Herbstsemester 2013
Analytische Chemie
(für Biol. / Pharm. Wiss.)
Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)
Dr. Martin Pabst
ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Pabst, martin.pabst@org.chem.ethz.ch
HCI D323
martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/
Übersicht Elektrophorese:
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• Gel-Elektrophorese
• Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
• Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
• Kapillarelektrophorese (CE)
• Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
• Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
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Kapillarelektrophorese
(capillary electrophoresis = CE)
Migration eines Ions im elektrischen Feld E
Analyten müssen „geladen“ sein (basische oder acide Analyten) Elektrophorese ist keine
Chromatographie!
Adenosine Triphosphate Neuraminsäuren
CE: Theoretische Grundlagen
µ EP = v
E = Geschwindigkeit eines Ions
Elektrische Feldstärke = e 6 π ⋅
1 η ⋅
z r
e ... Elementarladung
η ... Viskosität der Pufferlösung
z ... Ladung des Ions
r ... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions
Elektrophoretische Mobilität µ EP eines Ions im elektrischen Feld E
K o n s ta n te P u ff e rl ö s u n g Io n ( A n a ly t)
Trennung aufgrund von Ladung und
Grösse der Ionen
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CE: Theoretische Grundlagen
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Migration der Ionen im elektrischen Feld
+ –
A n o d e K a th o d e
Nach dem Probeneinlass wird Spannung angelegt (bis zu 30.000V) Analytionen trennen sich nach Ladung (und Grösse)
Analyt - Analyt +
Analyt -
Analyt +
Analyt +
Analyt -
µ
EP=vE=
Geschwindigkeit eines Ions Elektrische Feldstärke
= e6 π
⋅1 η
⋅z r
Anionen wandern in Richtung Anode und
Kationen in Richtung Kathode
Man würde in diesem Fall nur die Kationen detektieren…
Probeneinlass
Analyt -
Detektor
CE: Theoretische Grundlagen
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Elektroosmotischer Fluss (EOF) bei Quartzkapillaren
+ –
A n o d e K a th o d e
EOF
Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF).
Quarzkapillare (SiO
2)
Quarzkapillare (SiO
2)
Analyt - Analyt +
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Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
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K a ti o n e n N e u tr a le M o le k ü le (u n g e tr e n n t) A n io n e n
• Trennung von
Kationen und Anionen
• Neutrale Moleküle verlassen ungetrennt mit dem EOF die Kapillare
• Detektor wegen EOF kathodenseitig angebracht
• Nur Anionen, die schneller als der EOF wandern, erreichen den Detektor nicht
Aufbau eines CE Systems:
Fused silica capillaries High voltage power supply
(with platin electrodes)
2 x glass vials
A) B)
C)
A
B B
C
D)
D) Detector
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Detektion:
In der Regel UV Detektoren Kopplung an Massen-
Spektrometrie ist schwierig
Trennung:
Spannung (+/-) Kapillarlänge Puffer
Trennung von Metaboliten:
75cm Kapillare
Voltage: -15/-20/-25/-30 Ammonia bicarbonate EOF block, pumping
CE: Beispiel
Elektropherogram
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