Dr. rer. nat. Stephan Rust
Allgem. Pädiatrie, Klin. Kinder- u. Jug.-med., Stoffwechsellabor Prof. Marquardt
48149 Münster Tel.: 0251 83-55182 rusts@uni-muenster.de stephan.rust@ukmuenster.de
Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik Vorlesung: Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen
Wintersemester 2021/22 Rust 6/04 -6
Tangier Krankheit
uvula bifida Neue Gene - Warum?
Das menschliche Genom ist doch komplett bekannt?
• Fast – aber seine Funktion noch lange nicht.
• Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen
„Identifikation neuer Gene als Krankheitsursachen“
Volkskrankheiten
Differenzierung von Ursachen und damit bessere Vorhersage und gezieltere Therapie
WER
soll überhaupt therapiert werden und WIE
Stoffwechsel verstehen, alle Gene im Pathway kennen, um Angriffspunkte für Therapie zu
definieren.
seltene Krankheiten
pränatale Diagnose, und evtl. auch Ideen für Therapie (klassiches Beispiel PKU)
21.4
0 5 10 15 20 25
21,4 78,6 0
20 40 60 80 100
I II III IV V
Der PROCAM Algorithmus
0.6 2.1 2.8
7.6 Herzinfarkte (%) in 10 Jahren
325 tödliche und nicht-tödliche Herzinfarkte bei 4818 Männern im Alter von 35-65 Jahren Unabhängige Parameter: Alter, systolischer Blutdruck, LDL-Cholesterin, HDL-Cholesterin, Triglyzeride, Diabetes, Rauchen, familiäre Belastung
Quintile des PROCAM Score
Procamquintile n
Rust 6/04 -3
Skala >
78,6
er: Alter, sy yzeride, Dia
Technik:
Vererbung in Familien und in großen Case-Control Studien
mit SNP s
(single nucleotide polymorphisms)
Rust 6/04 -27
Prinzip bei Illumina: Synthese
A T
G
C
2 Allele, „A“ und „B“100 %
0 %
AA BB AB
B-Allel-Anteil
1. Grobe Lokalisation
... mit Illumina SNP-Chips
Identifikation der ursächlichen Gene bei rezessiven Erbkrankheiten
BB AB AA
Jeder blaue Punkt
= ein SNP-Genotyp:
AA (nahe bei 0.00)) AB (im mittleren Bereich) BB (max. Signal B)
Tangier Krankheit
- 9 - vergrößerte Tonsillen
Tangier Krankheit
• Tonsillen
• Schaumzellen auch bei Heterozygoten in Mukosa des Intestinums und Dickdarms
• Hepatosplenomegalie
• Periphere Neuropathie
• Thrombozytopenie
• Erhöhte Wahrscheinlichkeit für
koronare Herzkrankheit
• HDL-Defizienz
HDL / LDL -Cholesterin
Der HDL-Cholesterinspiegel ist teils
• genetischbedingt (Geschlecht, Zwillingsstudien),
• durch Verhalten (Rauchen , Sport ) beeinflußt Mittelwerte Deutschland
Frauen: 55 mg/dl Männer: 45 mg/dl
Niedriges HDL höheres Infarktrisiko LDL im Überschuss wird von Makrophagen aufgenommen,
... => Arteriosklerose
HDL kann Cholesterin zur Leber zurückführen.
Symbols:
female male, deceased heterozygous female homozygous female Pedigree of a Tangier disease family (1640 - today) G. Assmann et al. J. Clin. Inv. 60, 1025-35 ('77)
Rust 6/04 -15
Tangierpedigree
Identifikation des Tangiergens
ABCA1
9q31
Rust 6/04 -18
Unterschiedliche ABCA1 Defekte unterschiedlicher Effekt
Asn935Ser c.1823delG : Leu608Leu; L608fsX635
TD1 (CAD - ) TD2 (CAD +)
6 1
H2N
NBF
7 12
COOH M640
E662 L681
I703
V717 L739 L745
W767 F773 F794
L821
E843 F1348 I1677
P1370 V1655
S1764
F1786 N1800 I1718
M1822
R1873
1946-1953 V2261
EYSGVTSAHCNLCLLSSSDSRASASQVAGITAPATTPG
missense; in frame ins or del
mutations causing premature stop polymorphic missense mutations NBF
L1740
N1852
Structure of ABCA1 - Mutations in Tangier Disease
Rust 6/04 -19
N935S 933-940
fs*635
..fs*635: vorzeitiger Abbruch, RNA wird weitgehend abgebaut (-> nonsense mediated decay), keinerlei Funktion mehr,
HDL-Defizienz Oxysteroleim Blut, Arteriosklerose, Herzinfarkt Asn935Ser: ABCA1 - NBF1 ist defekt
HDL-Defizienz
ABER: Oxysterol-Transport noch möglich KEINE Arteriosklerose
=> das Wissen über die konkrete Mutation ist beim ABCA1 wichtiger als der Effekt auf das HDL-Cholesterindas Wissen über die konkrete Mutation ist beim ABCA1 wichtiger als der Effekt auf das HDL-Cholesterin Effekt der Mutationen im ABCA1:
Hepatocyte like cells Patientenspezifische Zellkulturmodelle - Beweis der funktionellen Relevanz von Mutanten
und nach Korrektur als Therapiemethode
Dalgetty DM, et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009 (review) HCLs:
Rashid ST, et al. J Clin Invest. 2010 25 days Song Z. et al. Cell Res. 2009 21 days Gay H., et al. Differentiation. 2010 25 days
Mutagenese durch Talen oder CRISPR/Cas9 Direkter:
Zielzelltyp (z.B. HepG2-Zellen)
SNPs – auch geeignet für große Case-Control Studien
„GWAS“
(genome wide association study) - auch geeignet, wenn kein meßbarer
Phänotyp außer Endpunktereignis;
geeignet besonders für häufige Variante mit schwachem Effekt
Ergebnisse Mai-Juni
2007:
Rust 6/04 -29
Wellcome Trust case control consortium:
14 000 cases, 3000 controls
9q-Deletion in der Chip-Analyse:
Conrad DF et al. Nat Genet. 2006 Jan;38(1):75-81 ... we estimate that typical individuals are hemizygous for roughly 30-50 deletions larger than 5 kb, totaling around 550-750 kb of euchromatic sequence across their genomes.
The detected deletions span a total of 267 known and predicted genes.
Tangier Krankheit
Rust 6/04 -6
uvula bifida
Schwerpunkt Glykoproteine
1 Kernmembran 2 Kernpore 3 Rauhes ER 4 Glattes ER 5 Ribosom 6 Proteine in
Vesikel 7 Transportvesikel 8 Golgi 9 Cis-Golgi 10 Trans-Golgi 11 Zisternen
II Golgi
C 6 5 4 3 2 1 0 C D G I C D G I-II
4
Isoelectric focusing (IEF)
2 1
Number of(sialicacids)
Endoplasmic reticulum (ER)
Ribosome
I
Dolichol-anchor for glycane precursor in ER membrane.
N-acetylglucosamine, mannose, glucose, galactose, sialic acid
ER-lumen Golgi
OST
CDG-I || CDG-II
Glukose Mannose Galaktose Sialinsäure N-Acetyl-Glucosamin Dolichol-Phosphat
Glykoproteine, N-Glykosylierung:
Serum Transferrin: 679 Aminosäuren, 2 Glykosylierungsstellen:
... Asn Tyr AsnLys SerAsp Asn ...
N-Glycosylierung am Asn in
... - Asn – X – Ser - ... oder ... - Asn – X – Thr - ... X : nicht Pro
... Gly Ser AsnVal ThrAsp Cys ... NH C O
CH2
C H
H C O
NH
N C
O C H
X NH
C O
- -
H N im Transferrin:
`
„Glykan“Isolektrische Fokussierung (IEF)
Die Ladung eines Proteins in Lösung wird durch den pH bestimmt
- im sauren Bereich: R-COOH, R-NH3+ - im basischen Bereich: R-COO-, R-NH2
Aminosäuren mit potentiell geladene Seitenketten:
Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin
Cystein, Tyrosin (geben bei basischen pH Proton ab) Außerdem: Sialinsäuren am Ende der Glykane
Prinzip isolelektrische Fokussierung in pH-Gradient
IP
isoelektrischer Punkt
= pH bei dem Gesamtladung des Proteins = 0 ist
- -
HH + +
Transferrin-Glykosylierung
Sialinsäure, neg. Ladung
- -
- -
Ko Ia AAy
4 32 1 0 C D G I
C D G II
Asn
Galactose IEF:
=> Isoelektrische Fokussierung des Transferrins wird genutzt zur Diagnose von Glykosylierungsstörungen
Stammbaum einer Familie mit CDGx
? ? ?
1. Homozygotiemapping 2. Next Generation Sequenzierung
(PGM1-CDG:) In der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) von Transferrin zeigte sich eine Mischform
CDG-I / II
Ko MAy AAy
Tetrasialo- Disialo-
Asialo- Trisialo-
Monosialo- Trans- ferrin
centromer PGM1
Basepairs Chromosome 1
Lodscore
Zusätzlich zu blaue-Punkt-Bildern:
Linkage analysis mit „Merlin“, hier Chromosom 1
In total: 87.37 MB in 12 regions of the genome
Anreicherung und Sequenzierung von interessanter Region oder Komplettsequenzierung von
Patientengenom
Agilent SureSelect
Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ... Good news ... Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Was können wir erwarten vom
„whole EXOME sequencing“ ? Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ... Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
Good news ...
PGM1 GALE
GCNT6 AKR7L
LRRC40 PAPOLG
OFCC1
HPSE2 PDZD8 NextGenSeq: > 200 homoz. Mutationen in autosomaler Kandidatenregion, davon nur 8nicht als SNP bekannt Homoz. - Mapping: > 1600 Datenbankeinträge, darin u.a. GALE (Galaktoseepimerase)
Homozygote Kandidatenregion
86,7 Mbp autosomal PGM1 – Struktur, Funktion, Mutationen
19 38 62 115 121 263 291 330 377 404 499 503 517
516 41
III I I I I
IV
II
Phosphoglucomutase 1
Gluc-1P Gluc-6P Gluc-1,6 BP
-1-P
UDP
GYS
glycogen UDP-
PYG UGP GALE
UDP-
-1-P
P
-6-P glycosylation
lactose -> galactose
glucose
energy, fatty acids PGM1
carbohydrates GALT
Normal function of PGM1
-1-P
UDP
GYS
glycogen UDP-
PYG UGP GALE
UDP-
-1-P
P
-6-P glycosylation
galactose
glucose
energy, fatty acids PGM1
lactate complex
carbohydrates GALT
Two disease classes:
Nahrungsergänzung auf beiden Seiten der PGM1-Reaktion
-1-P
UDP
GYS
glycogen UDP-
PYG UGP GALE
UDP-
-1-P
P
-6-P glycosylation
galactose
glucose
energy, fatty acids PGM1
lactate complex
carbohydrates GALT
A
B
77351.87
79556.44
2
3 4
79556.58 4
3
0 1 2
2
1 0
6 5 4 3 2 1 0 IEF
Number of(sialicacids)Number of(sialicacids)
6 5 4 3 2 1 0 IEF
Mass Spectroscopy
Transferrin- backbone
Galactose treatment of PGM1-deficiency tends to correct CDG:
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00
-20,00 -10,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00
Tetrasialo-Tf (%) Hyposialo-TF (%) Gal (g/day)
UDP- UDP-
1P-
PGM1-Defect
GALT GALE
1P- Glykane
UGP
UTP
-6-P glucose
PGM1
-6-P glucose
PGM1
-1-P
UDP
GYS
glycogen UDP-
PYG UGP GALE
UDP-
-1-P
P
-6-P glycosylation
galactose
glucose
energy, fatty acids PGM1
lactate complex
carbohydrates GALT
Therapeutic options:
Circumvent the PGM1-block
Uridine
Symtoms of PGM1-deficiency
3 x cardiac arrest
ZASP- binding
region
Arimura T et al.
Cardiovasc Res 2009;83:80-88 Published on behalf of the European Society of Cardiology. All rights reserved. © The Author
2009. For permissions please email: journals.permissions@oxfordjournals.org.
Fluorescence images of transiently expressed GFP-tagged PGM1
(in rat cardiomyocytes)
Dilatative Kardiomyopathie - ZASP Z band alternately spliced PDZ-containing protein
- =$63'HIHNWĺNHLQH%LQGXQJYRQ3*0ĺ'&0
Arimura T, Cardiovasc Res (2009) 83, pp 80-8
ZASP
PGM1
Effekt wird sichtbar bei Entzug von Serum in der Zellkultur
Sichtbar nach 3 Tagen, evtl. durch Verbrauch der Fettsäuren, Umschalten auf Energie aus Glucose Mögliche Therapie: Stabilisierung der Glucose und Lipide, Vermeidung von Glucose Bolus
Komplexe Kohlenhydrate
FS (%)
Metildigoxin Captopril
L-Thyroxine Enalapril Metoprolol Hydrocortisone
Somatropin
40 50 60 70 80 90 100 110 120
-20%
-10%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
FS % LVIDD (mm)
age (years) 40 -20%
0 5 10 15
0 5 10 15
25 30 35 40 45 50 55 60
Age (years)
Therapeutic options I: Circumvent the PGM1-block
Normalization of glucose & glycosylation:
galactose & uridine complex carbohydrates II: Myopathy, DCM
improved fatty acid use:
training below aerobic threshold to improve oxidative capacity
MCT, heptanoic acid, citrate
=> Newborn screening
Aufspüren des ursächlichen Gens – wenn keine Konsanguinität vorliegt
Exom-Sequenzierung:
350 000 Mutationen Allelfreq
<=2 % (5300)
451 relevante Mutationen in 35 Genen35 Gene
genesymbol #Mut
ADAMTSL4 2
AGAP3 1
ATP5A1 1
BCLAF1 2
CDC27 2
CTDSP2 2
DAAM2 2
FAM131C 2
FAT2 2
FAT4 2
GFI1 1
GGA1 2
HIP1R 1
KCNT1 2
KIAA0319 1
KIR2DL3 2
LRP12 2
LSMD1 1
MSLNL 2
NCOA7 1
ND5 1
PIEZO1 2
PIK3C2G 2
PKHD1L1 1
POU2F3 2
RBFOX3 2
SH3BP4 2
SLC39A8 2
TBP 3
TEKT4 8
TLN2 2
USP48 2
WDR74 3
ZNF138 2
ZNF423 2
Genedestiller, Brain- storming Ź Stand seit ca. 2017: fast immer Triom-Analyse =>
Neumutationen bei Kind erkennbar
Effizientes SNP-Chip basiertes Mapping und
„next generation sequencing“, oft Triom beschleunigen die Aufklärung der
„molecular basis of inherited disease“
Konsequenzen:
Pränatale und
prä-Implantations-Diagnostik möglich Gezielte Therapie oft möglich (Enzymersatztherapie, einfache Nahrungsergänzung oder ...
Stephan Rust, Tel. 83 - 5 5182 rusts@uni-muenster.de Laura Tegtmeier
Janine Reunert Julien Park Thorsten Marquardt Volker Debus Anja Seehöfer Stephan Rust
Universitätsklinikum Münster Klinik für Kinder- und Jugendmedizin
Marianne Jansen-Rust Tanja Seehafer Anika Sietmann
Melanie Bach Michaela Schreiner Michaela Tirre LIFA (geschlossen)