Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Relevanz des
CCAAT/enhancer binding protein β in
Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis infizierten RAW264.7 Makrophagen
THESE
zur Erlangung des Grades DOKTOR DER PHILOSOPHIE
- PhD -
im Fachbereich Mikrobiologie
an der Tierärztlichen Hochschule Hannover
vorgelegt von Sandra Sommer, Mönchengladbach
Hannover 2005
Stiftung, Hannover)
Betreuungsgruppe: PD Dr. R. Goethe
Prof. Dr. I. Just (Institut für Toxikologie, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover)
Prof. Dr. L. Haas (Institut für Virologie, Zentrum für Infektionsmedizin, Tierärztliche Hochschule Hannover, Stiftung, Hannover)
Externer Gutachter: Dr. L. Phi-van (Institut für Tierschutz und Tierhaltung, Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft, Celle)
Tag der mündlichen Prüfung: 10. November 2005
Die Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Sonderforschungsbereichs 621 „Pathobiologie der intestinalen Mukosa“ gefördert.
nicht im Unsichtbaren.
Oscar Wilde
SOMMER, S.; P. VALENTIN-WEIGAND; R. GOETHE (2003):
Differential relevance of protein kinase C (PKC) and protein tyrosine kinases (PTK) for LPS and mycobacterial induced signaling in J774 macrophages.
55. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, Dresden In: International Journal of Medical Microbiology 293, (Suppl. 36) (2003) 272
SOMMER, S.; S. JECKSTADT; P. VALENTIN-WEIGAND; R. GOETHE (2005):
Evidence for a reduced transactivating capacity of CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) β in Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) infected macrophages.
8th International Colloquium on paratuberculosis, Kopenhagen, Dänemark
In: Proceedings of the 8th International Colloquium on paratuberculosis (2005), in Druck
B. Schrifttum ... 14
B.1. Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis ...14
B.1.1. Abgrenzung von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis innerhalb des Mycobacterium avium-Komplexes ...14
B.1.2. MAP als Erreger der Paratuberkulose ...15
B.1.3. Pathogenese der Paratuberkulose ...16
B.2. Zelluläre Wirtsabwehr durch Makrophagen...19
B.2.1. Makrophagenaktivierung ...21
B.2.2. Antimikrobielle Eigenschaften von Makrophagen ...22
B.3. Signaltransduktion im Makrophagen ...23
B.3.1. Lipopolysaccharid und mykobakterielle Moduline...24
B.3.2. Vermittlung über Toll like Rezeptoren...26
B.3.3. LPS induzierte Signaltransduktion ...27
B.3.4. Mykobakterien induzierte Signaltransduktion ...28
B.3.4.1. Mykobakterielle Modulation der Ca2+ Signaltransduktion ...29
B.4. Transkriptionelle Regulation von Entzündungsgenen ...31
B.4.1. NFκB als zentraler Faktor der Entzündung...31
B.4.2. C/EBP als Faktoren der Entzündung ...32
C. Material und Methoden ... 34
C.1. Chemikalien, Reagenzien und Geräte ...34
C.2. Bakterienkulturen ...34
C.2.1. Mykobakterien ...34
C.2.1.1. Bakterienstämme...34
C.2.1.2. Stammhaltung ...34
C.2.1.3. Bakterienernte und Vitalitätsprüfung...35
C.2.2. Escherichia coli...36
C.2.2.1. Bakterienstämme...36
C.2.2.2. Stammhaltung ...36
C.3. Zellkultivierung ...36
C.3.1. Zelllinien ...36
C.3.3.1. Infektion mit MAP und Stimulation mit LPS sowie Kalziumionophor...37
C.3.3.2. Hemmstoffversuche...38
C.4. Zellkulturüberstandanalysen ...38
C.4.1. Gewinnung der Zellkulturüberstände ...38
C.4.2. Zytokinbestimmung...39
C.4.3. Nitritoxid-Messung ...39
C.5. DNA Arbeiten...39
C.5.1. Plasmide...39
C.5.2. Oligonukleotidprimer...39
C.5.3. Isolierung von DNA...40
C.5.3.1. Minipräparation von Plasmid-DNA...40
C.5.3.2. Endotoxinfreie Midipräparation von Plasmid-DNA...40
C.5.3.3. Gewinnung genomischer DNA ...41
C.5.4. Spektroskopische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA und RNA ...41
C.5.5. Klonierung von DNA Fragmenten ...42
C.5.5.1. Restriktionsverdau...42
C.5.5.2. Agarosegelelektrophorese von DNA ...42
C.5.5.3. Elution von DNA Fragmenten aus Agarosegelen ...43
C.5.5.4. Konzentrierung von Nukleinsäuren...43
C.5.5.5. Reinigung von Nukleinsäuren...43
C.5.5.6. Ligation ...43
C.5.6. Transformation...44
C.5.6.1. Herstellung chemokompetenter Escherichia coli...44
C.5.6.2. Transformation chemokompetenter Escherichia coli...44
C.5.7. Oligonukleotid-Doppelstränge ...45
C.5.7.1. Herstellung von Oligonukleotid-Doppelsträngen...45
C.5.7.2. Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden...45
C.6. RNA Arbeiten...46
C.6.1. Isolierung von RNA...46
C.6.1.1. Poly(A)+-RNA Präparation ...46
C.6.1.2. gRNA Präparation ...47
C.6.2.1. Gelelektrophorese von glyoxaldenaturierter RNA...49
C.6.2.2. Northern Blotting...49
C.6.2.3. Herstellung der cDNA Sonden...49
C.6.2.4. Nick Translation...51
C.6.2.5. Northern Hybridisierung...51
C.6.2.6. Entfernen der Radioaktivität von der Nylonmembran ...52
C.6.3. Reverse Transkriptions-PCR Analyse ...52
C.6.3.1. cDNA Synthese ...52
C.6.3.2. Reverse Transkriptions-PCR ...53
C.7. Funktionelle Promotoranalyse im Reportergen System...53
C.7.1. Herstellung der Luciferase Reportergenvektoren ...53
C.7.1.1. Herstellung der Thymidinkinase-Reportergenvektoren...53
C.7.1.2. Herstellung der Reportergenvektoren für die Deletionsstudien ...54
C.7.1.3. Herstellung der Reportergenvektoren für die Mutationsstudien...55
C.7.2. Dual-Luciferase Reportergen Assay ...56
C.7.2.1. Transfektion...56
C.7.2.2. Dual-Luciferase Assay...57
C.8. Proteinbiochemische Methoden ...57
C.8.1. Präparation von Proteinen ...57
C.8.1.1. Präparation von Zellkernextrakten...57
C.8.2. Bestimmung der Proteinkonzentration...58
C.8.3. South-Western Analyse ...58
C.8.3.1. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese ...58
C.8.3.2. Western Blotting ...59
C.8.3.3. Bindungsreaktion mit der radioaktiv markierten Sonde ...59
C.8.4 Electrophoretic Mobility Shift Assay...59
C.8.4.1. Probenvorbereitung ...60
C.8.4.2. Native Polyacrylamidgelelektrophorese...60
C.8.4.3 Super Shift Assay...61
D.1.1. Zytokin- und NO-Produktion in MAP infizierten und LPS stimulierten
RAW264.7 Makrophagen ...63 D.1.2. Vergleich der Genexpressionsmuster proinflammatorischer Zytokine
und der iNOS in stimulierten RAW264.7 Makrophagen...65 D.2. Relevanz der Transkritpionsfaktoren C/EBPβ und NFκB für die
Signalvermittlung in MAP infizierten Makrophagen...67 D.2.1. Bindung spezifischer LPS und MAP induzierter Proteinkomplexe an
die C/EBP- und NFκB-Bindungsstelle ...68 D.2.2. Komponenten der LPS und MAP induzierten Proteinkomplexe der
C/EBP-Bindungsstelle ...70 D.2.3. Induktion der C/EBPβ-Isoformen in stimulierten RAW264.7
Makrophagen...72 D.2.4. Induktion der Promotoraktivität in stimulierten RAW264.7
Makrophagen über die isolierten C/EBP- und NFκB-Bindungsstellen ...73 D.2.5. C/EBPβ und C/EBPδ Genexpressionsprofil in stimulierten RAW264.7
Makrophagen...75 D.3. Signalwege der induzierten Genexpression in RAW264.7
Makrophagen...77 D.3.1. Bedeutung des PKA, PKC und PI3-K Signaltransduktionsweges für
die IL-6 Genexpression...77 D.3.2. Bedeutung des PKA, PKC und PI3-K Signaltransduktionsweges für
die Induktion von C/EBPβ und NFκB...79 D.3.3. Bedeutung der [Ca2+]i auf die LPS induzierte Expression von IL-6
sowie C/EBPβ und NFκB in RAW264.7 Makrophagen...81 D.3.4. Bedeutung der [Ca2+]i für die MAP induzierte Expression von IL-6
sowie C/EBPβ und NFκB in RAW264.7 Makrophagen...85 D.3.5. Einfluss der [Ca2+]i auf die Regulation der IL-6 und C/EBPβ
Expression...88 D.4. Transkriptionelle Regulation des IL-6 Gens ...91
D.4.1. Funktionelle Analyse des murinen IL-6 Promotors in stimulierten
RAW264.7 Makrophagen ...91
D.4.3. Bedeutung der [Ca ]i für die induzierte IL-6 Promotoraktivität in MAP
infizierten RAW264.7 Makrophagen ...96
E. Diskussion ... 98
E.1. Murine Makrophagen als Infektionsmodell...99
E.2. Auswirkungen der intrazellulären Persistenz von MAP auf die Aktivierung von RAW264.7 Makrophagen ...100
E.3. Relevanz von NFκB und C/EBPβ als Regulatoren der MAP induzierten Immunantwort in RAW264.7 Makrophagen ...103
E.4. Relevanz von Ca2+ in MAP infizierten RAW264.7 Makrophagen ...107
E.5. Relevanz von C/EBPβ für die transkriptionelle Regulation des murinen IL-6 Gens in stimulierten RAW264.7 Makrophagen ...112
F. Zusammenfassung ... 115
G. Summary... 117
H. Literaturverzeichnis ... 119
I. Anhang... 136
I.1. Verbrauchsmaterialien ...136
I.2. Vektorkarten ...137
I.3. Abbildungsverzeichnis...139
I.4. Abkürzungsverzeichnis...141
A. Einleitung
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist ein säurefestes, fakultativ intrazelluläres Stäbchenbakterium, das dem Mycobacterium avium-Komplex (MAC) zugeordnet wird. Die MAP Infektion von Wiederkäuern verursacht eine chronische, granulomatöse, nicht therapierbare Enteritis, die Paratuberkulose. Die Erkrankung führt weltweit zu bedeutenden ökonomischen Verlusten in der Rinder- und Schafhaltung und zählt damit zu den wichtigsten Erkrankungen der Wiederkäuer.
Infektionen von anderen Spezies kommen vor. Zudem besteht der kontrovers diskutierte Verdacht, dass eine Kausalität zwischen der Infektion mit MAP bzw. eine Beteiligung des Erregers an der Morbus Crohn Erkrankung des Menschen besteht.
Kennzeichnend für eine Infektion mit MAP ist, im Gegensatz zu anderen mykobakteriellen Infektionen, der ausgeprägte Darmtropismus. Zum Schutz vor dem Immunsystem persistiert MAP paradoxerweise in der an sich mikrobenfeindlichen Umgebung der sub- und intraepithelialen Darmmakrophagen im Bereich der Peyer`schen Platten des Dünn- und Hüftdarms. Anders als z.B. Bakterien der Gattung Listeria, die nach der Phagozytose die Phagosomenmembran lysieren und im Zytoplasma der Zelle persistieren, überlebt und vermehrt sich MAP in den Phagosomen der Makrophagen. Diese intrazelluläre Persistenz spielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der Paratuberkulose.
Die durch eine Infektion mit MAP im Makrophagen induzierten subzellulären Mechanismen, welche das Überleben im Phagosom und somit die patho- physiologischen Vorgänge ermöglichen, sind weitgehend ungeklärt. Dies liegt zum einen an der Art der Erkrankung, zum anderen daran, dass für Untersuchungen dieser Art bisher nicht auf bovine Makrophagenzelllinien zurückgegriffen werden kann.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, auf subzellulärer Ebene molekulare Regulationsprozesse der Makrophagenaktivierung zu identifizieren, die das Überleben von MAP in Makrophagen sichern.
B. Schrifttum
B.1. Mycobacterium avium Subspezies paratuberculosis
B.1.1. Abgrenzung von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis innerhalb des Mycobacterium avium-Komplexes
Mykobakterien sind säurefeste, schlanke Stäbchen, die sich durch einen hohen Gehalt an Wachsen in ihrer Zellwand und der damit einhergehenden hohen Festigkeit gegenüber Säuren und Basen auszeichnen (MADIGAN et al. 2000). Die Gattung Mycobacterium (M.) umfasst weit in der Natur verbreitete saprophytäre Arten, wie z.B. M. smegmatis und M. phlei sowie verschiedene pathogene Spezies.
Alle pathogenen Mykobakterien wie M. tuberculosis, M. leprae und M. avium ssp.
paratubersulosis (MAP) sind typische fakultativ intrazelluläre Bakterien. Sie persistieren nach der Phagozytose durch Makrophagen in frühen Phagosomen, indem sie die Phagosomenreifung unterbinden und die Immunreaktion des Wirtes umdirigieren (KAUFMANN et al. 1999). MAP als Erreger der weiter unten beschriebenen Paratuberkulose, einer Darmerkrankung der Wiederkäuer, wird aufgrund der genetischen Ähnlichkeit zusammen mit den Spezies M. avium ssp.
avium (M. avium) und M. avium ssp. silvaticum dem M. avium-Komplex (MAC) zugeordnet. MAP grenzt sich von den beiden anderen Mitgliedern in mehrerer Hinsicht ab. Dabei bestehen zum einen große Unterschiede in der Pathogenese der hervorgerufenen Erkrankungen. Besonders ist der Aspekt des ausgeprägten Darmtropismus für eine Infektion mit MAP hervorzuheben, da für M. avium eine systemische Ausbreitung beschrieben ist. Im Gegensatz zu MAP ist M. avium für Rinder nur gering pathogen. Sie entwickeln eine effektive systemische Immunantwort, die zur Bildung von verkäsenden Granulomen und Eliminierung des Erregers führt (DE LISLE et al. 1998). Eine mögliche Erklärung für die unterschiedlichen Schicksale von MAP und M. avium in infizierten Rindern konnte kürzlich durch eine MAP spezifische Abregulierung von major histocompatibility complex (MHC) Klasse I und Klasse II Molekülen in infizierten bovinen Makrophagen gegeben werden (WEISS et al. 2001). Weiterhin induzieren beide Spezies unterschiedliche Genexpressionsmuster in bovinen Makrophagen (WEISS et al.
2004b). Demnach hat MAP andere immunsuppressive Effekte auf Makrophagen als
M. avium. Zum anderen wurden durch Genomvergleiche von MAP und M. avium für MAP spezifische offene Leserahmen identifiziert (BANNANTINE et al. 2002).
Weiterhin weist MAP ein extrem langsames, mycobactinabhängiges Wachstum auf.
Die Generationszeit liegt bei 1,3-4,4 Tagen, wodurch erst nach 8-12 Wochen mit dem Auftreten von sichtbaren Kolonien zu rechnen ist. Mycobactin ist ein zellwandassoziiertes Siderophor, welches von M. avium und anderen Mykobakterien, jedoch nicht von MAP, synthetisiert wird (BARCLAY et al. 1985; LAMBRECHT u.
COLLINS 1992).
B.1.2. MAP als Erreger der Paratuberkulose
Die Paratuberkulose ist eine spezifisch bei Rindern, Ziegen und Schafen auftretende chronische, granulomatöse Erkrankung des Dünn- und Hüftdarms, die durch MAP ausgelöst wird. Es besteht ein großes Erregerreservoir, dass neben Haus- wiederkäuern auch viele Wildtiere einschließt (CLARKE 1997). Weiterhin ist MAP das momentan am häufigsten diskutierte Pathogen in Bezug auf die Morbus Crohn Erkrankung des Menschen (CHACON et al. 2004; GREENSTEIN 2003). Daher wird vermehrt die Rolle von MAP als Zoonoseerreger untersucht.
Die Paratuberkulose ist weltweit verbreitet und verursacht bedeutende landwirtschaftliche Produktionseinbußen. Alleine in den Vereinigten Staaten von Amerika sind jedes Jahr Verluste von 1,5 Billionen Dollar zu verzeichnen (HARRIS u.
BARLETTA 2001). Bei Rindern infizieren sich am häufigsten neugeborene Kälber bis zu einem Alter von 6 Monaten über den fäkal-oralen Weg. Die klinischen Symptome entwickeln sich erst relativ spät im Alter von 3-5 Jahren (CHIODINI et al. 1984).
Bedingt durch den langen Infektionsverlauf unterscheidet man drei Stadien (COCITO et al. 1994). Im ersten praeklinischen Stadium kommt es zu einer ausgeprägten zellulären Immunantwort, ohne dass Krankheitssymptome sowie die Ausscheidung des Erregers mit dem Kot ersichtlich sind. Eine humorale Immunantwort ist zu diesem Zeitpunkt kaum entwickelt. Danach schließt sich die praeklinische Exkretionsphase an. Die Menge der Mykobakterien steigt in der Darmmukosa und im Lumen des Darms rapide an, womit die Erreger auch im Kot nachweisbar sind.
Begleitet wird das Geschehen von einer stärkeren humoralen Immunantwort.
Klinische Symptome sind nur bei einer geringen Anzahl von infizierten Tieren zu beobachten (LEPPER et al. 1989). Die dritte Phase ist die klinische oder
exkretorische Phase, die durch unstillbare wässrige Durchfälle und sich daraus ergebender Abmagerung bis zur völligen Auszehrung gekennzeichnet ist sowie zu einer Reduktion der Milchleistung, diffusen Ödemen, Anämie und Infertilität führt. Die Tiere werden in der Regel geschlachtet oder sterben an den Folgen der theraphieresistenten Durchfälle.
B.1.3. Pathogenese der Paratuberkulose
Die Pathogenese der Paratuberkulose ist noch weitgehend ungeklärt. Am besten sind die pathophysiologischen Vorgänge für das Rind erforscht. Bei Schaf und Ziege dürften aber sehr wahrscheinlich gleichartige Gegebenheiten vorliegen. Nach oraler Aufnahme gelangen die Erreger in den Darm und überwinden die intestinale Mukosa über die M-Zellen des Epithels im Bereich der Peyer`schen Platten des Dünn- und Hüftdarms (MOMOTANI et al. 1988; SIGURDARDOTTIR et al. 2004). Die Aufnahme erfolgt dabei sehr wahrscheinlich über bakterielle Membranproteine und bzw. oder die Fibronektinbindung (BANNANTINE et al. 2003; SECOTT et al. 2004).
Abb. 1: Schematische Darstellung eines Ausschnitts der intestinalen Mukosa im Bereich der Peyer`schen Platten (modifiziert nach LUGTON 1999). Nach oraler Aufnahme im Darmlumen befindliche M. avium ssp.
paratuberculosis (MAP) überwinden über die M-Zellen (M) des Epithels die Barriere der intestinalen Mukosa im Bereich des Dünn- und Hüftdarms.
Danach werden sie von sub- und intraepithelialen Makrophagen (MP) und wahrscheinlich auch von dendritischen Zellen aufgenommen.
MAP vermag in den naiven, nicht vor- stimulierten Makrophagen zu persis- tieren und sich zu vermehren. Die normalen Epithelzellen (E) scheinen nicht an der Aufnahme von MAP beteiligt zu sein.
Danach werden sie von sub- und intraepithelialen Makrophagen des Darms aufgenommen. Da MAP sich hauptsächlich in Makrophagen vermehrt, ist die proinflammatorische und zytotoxische Immunantwort essentiell, um die Infektion zu kontrollieren. Makrophagen, die MAP erfolgreich abgetötet und prozessiert haben, wandern in die lokalen Lymphknoten. Dort aktivieren sie über die Antigen- präsentation CD4+-T-Zellen, welche daraufhin proliferieren und über die Blutbahn an den Ort der MAP Infektion gelangen. Sowohl durch die Th1-Zellen als auch durch die ortsständigen Makrophagen kommt es zu einer angemessenen Immunantwort. Sie produzieren Interferon gamma (INF-γ), das aus dem Blutstrom rekrutierte Makrophagen aktiviert und somit die Infektion kontrolliert. Misslingt die vollständige Eliminierung des Erregers, so kommt es in der späten praeklinischen Phase der Erkrankung zur Ausweitung der persistent infizierten Makrophagen im Dünndarm.
Begünstigt wird dies durch eine fehlende Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) Produktion und die fehlende Abgrenzung infizierter Bereiche. Die MAP induzierte diffuse granulomatösen Entzündungsantwort ist im Gegensatz zu den herdförmigen Granulomen ausgelöst durch andere mykobakterielle Infektionserreger nicht in der Lage die Infektion zu kontrollieren (CLARKE 1997; LUGTON 1999). Die anhaltende proinflammatorische Entzündungsreaktion und das stete Wandern antigenpräsentierender Makrophagen in den Lymphknoten resultiert in der Proliferation antiinflammatorischer Immunzellen, die über die Interleukin(IL)-10 Produktion wirken. Befinden sich die proinflammatorischen und antiinflammatorischen Immunzellen im Ausgleich, kommt es zur Abschwächung der proinflammatorischen Th1-Zellantwort. Der Verlust der INF-γ und IL-6 Produktion in den betroffenen Gebieten führt dazu, dass rekrutierte, naive Makrophagen nicht mehr aktiviert werden und die Ausweitung der Infektion weiter voranschreitet. In klinisch erkrankten Tieren sind die Erreger massenhaft in der Darmmukosa und im Lumen des Dünn- und Hüftdarms. Die anhaltende chronische Entzündung und die toxische Wirkung von IL-1α, gebildet von infizierten Makrophagen, führen offensichtlich zur pathologischen Verdickung der Darmschleimhaut. Die Proliferation von T-Zell-Suppressorzellen in den Lymphknoten verdrängt die Th1-Zellproliferation und in Folge die IL-10 produzierenden Zellen. Durch den Verlust der antigenspezifischen T-Zellimmunantwort ist die MAP Infektion auch durch die
verbleibende humorale Immunantwort nicht mehr zu kontrollieren (COUSSENS 2004).
Trotz der vielfältigen Mechanismen, die zur Paratuberkulose führen, steht der Makrophage im Zentrum der Pathogenese. Die Invasion und Persistenz des Erregers in den naiven, nicht durch IFN-γ vorstimulierten Makrophagen bildet die Grundlage für alle weiteren pathophysiologischen Vorgänge, die vor allem nach dem Verlust der proinflammatorischen Th1-Antwort klinisch sichtbar werden.
Über die Invasion von MAP in Makrophagen ist wenig bekannt. Es wurde beobachtet, dass die Zugabe von Serum zu bovinen Makrophagen in der Zellkultur die frühe Aufnahmerate von MAP erhöht, ein Hinweis auf Rezeptoren, die einer Opsonisierung des Erregers bedürfen (ZURBRICK u. CZUPRYNSKI 1987).
Außerdem konnte gezeigt werden, dass MAP Fibronektin bindet, welches möglicherweise als Ligand bei der Internalisierung durch Makrophagen eine Rolle spielt (SECOTT et al. 2004; VALENTIN-WEIGAND u. MORIARTY 1992). CHEVILLE et al. (2001) konnten die Aufnahme von MAP über den CR3 nachweisen.
WEISS et al. (2004a; 2004b) konnten im Vergleich zu unstimulierten bovinen Makrophagen zum einen demonstrieren, dass die Erreger im Phagosom überleben.
Zum anderen konnte durch DNA Mikroarray Analysen gezeigt werden, dass die V- ATPase in MAP infizierten Makrophagen deutlich geringer exprimiert wird. Für das MAP-Phagosom in murinen Makrophagen konnte gezeigt werden, dass die Phagosomenreifung in einem frühen Stadium unterbunden wird und eine Ansäuerung fehlt (KUEHNEL et al. 2001).
Zur effektiven Eliminierung von MAP ist, wie bereits erwähnt wurde, die Aktivierung von Makrophagen unerlässlich. Dabei benötigt der Makrophage das koordinierte Zusammenspiel von IFN-γ der Th1-Zellen sowie von IL-1, IL-6, TNFα und dem granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (VALENTIN-WEIGAND u. GOETHE 1999). Verschiedene Studien versuchten die Rolle dieser Zytokine in der Pathogenese der bovinen Paratuberkulose aufzuklären (ADAMS et al. 1996; ADAMS u. CZUPRYNSKI 1995; COUSSENS 2004; LEE et al. 2001; STABEL 1995; STABEL 2000; ZURBRICK et al. 1988). Die Ergebnisse dieser Studien gaben Hinweise darauf, dass MAP eine verstärkte Expression der Zytokingene IL-1β, IL-6, TNFα und GM-CSF hervorruft. Diese Effekte wurden mit lebenden MAP, hitzeinaktivierten MAP und gereinigtem MAP Lipoarabinomannan (LAM) beobachtet. Neuere
Untersuchungen in J774A.1 Makrophagen zeigten, dass IFN-γ/Lipopolysaccharid (LPS) vorstimulierte Makrophagen im Vergleich zu naiven Makrophagen MAP effizienter abtöten (HOSTETTER et al. 2002). Im Gegensatz dazu konnten ZHAO et al. (1997) in bovinen Makrophagen zeigen, dass die IFN-γ Stimulation bereits infizierter Makrophagen nur geringe Effekte auf das intrazelluläre Überleben hat und dass die Menge des gebildeten bakteriziden Nitritoxid (NO) nicht für ein effizientes Abtöten des Erregers ausreicht. Eine Beeinflussung von TNFα konnte in murinen Makrophagen nachgewiesen werden (STABEL 1995). Dabei zeigte sich, dass das Überleben von MAP nach Zugabe von geringen Mengen TNFα verbessert ist, während höhere Dosen das Abtöten schneller und effizienter gestalten. Weiterhin konnte in MAP infizierten J774A.1 Makrophagen eine Hemmung der Makrophagen- und der CD4+-T-Zellaktivierung demonstriert werden. Die Expression von MHC Klasse II sowie den kostimulatorischen Molekülen ICAM-1, CD40, B7.1 und B7.2 ist dabei unbeeinflusst (ZUR LAGE et al. 2003). Diese Beobachtung legt nahe, dass die T-Zellaktivierung nur durch Makrophagen erfolgt, die erfolgreich MAP abgetötet haben oder durch dendritische Zellen. In infizierten bovinen Makrophagen konnte jedoch eine MAP spezifische Abregulierung von MHC Klasse I und Klasse II Molekülen beobachtet werden (WEISS et al. 2001).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sub- und intraepitheliale Makrophagen die erste Abwehrlinie gegen eine Infektion mit MAP bilden, paradoxerweise jedoch gleichzeitig dessen Hauptzielzelle im Wirt darstellen. Die persistente Infektion naiver, nicht durch IFN-γ vorstimulierter Makrophagen in der frühen Phase der Infektion ist entscheidend für den weiteren Verlauf der Erkrankung. Durch noch nicht genauer charakterisierte molekulare Mechanismen gelingt es MAP, den infizierten Makrophagen in einem deaktivierten Zustand zu halten, wobei die fehlende IFN-γ Aktivierung bereits infizierter Makrophagen eine Rolle spielen könnte. Als Konsequenz werden T-Zellen, die mit dem Makrophagen kommunizieren, ebenfalls in einen deaktivierten Zustand dirigiert.
B.2. Zelluläre Wirtsabwehr durch Makrophagen
Die intrazelluläre Persistenz von MAP in den naiven, nicht durch IFN-γ vorstimulierten Makrophagen steht, wie gerade dargestellt wurde, im Mittelpunkt der
Pathogenese der Paratuberkulose. Zum besseren Verständnis der patho- physiologischen Vorgänge einer Infektion mit MAP, wird im Folgenden die zentrale Bedeutung der Makrophagen für die zelluläre Wirtsabwehr dargestellt.
Die Wechselwirkungen pathogener Mikroorganismen mit dem Wirt stellen ein komplexes Geschehen dar. Dabei stehen die wirtseigenen Schutzmechanismen zur Abwehr körperfremder Partikel den vielfältigen Mechanismen der pathogenen Mikroorganismen zur Umgehung der Wirtsabwehr gegenüber. Im Allgemeinen kann das Immunsystem des Wirtes zwischen Körpereigenem und Körperfremdem unterscheiden und erkennt und eliminiert eingedrungene Mikroorganismen. Um sich gegen eine Infektion mit pathogenen Bakterien zu wehren, stehen Säugetieren zwei miteinander kommunizierende Immunsysteme zur Verfügung: zum einen die angeborene Immunität sowie zum anderen die erworbene Immunität (FEARON u.
LOCKSLEY 1996). Während die erworbene Immunität eine spezifische Immunantwort über die klonale Expansion von B- und T-Zellen mit folgender Produktion von antigenspezifischen Antikörpern auf die Erkennung von prozessiertem körperfremden Peptidantigenen auslöst, ist die angeborene Immunität in der Lage ohne Verzögerung mit einem phylogenetisch konserviertem Repertoire auf eine Infektion mit pathogenen Mikroorganismen zu reagieren (HOFFMANN et al.
1999; MEDZHITOV u. BIRON 2003). Durch die Entdeckung der Toll like Rezeptoren (TLR) in Säugetieren wurde ersichtlich, dass auch die angeborene Immunität über die Erkennung von mikrobiellen Bestandteilen, den sogenannten pathogen- associated molecular patterns (PAMP), die keine Analoga im Wirtsorganismus besitzen, in der Lage ist, selektiv auf eindringende Mikroorganismen zu reagieren.
TLR sind dadurch in der Lage, die Aktivierung der angeborenen und der erworbenen Immunität zu regulieren (TAKEDA et al. 2003).
Auf zellulärer Ebene stellen Makrophagen die erste Verteidigungslinie gegen wirtsfremde Partikel dar und werden als die Haupteffektorzellen des angeborenen Immunsystems angesehen (JANEWAY et al. 2002). Makrophagen repräsentieren eine Familie von enddifferenzierten mononukleären Phagozyten, die sich aus pluripotenten myeloiden Stammzellen des Knochenmarks entwickeln und innerhalb sowie außerhalb der lymphohämatopoetischen Organe im gesamten Körper anzutreffen sind (VAN FURTH u. SLUITER 1983). Dabei variieren sie je nach ihrer Herkunft und der lokalen Umgebung stark in ihrem Phänotyp (RUTHERFORD et al.
1993). Zu den typischen Gewebemakrophagen zählen z.B. die Peritoneal-
makrophagen, die Alveolarmakrophagen, die Kupfer`schen Sternzellen der Leber und die Mikroglia des zentralen Nervensystems. Trotz der großen Heterogenität ist die Aufgabe aller Gewebemakrophagen sehr einheitlich. Sie steigern die Wirtsabwehr gegen obligat und fakultativ pathogene Mikroorganismen im Zusammenspiel mit den B- und T-Zellen der erworbenen Immunität. Dabei repräsentieren Makrophagen äußerst spezialisierte Zellen, die partikuläre Antigene, einschließlich pathogener Bakterien, phagozytieren, degradieren und prozessieren, um sie restriktiv über MHC Klasse II Moleküle zu präsentieren.
B.2.1. Makrophagenaktivierung
Im Gegensatz zur spezifischen antimikrobiellen Antwort der erworbenen Immunität besteht die Aufgabe der unspezifischen angeborenen Immunität darin, eine schnelle und effektive erste Abwehrlinie gegen pathogene Mikroorganismen im Wirtsorganismus auszubilden und auf endogene Störungen, wie Gewebezerstörung und Zelltod zu reagieren (ADEREM u. ULEVITCH 2000; BEUTLER 2001; JANEWAY u. MEDZHITOV 2002).
Residente Gewebemakrophagen unterliegen dabei einer lokalen Aktivierung durch pathogenassoziierte, inflammatorische und immunologische Stimuli über oberflächenassoziierte Rezeptoren. Die Aktivierung bewirkt eine induzierte Migration von Monozyten aus dem Blutstrom sowie ihre Differenzierung, die Akkumulation von Gewebemakrophagen an den Ort des Geschehens und eine verstärkte Rekrutierung von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark. Zu den Erkenntnissen der klassischen Immunaktivierung von Makrophagen durch IFN-γ (CELADA u. NATHAN 1994;
MACKANESS 1962) kamen in den vergangenen Jahren immer neue Erkenntnisse, die aufzeigten, wie komplex die Aktivierung von Makrophagen ist. Verschiedene Liganden werden über eine Reihe von Membranrezeptoren erkannt und bewirken die rezeptorvermittelte Endozytose, intrazelluläre Signalvermittelung sowie Ver- änderungen in der Genaktivierung und Genexpression. Dabei handelt es sich um pathogene Bakterien und Bakterienbestandteile, aber vor allem auch um zelleigene bioaktive Botenstoffe, wie Zytokine und Chemokine. Die induzierten Effektor- funktionen der Makrophagen sind z.B. veränderte Adhäsions- und Migrations- eigenschaften, die Sekretion von bioaktiven Botenstoffen, die Antigenpräsentation und die Synthese von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffradikalen (GORDON 2003).
Auf Basis dieser Untersuchungen und nach der Entdeckung der TLR kam es zu einer neuen Einteilung der Makrophagenaktivierung in eine unspezifische angeborene Aktivierung und eine spezifische erworbene Aktivierung, der eine antigenspezifische und T-Zell-abhängige, IFN-γ induzierte Aktivierung zugrunde liegt. Wobei die unspezifische Aktivierung nur im Zusammenhang mit der klassischen antigenspezifischen Aktivierung des Makrophagen durch IFN-γ die effektive Abtötung von intrazellulären Bakterien, wie M. tuberculosis, vermittelt (FLYNN u. CHAN 2001).
Die unkontrollierte, überschießende Immunantwort der aktivierten Makrophagen wird über eine gesteuert Deaktivierung verhindert.
B.2.2. Antimikrobielle Eigenschaften von Makrophagen
Die Phagozytose, eine Sonderform der rezeptorvermittelten Endozytose, mit anschließender Lyse und Prozessierung internalisierter Mikroorganismen durch Makrophagen und neutrophile Granulozyten, gehört zu den wichtigsten unspezifischen Abwehrmechanismen des Wirtes (DJALDETTI et al. 2002;
KAUFMANN et al. 1999). Intrazelluläre pathogene Mikroorganismen, wie die Mykobakterien, verfügen über unterschiedliche Mechanismen, die es ihnen ermöglichen eukaryotische Zellen zu besiedeln und dem Prozess der Lyse und Prozessierung zu entgehen (ROSENBERGER u. FINLAY 2003).
Für die Phagozytose sind hauptsächlich drei Gruppen membranverankerter Rezeptoren von Bedeutung. Durch die Bindung ihrer Liganden wird die Phagozytose initiiert und Signale in das Zellinnere vermittelt (HENDERSON et al. 1996). Die Fc-Rezeptoren, vor allem der Fcγ-Rezeptor, und die Komplementrezeptoren CR1, CR3 und CR4 vermitteln die Phagozytose opsonisierter Bakterien. Die Gruppe der scavenger-Rezeptoren ist spezifisch für acetyliertes oder oxidiertes nieder- molekulares Lipoprotein, einige Lipoteichonsäuren und Polysaccharide (ERNST 1998; JANEWAY et al. 2002). Zusätzlich findet man an der Oberfläche von ausgereiften Makrophagen Mannoserezeptoren. Diese Transmembranproteine vermitteln die Phagozytose nicht-opsonisierter Mikroorganismen und verhindern die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROI) (ASTARIE-DEQUEKER et al.
1999).
Nach der Phagozytose befinden sich die Bakterien in einem spezialisierten Endosom, dem Phagosom, das unter koordinierten molekularen Veränderungen
schrittweise zum Phagolysosom heranreift (HAAS 2002). Das Phagosom wird hierbei durch die in die Phagosomenmembran eingelagerte protonenpumpende V-ATPase angesäuert. Dieser Prozess bewirkt eine Wachstumshemmung der Bakterien (VIEIRA et al. 2002). Die Phagosomenreifung wird unterteilt in das Stadium des frühen Endosoms, späten Endosoms und Phagolysosoms. Sie ist gekennzeichnet durch dynamische Membranfusionsvorgänge mit endosomalen Bestandteilen, welche durch wiederholende Abknospungs- und Fusionsereignisse von statten gehen und als kiss and run Interaktion bezeichnet werden (DORN et al. 2002;
STORRIE u. DESJARDINS 1996).
Die nach der Phagozytose der Mikroorganismen und Aktivierung der Makrophagen induzierten antimikrobiellen Eigenschaften können in sauerstoffabhängige und sauerstoffunabhängige Prozesse eingeteilt werden. Den sauerstoffabhängigen Prozessen kann der oxidative burst und die Produktion von reaktiven Stickstoffradikalen (RNI) zugeordnet werden (NATHAN u. SHILOH 2000). Beim oxidative burst handelt es sich um die Produktion von ROI durch NADPH-Oxidasen und weiteren Enzymen. Dieser Multikomponenten-Enzymkomplex reduziert molekularen Sauerstoff zu Superoxid-Anionen, Wasserstoffperoxid und anderen Metaboliten, die toxisch auf Mikroorganismen wirken. Die Produktion von NO und RNI durch die induzierbare NO-Synthase (iNOS) ist ein weiterer sauerstoff- abhängiger Prozess. Dabei katalysiert das Enzym die Oxidation des terminalen Guanidino-Sauerstoffatoms von Arginin. Die simultane Produktion von Sauerstoffperoxid und NO kann zur Bildung von Peroxynitrit führen, das eine im Vergleich zu NO wesentlich stärkere antimikrobielle Wirkung entfaltet (ISCHIROPOULOS et al. 1992).
Zu den sauerstoffunabhängigen antimikrobiellen Prozessen wird die Ansäuerung des Phagolysosoms, die Aktivierung von hydrolytischen lysosomalen Enzymen, der Entzug von wichtigen Nährstoffen, wie z.B. Eisen sowie die Produktion von Defensinen und anderen antimikrobiellen Enzymen, wie dem Lysozym gezählt (REINER 1994).
B.3. Signaltransduktion im Makrophagen
Die wesentlichen Pathomechanismen einer mykobakteriellen Infektion wirken auf subzellulärer Ebene. Viele Erkenntnisse im Bereich der Signalvermittlung beruhen
auf Untersuchungen in LPS stimulierten Makrophagen, daher wird im Folgenden auf die Signaltransduktion in Makrophagen, insbesondere die Signalvermittlung über TLR sowie die LPS bzw. Mykobakterien induzierte Signalkaskade, eingegangen.
Makrophagen werden durch bakterielle Antigene (PAMP), die eine sehr heterogene Gruppe von Molekülen mit und ohne Proteincharakter darstellen und keine Analoga im Wirtsorganismus aufweisen, auf unterschiedliche Weise moduliert. Die Antigene werden daher auch bakterielle Moduline genannt (HENDERSON et al. 1996).
Erkannt werden die PAMP durch pattern recognition receptors (PRR), zu denen auch die TLR oder der Mannoserezeptor gehören. Die Hauptaufgabe dieser Rezeptoren ist unter anderem die Induktion der Komplementaktivierungskaskade, Phagozytose, Aktivierung von proinflammatorischen Zytokinen sowie der Apoptose (JANEWAY u.
MEDZHITOV 2002).
Durch die Ligand-Rezeptor-Interaktion (Membranphase) wird ein extrazelluläres Signal über intrazelluläre Signaltransduktion (Zytoplasmaphase) durch die Zelle in den Zellkern weitergeleitet und induziert eine Veränderung der Genexpression.
Zumeist kommt es in der Signalkaskade zur Phosphorylierung der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin in den funktionellen Domänen der Proteine. Trotz vielfältiger Untersuchungen fehlt bislang ein vollständiges Bild über die Vernetzung von Signalwegen und ihrer Komponenten. Viele Erkenntnisse in diesem Gebiet wurden durch Untersuchungen an LPS stimulierten Makrophagen gewonnen (GUHA u. MACKMAN 2001; MONICK u. HUNNINGHAKE 2002), weitaus weniger ist über die Signalvermittlung in Mykobakterien infizierten Makrophagen bekannt (siehe unten).
B.3.1. Lipopolysaccharid und mykobakterielle Moduline
LPS, in der Literatur auch als Endotoxin bezeichnet, ist eine strukturelle Hauptkomponente der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien. Dabei ist LPS als Archetyp bakterieller Moduline fast vollständig für die Induktion der Makrophagenaktivierung bei einer Infektion mit Gram-negativen Bakterien verantwortlich (ROSENBERGER et al. 2000; SWEET u. HUME 1996). LPS ist ein amphiphiles Molekül, dessen Struktur in die drei separaten Teile Lipid A, Kernpolysaccharid (inner und outer core) und O-spezifisches Polysaccharid (O- Antigen) unterteilt werden kann (MADIGAN et al. 2000). Dabei variiert das O-Antigen stark von Spezies zu Spezies. Das Lipid A repräsentiert die Komponente, die für die
Endotoxinwirkung verantwortlich ist (RAETZ u. WHITFIELD 2002). LPS interagiert über das LPS-bindende Protein (LBP) und das Glykoprotein CD14 mit einem Multikomponenten-Rezeptor-Signal-Komplex, dessen zentrale Komponente der TLR4 darstellt, an der Oberfläche von Monozyten und Makrophagen und aktiviert die Zelle durch Stimulation verschiedener intrazellulärer Signalwege. Zu diesen zählen der nuclear factor kappa B (NFκB) und der immune response factor 3 (IRF-3) Signalweg (YAMAMOTO et al. 2004) sowie Tyrosinkinase-abhängige, Ionenkanal- abhängige (HENDERSON et al. 1996) und G-Protein-gekoppelte Signalwege (JAKWAY u. DEFRANCO 1986), die unten eingehender beschrieben werden.
Mykobakterielle Moduline sind einzigartige Strukturen, die zur Infektion von Makrophagen und ihrer Deaktivierung beitragen. Unter den mykobakteriellen Modulinen dominiert der Zellwandhauptbestandteil LAM. Es ist locker über seinen Lipidanteil in der Zytoplasmamembran oder dem oberen Segment der Zellwand, das aus komplexen Wachsen und Trialcylglyzerolen besteht, verankert (BRENNAN 2003). Funktionell repräsentiert es das mykobakterielle Analogon zum LPS. LAM ist eine verzweigte Form des Phosphatidylinositolmannosids (PIM) mit einem Mannosekern und einer Arabinose Domäne und kann anhand des capping Motivs der Arabinose Seitenketten in drei Hauptgruppen unterteilt werden (BRIKEN et al.
2004; QUESNIAUX et al. 2004): 1.) ManLAM: Das Mannose capping Motiv findet sich bei pathogenen Mykobakterien und wirkt antiinflammatorisch 2.) PILAM: Das Phosphoinositol capping Motiv findet sich bei apathogenen Mykobakterien und wirkt proinflammatorisch. 3.) AraLAM: Die Arabinose Seitenkette von M. chelonae besitzt kein capping Motiv und wirkt proinflammatorisch.
In vivo konnten deutliche Unterschiede in der Antigenität der unterschiedlichen LAM Gruppen nachgewiesen werden. Das capping Motiv scheint dabei für das Ausmaß der Makrophagenaktivierung entscheidend zu sein. Aber auch für Lipomannan (LM) sowie für PIM als biosynthetische Vorstufen des LAM konnten proinflammatorische Wirkungen nachgewiesen werden (QUESNIAUX et al. 2004).
Weitere typische mykobakterielle Moduline sind das in M. tuberculosis identifizierte zellassoziierte 19 kDa Lipoprotein, das Makrophagen TLR2 abhängig aktiviert (BRIGHTBILL et al. 1999), triacylierte Lipopeptide und Lipoproteine (TAKEUCHI et al. 2001; TAKEUCHI et al. 2002) sowie, als Hauptbestandteil der mykolsäurehaltigen Zellwandkomponenten, das Trehalose-dimycolat (TDM), auch cord factor genannt (INDRIGO et al. 2003; PEREZ et al. 2000).
Die Aktivierung der Makrophagen erfolgt bei den einzelnen mykobakteriellen Bestandteilen über unterschiedliche PRR (HELDWEIN u. FENTON 2002; KRUTZIK u. MODLIN 2004). Die isolierten mykobakteriellen Antigene spiegeln im Gegensatz zum LPS der Gram-negativen Bakterien nicht das Bild einer Infektion mit intakten Bakterien wieder. Dies zeigt, dass ganze Mykobakterien ein mehr oder minder komplexes Aktivierungsprogramm im Makrophagen initiieren (siehe unten).
B.3.2. Vermittlung über Toll like Rezeptoren
TLR gehören der Toll/IL-1-Rezeptor (TIR) Familie an (O'NEILL u. DINARELLO 2000). Agonisten von TLR, wie LPS oder LAM lösen im Makrophagen eine konservierte Signalkaskade aus, die der des IL-1 Rezeptors ähnelt (KOPP u.
MEDZHITOV 2003). Nach der Ligand-Rezeptor-Interaktion bindet die zytoplasmatische Rezeptordomäne (TIR-Domäne) an das Adaptermolekül myeloid differentiation primary response protein 88 (MyD88), welches die IL-1- Rezeptorassoziierte Kinasen (IRAK) rekrutiert. Durch Phosphorylierung aktivierte IRAK interagieren mit dem Tumornekrosefaktor-Rezeptorassoziierten Faktor 6 (TRAF6). TRAF6 wiederum leitet die Signale an mitogen-activated proteinkinases (MAPK) und IκB Kinasen (IKK), welche NFκB sowie das activator protein 1 (AP-1) rekrutieren, weiter. In der letzten Zeit konnten allerdings weitere Adaptermoleküle identifiziert werden, wie das TIR-Domänen Adapterprotein (TIRAP) auch MyD88- adaptor like protein (Mal) genannt. Dieses Protein ist wichtig für die Signalvermittlung über TLR2, TLR4 und TLR6 (HORNG et al. 2002). Ein weiteres Adaptermolekül ist das TIR domain-containing adaptor inducing interferon β (TRIF), welches eine Bedeutung für TLR3 hat und für die Vermittlung des über TLR4 induzierten MyD88- unabhängigen Weges, der IRF-3 aktiviert (PALSSON-MCDERMOTT u. O'NEILL 2004). Dieser selektive TLR4 Weg induziert IFN-β und über einen positiven feedback Mechanismus IFN-induzierbare Gene (YAMAMOTO 2004).
Nach der Aktivierung von TLR4 und TLR2 folgen viele Signalkaskaden über MAPK, Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3-K) und Sphingolipidmetabolite, deren Bedeutung weitgehend schon vor der Entdeckung der TLR für Makrophagen nachgewiesen wurde (SWEET u. HUME 1996). Zudem gibt es eine TLR verwandte Proteinfamilie von intrazellulären Rezeptoren, die nucleotide-binding oligomerisation domain proteins (NOD), welche intrazellulär gelegene bakterielle Bestandteile, wie z.B.
Peptidoglykane erkennen (INOHARA u. NUNEZ 2003). Ein Defekt des NOD2 Gens scheint zudem praedisponierend für entzündliche Darmerkrankungen, wie den Morbus Crohn, zu sein (GREENSTEIN 2003). Eine Rolle in der Vermittlung von mykobakteriellen Bestandteilen ist bisher nicht bekannt.
B.3.3. LPS induzierte Signaltransduktion
Wie bereits erwähnt, werden LPS induzierte Signale durch einen Multikomponenten- Rezeptor-Komplex übertragen. Hieraus resultiert offensichtlich eine breite Spanne von aktivierten Signalwegen. Zu diesen zählen Wege mit Aktivierung der PI3-K, der Proteinkinase C (PKC), der Proteintyrosinkinasen (PTK) sowie die im vorherigen Punkt angesprochene Aktivierung von MAPK und IKK über die Induktion von MyD88- abhängigen und MyD88-unabhängigen Wegen über TLR4. Die klassischen Rezeptor-PTK (RPTK) dimerisieren und autophosphorylieren nach der Bindung des Liganden und aktivieren ihrerseits eine Fülle von Signalwegen (SCHLESSINGER 2000). Untersuchungen mit einer Reihe von PTK Hemmstoffen belegen, dass PTK für die LPS Induktion von Zytokinen notwendig sind (SHAPIRA et al. 1994;
STEFANOVA et al. 1993).
Über die PTK erfolgt auch eine Stimulation des Phosphoinositol-Metabolismus. Die Phospholipase Cγ (PLCγ) wird aktiviert und hydrolisiert Phosphatidylinositol(4,5)P2
(PIP2) zu den second messenger Molekülen Diacylglycerol (DAG) und Inositol(1,4,5)P3 (IP3). IP3 bewirkt die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern, das seinerseits als second messenger fungiert und z.B. an Calmodulin bindet und Kalzium-Calmodulinkinasen (CaMK) aktiviert. Zudem aktivieren DAG und Ca2+ Mitglieder der PKC Familie (SCHLESSINGER 2000). Die Relevanz von PKC und Ca2+ für die LPS induzierte Signalvermittlung konnte in diversen Studien nachgewiesen werden (REINER 1994; SWEET u. HUME 1996).
Ein weiterer Effektor von PTK ist die Phospholipidkinase PI3-K. Aktivierte PI3-K ist membranständig und phosphoryliert Phosphatidylinositol(4)P (PIP) zu PIP2 und Phosphatidylinositol(1,4,5)P3 (PIP3), welches die Translokation von vielen Signalproteinen vermittelt (SCHLESSINGER 2000). Weiterhin wurde über ein Ankerprotein die PKC aktiviert (HERRERA-VELIT et al. 1997). Neuere Untersuchungen konnten zudem eine Beteiligung der PI3-K in der Signalvermittlung über TLR demonstrieren (MONICK u. HUNNINGHAKE 2002; OJANIEMI et al. 2003).
Zentraler Bestanteil der LPS induzierten Signalvermittlung sind MAPK, die Serin bzw.
Threonin phosphorylieren. Dabei unterscheidet man drei Hauptgruppen (Jun N-terminal kinase (JNK), extracellular signal-regulated kinases (ERK 1/2) und p38), die alle durch LPS und andere TLR Liganden über die TIR-Domäne aktiviert werden (SCHERLE et al. 1998). Die Aktivierung der MAPK erfolgt über MAPK-aktivierende Kinasen (MKK), die in hochkonservierten Proteinkinasekaskaden angeordnet sind und ihrerseits durch MAPK-Kinase-Kinasen (MKKK) aktiviert werden (RAO 2001).
Dem p38 Kinase Weg fällt eine essentielle Bedeutung für die LPS induzierte Zytokinaktivierung im Makrophagen zu (LEE et al. 1994). MAPK können wiederum auch über kleine G-Proteine von RPTK aktiviert werden (BAR-SAGI u. HALL 2000).
Heterotrimere G-Proteine sind schon lange als Komponenten der LPS induzierten Signalvermittlung in Makrophagen bekannt. Eine Ligandenbindung bewirkt die Bindung von GTP und die Dissoziation der α-Untereinheit, welche in der Lage ist, zytoplasmatische Effektormoleküle zu aktivieren (CHAKRABORTY 2001). Unter anderem kommt es zur Aktivierung der Adenylatzyklase, die die Erhöhung von intrazellulärem cAMP bewirkt. cAMP wirkt als second messenger auf die Proteinkinase A (PKA). Für zahlreiche LPS induzierten Gene konnten cAMP und PKA als Signalvermittler nachgewiesen werden (LORENZ et al. 1995; MUROI u.
SUZUKI 1993).
Zusammenfassend wird ersichtlich, dass eine Vielzahl von Signalwegen durch LPS induziert wird. Dabei kommt es zu einer sehr komplexen Quervernetzung der einzelnen Signalwege, die eine gezielte Aufklärung sehr erschweren.
B.3.4. Mykobakterien induzierte Signaltransduktion
Weitaus weniger ist über die mykobakteriell induzierte Signalvermittlung bekannt.
Mykobakterien und mykobakterielle Bestandteile aktivieren den Makrophagen über TLR (KRUTZIK u. MODLIN 2004). M. tuberculosis vermag Makrophagen über TLR2, als auch über TLR4 zu aktivieren (MEANS et al. 1999; MEANS et al. 2001). Im Gegensatz dazu aktivieren lebende M. avium Makrophagen nur über TLR2 (LIEN et al. 1999). Wie die Signalvermittlung genau initiiert wird, ist gegenwärtig noch unklar.
Gewissheit besteht über die zentrale Rolle der MAPK in der mykobakteriell induzierten Signalvermittlung (SCHOREY u. COOPER 2003). Mehrere Studien belegen, dass AraLAM, PIM und ManLAM p38 und ERK1/2 aktivieren (CHAN et al.
2001; JONES et al. 2001). In Infektionsexperimenten mit M. avium konnte gezeigt werden, dass die ERK1/2 essentiell für die TNFα Produktion ist (BHATTACHARYYA et al. 2002; BLUMENTHAL et al. 2002; REILING et al. 2001) und eine Wachstumshemmung von weniger virulenten glatten, opaken Kolonievarianten hervorruft (TSE et al. 2002). In diesen Studien war p38 für die IL-10 Expression notwendig und vermittelte die Vermehrung von virulenten glatten, transparenten Morphotypen. ROACH u. SCHOREY (2002) konnten in diesem Zusammenhang zeigen, dass ein virulenter M. avium Stamm kurzzeitig p38 und ERK1/2 aktiviert, während apathogene Vertreter konstitutiv die Aktivität der beiden MAPK erhöhte. Die den MAPK übergeordneten Signalwege sind in Mykobakterien infizierten Makrophagen weitgehend unbekannt. Ca2+, PKC und CaMK scheinen wie bereits erwähnt den MAPK übergeordnet zu sein. YADAV et al. (2004) konnten kürzlich demonstrieren, dass die ERK1/2 Aktivierung in M. avium und M. smegmatis infizierten murinen Makrophagen abhängig von der CaMKII war. Weitere Mediatoren scheinen wie bei LPS die kleinen GTP-bindenden Proteine zu sein, die als CR3- assoziiert auch mitverantwortlich für die Aufnahme von Mykobakterien sind (CHIMINI u. CHAVRIER 2000). Im Gegensatz zu den anderen Mykobakterien sind für die MAP induzierte Signalvermittlung noch keine Untersuchungen durchgeführt worden.
B.3.4.1. Mykobakterielle Modulation der Ca2+ Signaltransduktion
Aufgrund der in dieser Arbeit demonstrierten zentralen Bedeutung der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i) für die Signalvermittlung in stimulierten Makrophagen, wird im Folgenden die Rolle von Ca2+ in der Signalvermittlung sowie im besonderen die Modulation durch mykobakterielle Infektionen, dargestellt.
Eine wichtige Rolle in der Aktivierung von antimikrobiellen Effektorfunktionen im Makrophagen übernimmt das second messenger Molekül Ca2+ (BRIKEN et al. 2004).
In allen nicht erregbaren Zellen beginnt die Ca2+ vermittelte Signaltransduktion mit der Ausschüttung von Ca2+ aus Ca2+-speichernden Kompartimenten ins Zytoplasma der Zelle. Durch einen Infektions- oder Entzündungsstimulus wird die PLC aktiviert, welche PIP2 zu den second messenger Molekülen DAG und IP3 hydrolisiert (BERRIDGE 1993). Wie bereits erwähnt wurde, bewirkt IP3 die Freisetzung von Ca2+
aus den intrazellulären Speichern, welches seinerseits als second messenger fungiert und z.B. an Calmodulin bindet und CaMK aktiviert. Zudem aktivieren DAG
und Ca2+ Mitglieder der PKC Familie (SCHLESSINGER 2000). Die Relevanz der PKC und der [Ca2+]i für die LPS induzierte Signalvermittlung konnte in diversen Studien nachgewiesen werden (REINER 1994; SWEET u. HUME 1996). Weiterhin spielt die [Ca2+]i eine wichtige Rolle für den induzierten Zelltod (MATTSON u. CHAN 2003; ORRENIUS et al. 2003).
Pathogene Mikroorganismen beeinflussen auf unterschiedliche Weise die Ca2+
induzierte Signalvermittlung, um ihre Pathogenität zu entfalten und ihr Überleben im Wirt zu sichern (NHIEU et al. 2004). Auch in Mykobakterien infizierten Makrophagen konnte eine Beeinflussung des Ca2+ Signalweges und damit einhergehend die Hemmung von Makrophageneffektorfunktionen beobachtet werden. Untersuchungen zur Ca2+ Signalvermittlung in M. tuberculosis infizierten Makrophagen zeigten, dass lebende Bakterien im Gegensatz zu abgetöteten Bakterien die Sphingosinkinase 1 (SK1) Aktivität hemmten. Dieses Enzym phosphoryliert Sphingosin zu Sphingosin-1- Phosphat (S1P), welches über einen IP3-unabhängigen, unbekannten Mechanismus zur Erhöhung der [Ca2+]i führt (MALIK et al. 2003). Zudem konnten MALIK et al.
(2000) für eine Infektion mit lebenden M. tuberculosis eine fehlende Ca2+- Ausschüttung im Vergleich zu abgetöteten Bakterien demonstrieren, die zur Hemmung der Phagosomenreifung führt. In weiterführenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass das Phagosom mit lebenden Bakterien weniger Calmodulin enthält (MALIK et al. 2001). In diesem Zusammenhang stehen Ergebnisse von Untersuchungen in Makrophagen, die mit ManLAM gecoateten Latexkügelchen inkubiert wurden (FRATTI et al. 2003; VERGNE et al. 2003). In den ManLAM- Latexkügelchen enthaltenden Phagosomen ist nicht genügend Calmodulin vorhanden, um die CaMKII zu aktivieren. Dadurch bleibt die Rekrutierung von PIP3
an die Phagosomenmembran aus. Dieser Schritt ist jedoch eine Voraussetzung für die Phagosomenreifung und das Abtöten phagozytierter Mykobakterien (ANES et al.
2003).
Die Untersuchungen von ROJAS et al. (2000) gaben zudem Hinweise auf eine mögliche Verbindung der Fähigkeit von ManLAM die infektionsbedingte Apoptose zu hemmen und der Hemmung der Ca2+-Ausschüttung.
Die Beeinflussung des Ca2+ Signalweges könnte ebenfalls eine Bedeutung für die Hemmung der IFN-γ Signalkaskade durch M. tuberculosis haben. Die Verbindung zwischen dem Ca2+-CaMK Weg und der IFN-γ induzierten Expression von MHC Klasse II Molekülen wurde von INA et al. (1987) demonstriert. Weiterhin wird der
signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1), als wichtiger Transkriptionsfaktor IFN-γ-regulierter Gene, durch CaMKII aktiviert (NAIR et al.
2002).
B.4. Transkriptionelle Regulation von Entzündungsgenen
Die Aktivierung des Makrophagen durch einen Infektions- oder Entzündungsstimulus führt über die oben genannten Signalwege zur Aktivierung von Transkriptions- faktoren, auch transaktivierende Faktoren genannt, die die Transkription entzündungsrelevanter Gene vermitteln. Im Promotorbereich von Genen sind cisregulatorische Elemente vorhanden, die transaktivierende Faktoren spezifisch binden können. Im Folgenden wird nur auf die Transkriptionsfaktoren NFκB und CCAAT/enhancer binding protein β (C/EBPβ) eingegangen, da beide in den Untersuchungen dieser Arbeit zum einen als entscheidende Faktoren der IL-6 Genexpression in stimulierten Makrophagen identifiziert wurden und zum anderen eine Beeinflussung beider Faktoren in MAP infizierten Makrophagen vorliegt.
B.4.1. NFκB als zentraler Faktor der Entzündung
NFκB ist ein ubiquitärer, transienter Transkriptionsfaktor, der in zahlreichen Zellen exprimiert wird und vor allem bei der frühen Phase der Induktion meist immunologisch relevanter Zielgene eine zentrale Rolle spielt (GHOSH 1999). Eine Vielzahl interner und externer Stimuli induziert die Phosphorylierung und anschließende Degradation inhibitorischer κB Ankerproteine (IκB), die NFκB durch Komplexbildung im Zytoplasma arretieren. Durch die Degradation von IκB kann freies NFκB in den Zellkern wandern kann (KARIN u. BEN NERIAH 2000). Die Bindung von Homo- oder Heterodimere, die sich hinsichtlich ihrer transkriptionellen Aktivität unterscheiden, an sequenzspezifische κB-Motive in enhancer- und Promotorsequenzen initiiert, verstärkt bzw. hemmt die Expression NFκB-regulierter Gene (BALDWIN 1996). Dabei tritt NFκB oft in Verbindung mit anderen proinflammatorischen Transkriptionsfaktoren, wie z.B. C/EBP auf und scheint ein zentraler Koordinator der Immunantwort zu sein (AKIRA u. KISHIMOTO 1997). Das klassische NFκB Molekül besteht aus RelA (p65) und NFκB1 (p50). Diese beiden Untereinheiten bilden mit NFκB2 (p52), RelB und c-Rel die NFκB/Rel-Proteinfamilie
(GHOSH u. KARIN 2002). NH2-terminal besitzen alle Mitglieder die Rel-Homologie- Domäne (Rel-Domäne), welche die DNA-Bindung, Dimerisierung und nukleäre Translokation sowie die Interaktion mit IκB vermittelt (BLANK et al. 1992). Die alleinige Translokation von NFκB in den Zellkern ist jedoch noch nicht ausreichend für eine Induktion der Genexpression. RelA (p65) ist erst nach Phosphorylierung transaktivierungskompetent (YOZA et al. 1996). Die Phosphorylierung erfolgt dabei über MAPK, PKA, PKC und Proteinkinase B (PKB)/Akt. Zudem ist für die funktionelle Aktivierung eine Interaktion mit Kofaktoren sowie mit Faktoren des basalen Transkriptionskomplexes von Bedeutung (CARTER u. HUNNINGHAKE 2000; KERR et al. 1993). Die schnelle Neusynthese von IκBα führt zu einem vermehrten Einwandern von IκBα in den Zellkern, IκBα-NFκB-Komlexbildung und Zellkernexport zurück ins Zytoplasma, wodurch ein Abbruch der NFκB induzierten Transkription erfolgt (KARIN 1999).
B.4.2. C/EBP als Faktoren der Entzündung
Die Familie der C/EBP umfasst 6 Mitglieder: C/EBPα, β, γ, δ, ε und ζ, die über den leucine zipper dimerisieren und über die basic region an DNA binden (POLI 1998;
RAMJI u. FOKA 2002). Daher werden sie auch als basic leucine zipper (bZIP) Transkriptionsfaktoren beschrieben. Die in vitro Bindungsaktivitäten von C/EBPα, β, γ, δ und ε sind nach bisherigen Untersuchungen nahezu identisch. Durch die Möglichkeit der Bildung von Homo- und Heterodimeren sowie das Vorkommen von C/EBP-Isoformen entsteht ein großes Repertoire an Transkriptionsfaktoren mit enormem regulatorischen Potential (MCKNIGHT 2001; POLI 1998; RAMJI u. FOKA 2002). Im reifen Makrophagen haben vor allem C/EBPβ und δ eine wesentliche Relevanz während der Aktivierung durch Entzündungsstimuli. So weisen die Promotoren von vielen entzündungsrelevanten Genen C/EBP-Bindungsmotive auf (POLI 1998). C/EBPβ (NF-IL-6) wurde erstmalig 1990 als ein IL-1 induzierbarer Faktor beschrieben, der für die in vitro Expression von IL-6 notwendig ist (ISSHIKI et al. 1990). Trotz der Bedeutung der C/EBP sind die Erkenntnisse im Vergleich zu NFκB über die Aktivierung sowie die Relevanz von posttranskriptionellen und posttranslationalen Modifikationen im Makrophagen sehr begrenzt. Die Proteine der C/EBP Familie der Transkriptionsfaktoren werden auf mehreren Ebenen reguliert.
Diese umfassen die Transkription, Translation, Protein-Protein-Wechselwirkungen sowie phosphorylierungsbedingte Änderungen der DNA-Bindungsaktivität, des Transaktivierungspotentials und der Zellkerntranslokation. Zusätzlich zu diesen generellen Mechanismen wurde die potentielle Existenz von Gewebs- bzw. Zell- und Spezies-spezifischen Unterschieden in den Regulationsmechanismen identifiziert (RAMJI u. FOKA 2002). Im Gegensatz dazu zeigten neuere Untersuchungen von BRADLEY et al. (2003) zur C/EBPβ Aktivierung in LPS stimulierten murinen Makrophagen, dass C/EBPβ über die Genexpression reguliert wird, konstitutiv phosphoryliert vorliegt und nach der Translation direkt in den Zellkern wandert sowie zur DNA-Interaktion keine weiteren Phosphorylierungsschritte benötigt. Zudem konnte für RAW264.7 Makrophagen bisher gezeigt werden, dass C/EBPβ ein wichtiger Effektor bei der IFN-γ induzierten Genexpression über ERK1/2 (ROY et al.
2002) und mixed lineage kinase 3 (MLK3) (ROY et al. 2005) ist. Weiterhin konnten UEMATSU et al. (2002) in LPS stimulierten Makrophagen demonstrieren, dass C/EBPβ offensichtlich über einen TLR4-MyD88-abhängigen Signalweg aktiviert wird.
In diesem Zusammenhang scheinen auch MAPK eine Bedeutung für die C/EBPβ Aktivität zu haben. So erfolgt eine Beeinflussung der C/EBPβ Aktivität durch den p38-spezifischen Hemmstoff SB203580 (BALDASSARE et al. 1999).
Eine weitere Eigenschaft von C/EBP ist ihre Fähigkeit mit anderen Transkriptionsfaktoren zu interagieren (MCKNIGHT 2001; POLI 1998; RAMJI u.
FOKA 2002). Dies erweitert das Repertoire an möglichen Transkriptionsfaktoren enorm. Im Makrophagen kommt der Interaktion mit NFκB eine tragende Rolle zu (LECLAIR et al. 1992; LEE et al. 1996). Dabei interagieren C/EBP und NFκB über ihre bZIP- bzw. Rel-Domäne (STEIN et al. 1993). Die Relevanz dieser Interaktion konnte durch die synergistische Aktivierung von vielen Genen, wie dem IL-6 und dem IL-8 Gen durch C/EBP und NFκB belegt werden (MATSUSAKA et al. 1993).
CAIVANO et al. (2001) konnten für die LPS induzierte Cyclooxygenase 2 alpha Expression nachweisen, dass die frühe Phase durch NFκB reguliert und die späte Phase durch die vermehrte Synthese von C/EBP dominiert wird. Es ist anzunehmen, dass dieses Modell in einer mehr oder weniger stimulusabhängigen Form auch für andere NFκB- und C/EBP-regulierte Gene in Makrophagen zutrifft.
C. Material und Methoden
C.1. Chemikalien, Reagenzien und Geräte
Alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden, falls nicht durch Fußnoten gekennzeichnet, von Sigma (Deisenhofen), Merck (Darmstadt) oder Roth (Karlsruhe) bezogen. Die eingesetzten Enzyme, Protein- und DNA-Größen- marker, Zellkulturmedien sowie die Medienzusätze stammten von Invitrogen (Groningen, NL) und die verwendeten Restriktionsendonukleasen von New England Biolabs (Frankfurt/Main), andernfalls erfolgte eine Kennzeichnung durch Fußnoten.
Geräte, verwendete Kits und spezielle biologische Reagenzien sind durch Fußnoten gekennzeichnet. Die Verbrauchsmaterialien sind im Anhang (I.1.) aufgelistet.
C.2. Bakterienkulturen
C.2.1. Mykobakterien
C.2.1.1. Bakterienstämme
Sämtliche dieser Arbeit zugrunde liegenden Untersuchungen wurden mit dem Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) Feldstamm 6783, der erstmalig bei (JARK et al. 1997) beschrieben wurde, durchgeführt. Der Stamm wies ein mycobactinabhängiges Wachstum auf und wurde vom nationalen Referenzzentrum für Mykobakterien (Institut für experimentelle Biologie und Medizin, Forschungsinstitut Borstel) durch Sequenzanalyse des 16S rRNA Gens als MAP identifiziert. Die Bestätigung der Klassifizierung erfolgte am Institut für Mikrobiologie an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durch den PCR gestützten Nachweis des IS900. Der Bakterienstamm ist bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) unter der Nummer 44135 hinterlegt.
C.2.1.2. Stammhaltung
Die Kultivierung der Mykobakterien erfolgte an der Oberfläche in Zellkulturflaschen bei 37°C und feuchter Atmosphäre im Brutschrank über mehrere Monate unter
Zusatz von 2 mg/l Mycobactin J1 in 20 ml Watson-Reid Medium (5 g/l L-Asparagin;
10 g/l Glukose; 2 g/l Diammoniumcitrat; 75 mg/l Eisenammoniumcitrat; 2 g/l NaCl;
2 g/l KH2PO4; 1 g/l MgSO4 x 7 H2O; 10 mg/l ZnSO4 x 7 H2O; 2 mg/l CaCl2 x H2O;
63 ml/l Glyzerin, 4 g/l Natriumpyruvat). Der pH-Wert des Mediums wurde mit NaOH auf 5,6 eingestellt und anschließend autoklaviert. Bei RT erfolgte die Zugabe des Natriumpyruvats und des Mycobactins. Zur längeren Konservierung wurden die Mykobakterien in Watson-Reid Medium als 25% [v/v] Glyzerinstocks bei -80°C eingefroren oder es erfolgte die Anfertigung von Lyophilisaten. Dabei wurde MAP- Kulturmaterial in 10 ml Kälberserum mit Zusatz von 10% [w/v] Glukose auf- genommen, je 1 ml in ein Lyophilisatgefäß überführt und 12-16 h lyophilisiert. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
C.2.1.3. Bakterienernte und Vitalitätsprüfung
Zur Gewinnung der Mykobakterien für die Infektionsversuche wurden nur Kulturflaschen verwendet, die ein dichtes Wachstum an Bakterien mit einem Koloniedurchmesser von 3-15 mm aufwiesen. Mit einer sterilen Impföse wurden die Kolonien von der Oberfläche des Mediums abgehoben und in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml DMEM überführt. Nach Zugabe von 30 sterilen Glasperlen erfolgte die Vereinzelung der Bakterien für 5 min auf dem Vortex2. Um verbliebene Kolonieverbände von den vereinzelten Mykobakterien zu trennen, erfolgte ein Zentrifugationsschritt der Suspension für 10 min bei 100 x g und RT. Der Überstand wurde für die Infektion gesammelt und die optische Dichte bei 660 nm (OD660nm) bestimmt, um nachfolgend die Bakteriensuspension für die Infektionsversuche auf eine OD660nm von 0,15 (KUEHNEL et al. 2001) einzustellen.
Die Vitalität der Bakterien wurde mit dem BacLight System3 nach den Angaben des Herstellers überprüft. Im Allgemeinen betrug die Vitalität der MAP ca. 70-80%.
1 Synbiotics, Stuttgart
2 Heidolph, Vertrieb Landgraf, Hannover
3 Molecular Probes, Vertrieb Invitrogen, Groningen, NL
C.2.2. Escherichia coli
C.2.2.1. Bakterienstämme
Für sämtliche Arbeiten wurde der Escherichia coli (E. coli) Stamm DH5α (HANAHAN 1983) mit dem Phänotyp supE44 ΔlacU169 (φ80lacZ ΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 eingesetzt.
C.2.2.2. Stammhaltung
Der DH5α Stamm wurde in autoklaviertem Luria-Bertani (LB) Medium (1,0% [w/v]
NaCl; 1,0% [w/v] Trypton; 0,5% [w/v] Hefeextrakt) bei 37°C und 150 Umin-1 im Schüttelinkubator kultiviert. Bei Bedarf wurde dem Medium 100 µg/ml Ampicillin (Amp) zugesetzt. Die Amp-Stocklösung (100 mg/ml in 70% [v/v] Ethanol) wurde bei -20°C gelagert. Eine Lagerung der Bakterien im Kühlschrank auf LB-Agarplatten (1,5% [w/v] Agar) war für 4 Wochen möglich. Für eine längerfristige Konservierung wurden 25% [v/v] Glyzerinstocks angelegt und diese bei -80°C gelagert.
C.3. Zellkultivierung
C.3.1. Zelllinien
Für die Gewinnung von genomischer DNA (gDNA) wurden J774A.1 Makrophagen (RALPH et al. 1976) eingesetzt. Diese murine Zelllinie (DSMZ-Nummer ACC 170) wurde 1968 aus einem spontanen Tumor einer BALB/c Maus gewonnen und besitzt folgende Eigenschaften: Komplement- und Immunglobulinrezeptoren, Lysozym- und Interleukin 1-Synthese. Für alle Untersuchungen der Interaktion von MAP bzw.
Lipopolysaccharid (LPS) mit Makrophagen wurde die murine Zelllinie RAW264.7 (RASCHKE et al. 1978) eingesetzt. Dabei handelt es sich um durch den murinen Abelson Leukämievirus transformierte Makrophagen (ATCC4-Nummer TIB-71).
Diese Zelllinie weist folgende Eigenschaften auf: Lysozymsynthese, keine Oberfächen-immunglobuline.
4 American Type Culture Collection, Manassas, USA
C.3.2. Kultivierungsbedingungen
Die Makrophagen wurden in 20 ml DMEM mit Zusatz von 10% [v/v] FCS und 1% [v/v] Glutamin (Vollmedium) in Zellkulturflaschen bei 37°C, 8% CO2 und feuchter Atmosphäre im Brutschrank kultiviert. Die Passagierung der Zellen erfolgte alle 48 h in einer 1:2 Verdünnung. Dabei wurden die stark anhaftenden Makrophagen in DMEM abgeschabt. Zur längeren Konservierung wurden ca. 5 x 107 Zellen/ml in Einfriermedium (70% [v/v] DMEM; 20% [v/v] FCS; 10% [v/v] DMSO) aufgenommen und als Arbeitsstocks bei -80°C oder zur Aufbewahrung von bis zu drei Jahren in flüssigem Stickstoff gelagert.
C.3.3. Stimulation und Infektion von Makrophagen
C.3.3.1. Infektion mit MAP und Stimulation mit LPS sowie Kalziumionophor Für die Infektion der Makrophagen mit MAP bzw. die Stimulation mit LPS5 sowie Kalziumionophor wurden die Zellen, wie in den einzelnen Methoden (C.4.1.; C.6.1.1.;
C.6.1.2.; C.7.2.1.; C.8.1.1.) angegeben, in 12-well-Kulturplatten oder in Kulturschalen (85 mm und 150 mm) ausgesät. Die Zelldichte wurde so eingestellt, dass sich am Tag der Infektion eine Konfluenz von ca. 80-100% ergab. Das Medium wurde einen Tag vor dem Versuch durch frisches Medium ersetzt. Bei der Transfektion wurden bestimmte Abweichungen vorgenommen, die in dem Kapitel C.7.2.1. separat beschrieben sind. Die Infektion mit MAP erfolgte mit einer OD660nm von 0,15 für 2 h in 5 ml Vollmedium bei 37°C und 8% CO2. Danach wurden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 6,5 mM Na2HPO4; 1,7 mM KH2PO4; pH 7,2) gewaschen, um alle noch extrazellulär gelegenen MAP zu entfernen. Anschließend wurde den Zellen 5 ml Vollmedium für den 2 h und 8 h Erntezeitpunkt bzw. 10 ml Vollmedium für den 24 h Erntezeitpunkt dazugegeben. Für die Stimulation mit LPS wurde eine Konzentration von 5 µg/ml Vollmedium gewählt. Dabei verblieb das LPS bis zu den Erntezeitpunkten auf den Zellen. Für die Stimulation mit Kalziumionophor (A231876) wurde eine Konzentration von 10 µM gewählt. Dabei wurde dem Vollmedium A23187 vor der Infektion mit MAP oder der Stimulation mit LPS A23187 sowie dem Vollmedium nach dem Waschschritt
5 LPS von Salmonella Typhimurium, Sigma, Deisenhofen
6 Calbiochem, Vertrieb Merck Biosciences, Schwalbach
der MAP infizierten Zellen zugesetzt. Bei alleiniger Behandlung der Makrophagen mit A23187 verblieb das Kalziumionophor bis zu den Erntezeitpunkten auf den Zellen.
C.3.3.2. Hemmstoffversuche
Für die Hemmstoffversuche erfolgte vor der Stimulation der Zellen mit LPS eine Präinkubation mit dem entsprechenden Hemmstoff für 30 min bei 37°C und 8% CO2. Nach Entfernung des Mediums erfolgte die Stimulation mit LPS unter Zusatz der Hemmstoffe wie unter C.3.3.2. beschrieben. Die eingesetzten Hemmstoffe7 wurden in folgenden Konzentrationen eingesetzt:
EGTA; extrazellulärer Ca2+ Chelator; final 1 mM
Gö 6979; Ca2+-PKC Antagonist; final 100 nm; 0,5 µM; 1 µM H-89, Dihydrochlorid; PKA Antagonist; final 4 µM
KN-93; kompetitive Hemmung CaMK II; final 10 µM LY 294002; PI3-K Antagonist; final 50 µM
Ro-31-8220; PKC Antagonist; final 1 µM
TMB-8, Hydrochlorid; Hemmung der Ca2+-Ausschüttung; final 50 µM
C.4. Zellkulturüberstandanalysen
Die Messung des Zytokin- und Nitritoxid (NO)-Gehaltes in Zellkulturüberständen ist eine gängige Methode, um den Grad der Aktivierung von Makrophagen zu bestimmen.
C.4.1. Gewinnung der Zellkulturüberstände
Für die Gewinnung der Zellkulturüberstände wurden 5 x 105 RAW264.7 Makrophagen pro well in 1 ml Vollmedium auf 12-well-Kulturplatten ausgesät und über Nacht inkubiert (C.3.2.). Nachfolgend erfolgte die Infektion der Zellen mit MAP bzw. die Stimulation mit LPS (C.3.3.1.) in 1 ml Vollmedium. Nach 2 h, 8 h und 24 h wurden die Zellkulturüberstände abgenommen, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und bis zur Messung bei -80°C gelagert.
7 vgl. 6
