t wurde eine 1:50 verdünnte Lösung v o n fluoreszenzmarkiertem A n t i - H u m a n - I g A v o m K a - ninchen verwendet. Für den I g M - T e s t auf V C A wurden 7 T a g e alte Z e l l e n der gleichen A r t wie für den I g G - T e s t verwendet. D i e F i x i e r u n g und A u f - bewahrung wurde jedoch nach Schmitz (10) m o d i - fiziert. Das Serum wurde 3 Std. mit dem A n t i g e n bei 37 ° C inkubiert. A l s K o n j u g a t für den I g M - Test wurde eine 1:50 verdünnte Lösung v o n f l u o - reszenzmarkiertem A n t i - H u m a n - I g M v o m K a n i n - chen verwendet. W e n n nicht anders angegeben, wurden die fluoreszenzmarkierten Antikörper von D A K O , Kopenhagen, bezogen.

D i e Tests w u r d e n mit einem Zeiss-Forschungs- mikroskop III mit 50 W H g Hochdrucklampe mit dem Filtersatz, bestehend aus: Erregerfilter B P 450-490; Farbteiler F T 510; Sperrfilter L P 520, einem 25/0,80 W W a s s e r - G l y c e r i n - ö l oder 25/0,60 L u f t O b j e k t i v bei 325facher Endvergrößerung, abgelesen.

Ergebnisse

D i e Ergebnisse sind aus den A b b . 1 u n d 2 zu entnehmen. Jeweils links sind die Patienten mit Nasopharynxkarzinomen und rechts die K o n t r o l l - populationen aufgetragen. D i e N a s o p h a r y n x k a r - zinome sind dabei noch einmal unterteilt i n drei G r u p p e n :

1. Tumortragende Patienten.

2. V o r längerer Z e i t (1-6 Jahre) behandelte, k l i - nisch rezidivfreie Patienten.

3. D i e Gesamtzahl aller N P C - P a t i e n t e n , wobei hier bei zeitlich gestaffelten Mehrfachunter- suchungen jeder W e r t berücksichtigt wurde.

Zu Abb. 1:

a) Antikörper gegen #pstein-#arr-spezifisches mikleäres A n t i g e n (EBNA).

W e g e n seiner Lokalisation am K e r n w i r d dieses A n t i g e n Epstein-Barr-spezifisches nukleares A n t i - gen genannt. D i e T i t e r bei N P C - P a t i e n t e n be- wegen sich zwischen 1:16 u n d 1:2048. D i e K o n t r o l - len sind deutlich niedriger, nur 1 Patient mit einer infektiösen Mononukleose (IM) hatte T i t e r v o n 1:256.

b) Antikörper gegen das frühe Antigen (EA) IgG-Antikörper gegen E A sind bei allen an N P C erkrankten Patienten deutlich gegenüber den K o n t r o l l e n erhöht. N u r die I M bildet eine A u s - nahme und zeigt ebenfalls erhöhte Antikörper- titer.

NPC Patienten Test Ko n t rollen

1

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A b b . 1 Vergleich v o n IgG-Antikörpern gegen EB-spezifisches Kernantigen ( E B N A ) u n d v o n I g G - u n d IgA-Antikörpern gegen frühes A n t i g e n ( F A ) bei Patienten mit Nasopharynxkarzinomen u n d K o n - trollpopulationen.

NPC Patienten Test Ko nt rollen

1

| — frische NPC F ä l l e

| = alte NPC Fälle

| ,,.*„, alle NPC Fälle

1

1

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: 1 andere Tumoren j i mmm i n f e k t i ö s e Mononukleose II gesunde Personen

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A b b . 2 Vergleich v o n I g M - , I g G - u n d IgA-Antikörpern gegen EBV-spezifische Kapselantigene ( V G A ) bei Patienten mit Nasopharynxkarzinomen u n d Kontrollpopulationen.

c) IgA-Antikörper gegen E A entwickeln n u r etwa die Hälfte aller N P C - P a t i e n t e n .

In den K o n t r o l l e n finden sich keine I g A - A n t i - körper gegen E A . D a s V o r l i e g e n v o n I g A - A k gegen E A spricht daher eindeutig für ein N P C , der negative A u s f a l l des Testes aber nicht d a - gegen.

Zu Abb. 2:

D i e A b b . 2 zeigt die T i t e r der drei untersuchten Antikörperklassen I g M , I g G u n d I g A gegen das V i r u s - K a p s i d - A n t i g e n ( V C A ) .

a) IgM-Antikörper gegen VCA sind bei einer frischen Infektion durch E B V , das heißt, bei einer infektiösen Mononukleose i n der M e h r z a h l v o r -

handen. V o r allem bei älteren Patienten u n d chro- nisch K r a n k e n können Rheumafaktoren zu falsch positiven Befunden führen. B e i einigen N P C - P a - tienten w a r dies der F a l l , d a nach E l i m i n a t i o n der Rheumafaktoren durch A d s o r p t i o n an L a t e x der I g M - T e s t negativ ausfiel. N u r wenige Patienten hatten IgM-(VCA-)Antikörper gebildet. I g M - Antikörper sind somit ohne Bedeutung für den serologischen Nachweis eines N a s o p h a r y n x k a r z i - noms.

b) IgG-Antikörper persistieren nach einer Infek- tion lebenslang. Während sie bei einer infektiösen Mononukleose immer erhöht sind, finden sich auch bei den anderen K o n t r o l l e n gelegentlich erhöhte Titer. B e i N P C - P a t i e n t e n finden sich zum T e i l extrem hohe T i t e r bis 1:16 384. IgG-Antikörper sind somit für N P C - P a t i e n t e n signifikant, aber i m E i n z e l f a l l der serologischen A u s w e r t u n g ohne wesentliche Bedeutung.

c) IgA-Antikörper gegen V C A entwickelten alle N P C - P a t i e n t e n . V o n den Kontrollpopulationen waren i m F a l l e der I M gelegentlich u n d vorüber- gehend niedere T i t e r von I g A ( V C A ) nachzuwei- sen. B e i den anderen K o n t r o l l e n sind nur selten und kaum signifikante T i t e r gefunden worden.

Dagegen waren nur 2 Patienten mit N a s o p h a r y n x - karzinomen i n diesem Test negativ. Sie waren i n - sofern eine Ausnahme, als sie an einem ausge- dehnten, die Schädelbasis infiltrierenden K a r z i - nom litten, an dem sie kurz nach der Blutentnahme verstarben. L y m p h k n o t e n waren keine vorhanden.

Möglicherweise handelt es sich hier u m einen Z u - sammenbruch des Abwehrsystems, der zu einem Erliegen der Antikörperproduktion führte.

IgA-Antikörper gegen V C A sind unserer M e i - nung nach ein überzeugender H i n w e i s auf das V o r l i e g e n eines N P C .

Diskussion

A u s unseren Untersuchungen geht hervor, daß Patienten mit Nasopharynxkarzinomen deutlich erhöhte T i t e r von Antikörpern ver- schiedener Klassen gegen unterschiedliche E B V - A n t i g e n e entwickeln.

Beweisend für das Vorliegen eines N P C sind insbesondere Antikörper der IgA-KIasse gegen das frühe A n t i g e n ( I g A - E A ) sowie ge- gen das V i r u s - K a p s i d - A n t i g e n ( I g A - V C A ) . IgG-Antikörper gegen E A , V C A und E B N A sind ebenfalls meist deutlich erhöht. Sie sind jedoch auch bei Kontrollpopulationen zu f i n - den und damit für die Diagnose i m E i n z e l -

fall - darauf kommt es uns besonders an - von geringerem W e r t . Statistisch gesehen sind sie jedoch signifikant.

Bedenkt man, daß in 8 % der Fälle zervi- kaler Metastasierungen zunächst kein Primär- tumor gefunden werden kann (1), so bietet die serologische Untersuchung auf IgA-Antikör- per eine wertvolle Ergänzung klinischer, op- tischer und endoskopischer Untersuchungs- methoden. Insbesondere beim lymphoepithe- lialen K a r z i n o m erscheint dies bedeutungs- voll, da dieses sich nicht selten subepithelial unauffällig in der Rosenmüllerschen Grube entwickelt.

D i e bisherige Erfassung und Beobachtung (Beginn der Studie: Frühjahr 1978) von ca.

55 unbehandelten und behandelten sowie k l i - nisch rezidivfreien Nasopharynxkarzinom- patienten lassen zudem einen A b f a l l der I g A - Antikörper nach erfolgreicher Behandlung erkennen. Trotz der relativ kurzen Dauer der Studie von ca. 1,5 Jahren konnten bei zu- nächst klinisch rezidivfreien Patienten erneute Titeranstiege festgestellt werden. In einigen Fällen war die eingeleitete Suche nach einem Rezidiv positiv.

Sollten sich unsere Beobachtungen über einen längeren Zeitraum und an einem größeren Patientengut weiter erhärten, so wäre die B e - stimmung von Antikörperspektren gegen E B V und insbesondere von IgA-Antikörpern ge- gen V C A ein ausgezeichnetes Hilfsmittel für die Unterstützung der primären Diagnose und vorzüglich geeignet für die Überwachung und Verlaufskontrolle behandelter Patienten. D a E B V - D N A regelmäßig in den epithelialen Z e l l e n des N P C nachgewiesen werden konnte (12, 13), liegt hier ein Test vor, der mit gro- ßer Wahrscheinlichkeit direkt mit einem ätio- logisch wichtigen Agens ( E B V ) des N P C kor- reliert.

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11 Tovey, M. G., G. Lenoir, J. Begon-Lours: A c t i v a t i o n of latent E p s t e i n - B a r r - v i r u s by antibody to human I g M . Nature (Lond.) 276 (1978) 270

12 Wolf, H., H. zur Hausen, V. Becker: E B viral genomes im epiitheiliail niasopharynge'al cardin/oma cell®. Nature (Lond.) 244 (1973) 245

13 Wolf, H., H. zur Hausen, G . Klein, V. Becker, G . Henle, W. Henle: Attempts to detect virus-speeifie D N A sequen- ces in human tumors. III. E p s t e i n - B a r r - v i r a l D N A i n , non-lymphoid nasopharyngeal Carcinoma cells. M e d . M i c r o b i o l . Immunol. 161 (1975) 15

Dr. E. Wilmes, Univ.-HNO-Klinik, Klinikum Großhadern, Marchioninistr. 15, 8000 München 70 Dr. H. Wolf, Max-von-Pettenkofer-Institut, Pettenkoferstraße 9 a, 8000 München 2