Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie (Direktor: Prof. Dr. med. M. Ochs)
der Medizinischen Hochschule Hannover
Mesenteric lymph nodes are not required for an intestinal IgA response to oral cholera toxin
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
Vorgelegt von: Anika Hahn aus Braunschweig
Hannover 2010
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 07.10.2010 Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer der Arbeit: Professor Dr. med. Reinhard Pabst
Dr. rer. nat. Ulrike Bode
Referent: Prof. Dr. med. Heike Nave
Korreferent: Prof. Dr. med. Mathias Hornef
Tag der mündlichen Prüfung: 07.10.2010
Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. Ernst Ungewickell
Prof. Dr. Johannes Gessner
Prof. Dr. Georg Behrens
Titel Seite
1. Einleitung
1.1 Aufbau des Immunsystems 1
1.2 Die Immunantwort 2
1.3 Das Immunsystem des Darms 5
a) Aufbau 5
b) Ablauf einer Immunantwort 6
c) Mesenteriale Lymphknoten und Peyer’s Patches 7
d) Wege der B-Zellen 8
1.4 Aufbau und Funktion der Milz 10
1.5 Fragestellung der Arbeit 12
2. Publikation „Mesenteric lymph nodes are not required for an intestinal IgA 13 response to oral cholera toxin“
Hahn A., Thiessen N., Pabst R., Buettner M., Bode U.; Immunology, 2009
Summary 13
Introduction 13
Materials and methods 14
Animals 14
Intestinal surgery and cholera toxin administration 14
Flow cytometry 15
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 15
Immunohistology 15
Results 16
Discussion 20
Acknowledgements 21
Disclosure 21
References 22
Supplemental Data 23
3. Diskussion 24
4. Zusammenfassung 26
5. Literaturverzeichnis 28
6. Lebenslauf 30
7. Erklärung nach §2 Abs.2 Nr.5 und 6 PromO 32
8. Danksagung 33
1. Einleitung
1.1 Aufbau des Immunsystem
Jeden Tag ist der Körper den unterschiedlichsten Einflüssen der Umwelt ausgesetzt. Das Immunsystem hat die Aufgabe den Körper vor schädlichen Einflüssen zu schützen. Es kann unterteilt werden in primäre und sekundäre lymphatische Organe, denen unterschiedliche Aufgaben zugeschrieben werden. Die primären lymphatischen Organe, wie Thymus und Knochenmark, sind verantwortlich für die Bildung und Reifung von Lymphozyten und der anschließenden Abgabe an die Blutbahn. Diese so genannten naiven Lymphozyten zirkulieren durch den Körper und passieren auf ihrem Weg regelmäßig die sekundären lymphatischen Organe, zu denen Lymphknoten (LN), Milz und Schleimhaut assoziierte lymphatische Gewebe (MALT= mucosa associated lymphatic tissue) wie zum Beispiel Tonsillen und Peyer’sche Platten (PP = Peyer’s Patches) zählen. In den sekundären lymphatischen Organen als Orten der adaptiven (spezialisierten) Immunantwort werden den naiven Lymphozyten aufgenommene Antigene präsentiert. Passen ein Lymphozyt und ein Antigen nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip ihrer Oberflächenstrukturen zueinander, so wird der entsprechende Lymphozyt aktiviert und eine spezifische Immunantwort gegen das Antigen ausgelöst.
Eine weitere Unterteilungsmöglichkeit des Immunsystems ist die Spezifität. Die Zellen des angeborenen Immunsystems sind unter anderem die Phagozyten (Granulozyten,
Makrophagen) und die Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) sowie die Epithelien mit antimikrobiellen Substanzen und das Komplementsystem. Diese wirken unspezifisch gegen allgemeine Erregermerkmale. Die Plasmaproteine des Komplementsystems haben vielfältige Aufgaben inne. Zum einen können die Proteine Poren in die Membranen von Bakterien einfügen, was zu einer gesteigerten Permeabilität und somit zur Zerstörung der Bakterien führt. Zum anderen sind sie in der Lage die Oberflächen von Antigenen zu bedecken und somit für die Phagozyten zu markieren (Opsonierung). Außerdem lösen sie eine
Inflammationsreaktion aus.
Das erworbene Immunsystem bestehend aus CD4 T-Lymphozyten, CD8 T-Lymphozyten und Plasmazellen, entwickelt sich erst nach dem Kontakt mit einem Antigen (AG) und wirkt dann spezifisch gegen diesen Erreger. Für diese Zellen werden die Antigene in speziellen
Oberflächenmolekülen von so genannten antigenpräsentierenden Zellen (APC) präsentiert. Zu den APC gehören vor allem die Dendritischen Zellen (DC) aber auch Makrophagen [1].
1.2 Die Immunantwort
Kommt es zum Kontakt zwischen Erreger und Körper, so sieht sich der Erreger zunächst dem unspezifischen Immunsystem konfrontiert. Die Haut mit ihrem Säureschutzmantel oder die Zilien der Schleimhautoberflächen bilden die erste Barriere gegen das Eindringen (Abb.1 Nr.1). Gelangen beispielsweise Bakterien dennoch in den Körper, so versuchen Granulozyten und Makrophagen die fremden Antigene zu phagozytieren und zu lysieren (Abb.1 Nr.2).
Makrophagen sind außerdem in der Lage genau wie die Dendritischen Zellen,
charakteristische Merkmale des jeweiligen Erregers durch MHC II Molekülen (Major Histocompatibility Complex II) auf ihrer Oberfläche zu präsentieren (Abb.1 Nr.3). MHC II präsentierte Antigene auf DC und Makrophagen werden von den naiven antigenspezifischen CD4 positiven T-Zellen der spezifischen Abwehr erkannt, was diese zu Effektorlymphozyten aktiviert und zur Proliferation anregt. Die CD4 positiven Effektor-T-Zellen (T-Helferzellen) wandern schließlich in die Peripherie, wo sie wiederum weitere Makrophagen der
unspezifischen Abwehr aktivieren (Abb.1 Nr.5) oder mit den für das Antigen spezifischen B- Zellen (spezifische Abwehr) interagieren (Abb.1 Nr.4) und diese zur Differenzierung zu Plasmazellen anregen (Abb.1 Nr.6). Die Plasmazellen produzieren schließlich speziell gegen den Erreger gerichtete Antikörper (Abb.1 Nr.7). Die Aufgaben der Antikörper sind vor allem Neutralisierung (Verhinderung des Ansetzens von Toxinen, Viren oder Bakterien an
Körperzellen), Opsonierung (Markierung der Antigene für Phagozyten) und Komplementaktivierung.
Jede körpereigene Zelle besitzt auf ihrer Oberfläche den Major Histocompatibility Complex I (MHC I). Wird die Zelle von Viren infiziert, so werden die Antigene durch MHC I präsentiert und für das AG spezifische CD8 positive T-Zellen (der spezifischen Abwehr) werden
aktiviert, zur Proliferation angeregt, wandern dann in die Peripherie und zerstören dort die die befallenen Zellen (Abb.1 Nr.10,11). Einige Viren haben jedoch die Fähigkeit entwickelt, die MHC I- Präsentation zu verhindern und entgehen auf diese Weise der Zerstörung durch die CD8 positiven T-Zellen. Um dieser Viren dennoch Herr zu werden, verfügt das Immunsystem über die Natürlichen Killerzellen. Diese Zellen sind Teil des unspezifischen, angeborenen Immunsystems und reagieren auf vermindertes Vorkommen von MHC I auf der Oberfläche von Zellen. Sie leiten bei den betroffenen Zellen die Apoptose ein (Abb.1 Nr.12, 13) [1].
Abb.1 : Schema Auslösen einer Immunantwort (modifiziert nach [1])
Haut/ Schleimhaut
Plasmazelle
Y Y YYY
Y Antikörper
Viren
Körpereigene Zelle CD8 pos. T-Zelle NK-Zelle
Bakterien
Granulozyt Makrophage
CD4 pos. T-Zelle B-Zelle
Dendritische Zelle
Unspezifische Abwehr Spezifische Abwehr
Y Y YY
Y Y
1
1
2
2
3 4
5
6 7
8
4
10
11
9 3
angeborener, unspezifischer Teil des Immunsystems
Aktivierung durch Aufgabe
Haut, Schleimhaut keine spezielle Aktivierung Barriere und mit antimikrobiellen Substanzen
Komplementsystem (Plasmaproteinsystem)
Antikörper Markierung (klassisch),
Fremdoberflächen(alternativ), Lektin-Weg (bakt.
Peptidoglykane)
Zerstörung der Zielzelle durch Porenbildung in der Zellmembran, zusätzlich Markierung der Erreger für Phagozyten, Auslösen
Entzündungsreaktion Phagozyten (Granulozyten,
Makrophagen)
keine spezielle Aktivierung, Verstärkung Makrophagen durch CD4 pos. T-Zellen
Phagozytose und Aktivierung
bakterizider Funktionen, Makrophagen zusätzlich AG Präsentation
Natürliche Killerzellen/ NK-Zellen verminderte MHC I Expression auf der Zelle
Freisetzung lytischer Granula zur Tötung virusinfizierter Zellen
erworbener, spezifischer Teil des Immunsystems
Aktivierung durch Aufgabe
CD4 positive T-Lymphozyten/ T- Helferzellen
in MHC II präsentierte AG Aktivierung B-Zellen (TH1-Zellen), Aktivierung Makrophagen (TH2- Zellen)
CD8 positive T-Lymphozyten/
zytotoxische T-Zellen
in MHC I präsentierte AG Zytotoxische Funktion, zerstören Zielzelle
B-Lymphozyten CD4 pos. T-Zellen Differenzieren zu Plasmazellen, welche Antikörper produzieren
Tab. 1: Übersicht Bestandteile Immunsystem und deren Aufgaben (modifiziert nach [1])
1.3 Das Immunsystem des Darms
a) Aufbau
Die Hauptkontaktflächen des Körpers mit Antigenen sind, anders als man zunächst vermuten würde, jedoch nicht die oberflächliche Haut sondern die Schleimhäute von Bronchialsystem und vor allem Darm [2].
Ein näherer Blick auf das Darmlumen zeigt zahlreiche Stoffe, die potentiell als Antigene wirken können wie Nahrungsbestandteile, kommensale Bakterien und tatsächliche Pathogene [2]. Von elementarer Bedeutung ist hier der Wandaufbau des Darms in seinen drei Schichten:
Schleimhaut (Mucosa), Muskelschicht (Muscularis) und der äußeren Serosa. Das nur einschichtige Epithel der Darmschleimhaut hat zwar unbestrittene Vorteile in der
Nahrungsresorption, birgt aber deutliche Risiken für das Eindringen von Erregern. Während eine reine Toleranz den Bestandteilen gegenüber mit einem lebensgefährlichen Immundefizit einherginge, käme ein überaktives Immunsystem einer Autoimmunerkrankung gleich. Aus diesem Grunde ist für die Entscheidung zwischen Induktion, Toleranz und Auslösen einer Immunantwort ein ausbalanciertes, genau reguliertes Immunsystem nötig [1,2].
Die Induktion oraler Toleranz wird, wie erst in den vergangenen Jahren nachgewiesen, vor allem den mesenterialen Lymphknoten (mLN) zugeschrieben, die durch Dendritische Zellen (DC) aktiviert werden, welche ihnen Antigene aus der intestinalen Mukosa präsentieren [3, 4]. Nach den bisherigen Erkenntnissen sind sie zusätzlich, neben den Peyer’s Patches (PP), eine der primären Filterstationen für Antigene aus dem Darm und mitverantwortlich für die charakteristische Immunantwort in Form von sezernierten Immunglobulin A (IgA) Dimeren auf der Schleimhaut [5,6].
Die wichtige Rolle des IgA ist vor allem auf die großen Antigen-Kontaktflächen, welche die Schleimhäute bieten, zurückzuführen. Aus diesem Grund ist IgA und nicht das im Serum vorkommende IgG, das am häufigsten im Körper vorkommende Immunglobulin [5, 7]. Die Aufgabe der IgA besteht vor allem in der Neutralisierung von Antigenen und Verhinderung von deren Eindringen durch die Körperoberflächen [6].
b) Ablauf einer Immunantwort
Bei einer Immunantwort nehmen Dendritische Zellen (DC) die Antigene auf und
transportieren sie in die mesenterialen Lymphknoten (s.Abb.2) [9-11]. Auch können Antigene von im Domareal der Schleimhaut über den Peyer’s Patches befindlichen M-Zellen resorbiert werden, von wo sie zunächst direkt in die Peyer’s Patches und anschließend in die
mesenterialen Lymphknoten gelangen (s. Abb.2) [1, 5, 12]. In den lymphatischen Geweben werden die Antigene präsentiert. Erfolgt die Antigenpräsentation durch MHC I (bei Viren), so werden naive CD8 positiven zytotoxischen T-Zellen zur Proliferation aktiviert, die dann als Effektorlymphozyten über die efferente Lymphe wieder ins Intestinum gelangen und dort neutralisierend wirken [1]. MHC II präsentierte AG (bei Bakterien) aktivieren naive CD4 positive T-Helferzellen, die ebenfalls proliferieren und dann ihrerseits Makrophagen zur Phagozytose und außerdem B-Zellen aktivieren. Es erfolgt das Auslösen einer spezifischen Immunantwort mit IgA, dem typischen Immunglobulin der mucosalen Immunantwort durch Proliferation der B -Zellen in den Lymphknotenfollikeln, die später zu Plasmazellen reifen, in die Lamina propria des Darms zurückwandern und dort Antikörper produzieren [5, 13, 14, 15].
Abb. 2: Weg der intestinalen Antigene zu den mesenterialen Lymphknoten (modifiziert nach [3])
other B cell M cell
c) Mesenteriale Lymphknoten und Peyer’s Patches
Zu den wesentlichen Bestandteilen des Darmimmunsystems gehören die mesenterialen Lymphknoten sowie die Peyer’s Patches. Die mesenterialen Lymphknoten (s.Abb.3) bestehen wie die anderen Lymphknoten des Körpers auch, aus drei Bereichen. Im Rindenbereich (Cortex) befinden sich Ansammlungen von B-Zellen (Follikel). Im Übergangsbereich (Paracortex) haben sich die T-Zellen angesiedelt und im Mark (Medulla) findet man unter anderem Plasmazellen. Antigenpräsentierende Zellen wie zum Beispiel Dendritische Zellen, oder lösliche Antigene gelangen über die afferente Lymphe in den Lymphknoten. Im
Paracortexbereich treten sie in Kontakt mit den antigenspezifischen T-Zellen, welche dadurch aktiviert werden. Die CD4 positiven T-Zellen (T-Helferzellen) aktivieren nun ihrerseits die zugehörigen antigenspezifischen B-Zellen, die in den Follikeln beginnen zu proliferieren.
Diese Ansammlung proliferierender Zellen im Follikel werden als Keimzentrum bezeichnet und kennzeichnen eine Immunaktivierung des Lymphknotens gegen Antigene. Einen Follikel mit Keimzentrum nennt man nicht mehr länger Primär- sondern Sekundärfollikel [1]
Abb. 3: Aufbau eines Lymphknotens (modifiziert nach [8])
Afferente Lymphgefäße
Efferentes Lymphgefäß
Cortex mit Follikeln (B-Zellbereich)
Paracortex (T-Zellbereich)
Medulla (Plasmazellen)
Arterie/Vene
Die Peyer’s Patches sind den mLN im Aufbau und Funktion sehr ähnlich (s. Abb.3). Unter der sich domartig vorwölbenden Schleimhaut, welche in diesem Bereich keine Krypten oder Zotten besitzt, befinden sich ein B-Zellbereich (Follikel) und angelagerte T-Zellbereiche sowie efferente Lymphgefäße. Antigene gelangen durch die M-Zellen im Domareal der Peyer’s Patches problemlos in die PP [1].
Abb. 4: Aufbau eines Peyer’s Patches (modifiziert nach [3])
d) Wege der B-Zellen
Über die genauen Mechanismen der B-Zellaktivierung bestehen verschieden Theorien. Nach neuesten Erkenntnissen ist wahrscheinlich sogar von mehreren Subtypen der B-Zellen auszugehen.
Ein Großteil der Studien beschreibt den klassischen Weg der B-Zellen (s.Abb.4). Diese Zellen sind durch die Oberflächenmarker IgMlo/ IgD hi, Mac-1-, B220 int to hi
gekennzeichnet und werden als B2-Zellen bezeichnet. Sie werden im Knochenmark gebildet und befinden sich in naiver Form hauptsächlich in den Peyer’s Patches und den mLN. DC nehmen AG auf und präsentieren sie den CD4 Zellen, worauf diese die Botenstoffe Interleukin-4 und Tumor growth factor ß (TGF-ß) produzieren. Durch die Anwesenheit dieser Zytokine werden die B- Zellen angeregt, den Isotypenswitch von IgM zu IgA zu vollziehen [7, 15]. Die aktivierten B- Zellen aus den Peyer’s Patches wandern in die mLN. In den Follikeln findet hier die
Proliferation und Differenzierung zu Plasmablasten über Zentroblasten und Zentrozyten statt.
T-Zellbereich
B-Zellbereich (Follikel)
Efferentes Lymphgefäß Intestinales Lumen
M Zellen
Somatische Hypermutation während der Proliferation bringt noch höher affine Zellen hervor [1, 7]. Im Anschluss verlassen die IgA-Plasmablasten die mLN, gelangen über den Ductus thoracicus ins Blut und auf diesem Wege schließlich in den Darm. Für das „Homing“ in die Lamina propria sorgen die Oberflächenmoleküle MadCAM-1 in den hochendothelialen Venulen (HEV) und der Chemokinligand (CCL25) auf den epithelialen Zellen des
Dünndarms. Von TH2- CD4 Zellen freigesetzte Interleukine IL-5 und IL-6 induzieren den letzten Schritt der Differenzierung zu reifen IgA-Plasmazellen. Die IgA Dimere werden von den Plasmazellen sezerniert und schließlich in das Darmlumen abgegeben, wo sie
neutralisierend wirken können [7, 15].
Ein noch recht ungeklärter Weg der Plasmazellreifung beschäftigt sich mit den so genannten B1-Zellen (s.Abb.4). Diese sind charakterisiert durch IgM hi/IgD lo, Mac-1+, B220 lo. B1- Zellen werden fetal in Leber und Omentum gebildet und sind in adulten Tieren hauptsächlich in der Pleura- und Peritonealhöhle zu finden, wo sie eine Art Selbsterneuerung betreiben. Es ist zu vermuten, dass sie die Peritonealhöhle über die mesenterialen Lymphgefäße verlassen und über den Ductus thoracicus in die Blutbahn gelangen. Vermittelt durch CCL25 erfolgt das
„Homing“ der B1-Zellen in die Lamina propria. Erst jetzt induziert IL-15 die Differenzierung der bis dahin IgM positiven B-Zellen zu IgA produzierenden Plasmazellen. Der Weg der B1- Zellen bietet also die Möglichkeit der T-Zell unabhängigen Antikörperproduktion. In einigen Studien findet man sogar die Aussage, dass bis zu 50% der IgA-Plasmazellen in der Lamina propria von B1-Zellen abstammen [7, 15].
Neuere Studien zeigen eine weitere Möglichkeit der T-Zell unabhängigen IgA-Produktion (in Abb. 4 nicht dargestellt). So vermutet man, dass Dentritische Zellen aus dem Darm in der Lage sind IL-5, IL-6 und Retinolsäure (retinoic acid = RA) zu produzieren. Die RA bewirkt einen Anstieg des Chemokinrezeptors CCR9 auf den B-Zellen und des Moleküls α4β7 Integrin in den hochendothelialen Venulen. Auf diese Weise werden die B-Zellen zum
„Homing“ in die Lamina propria veranlasst. Das Milieu aus IL-5, IL-6 und Retinolsäure induziert außerdem den Isotypenswitch der B-Zelle zu IgA. Der gesamte Mechanismus ist wie auch bei den B1-Zellen unabhängig von T-Zellen [15].
Abb. 4: Wege der B-Zellaktivierung (ohne Möglichkeit 4) [7]
1.4 Aufbau und Funktion der Milz
Die Milz ist das größte Blut filternde Organ des Körpers. Zur Erfüllung dieser Aufgabe ist ein komplexer Aufbau erforderlich (s.Abb.5). Das um die sich baumartig aufzweigenden Gefäße liegende Organparenchym, die so genannte Pulpa, kann unterteilt werden in zwei funktionell unterschiedliche Bereiche. Die rote Pulpa ist verantwortlich für die Blutmauserung,
Aussortierung defekter Erythrozyten, sowie Eisenrecycling. Die weiße Pulpa hingegen ist Teil der sekundären lymphatischen Organe und ist an der Bildung von Serum-Antikörpern
beteiligt.
Das Blut gelangt über die die arteriellen Zuflüsse in die rote Pulpa, wo die Zellen aus dem Gefäßsystem in einem offenen Kreislauf frei in die Markstränge geleitet werden. Sie befinden sich nun nicht mehr länger im geschlossenen Endothelschlauch des Blutkreislaufes. Um dorthin zurückgelangen zu können, müssen die Zellen so genannte Schlitzporen in der Gefäßwand der venösen Sinus passieren, von wo sie über die Sammelvene wieder dem Kreislauf zugeführt werden. Diese Schlitzporen sind jedoch nur für elastische,
funktionsfähige Erythrozyten passierbar. Defekte, membrangeschädigte Zellen, die ihre Elastizität verloren haben, bleiben in den Marksträngen zurück und werden von den dort
befindlichen Makrophagen phagozytiert, abgebaut und ihr Eisen wieder dem Blut bildenenden System zugeführt [16].
Der lymphatische Teil der Milz befindet sich in der weißen Pulpa. Der wesentliche Unterschied zu den Lymphknoten besteht in der Art und Weise, in der die Antigen
präsentierenden Zellen in das Organ gelangen. Erfolgt der Eingang in den Lymphknoten vor allem über die Lymphgefäße, so erreichen die Antigene die Milz nur über den Blutweg. Der erste Kontakt der Antigene mit Immunzellen der Milz findet in der so genannten
Marginalzone statt. In dieser Transitzone befinden sich vor allem Marginalzonen- Makrophagen (MZM), welche durch Phagozytose die unspezifische, angeborene
Immunabwehr übernehmen. Diesen speziellen Makrophagen fehlt jedoch die Möglichkeit zur Antigenpräsentation in MHC II. Es wird daher vermutet, dass spezielle Marginalzonen B- Zellen (MZBC) in der Lage sind, aus dem Blut stammende Antigene zu erkennen, gleich zu Antigen produzierende IgM-Plasmazellen zu differenzieren oder selbst die Rolle als Antigen präsentierende Zellen zu übernehmen. An dieser Stelle beginnt der Abschnitt der
spezifischen, erworbenen Immunabwehr. Die von diesen Plasmazellen produzierten
Antikörper sind die erste noch niedrig affine IgM Antwort des Immunsystems auf die Erreger.
Die als potente antigenpräsentierende Zellen (APC) fungierende Marginalzonen B-Zellen verlassen die Marginalzone und wandern in die T-Zellzone PALS (periarteriolar lymphocyte sheath), wo sie naive CD4 T-Zellen aktivieren. Diese T-Zellen wandern nun ihrerseits zum Übergang zu den B-Zellfollikeln um dort B-Zellen zur Proliferation, Differenzierung zu Plasmazellen und zum Isotypenswitch von IgM zu IgG anzuregen. Der Spezifische Anteil der Immunantwort in der Milz gleicht nahezu den Abläufen in den Lymphknoten, mit dem wichtigen Unterschied, dass die Immunglobuline der Milz vor allem vom IgM oder IgG-Typ sind und die der mLN vor allem vom IgA-Typ [16].
Abb. 5: Aufbau und Funktion der Milz (modifiziert nach [16])
Milzarterie
Sammelvene Venöser Sinus
Markstränge Kapsel Zentralarterie Follikel (B-Zellzone) PALS (T-Zellzone)
Marginalzone (Phagozyten)
1.5 Fragestellung der Arbeit
Die vorliegende Arbeit untersucht, welche Auswirkung die Entfernung der mesenterialen Lymphknoten hat. Als essentieller Bestandteil der Immunantwort ist zu klären, ob das
Immunsystem dann überhaupt noch in der Lage ist, eine adäquate Immunantwort auszulösen.
Insbesondere soll untersucht werden, ob das für die intestinale Immunantwort typische IgA noch spezifisch gebildet werden kann. Wäre dies der Fall, so gilt zu klären, auf welche Art und Weise die Immunantwort dann abläuft.
Aus der Literatur ist bekannt, dass Lymphgefäße nach der Entfernung von Lymphknoten wieder regenerieren und den Lymphabfluss durch Bildung einer pseudoafferenten Lymphe vollständig gewährleisten [17, 18]. Auf diese Weise würden die aufgenommenen
mesenterialen Antigene über die pseudoafferente Lymphe und den Ductus thoracicus ins Blut gelangen. Somit wäre die nächste lymphatische Filterstation die Milz [19]. Es ist zu vermuten, dass die Milz als potentes sekundär lymphatisches Organ auf jeden Fall in der Lage wäre, gegen im Blut befindliche Antigene eine Immunantwort mit spezifischen Antikörpern einzuleiten. Unbekannt ist jedoch, ob die produzierten Immunglobuline vom milztypischen IgM oder IgG wären oder ob die Milz den Isotypenswitch zu IgA übernehmen kann.
In den durchgeführten Versuchen konnten wir zeigen, dass sowohl in Darmlavage als auch im Serum nach Entfernung der mLN trotzdem eine CT-spezifische IgA-Antwort stattfindet.
Mehr noch, die Antikörpertiter sind sogar erhöht verglichen mit dem Zustand mit mLN. Des Weiteren konnte ein Antstieg der IgA positiven CT-spezifischen Zellen in der Lamina propria nach mLN Resektion nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Milz zeigte eine Zunahme an Keimzentren nach mLN Resektion, sowie CT-spezifische IgM B-Zellen in den
Keimzentren jedoch keine IgA positiven Zellen. Es lässt sich somit sagen, dass die Milz zwar an der Immunantwort beteiligt ist, jedoch in Form der ihr typischen Immunglobuline vom IgM/IgG Typ und nicht durch IgA. Andere lymphatische Organe, wie Knochenmark, axilläre Lymphknoten oder Blut hingegen sind nicht an der Immunreaktion gegen CT beteiligt. Es besteht die Möglichkeit, dass die erhöhte Anzahl IgA positiver B-Zellen von aus der Milz zugewanderten IgM B-Zellen nach dem Isotypenswitch stammen und somit für die erhöhten IgA Titer verantwortlich sind.
2. Publikation
Supplemental data
After CT treatment bands of proliferating cells are formed at the border of the PALS and marginal zone
The spleens of mLN-bearing animals were analysed by immunohistology without and after CT administration. Cryosections were stained with Abs against B cells (BM4013+, blue) and incorporated BrdU (red) (n=4-5) (Magnification 4X). An increase of proliferating cells at the border of the PALS and marginal zone was seen after CT administration and mLN resection (arrows) (Magnification 4X).
3. Diskussion
In der intestinalen Immunantwort sind bestimmte Anteile des Aktivierungsmechanismus abschließend geklärt. So zeigen verschiedene Studien eindeutig, dass Antigene aus dem Darm zum einen von Dentritischen Zellen aufgenommen werden und zu den Peyer’s Patches und mesenterialen Lymphknoten transportiert werden [9-11]. Zum anderen können die Antigene durch M-Zellen direkt an der mukosalen Oberfläche in die Peyer’s Patches gelangen [1, 5, 12]. Der weitere Ablauf ist abhängig von der Art der Antigene. Intrazelluläre Erreger wie beispielsweise Viren werden durch MHC I Moleküle präsentiert, worauf CD8-positive Killer T-Zelllen aktiviert werden. Diese gelangen über die efferenten Lymphwege ins Intestinum, wo sie neutralisierend wirken. Bakterien hingegen, präsentiert durch MHC II Moleküle, rufen die Aktivierung von CD4 positiven T-Zellen und B-Zellen hervor. Die CD4 positiven T- Zellen aktivieren ihrerseits Makrophagen zur Phagozytose der Antigene, während die B- Zellen zu Antikörper produzierenden Plasmazellen differenzieren [1, 7, 15]. Die
mesenterialen Lymphknoten haben somit eine wichtige Position in der Erkennung der Antigene aus dem Darm inne [19]. Des Weiteren gelten die mesenterialen Lymphknoten als hauptverantwortlich in der Toleranzinduktion [4]. Aktivierte B-Zellen wandern von ihrem Aktivierungsort in die Lamina propria [26], wo die für das Intestinum typischen
Immunglobuline vom Typ A gebildet und anschließend als Dimere in das Darmlumen sezerniert werden [4].
In dieser Arbeit wird Choleratoxin (CT) zur Auslösung einer spezifischen Immunantwort im Darm verwendet. Es handelt sich hierbei um das Toxin des Vibrio cholerae, ein im
Darmlumen produziertes Enterotoxin. Dies bedeutet, dass der Erreger selbst nicht in die Schleimhautzellen eindringt. Die Struktur des CT ist hexamer. Es besteht aus einem schweren A-Protein und fünf leichten, in einem Ring angeordneten B-Proteinen. Im Darmlumen bindet das B-Protein Pentamer an den GM1-Gangliosid Rezeptor auf der Oberfläche der
Dünndarmepithelzelle. Das A-Protein dringt daraufhin ins Zytosol der Zellen ein und blockiert dort die Hemmung der Adelylatzyklase, wodurch die Produktion von cyclischem Adenosinmonophosphat bewirkt wird. Daraus resultiert eine vermehrte Sekretion von Cl-, Na+ und somit osmotisch auch Wasser. Wichtig ist vor allem die Tatsache, dass A und B- Protein unabhängig voneinander nicht toxisch wirksam sind. Die A-Untereinheit kann nach dem Untergang der von ihr befallenen Zelle in keine weitere eindringen. Die Krankheit ist somit selbstlimitierend [20].
Für die folgende Arbeit ist jedoch nicht die klinische Symptomatik des Cholera Toxins ausschlaggebend, sondern die Tatsache, dass CT oral verabreicht als eines der stärksten Immunogene an der Schleimhaut gilt und zusätzlich als Adjuvans wirkt, ohne dabei jedoch eine systemische Immunantwort auszulösen [21, 22, 23]. In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Cholera Toxin zu einem Anstieg der Anzahl der IgA positiven B-Zellen führt, so dass sogar bis zu 5% der Plasmazellen CT-spezifisch sein können [27]. Des Weiteren kann CT Auslöser für ein lange Zeit bestehendes
immunologisches Gedächtnis gegen das Toxin sein [24].
In der vorliegenden Studie konnten nach CT-Gabe in der Medulla der mLN, dem Plasmazellareal, CT-spezifische IgA-positive Zellen nachgewiesen werden [29]. Diese Tatsache lässt ebenso wie der Anstieg der Keimzentren in mLN nach der CT-Gabe auf eine eindeutige Beteiligung der mLN in der mesenterialen Immunantwort schließen. Die Messung von CT-spezifischen IgA in der intestinalen Lavage zeigt nach Resektion der mLN jedoch nicht wie erwartet einen Abfall, sondern einen Anstieg der CT-spezifischen Antikörper. Auf gleiche Weise sind auch die CT-spezifischen IgA-positiven Zellen in der Lamina propria nach mLN-Resektion erhöht in Bezug auf den Zustand mit mLN. Allem Anschein nach ist dem mLN also eher eine regulierende als eine induzierende Rolle in der intestinalen
Immunantwort zuzuschreiben. Es konnte gezeigt werden, dass bei aus der Peripherie ins Mesenterium transplantierten Lymphknoten die CT-spezifische Immunantwort nicht so ausgeprägt ist, wie beim Zustand mit mLN. Daher ist auch eine Funktion in der
Aufrechterhaltung der Immunantwort denkbar [21].
Betrachtet man die erhöhten IgA Titer nach mLN-Resektion, so stellt sich die Frage, wo der Ursprung der Produktion der Antikörper zu suchen ist. In der Literatur ist beschrieben, dass nach Resektion der mLN die Lymphgefäße regenerieren und die Bildung der so genannten pseudoafferenten Lymphe stattfindet. Basierend auf diesen Daten ist es sehr wahrscheinlich, dass die Antigene über diese Lymphgefäße und den Ductus thoracicus in die Blutbahn und schließlich in die Milz gelangen [17, 18].
Bestätigung findet diese Theorie in der Zunahme der Keimzentren in der Milz nach der CT- Gabe. Die Zunahme ist sogar noch verstärkt in Tieren, denen der mLN entfernt wurde. Eine wichtige Erkenntnis ist die Tatsache, dass in der Milz lediglich CT-spezifische IgM und nicht
IgA nachgewiesen werden konnten. Dies erlaubt die Aussage, dass die Milz in jedem Fall an der intestinalen Immunantwort auf Cholera Toxin beteiligt ist, nach mLN Resektion sogar vermehrt. Sie übernimmt aber keine Funktion in der Produktion von CT-spezifischen IgA.
In Studien konnte gezeigt werden, dass 90% der IgA Produktion im oberen Intestinum aus der Galle stammen [übersicht in 2]. Nachdem die Milz als verantwortlich für die erhöhten IgA Spiegel ausgeschlossen werden konnte, bot sich hier eine neue Erklärung: Antikörper aus dem Blut könnten über die Leber in die Gallenflüssigkeit gelangen und von dort aus ins Duodenum abgegeben werden. Allerdings konnten bei Messungen CT-spezifische IgA nur im distalen Intestinum wie Jejunum und Ileum, nicht aber im Duodenum nachgewiesen werden. Das Blut scheidet somit als Quelle der CT-spezifischen IgA nach mLN-Resektion ebenfalls aus.
Eine wichtige Rolle in der IgA Immunantwort des Darmes spielen ebenfalls die Peyer’s Patches [7]. Auch dort konnten CT bindende Zellen nachgewiesen werden. Allerdings erwies sich der Anteil der CT-spezifischen Zellen unter den IgA-positiven in den PP als deutlich geringer verglichen mit den mLN. Es zeigte sich, dass die CT-spezifischen Zellen in den PP zumeist IgM-positiv waren. Es ist durchaus möglich, dass diese IgM-positiven Zellen die PP verlassen, den Isotypenswitch zu IgA durchlaufen und schließlich in die Lamina propria einwandern. Diese Vermutung deckt sich mit der Beobachtung fehlender Proliferation unter den IgA-positiven Zellen beziehungsweise CT-spezifischen IgA-positiven Zellen in der Lamina propria. Wo der Isotypenswitch der B-Zellen stattfindet bleibt jedoch ungeklärt. Die Bildung der CT-spezifischen IgA-Zellen in der Lamina propria kann somit verneint werden.
In der Untersuchung anderer Lymphorgane wie Knochenmark, axillären Lymphknoten und Blut konnten keine CT-spezifischen IgA-positiven Zellen nachgewiesen werden. Somit sind diese ebenfall als Ursache für die erhöhten CT-IgA Spiegel auszuschließen.
4. Zusammenfassung
Die Ergebnisse dieser Studie dokumentieren die Beteiligung der mesenterialen Lymphnoten an der spezifischen IgA-Immunantwort auf Cholera Toxin. Allerdings scheint die Aufgabe der mesenterialen Lymphknoten eher eine regulierende als eine induzierende zu sein. Die Milz scheint nach mLN-Resektion vermehrt an der Immunreaktion gegen das oral
verabreichte Cholera Toxin beteiligt zu sein, doch konnte eine Produktion von CT- spezifischen IgA Antikörpern durch die Milz ausgeschlossen werden. Es kann jedoch
vermutet werden, dass in der Milz vermehrt produzierte IgM-positive B-Zellen in die Lamina propria auswandern und dort nach einem Typenswitch als IgA-positive Plasmazellen für eine entsprechende Antikörperproduktion sorgen.
5. Literaturverzeichnis
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6. Lebenslauf
Anschrift Anika Hahn
Zum Heidgarten 1
31234 Edemissen/ Blumenhagen
Personaldaten geb. am 15.6.1984 in Braunschweig
deutsche Staatsangehörigkeit
ledig Schulbildung/
Hochschulbildung
1990 - 1994 Grundschule Wendeburg 1994 - 1996 Orientierungsstufe Wendeburg
1996 - 2003 Gymnasium Martino – Katharineum in Braunschweig 24.06.2003 Erlangen der allg. Hochschulreife, Notendurchschnitt: 1,6 Seit Oktober 2003 Studium der Humanmedizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
August/September 2005 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Note: gut
August 06 - August 07 Teilnahme am StrucMed Programm der Hanover Biomedical Research School im Rahmen der strukturierten
Doktorandenausbildung
März 09 - Januar 10 Absolvieren des Praktischen Jahres in den Kliniken Braunschweig und Peine
18.06.2010 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Note: sehr gut
18.06.2010 Ärztliche Prüfung
Note: gut
Schüleraustausch
November 1999 Teilnahme am Austausch mit der Columbia Falls High School,
Montana, USA
Oktober 2000 Teilnahme am Austausch mit dem Collegio Aleman Alexander von Humboldt in Mexiko-City, Mexiko
Praktika
November 2000 Praktikum in einer Tierarztpraxis April 2003 Praktikum in einer Zahnarztpraxis
Mai 2003 Hospitations-Praktikum im Institut für Radiologie der
MHH Hannover
Mai 2003 Hospitations-Praktikum in der Blutbank der
MHH Hannover
März 2004 Pflegepraktikum in der HTG des Städtischen Klinikums Braunschweig, Standort Salzdahlumer Str.
September 2004 Pflegepraktikum in der Neurochirurgie des Städtischen Klinikums Braunschweig, Standort Salzdahlumer Str.
Semester 2004/05 Ehrenamtliche Tutortätigkeit im Kurs der Makroskopischen Anatomie an der MH-Hannover
März 2005 Pflegepraktikum in der Orthopädie des Herzogin-Elisabeth- Heime, Standort Melverode
August 2007 Famulatur in der Anästhesie des Victoria Hospitals, Republic of Seychelles
April 2008 Famulatur in der Urologie der MH-Hannover
Juli 2008 Famulatur in der Kinderarztpraxis Fürst-Burger/Caesar
in Braunschweig
September 2008 Famulatur in der Urologie der MH-Hannover
März- Juni 2009 Praktisches Jahr, Block Pädiatrie im Städtischen Klinikum Braunschweig
Juni- Oktober 2009 Praktisches Jahr, Block Chirurgie im Klinikum Peine Oktober 2009 - Praktisches Jahr, Block Innere Medizin im Klinikum Peine Januar 2010
Blumenhagen im Oktober 2010
7. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nr. 5 und 6
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel:
Mesenteric lymph nodes are not required for an intestinal IgA response to oral cholera toxin
im Institut für Funktionelle und Angewandte Anatomie der Medizinischen Hochschule Hannover unter Betreuung von Herrn Prof. Dr. med. Reinhard Pabst und Frau Dr. rer. nat. U.
Bode ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt
Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht
erworben habe.
Ergebnisse der Dissertation wurden im November 2009 in folgendem Publikationsorgan veröffentlicht:
Hahn Anika, Thiessen Nadja, Pabst Reinhard, Buettner Manuela, Bode Ulrike;
Mesenteric lymph nodes are not required for an intestinal IgA response to oral cholera toxin;
Immunology, 2009, Epub PMID 19922419
Hannover, den ________________________________________
Anika Hahn
8. Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung am Institut für „Funktionelle und Angewandte Anatomie“ der Medizinischen Hochschule Hannover.
Ich danke Herrn Professor Reinhard Pabst für die Überlassung des Themas, sowie für seine ausgezeichnete wissenschaftliche Unterstützung. Mein Dank gilt auch Frau Dr. Ulrike Bode für die hervorragende Betreuung und Ihre exzellente Anleitung zum wissenschaftlichen Arbeiten. Beiden danke ich für das Interesse, die wertvollen Hinweise bei der Durchführung und die Mühe bei der Durchsicht der Arbeit. Des Weiteren möchte ich mich bedanken bei meinem Co-Betreuer Herrn Professor Oliver Pabst für die Anregungen und die
wissenschaftliche Diskussion die mir bei meinen Experimenten sehr geholfen haben.
Für die mir entgegengebrachte Hilfsbereitschaft möchte ich mich bei den vielen
Diskussionspartnern, insbesondere bei den Mitarbeitern des Institutes sowie bei all denen, die in irgendeiner Weise zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben, herzlich bedanken.
Stellvertretend richte ich diesen Dank an Manuela Ahrendt für die geduldige Anleitung, die moralische Unterstützung, vor allem aber für die unverzichtbare Hilfe in der Laborarbeit, Frauke Weidner, Melanie Bornemann und Karin Westermann für meine erstklassige Einarbeitung in die Laborarbeit und die wertvolle Hilfe bei der Durchführung der
Experimente. Sheila Fryk gilt mein Dank für die unermüdlichen Korrekturen der englischen Texte. Bei Nadja Thiessen bedanke ich mich für die Einsicht in ihre Ergebnisse, die mir den Einstieg in mein Thema sehr erleichtert haben.
Meinen „Mit-Strukturetten“ Miriam, Marie und Inga danke ich herzlich für die tolle Zeit während der Doktorarbeit aber auch während des ganzen Studiums.
Besonderer Dank gilt auch meinen Eltern Karin und Klaus-Uwe Hahn, zum einen für die finanzielle, besonders aber auch für den moralischen Rückhalt während meines gesamten Studiums. Ohne euch wäre das alles nicht möglich gewesen.
Dir, lieber Hägar, danke für Deine Geduld und Dein Verständnis und deine liebevolle Unterstützung.
