TGFbeta und Fibrose der Haut

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Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie (Prof. Dr. med. M. Schön)

der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen

vorgelegt von

Marie Sophie Lüders

aus Hannover

Göttingen 2020

TGFβ und Fibrose der Haut

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Dekan: Prof. Dr. med. W. Brück

Betreuungsausschuss

Betreuer/in Prof. Dr. med. C. Seitz………….……….

Ko-Betreuer/in: Prof. Dr. med. D. Katschinski……….….……….

Prüfungskommission

Referent/in Prof. Dr. med. C. Seitz……….…….

Ko-Referent/in: Prof. Dr. med. D. Katschinski..……….

Drittreferent/in: Prof. Dr. mult. T. Meyer……….

Datum der mündlichen Prüfung: …08.07.2021………..

(3)

Hiermit erkläre ich, die Dissertation mit dem Titel "TGFβ und Fibrose der Haut" eigenständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.

Göttingen, den ……… ………

(Unterschrift)

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Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis ... III Tabellenverzeichnis ... IV Abkürzungsverzeichnis... V

1 Einleitung ... 1

1.1 Aufbau der Haut ... 1

1.1.1 Die Epidermis ... 1

1.1.2 Die Dermis ... 2

1.1.3 Die Subkutis ... 2

1.2 Das Zytokin Transforming Growth Factor β (TGFβ) und seine Funktion in der Haut ... 3

1.2.1 Der TGFβ-Signalweg ... 3

1.2.2 TGFβ1 in Wundheilung ... 4

1.2.3 Fibrose der Haut ... 4

1.2.4 TGFβ1 und epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ... 5

1.3 Beispiel einer fibrosierenden Hauterkrankung: Systemische Sklerodermie ... 6

1.3.1 Epidermis in fibrosierenden Hauterkrankungen ... 7

1.4 TGFβ1 und das Zytoskelett ... 8

1.4.1 Einfluss von TGFβ1 auf das Aktin-Zytoskelett ... 8

1.4.2 Das aktinbindende Protein Sm22α ... 9

1.4.3 Sm22α in Fibrose und Zellmotilität ... 10

1.5 Zielsetzung dieser Arbeit ... 11

2 Material und Methoden ... 13

2.1 Material ... 13

2.1.1 Geräte ... 13

2.1.2 Einmalmaterialien ... 14

2.1.3 Chemikalien ... 16

2.1.4 Lösungen und Puffer ... 17

2.1.5 Zellkulturreagenzien ... 19

2.1.6 Antikörper ... 19

2.1.7 Oligonukleotide ... 20

2.1.8 Kits ... 22

2.1.9 Software ... 22

2.2 Methoden ... 22

2.2.1 Zellkulturmethoden ... 22

2.2.2 Analyse der Proteinexpression ... 24

2.2.3 Analyse der Ribonukleinsäure (RNA)-Expression ... 27

2.2.4 Phasenkontrastmikroskopie ... 30

2.2.5 Immunfluoreszenz ... 30

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Inhaltsverzeichnis II

2.2.6 Live Cell Imaging ... 31

2.2.7 Ergebnisanalyse und statistische Auswertung ... 31

3 Ergebnisse ... 33

3.1 Morphologische Veränderung von HaCaT-Keratinozyten unter TGFβ1-Stimulation ... 33

3.2 Veränderungen von Protein- und Genexpression in TGFβ1-stimulierten HaCaT- Keratinozyten ... 34

3.2.1 Aktivierung des Smad3 Signalwegs durch TGFβ1 in HaCaT-Keratinozyten ... 34

3.2.2 Expression fibrotischer Marker in TGFβ1-stimulierten HaCaT-Keratinozyten ... 35

3.2.3 EMT-Marker in TGFβ1-stimulierten HaCaT-Keratinozyten ... 36

3.2.4 Expression zytoskelettaler Marker in TGFβ1-stimulierten Keratinozyten ... 38

3.3 Immunfluoreszenz ... 41

3.4 Motilitätsanalyse TGFβ1-stimulierter HaCaT-Keratinozyten ... 45

3.5 Funktionelle Auswirkung eines siRNA-Knockdowns des aktinbindenden Sm22α auf TGFβ1-stimulierte HaCaT-Keratinozyten ... 47

3.5.1 Bestätigung des Sm22α-Knockdowns auf mRNA- und Proteinebene ... 47

3.5.2 Morphologie siRNA-transfizierter HaCaT-Keratinozyten ... 48

3.5.3 mRNA-Expression fibrotischer und EMT-Marker in siRNA tranfizierten HaCaT- Keratinozyten ... 49

3.5.4 Protein-Expression fibrotischer und EMT-Marker in siRNA tranfizierten HaCaT- Keratinozyten ... 52

4 Diskussion ... 54

4.1 Wirkung von TGFβ1 auf Keratinozyten ... 54

4.2 TGFβ1-assoziierte zytoskelettale Effekte und funktioneller Einfluss von Sm22α auf fibrotische Markerexpression in Keratinozyten ... 56

4.3 Zelluläre Interaktion im Kontext Hautfibrose ... 60

5 Zusammenfassung ... 62

6 Literaturverzeichnis ... 64

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Abbildungsverzeichnis III

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hautaufbaus im Querschnitt ... 1

Abbildung 2: Schematische Darstellung des TGFβ-Signalwegs ... 3

Abbildung 3: Schematische Darstellung der TGFβ1-induzierten Stressfaserbildung. ... 8

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines fokalen Adhäsionskomplexes ... 9

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Proteins Sm22α ... 10

Abbildung 6: Veränderung der HaCaT-Zellmorphologie durch TGFβ1-Stimulation. ... 33

Abbildung 7: Der Smad3-Signalweg wird durch TGFβ1 in humanen Keratinozyten aktiviert ... 34

Abbildung 8: TGFβ1-Stimulation induziert die Expression fibrotischer Marker in humanen Keratinozyten. ... 36

Abbildung 9: EMT-Marker Expression nach TGFβ1-Stimulation ... 37

Abbildung 10: K6-Expression in TGFβ1-stimulierten HaCaT-Keratinozyten ... 38

Abbildung 11: Erhöhte F/G-Aktin-Ratio und Sm22α-Expression nach TGFβ1-Stimulation ... 40

Abbildung 12: Subzelluläre Sm22α-Expression in unstimulierten und TGFβ1-stimulierten HaCaT-Keratinozyten ... 41

Abbildung 13: Co-Färbung von Sm22α und Vinculin in TGFβ1-stimulierten HaCaT- Keratinozyten ... 44

Abbildung 14: TGFβ1-assoziiertes Migrationsverhalten von humanen HaCaT-Keratinozyten ... 46

Abbildung 15: Herunterregulation von Sm22α durch siRNA-Transfektion ... 48

Abbildung 16: Phasenkontrastaufnahmen siRNA-transfizierter HaCaT-Keratinozyten ... 49

Abbildung 17: mRNA-Expression fibrotischer und EMT-Marker in humanen Keratinozyten nach siRNA-Transfektion mit und ohne TGFβ1-Stimulation ... 51

Abbildung 18: Proteinexpression von Fibrose- und EMT-Markern in HaCaT-Keratinozyten nach siRNA Transfektion und TGFβ-Stimulation ... 53

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IV

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Geräte ... 13

Tabelle 2: Einmalmaterialen ... 14

Tabelle 3: Chemikalien ... 16

Tabelle 4: Zellkulturmaterial ... 19

Tabelle 5: Primärantikörper ... 19

Tabelle 6: Sekundärantikörper ... 20

Tabelle 7: qPCR-Primer ... 20

Tabelle 8: siRNA-Konstrukte ... 21

Tabelle 9: Gebrauchsfertige Kits ... 22

Tabelle 10: Verwendete Geräte- und IT-Software ... 22

Tabelle 11: Herstellung des Lysis-Puffers im G/F-Aktin Kit ... 25

Tabelle 12: Bestandteile SDS-Mini-Gele... 26

Tabelle 13: Ansatz zur cDNA-Umschreibung ... 28

Tabelle 14: Mastermix für cDNA-Herstellung ... 28

Tabelle 15: Master-Mix qPCR-Reaktion ... 29

Tabelle 16: Real-Time-PCR-Inkubationszyklus ... 29

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Abkürzungsverzeichnis V

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzung Bedeutung

ATP Adenosintriphosphat

BSA bovines Serumalbumin

cDNA complementary desoxy robonuclein acid Desoxyribonukleinsäure

COL1A1 Kollagen 1

CTGF connective tissue growth factor DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium E-Cadherin epitheliales Cadherin

ECL enhanced chemiluminescence

EMT epitheliale-mesenchymale Transition EZM extrazelluläre Matrix

FA fokaler Adhäsionskomplex

FCS fetales Kälberserum

F-Aktin filamentöses Aktin G-Aktin globuläres Aktin

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GTP Guanosintriphosphat

JAK Januskinase (-Signalweg)

K6 Keratin 6

K14 Keratin 14

MAPK/ERK mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase MMPs Matrix-Metallo-Proteasen

mRNA messenger ribonuclein acid N-Cadherin neuronales Cadherin

PAI-1 plasminogen activator inhibitor 1 PBS phosphate-buffered saline

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Abkürzungsverzeichnis VI

PCR polymerase chain reaction

RhoA ras homolog gene family member A RIPA radioimmunoprecipitation assay

siRNA (messenger) / small interfering ribonuclein acid Ribonukleinsäure S100A2 Familie S100 calciumbindendes Protein A2

SDS sodium n-dodecyl sulfate Sm22α smooth muscle 22α

(p)Smad3 (phospho)mothers against decapentaplegic homologue 3 SNAI-1 snail family transcriptional repressor 1

SSc Systemische Sklerodermie TGFβ transforming growth factor β αSMA α smooth muscle actin

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1 Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Aufbau der Haut

Die Haut gliedert sich schichtweise in die Epidermis, die Dermis sowie die Subkutis.

Epidermis und Dermis sind durch eine Basalmembran voneinander abgegrenzt.

1.1.1 Die Epidermis

Die Epidermis bedeckt die Körperoberfläche und stellt somit die äußere Barriere des Organismus zum Schutz vor Umwelteinflüssen dar. Zusätzlich schützt die Epidermis die darunterliegende Dermis, in der kleinere Gefäß-, Nerven- und Lymphbahnen verlaufen (Abbildung 1).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Hautaufbaus im Querschnitt. Die Epidermis liegt an der Hautoberfläche und wird wie in der Abbildung rechts dargestellt in Stratum corneum, granulosum, spinosum und basale gliedert. Sie wird durch die Basalmembran von der Dermis abgegrenzt. In der Dermis befinden sich Fibroblasten und hier verlaufen kapilläre Gefäße, die aus größeren Gefäßen in der tiefer liegenden Subkutis gespeist werden (siehe linke Übersichtsdarstellung).

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1 Einleitung 2

Die Epidermis besteht zu etwa 90% aus Keratinozyten, die in der Basalzellschicht (Stratum basale) oberhalb der Basalmembran proliferieren (Hamm 2017) (Abbildung 1). Die Ausdifferenzierung der Keratinozyten geschieht auf dem Weg durch das Stratum spinosum und Stratum granulosum bis zum Verlust des Zellkerns im Stratum corneum.

Zellfragmente werden an der Oberfläche schließlich als Schuppen abgeschilfert (Abbildung 1). Neben Keratinozyten befinden sich pigmentbildende Melanozyten, drucksensible Merkelzellen sowie Langerhans-Zellen in der Epidermis (Hamm 2017).

Die Proliferation und Differenzierung der Keratinozyten wird durch diverse Stimuli gesteuert und äußert sich in der Expression spezifischer zytoskelettaler Bestandteile, der Keratine. Keratin 14 und 5 gelten als Marker der epidermalen Zellproliferation, die unter physiologischen Bedingungen lediglich in der Basalschicht der Epidermis exprimiert werden (Fuchs und Green 1980; Wang et al. 2016). Die beginnende Differenzierung wird definiert durch die Proliferationsinhibition sowie die Expression von Keratin 1 und 10 in den suprabasalen Schichten (Fuchs und Green 1980; Wang et al. 2016). Auch im Laufe anderer zellulärer Prozesse werden spezifische Keratine synthetisiert, zum Beispiel Keratin 6 und 16 während der Wundheilung (Aden et al. 2010; Wang et al. 2016).

1.1.2 Die Dermis

Die Dermis gliedert sich in das an die Epidermis angrenzende Stratum papillare und das darunter liegende Stratum reticulare (Moll 2016). In dieser Hautschicht finden sich dermale Fibroblasten, die wie alle in der Dermis befindlichen Zellen und Strukturen in ein Gerüst aus extrazellulärer Matrix (EZM) eingebettet sind (Moll 2016) (Abbildung 1). Die EZM wird von den Fibroblasten selbst gebildet und enthält u. a. faserbildendes Kollagen I, Adhäsionsmoleküle wie beispielsweise Fibronektin sowie wasserbindende Proteoglykane (Deutzmann und Bruckner 2014). Die Zusammensetzung der EZM ist entscheidend für die Festigkeit und Steifheit des Gewebes und wird durch zahlreiche Faktoren wie zum Beispiel die Proteinexpression in den Fibroblasten, die Expression von Zytokinen aber auch durch auf das Gewebe ausgeübte mechanische Kräfte beeinflusst (Deutzmann und Bruckner 2014; Moll 2016).

1.1.3 Die Subkutis

Die Subkutis befindet sich unterhalb des Stratum reticulare der Dermis und besteht zu einem Großteil aus Adipozyten (Fettzellen) und lockerem Bindegewebe (Fritsch 2009).

Zwischen Subkutis und Dermis verlaufen größere Gefäß- und Nervenbahnen (Moll 2016).

Die Funktion der Subkutis ist neben dem mechanischen Schutz von z. B. Muskeln und Knochen weiterhin die Wärmeisolation (Fritsch 2009).

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1 Einleitung 3

1.2 Das Zytokin Transforming Growth Factor β (TGFβ) und seine Funktion in der Haut

Das Signalmolekül TGFβ ist in diversen zellulären Prozessen wie embryonaler Entwicklung, Tumorprogression (Wendt et al. 2012), der Fibrose verschiedener Organsysteme (Yu et al. 2008; Bhattacharyya et al. 2011; Samarakoon et al. 2013) sowie Wundheilung (Martinez-Ferrer et al. 2010; Ramirez et al. 2014) von entscheidender Bedeutung. Es gibt drei verschiedene Subtypen von TGFβ – TGFβ1, TGFβ2, und TGFβ3 – die prinzipiell alle an den oben beschriebenen Prozessen beteiligt sein können. Im Folgenden wird von dem am besten charakterisierten TGFβ1 die Rede sein.

1.2.1 Der TGFβ-Signalweg

TGFβ1 ist ein Zytokin, dessen Bindung am TGFβ-Rezeptor II (TGFβRII) über den Smad- abhängigen Signalweg eine Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren, der inaktiv im Zytoplasma vorliegenden Smad-Moleküle Smad2 und Smad3, bewirkt. Im Komplex mit Smad4 translozieren diese in den Nukleus (Abbildung 2) und regulieren dort die Expression zahlreicher fibroseassoziierter Zielgene wie z. B. α smooth muscle actin (αSMA), Kollagen 1 (COL1A1) und connective tissue growth factor (CTGF) (Derynck und Zhang 2003; Shi und Massagué 2003; Jinnin 2010; Ramirez et al. 2014).

Abbildung 2: Schematische Darstellung des TGFβ-Signalwegs. TGFβ1 bindet an den heterodimeren TGFβ-Rezeptor und aktiviert über Phosphorylierung die zytoplasmatisch vorliegenden Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3. Diese bilden einen Komplex mit Smad4, welcher in den Nukleus transloziert und dort an die Promotoren der Zielgene bindet. Des Weiteren aktiviert TGFβ1 den MAPK/ERK- und den JNK-Signalweg sowie GTPasen wie die RhoA-Kinase.

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1 Einleitung 4

Neben diesem klassischen Smad-abhängigen Signalweg kann TGFβ1 auch weitere prominente Signalkaskaden wie beispielsweise den MAPK/ERK(mitogen activated protein kinase/extracellular signal regulated kinase)-Signalweg und den JAK(Januskinase)-Signalweg aktivieren (Derynck und Zhang 2003; Lee et al. 2007) (Abbildung 2). Zusätzlich bewirkt TGFβ1 eine Veränderung des Zytoskeletts über Aktivierung von Rho-abhängigen Kinasen (Edlund et al. 2002) (Abbildung 2).

1.2.2 TGFβ1 in Wundheilung

Die Wundheilung der Haut ist ein vielschichtiger Prozess, der in Abhängigkeit von der Tiefe der Wunde Re-Epithelialisierung der Epidermis und auch Regenerationsvorgänge der Dermis betrifft. Ein Zell- und Gefäßschaden bedingt die Freisetzung diverser Zytokine, die die Wundheilung organisieren und regulieren, darunter auch TGFβ1. Die Re- Epithelialisierung der Epidermis erfordert zum einen eine verstärkte Proliferation der Keratinozyten, zum anderen müssen diese an den Ort der Schädigung gelangen, indem sie auf den unbedeckten Teil des Wundbettes einwandern, wo sie auf der regenerierten Basalmembran die zuvor beschriebene epidermale Struktur initiieren (Ramirez et al. 2014).

Als Grundlage dieses Vorgangs müssen jedoch zuvor eine Kontraktion der Wundränder und der Aufbau eines stabilen Wundbettes erfolgen, auf dem sich die neue Keratinozytenschicht bilden kann. fBei einer Wundreaktion, die die Dermis mit beeinträchtigt, erfolgt auf zellulärer Ebene eine TGFβ1-assoziierte Aktivierung und Differenzierung von residenten dermalen Fibroblasten zu sogenannten Myofibroblasten (Desmoulière et al. 1993), die kontraktile Eigenschaften besitzen (Sandbo und Dulin 2011;

Hinz et al. 2012) und für die Kontraktion des geschädigten Gewebes sorgen. Außerdem produzieren Myofibroblasten vermehrt EZM-Proteine, die als Grundsubstanz des neu aufgebauten Mesenchyms dienen.

Insgesamt ist TGFβ1 in der Wundumgebung daher ein zentraler Mediator, wird hochreguliert und stimuliert – im Falle einer epidermalen Wundheilungsreaktion vor allem über die Förderung der Keratinozytenmigration (Lamar et al. 2008) – die Abheilung der Wunde (Ramirez et al. 2014).

1.2.3 Fibrose der Haut

Als Fibrose wird ein pathologischer Zustand bezeichnet, in dem sich Bindegewebsbestandteile so stark vermehren, dass es zur Versteifung und Funktionseinschränkung des betroffenen Gewebes kommt. Damit ähneln Mechanismen der Fibrose den Vorgängen einer Art überschießender Wundheilung. Hierbei kommt es zur gesteigerten Teilungsrate gewebeständiger Zellen sowie zur unkontrollierten Differenzierung von Myofibroblasten, die wiederum akkumulierend EZM-Proteine produzieren. Bei diesem Prozess stellt TGFβ1 einen zentralen Faktor dar, da es zum einen die Myofibroblastendifferenzierung aufrechterhält (Desmoulière et al. 1993) und zum

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1 Einleitung 5

anderen über die Induktion diverser profibrotischer Mechanismen die Fibrose orchestriert (Jinnin 2010).

Ein bekannter Marker für fibrotische Prozesse ist zum Beispiel der Connective tissue growth factor (CTGF), dessen Expression durch TGFβ1 gesteigert wird (Frazier et al. 1996; Sato et al. 2000; Dziadzio et al. 2005; Nikitorowicz-Buniak et al. 2014) und zum einen die Myofibroblastendifferenzierung induziert (Sonnylal et al. 2010), aber auch von Keratinozyten im fibrotischen Kontext verstärkt exprimiert wird (Steffen et al. 1998;

Amjad et al. 2007; Nikitorowicz-Buniak et al. 2014).

Ein weiterer zentraler Marker, der Einfluss auf die EZM nimmt, ist der Serinprotease- Inhibitor Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1). PAI-1 inhibiert die Entstehung von proteolytisch aktivem Plasmin (Ghosh und Vaughan 2012) und dadurch indirekt die plasminabhängige Aktivierung von EZM-abbauenden Matrix-Metallo-Proteasen (MMPs).

Insgesamt bewirkt PAI-1 eine verminderte EZM-Degradation und trägt damit in der Fibrose zur Versteifung des Gewebes bei (Ghosh und Vaughan 2012).

Die MMPs sind eine Familie von Enzymen, die durch das Lysieren unterschiedlicher EZM-Strukturen zur Erhaltung der Homöostase der Haut beitragen (McCawley und Matrisian 2001a; Visse und Nagase 2003) und damit ebenfalls wichtige Regulatoren der Fibrose darstellen (Jinnin 2010).

Sowohl PAI-1 als auch MMP-9 sind Zielgene von TGFβ1 (Santibáñez et al. 2002; Yang et al. 2007; Lamar et al. 2008; Samarakoon und Higgins 2008). MMP-9 selbst kann wiederum die inaktive Form von TGFβ1 aktivieren (Yu und Stamenkovic 2000), was die fibrotische Induktion weiter verstärken kann.

Weiterhin sind sowohl MMP-9 als auch PAI-1 in Verbindung mit Zellmotilität beschrieben. Während PAI-1 als entscheidender Faktor für die Migration von Keratinozyten auf dem Wundbett identifiziert wurde (Providence und Higgins 2004), konnte die Beteiligung der Gelatinase MMP-9 an der Metastasierung epithelialer Tumoren gezeigt werden (McCawley und Matrisian 2001b). Ebenso wurde beobachtet, dass MMP-9 in der Entstehung von Nierenfibrose eine entscheidende Rolle spielt, da es das Auswandern endothelialer Zellen begünstigt und somit der Pool von Zellen erhöht wird, die zu Myofibroblasten differenzieren (Zheng et al. 2009; Zhao et al. 2017).

1.2.4 TGFβ1 und epitheliale-mesenchymale Transition (EMT)

Die Gemeinsamkeit der oben beschriebenen Prozesse besteht in dem Ausbrechen von epithelialen Zellen aus dem Zellverband mit einer konsekutiven Wanderung ins benachbarte Parenchym unter Annahme mesenchymaler Eigenschaften. Dieser Vorgang ist als epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) bekannt und spielt in Embryogenese und Tumormetastasierung, aber auch Wundheilung und Fibrose eine zentrale Rolle (Yu et al.

2008; Wendt et al. 2012; Ramirez et al. 2014). Der Prozess der Re-Epithelialisierung im

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1 Einleitung 6

Rahmen der Wundheilung wird auch als partielles EMT bezeichnet, da Keratinozyten nur vorrübergehend aus dem epithelialen Verband an den Wundrändern ausbrechen und während der Wanderung auf dem Wundbett mesenchymale Eigenschaften annehmen, bevor sie erneut einen stabilen Epithelverband bilden (Stone et al. 2016).

TGFβ1 gilt als ein wichtiger Regulator von EMT (Bhowmick et al. 2001; Zavadil et al.

2001; Ozdamar et al. 2005; Zavadil und Böttinger 2005) und wird in vielen Modellen als EMT-induzierender Stimulus für epitheliale Zellen verwendet (Xu et al. 2009; Chen et al.

2017).

Die Motilitätszunahme der auswandernden Zellen geht mit einer verstärkten Expression EMT-assoziierter Markermolekülen einher, wie beispielsweise des Adhäsionsproteins N- Cadherin (Derycke und Bracke 2004), aber auch des Intermediärfilaments Vimentin und des EZM-Moleküls Fibronectin (Huang et al. 2012; Stone et al. 2016).

Gleichzeitig werden klassische epitheliale Marker wie E-Cadherin vermindert exprimiert. E- Cadherin ist Bestandteil von Zell-Zell-Verbindungen und sorgt somit für den Zusammenhalt eines epithelialen Verbands (Huang et al. 2012; Stone et al. 2016). Die E- Cadherin-Expression wird vom Zinkfinger-Protein Snail family transcriptional repressor 1 (SNAI-1) inhibiert, das daher ebenfalls als EMT-Marker etabliert ist. TGFβ1 ist ein bekannter Induktor der SNAI-1-Expression (Peinado et al. 2003; Medici et al. 2006).

Ein weiterer Marker ist das Calcium-bindende Protein S100A2. In Lungen- und Leberepithelzellen konnte gezeigt werden, dass S100A2 ein Smad-3 abhängiges EMT auslöst (Naz et al. 2014).

1.3 Beispiel einer fibrosierenden Hauterkrankung: Systemische Sklerodermie

Ein bekanntes Beispiel für fibrosierende Erkrankungen der Haut ist die systemische Sklerodermie (SSc). Bei der SSc tritt durch Fibrose eine Verhärtung und Versteifung der Haut in einer limitierten, auf die distalen Extremitäten und das Gesicht beschränkten, sowie einer generalisierten Form auf, die die gesamte Hautoberfläche betreffen kann (LeRoy et al. 1988). Bei der SSc sind eine Beteiligung der Lunge und chronisches Nierenversagen gefürchtete Beteiligungen innerer Organe, die mit einer erhöhten Mortalität einhergehen (Knobler et al. 2017). Genetische Disposition und möglicherweise schädliche Umwelteinflüsse werden als Risikofaktoren für SSc diskutiert (Viswanath et al. 2013). Ein typisches Frühsymptom, das der eigentlichen Erkrankung um Jahre bis Jahrzehnte vorausgehen kann, ist das Raynaud-Phänomen. Dieses wird ausgelöst durch Gefäßspasmen mit konsekutivem Gefäßschaden und Reduktion der Mikrovaskulatur (Fleischmajer und Perlish 1980). Eine Immunreaktion wird außerdem im Verlauf der Krankheit initiiert.

Diagnostisch relevante spezifische Auto-Antikörper lassen sich bei einer Vielzahl von Sklerodermie-Patienten finden (Hamaguchi 2010). Während bei Patienten mit limitierter

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1 Einleitung 7

Form üblicherweise anti-Zentromer-Antikörper vorhanden sind, lassen sich bei Patienten mit einer generalisierten Form häufig Scl-70-Antikörper nachweisen (LeRoy et al. 1988;

Knobler et al. 2017). Das komplexe Zusammenspiel der freigesetzten immunogenen und vasoaktiven Mediatoren wird als Grundlage der fibrotischen Reaktion und damit der progressiven Verhärtung der Haut vermutet (Viswanath et al. 2013). Dennoch ist die Ätiologie von SSc nicht vollständig geklärt und die Therapie auf symptomatische Behandlungen wie z. B. der Gabe von Immunsuppressiva oder vasodilatierenden Substanzen beschränkt (Knobler et al. 2017). Aufgrund der eingeschränkten Therapieoptionen besteht ein hohes Interesse am genauen Verständnis fibrotischer Prozesse, um möglicherweise der Sklerosierung der Haut therapeutisch entgegen wirken zu können.

1.3.1 Epidermis in fibrosierenden Hauterkrankungen

Trotz genauer Untersuchungen der fibrotischen Pathophysiologie sind die Zusammenhänge hinsichtlich des Auslösers der fibrotischen Kaskade nach wie vor unbekannt. Bisher wurden vor allem die Vorgänge in der Dermis betrachtet. Ein innovativer, bisher noch nicht ausgiebig untersuchter Ansatzpunkt ist die Frage nach assoziierten Prozessen und Interaktionen in der Epidermis, die durch ihre oberflächliche Lage zahlreichen Umweltausflüssen, die als Risikofaktoren für SSc gelten, ausgesetzt ist (Bhattacharyya et al. 2011; Viswanath et al. 2013).

Ein erster Hinweis auf die Beteiligung der Epidermis in der Pathogene von SSc war die verstärkte Expression des basalen Keratinozytenmarkers Keratin 14 (Aden et al. 2010;

Nikitorowicz-Buniak et al. 2015). Ebenfalls vermehrt exprimiert sind Keratin 6 (K6) und 16, die als Indikatoren für eine aktivierte Epidermis gelten und z. B. auch in Wundumgebung erhöht sind (Aden et al. 2010).

Ein weiteres Indiz für eine mögliche Beteiligung der Epidermis ist die Aktivität des bereits beschriebenen TGFβ1-Signalwegs in Keratinozyten von Sklerodermie-Patienten. Durch immunhistochemische Färbungen konnte die nukleäre Translokation des pSmad2/3- Komplexes in SSc-Epidermis und damit die Aktivierung des TGFβ1-Signalwegs in Keratinozyten nachgewiesen werden (Nikitorowicz-Buniak et al. 2015).

Weiterhin wurde in fibrotisch induzierten, in vitro mit TGFβ1-stimulierten Keratinozyten der Verlust epithelialer Marker und die vermehrte Expression mesenchymaler Marker hervorgerufen (Nikitorowicz-Buniak et al. 2015; Carthy et al. 2016). (Nikitorowicz-Buniak et al. 2015; Stone et al. 2016). Hierbei stellt sich vor allem die Frage, ob der Pool der gewebsständigen Fibroblasten durch ein EMT aus epithelialen Zellen gespeist wird, wie es für Lungen- und Nierenfibrose bereits nachgewiesen wurde (Thannickal et al. 2004; Yu et al. 2008; Zheng et al. 2009; Zhao et al. 2017; Divya et al. 2018). Daher ist EMT ein Prozess, über den auch in der Fibrose der Haut diskutiert wird, dessen Bedeutung für Hautfibrose allerdings noch nicht eindeutig geklärt ist (Nikitorowicz-Buniak et al. 2015).

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1 Einleitung 8

Zusammenfassend ist die genaue Funktion der Epidermis und speziell von Keratinozyten in der Fibrose bisher unbekannt, jedoch gibt es vermehrt Hinweise auf eine Beteiligung der Keratinozyten in der fibrotische Induktion.

1.4 TGFβ1 und das Zytoskelett

1.4.1 Einfluss von TGFβ1 auf das Aktin-Zytoskelett

Das Protein Aktin ist ein zentraler Bestandteil des Zytoskeletts. Es existieren mehrere Isoformen. Diese werden in eine α-, β- und γ-Gruppe eingeteilt und gewebeabhängig exprimiert. Aktin kann sich in verschiedenen Varianten zusammenlagern. Als globuläres G- Aktin liegt es in einzelnen Monomeren im Zytoplasma vor. Diese Monomere können unter ATP-Verbrauch an das aufbauende Ende eines Aktin-Filamentstrangs zu filamentösem F- Aktin polymerisiert werden. Am entgegengesetzten Ende des F-Aktin-Strangs werden G- Aktin-Monomere abgebaut, sodass die Form und der Aufbau des Aktin-Zytoskeletts einem dynamischen Prozess unterliegen.

Dabei nehmen sowohl intra- als auch extrazelluläre Signale Einfluss auf die Verzweigung, funktionsspezifischen Konformationen und Stabilisierung der F-Aktin-Stränge. So können beispielsweise mit Hilfe von aktinbindenden Proteinen Aktinfilamente zu kontraktilen Stressfasern gebündelt werden (Vicente-Manzanares und Horwitz 2011).

Abbildung 3 Schematische Darstellung der TGFβ1-induzierten Stressfaserbildung. TGFβ1 aktiviert über den TGFβ-Rezeptor verschiedene Signalwege, die über die Expression aktinbindender Proteine sowie Einflussnahme auf das F/G-Aktin-Gleichgewicht die Bildung von Stressfasern induzieren.

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1 Einleitung 9

TGFβ1 bewirkt über die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden Veränderungen am Aktin-Zytoskelett (Moustakas und Heldin 2008) (Abbildung 3). Während der Smad- Signalweg die Expression aktinbindender Moleküle steigert, greifen insbesondere Rho- Kinasen in die dynamische Regulation der Polymerisierung von G- zu F-Aktin ein (Abbildung 3) (Edlund et al. 2002; Vicente-Manzanares und Horwitz 2011).

TGFβ1 begünstigt daher sowohl die Polymerisierung von G- zu F-Aktin als auch das Zusammenlagern zu Stressfasern (Moustakas und Heldin 2008). Aktin-Stressfasern münden in ausgereiften fokalen Adhäsionskomplexen (FAs) an der Zellmembran und stehen über verschiedene transmembrane Integrine mit der EZM in Verbindung (Sandbo und Dulin 2011; Vicente-Manzanares und Horwitz 2011) (Abbildung 4). Neben der mechanischen Verankerungsfunktion der Zelle in ihrer Umgebung modulieren die im fokalen Adhäsionskomplex enthaltenen Proteine intra- und extrazelluläre Signalkaskaden, die die Expression zytoskelettassoziierter Proteine wie beispielsweise der aktinbindenden Proteine beeinflussen.

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines fokalen Adhäsionskomplexes. Das Aktin- Zytoskelett wird mit den daran anheftenden aktinbindenden Proteinen über einen Komplex aus fokalen Adhäsionsproteinen und Integrinen mit der EZM verbunden.

1.4.2 Das aktinbindende Protein Sm22α

Das aktinbindende Protein Smooth-muscle 22 α (Sm22α) ist auch unter dem Namen Transgelin-1 bekannt (Lawson et al. 1997) und wurde 1987 erstmals im Hühnermagen identifiziert (Pearlstone et al. 1987). Sm22α ist strukturell verwandt mit dem bekannteren aktinbindenden Protein Calponin, das sich durch regulatorischen Einfluss auf die Kontraktilität, Proliferation und Motilität von Zellen auszeichnet (Shibukawa et al. 2010;

Liu und Jin 2016).

(19)

1 Einleitung 10

Sm22α dient als Marker für differenzierte glatte Muskelzellen, konnte aber auch in diversen anderen mesenchymalen und epithelialen Zellen nachgewiesen werden (Lawson et al. 1997;

Yu et al. 2008; Elsafadi et al. 2016). Als aktinbindendes Protein hat es ebenso wie Calponin Auswirkung auf Form, Motilität und Kontraktilität der Zellen (Lee et al. 2010; Thompson et al. 2012).

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Proteins Sm22α. Sm22α enthält eine Calponin- homologe CH-Domäne (grau) sowie das calponin like module CLIK23 (grün). Hier befinden sich die Aktin-Bindungsstellen (rot) des Proteins.

Während das N-terminale Ende sowie die Calponin-homologe(CH)-Domäne beim Sm22α Protein ähnlich zu Calponin ist (Liu et al. 2017), liegen die individuellen Eigenschaften im COOH-terminalen Ende mit der als calponin like module (CLIK23) bezeichneten Domäne inklusive Bindungsstellen (Assinder et al. 2009; Matsui et al. 2018). Aktinbindende Bereiche liegen sowohl in der CH-Domäne als auch im COOH-Ende vor (Fu et al. 2000; Assinder et al. 2009; Matsui et al. 2018). Ein weiterer Bestandteil des Proteins Sm22α ist das calciumbindende EF-Motiv bestehend aus einer calciumbindenden α-Helix „E“ sowie einer zweiten α-Helix „F“ (Kawasaki und Kretsinger 2017). Dies ist insofern ein interessanter Aspekt an der Proteinstruktur von Sm22α, als dass Calcium große Auswirkung auf die Kontraktilität von glatten Muskelzellen hat. Weitere potenzielle regulatorische Elemente sind Bindungsstellen für Kreatin-Kinase und Protein-Kinase-C (Assinder et al. 2009;

Matsui et al. 2018). Inwiefern diese Bindungsstellen für die Regulation von Sm22α bedeutend sind, ist jedoch noch nicht abschließend untersucht.

1.4.3 Sm22α in Fibrose und Zellmotilität

Als Marker für fibrotische Myofibroblasten konnte Sm22α neben anderen Markern wie Kollagen I und α smooth muscle actin (αSMA) bereits etabliert werden (Qiu et al. 2003).

Zudem konnte gezeigt werden, dass Sm22α ein mechanosensitives Protein ist, das unter mechanischer Spannung stabilisiert wird und dessen Expression durch Zellkultivierung auf steifer Matrix gesteigert wird (Liu et al. 2017).

In diesem Kontext ist relevant, dass die Expression von Sm22α über den Smad-Signalweg des TGFβ1-Signals reguliert wird (Chen et al. 2003; Qiu et al. 2003; Yu et al. 2008), der auch in der Hautfibrose die zentrale Rolle spielt. Tatsächlich konnte in Lungenepithelzellen von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose, die sich durch eine TGFβ1-gesteuerte

(20)

1 Einleitung 11

EMT und Myofibroblastendifferenzierung auszeichnet, eine Erhöhung der SM22α- Genexpression beobachtet werden (Yu et al. 2008).

Weiterhin stellt die Induktion der Migration und Invasion epithelialer Tumorzellen durch Sm22α (Lee et al. 2010; Zhou et al. 2016) eine interessante Querverbindung zu EMT dar.

Auch konnte gezeigt werden, dass MMP-9 von Sm22α induziert wird (Nair et al. 2006), ein Marker, der sowohl im Kontext von EMT als auch Fibrose beschrieben wurde.

Insgesamt ergeben sich für das Protein Sm22α also viele Indizen für eine funktionelle Involvierung in die Entstehung von Fibrose, der genaue Einfluss auf eine fibrotische Induktion epidermaler Keratinozyten ist jedoch bisher unbekannt.

1.5 Zielsetzung dieser Arbeit

Im Kontext der Wundheilung und Fibrose beeinflusst insbesondere das zentrale Zytokin TGFβ1 die Expression und Aktivierung EZM-assoziierter Proteine, aber auch zytoskelettaler Strukturen und Adhäsionsmolekülen verschiedenster Zelltypen, u. a. von Keratinozyten (Bhowmick et al. 2001; Santibáñez et al. 2002; Moustakas und Heldin 2008).

Bisher ist die Funktion der Epidermis und der Keratinozyten in der Fibroseentstehung unvollständig charakterisiert, allerdings werden verschiedene Fibrosemarker wie z. B.

CTGF auch in fibrotischen Keratinozyten induziert (Nikitorowicz-Buniak et al. 2014).

Zudem ist für den in SSc charakterisierten Fibrosemarker PAI-1 eine entscheidende Funktion für Keratinozyten im Zusammenhang mit der Re-Epithelialisierung in der Wundheilung beschrieben (Providence und Higgins 2004; Simone et al. 2015). Dies ist ein Hinweis auf mögliche Parallelen zwischen fibrose- und zellmigrationsassoziierten zellulären Veränderungen. In der Fibrose verschiedener Organe ist die zentrale Bedeutung der Migration von Epithelzellen ins Mesenchym durch TGFβ1-induziertes EMT bereits beschrieben worden (Kalluri und Neilson 2003; Thannickal et al. 2004; Yu et al. 2008;

Zeisberg und Kalluri 2008; Stone et al. 2016).

Sowohl für mechanische Veränderungen eines Gewebes als auch für die zelluläre Migration hat das Aktin-Zytoskelett entscheidende Funktionen und wird dabei in seiner Dynamik u. a. durch aktinbindende Proteine moduliert. Das aktinbindende Sm22α gilt als Marker für fibrotische Myofibroblasten und trägt als Bestandteil von Stressfasern zur Kontraktilität der Zelle bei. Auch ein Einfluss auf die Motilität epithelialer Zellen ist für Sm22α beschrieben, sodass es sich auf verschiedene pathophysiologische Aspekte der Fibroseentstehung auswirken könnte.

Ziel dieser Arbeit war, die Bedeutung der Epidermis für die Fibroseentstehung in SSc näher zu beleuchten. Dazu erfolgte zunächst die Identifikation relevanter Fibrosemarker, um die fibrotischen Induktion in humanen Keratinozyten genauer zu definieren. Um die Rolle zytoskelettaler Bestandteile in der fibrotischen Induktion zu identifizieren, wurde ebenfalls untersucht, inwiefern sich die Morphologie, die Beschaffenheit des Aktin-

(21)

1 Einleitung 12

Zytoskeletts und die Motilität der Zellen unter TGFβ1-Einfluss ändern. Mit der Analyse bisher nicht beschriebener Fibrosemarker wie des aktinbindenden Proteins Sm22α sowie der funktionellen Analyse potentieller regulatorischer Faktoren können möglicherweise neue Hinweise auf die Ätiologie und Pathogenese der Fibroseentstehung und damit die Grundlage für neue Therapieansätze gefunden werden.

(22)

2 Material und Methoden 13

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Geräte Tabelle 1: Geräte

Gerät Hersteller

Autoklaviergerät Sanyo

CO₂Inkubator HeraCell 150i Thermo Fisher Scientific Elektrophorese Netzanschlussgerät EPS 1001 Amersham Bioscience

Feinstwaage Acculab ALC Sartorius

Heizblock Thermostat Plus Eppendorf

Kamera Orca Flash 4.0 Advanced Imaging

Kühlschränke 4 °C, -20 °C, -80 °C Liebherr, Privileg Luminescent Image Analyzer LAS 4000 Fujifilm

Magnetrührplatte Stirrer VWR

Membran-Vakuumpumpe Vacuubrand

Mikroskop Axioimager M1 Zeiss

Mikroskop Axiovert 200 Zeiss

Mikroskop Axiovert 40C Zeiss

Mikroskop Olympus Cell Vivo ix83, invertiert Olympus

Mikroskop Olympus IX, invertiert Olympus

Mikrozentrifuge Galaxy Mini Star VWR

Mikrozentrifuge Sprout Biozym

Neubauer Zählkammer Laboroptik Ltd

Photometer Genesys 10 Bio Thermo Fisher Scientific Pipetten 1 µl, 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl Eppendorf

Pipettierhilfe Pipetboy Integra Biosciences

Protean®-3-Elektrophorese-Kammer Bio-Rad

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Gerät Hersteller

Protean®-3-System zur Gelherstellung: Glasplatten, Deckplatten, Klammern, Halter, Gelkämme

Bio-Rad

Schüttler IKA R MS1 Sigma Aldrich

Schüttler Stuart™ See Saw Rocker SSL4 Thermo Fisher Scientific

Spannungsquelle Power Pac Basic Bio-Rad

Taumelschüttler Polymax 1040 Heidolph

Thermocycler FlexCycler Analytik Jena

Thermocycler Quant Studio 5 Thermo Fisher Scientific Transfergerät Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad

Ultrazentrifuge TL-100 Beckmann

Vortex Mixer VELP Scientifica Starlab International

Vortex Powermixer Mixer L46 Labinco

Waage Acculab Vicon Sartorius

Wasserbad Memmert

Wasserdestillieranlage arium ® 611 VF Sartorius Stedim Biotech

Zellkulturbank HeraSafe Kendro Laboratory Products

Zentrifuge 5417R (kühlbar) Eppendorf

Zentrifuge Heraeus Megafuge 16R Thermo Fisher Scientific Zentrifuge Heraeus Multifuge 1S-12 Thermo Fisher Scientific Zentrifuge Heraeus Pico 17 Thermo Fisher Scientific

2.1.2 Einmalmaterialien Tabelle 2: Einmalmaterialen

Verbrauchsmaterialien Hersteller

8-Kammer-Zellkultur-Objektträger Falcon

Cryo-Röhrchen (1 ml) Greiner Bio One

Deckgläschen Menzel-Gläser

Desinfektionstücher Kimtech Science Delicate Task Wipes

Kimberly-Clark Professional

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Verbrauchsmaterialien Hersteller

Falcon Röhrchen (15 ml; 50 ml) Greiner Bio One

Filterpapier Whatman^TM GE Healthcare Life Sciences

Filterpipettenspitzen (10 µl, 100 µl, 1000 µl) Starlab International Glaspipetten steril (5 ml; 10 ml; 25 ml) Sarstedt

Kanüle 20G BD Microlane 3 Becton Dickinson

Küvetten (Photometer) Sarstedt

Nitrozellulose Membran 0,45 µm BioRad

Omnifix 20 ml LuerLock Solo Spritzen B.Braun

Parafilm® Bemis

Pasteurpipetten Carl Roth

PCR-Abdeckfolie StarSeal Advanced Polyoletin Film Starlab International

PCR-Platte, 384 Well Starlab International

Pipettenspitzen (10 µl, 200 µl, 1000 µl) Starlab International, Eppendorf

Pipettenspitzen (10 ml) Eppendorf

Reaktionsgefäße (2 ml, 1,5 ml) Sarstedt

Reaktionsgefäße 0,5 ml Eppendorf

Reaktionsgefäße PCR SingleCap Soft Strips 0,2 ml Biozym Scientific

Skalpell TechnoCut HMD Healthcare

Transferpipetten Eppendorf, Brand

Zellkulturflaschen 75 cm² Greiner Bio One

Zellkulturplatten, 6 Well Greiner Bio One

Zellkulturschalen 100 mm Greiner Bio One

Zellschaber 25cm Sarstedt

(25)

2.1.3 Chemikalien Tabelle 3: Chemikalien

Chemikalie Hersteller

4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma

Aceton Carl Roth

Acrylamid/Bis-acrylamid, 30 % Bio-Rad

Ammoniumpersulfat (APS) Thermo Scientific

Ampuwa-Wasser, steril B.Braun

anchored oligo primer Jena Bioscience

Blockmilch (non-fat dry milk) Bio-Rad

bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich

Bradford Standards Bovine Gamma Globuline 1-7 Thermo Scientific

Bromophenolblau Sigma-Aldrich

Essigsäure Sigma-Aldrich

Ethanol Carl Roth

Ethylenediamintetraaceticsäure (EDTA) pH 8,0 Carl Roth

EVA-Green-PCR-Mix Solis Biodyne

Fluorezenz-Mounting-Medium Dako

Glycerol Sigma-Aldrich

Glycin Serva Electrophoresis

Luminol Sigma-Aldrich

Methanol Merck

Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth

Natronlauge Carl Roth

PageRuler^TM Prestained Protein Ladder Thermo Scientific

P-Cumarsäure Sigma-Aldrich

Phalloidin PromoFluor 555 PromoKine

Ponceau S Sigma-Aldrich

Promofectin PromoCell

Proteaseinhibitor Complete mini tablets 7x Roche

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Chemikalie Hersteller

protein assay dye reagent concentrate Bio-Rad

Restore™ Western Blot Stripping Puffer Thermo Fisher

RNase away Molecular Bio Products

Salzsäure (HCl) Carl Roth

Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth

Spectra^TM Multicolor High Range Protein Ladder Fermentas Tetramethylethylendiamine (TEMED) Sigma Aldrich

Tris Carl Roth

Tris Hydrochlorid Säure (Tris-HCl) Carl Roth

Triton X-100 Merck

Trypanblau 0,4% Sigma-Aldrich

Tween-20 Carl Roth

Wasserstoffperoxid (H₂O₂) Carl Roth

β-Mercaptopurin Carl Roth

2.1.4 Lösungen und Puffer

ECL-Lösung (Lösung 1 : Lösung 2 = 1:1 ) Lösung 1

 100 mM Tris-HCl (pH 8,5)

 0,4 mM P-Cumarsäure

 2,5 mM Luminol

Lösung 2

 100 mM Tris-HCl (pH 8,5)

 0,018% Wasserstoffperoxid

Laufpuffer 10x

 1,92 M Glycin

 247 mM Tris

 10% SDS-Lösung

 ad Aqua bidest.

(27)

Lysispuffer

 14,3 % Protease-Inhibitor „complete mini“

 85,7 % RIPA-Puffer

Ponceau-S-Lösung

 0,1 % PonceauS

 5 % Essigsäure

 ad Aqua bidest.

RIPA(radioimmunoprecipitation assay)-Puffer

 1 M Tris-HCl pH 7,0

 10 % SDS

 10 % β-Mercaptopurin

 ad Aqua bidest.

5x SDS-Probenpuffer

 200 mM Tris-HCl pH 6,8

 4 % SDS

 40 % Glycerol

 0,07 % Bromophenol Blau

TBS-Puffer

 10 mM Tris-HCl pH 7,0

 1 mM EDTA pH 8,0

 150 mM NaCl

 ad Aqua bidest.

TBS-Tween-Puffer

 TBS-Puffer

 0.05 % Tween 20

 ad Aqua bidest.

Transfer-Puffer

 48 mM Tris

 39 mM Glycin

 0.0375 % SDS

 20 % Methanol

 ad Aqua bidest.

(28)

2.1.5 Zellkulturreagenzien Tabelle 4: Zellkulturmaterial

Produkt Hersteller

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high Glucose Lonza und Sigma Aldrich Dulbecco´s PBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ Lonza

Fetales Kälberserum (FCS) Biochrom

Kryomedium Cryo SFM PromoCell

L-Glutamin Lonza

Penicillin/ Streptomycin Lonza

TGFβ1 Invitrogen

Trypsin-EDTA Lonza

DMEM Kulturmedium

 10% FCS

 100 U/ml Penicillin

 100 µl/ml Streptomycin

 2 mM L-Glutamin

DMEM Basalmedium

 2,5% FCS

 100 U/ml Penicillin

 100 µl/mlStreptomycin

 2 mM L-Glutamin

2.1.6 Antikörper 2.1.6.1 Primärantikörper Tabelle 5: Primärantikörper

Primärantikörper Hersteller

Anti-Aktin Maus IgG Millipore

Anti-E-Cadherin Maus IgG BD Pharmingen

Anti-GAPDH Kaninchen IgG Cell Signaling

Anti-N-Cadherin Kaninchen IgG TaKaRa

Anti-PAI-1 Maus IgG Santa Cruz

(29)

Primärantikörper Hersteller

Anti-pSmad Kaninchen IgG Abcam

Anti-Sm22α Maus IgG ThermoFisher

Anti-Smad3 Kaninchen IgG Cell Signaling

Anti-SNAI-1 Kaninchen IgG Cell Signaling

Anti-Vinculin Maus IgG Sigma Aldrich

2.1.6.2 Sekundärantikörper Tabelle 6: Sekundärantikörper

Sekundärantikörper Hersteller

Anti-Maus IgG (H+L), HRP Conjugate Promega Anti-Kaninchen IgG (H+L), HRP Conjugate Promega Anti-Maus IgG (H+L), F(ab’)2 Fragment (Alexa

Fluor® 488 Conjugate)

Cell Signaling

Alexa Fluor® 555 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Invitrogen

2.1.7 Oligonukleotide 2.1.7.1 Primer

Tabelle 7: qPCR-Primer

Gen Forward Primer

Größe Reverse Primer

Smooth-muscle 22α (SM22α) 5’-AGCCTTCTT TCCCCAGACAT-3’

216 bp 5’-CACCAGCTTGCTCAGAATCA-3’

Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI1)

5’-CTCTCTCTGCCCTCACCAAC-3’

212 bp 5’-GTGGAGAGGCTCTTGGTCTG-3’

Matrix-Metalloproteinase (MMP-9) 5’-GTACTCGACCTGTACCAGCG-3’

92 bp 5’-AGAAGCCCCACTTCTTGTCG-3’

(30)

Gen Forward Primer

Größe Reverse Primer

Connective Tissue Growth Factor (CTGF)

5’-CTCGCGGCTTACCGACTG-3’

169 bp 5’-GGCTCTGCTTCTCTAGCCTG-3’

Keratin 6 (K6) 5’-GACCGGCGGAGATGTGAAC-3’

94 bp 5’-CTGCTCGTACTGGTCACGC-3’

S100 Calcium bindendes Protein A2 (S100A2)

5’-AGCTTTGTGGGGGAGAAAGT-3’

194 bp 5’-ATCCATGGCAGGAAGTCAAG-3’

Snail Family Transcriptional Repressor 1 (SNAI-1)

5’-ACCCCAATCGGAAGCCTAACT-3’

75 bp 5’-GGTCGTAGGGCTGCTGGAA-3’

Smad family member 3 (SMAD3) 5’-GCCTGTGCTGGAACATCATC-3’

124 bp 5’-TTGCCCTCATGTGTGCTCTT-3’

RNA-Polymerase (RPOL) 5’-GGAGATTGAGTCCAAGTTCA-3’

115 bp 5’-GCAGACACACCAGCATAGT-3’

Glycerinaldehyd-3-phosphat-

Dehydrogenase (GAPDH) Qiagen - QuantiTec - QT00079247 ^{95 bp}

2.1.7.2 Small interfering RNA (siRNA) Tabelle 8: siRNA-Konstrukte

Bezeichnung Produktname Zielsequenz

Kontroll-siRNA Qiagen nicht angegeben

Sm22α siRNA IV Hs_TAGLN_4 5’-TCCCAACTGGTTTATGAAGAA-3’

Sm22α siRNA VII Hs_TAGLN_7 5’-CACCACGGCGGCAGCCCTTTA-3’

(31)

2.1.8 Kits

Tabelle 9: Gebrauchsfertige Kits

Kit Hersteller

innuPREP RNA Mini Kit Analytic Jena

Invitrogen SuperScript IV Thermo Fisher Scientific G-Aktin/F-Aktin In Vivo Assay Biochem

Kit

Cytoskeleton

2.1.9 Software

Tabelle 10: Verwendete Geräte- und IT-Software

Software Hersteller

QuantStudio™ Design & Analysis Software Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific

ImageJ 1.51 National Institute of Health

LAS4000 Imaging System Fujifilm

Metamorph 6.3r2 Molecular Devices

Axiovision Rel 4.7 Zeiss

Cell Sense Dimension Olympus

Chemotaxis Migration Tool Ibidi

Olympus Fluoview 4.2 Olympus

Rest 2009 Pfaffl, Qiagen

Windows 7 Professional Microsoft

2.2 Methoden

2.2.1 Zellkulturmethoden

2.2.1.1 Kultivierung der Keratinozyten-Zelllinie HaCaT

Die spontan immortalisierte Keratinozyten Zellline HaCaT stammt ursprünglich aus einer Hautprobe vom unverändert wirkenden Rand eines exzidierten Melanoms (Boukamp et al.

1988). Durch die Inkubation der Hautprobe über einen Zeitraum von 5 Monaten brachte

(32)

die Arbeitsgruppe um Boukamp et al. (1988) eine Zelllinie von Keratinozyten hervor, die mit einer Teilbarkeit bis über die 140. Passage hinaus als immortalisiert gilt. Der Name ergibt sich aus dem Ursprung (Human), den Kulturbedingungen mit einem niedrigen Calcium (Ca) Gehalt im Medium sowie einer leicht erhöhten Temperatur (T) im Inkubator, bei der die Zelllinie entstand. Trotz Veränderungen wie einem aneuploiden Chromosomensatz und dem Verlust beider p53 Allele zeigen HaCaT-Keratinozyten eine stabile Expression ausgewählter chromosomaler Marker (Lehman et al. 1993). Weiterhin zeigten HaCaT-Keratinozyten in in vivo-Versuchen kein tumorähnliches Verhalten und konnten bei der Transplantation auf Nacktmäuse eine normal differenzierte Epidermis ausbilden (Boukamp et al. 1988).

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden HaCaT-Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ unter sterilen Bedingungen im Inkubator kultiviert. Die Inkubation erfolgt in 75 cm² Zellkulturflaschen in 12 ml DMEM-Kulturmedium. Es erfolgten routinemäßige Kontrollen auf Mykoplasmen-Kontamination durch PCR. Bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 80%

wurden die Zellen passagiert. Dazu wurde das alte Medium abgesaugt, der Zellrasen zweimalig mit auf 37 °C erwärmten PBS (phosphate buffered saline) gewaschen und anschließend mit 1,5 ml Trypsin für 5 min bei 37 °C inkubiert, sodass ca. 90% der Zellen vom Boden gelöst waren. Durch Hinzugabe von 5,5 ml DMEM-Kulturmedium wurde die Trypsin-Reaktion abgestoppt und der Flascheninhalt in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Dies wurde für 3 min bei 1200 rpm bei 22 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit 10 ml DMEM-Kulturmedium suspendiert. Zur weiteren Kultivierung wurden die Zellen in DMEM-Kulturmedium in einer Verdünnung zwischen 1:5 und 1:15 in einem Gesamtvolumen von 12 ml ausgesät und wie oben beschrieben inkubiert.

Für einen Experimentansatz wurde die Zellzahl der suspendierten HaCaT-Keratinozyten mittels einer Neubauer Zählkammer ermittelt sowie der Anteil lebender Zellen mittels Trypan-Blau bestimmt und HaCaT-Keratinozyten dem Experiment entsprechend ausgesät.

2.2.1.2 Stimulation mit TGFβ1

Im Rahmen der Zellkultivierung zur Gewinnung von Protein- und RNA-Proben wurden die ausgesäten Zellen zu definierten Zeitpunkten vor Experimentende mit 5 ng/ml TGFβ1 stimuliert. Es erfolgte einmalig 24 h nach Aussäen der Zellen ein Mediumwechsel auf DMEM-Basalmedium. Die Hinzugabe von 5 ng/ml TGFβ1 erfolgte entsprechend des Experiments, beispielsweise 72, 48 und 24 h vor Experimentende. Die Zellen wurden kontinuierlich bei 5 % CO₂ und 37 °C inkubiert.

(33)

2.2.1.3 Transfektion

Für die Transfektionsversuche erfolgte ein Aussäen der Zellen unter simultaner Transfektion der noch nicht adhärierten Zellen mit den Sm22α siRNA-Konstrukten SmIV und SmVII sowie der Kontroll(ctrl)-siRNA in einer Konzentration von 25 nM pro Well.

Als Transfektionsreagenz diente Promofectin. Als zusätzliche Negativ-Kontrollen wurden weitere Ansätze nur mit Promofectin oder Nullmedium-DMEM versetzt. 24 h nach Transfektion erfolgte ein Mediumwechsel auf DMEM-Basalmedium in allen Zellkulturschalen. 24 h vor Experimentende erfolgte die Stimulation mit 5 ng/ml TGFβ1 in jeweils einem der beiden Kulturschalen der verschiedenen Transfektionsansätze. Die Zellen wurden kontinuierlich bei 5% CO₂ und 37°C inkubiert.

Für die Transfektionsversuche zeigten sich für die untersuchten Marker auf Protein- und m(messenger)RNA-Ebene keine Unterschiede zwischen den mit ctrl-siRNA, Promofectin und Nullmedium behandelten Zellen, sodass die ctrl-siRNA als Negativkontrolle bestätigt wurde. Daher werden der Übersicht halber im Ergebnissteil nur die mit ctrl-siRNA behandelten Proben dargestellt.

2.2.2 Analyse der Proteinexpression 2.2.2.1 Gewinnung von Ganzzell-Lysaten

Für die Proteinextraktion erfolgte ein Aussäen von 3-3,5*10^5 Zellen in DMEM- Basalmedium in 6-Well-Zellkulturplatten. Die TGFβ1-Stimulation erfolgte 72, 48 und 24 h vor Experimentende. Zur Gewinnung der Ganzzell-Lysate wurde das Medium entfernt und die HaCaT-Zellen wurden unter Hinzugabe von 0,5 ml kaltem PBS pro Well abgeschabt. Die Zellsuspension der abgeschabten Zellen wurde in 1,5-ml-Eppendorf- Röhrchen überführt, bei 850 g bei 4 °C für 8 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet bei -20 °C bis zur weiteren Aufarbeitung gelagert. Zur Proteinextraktion wurden die Zellpellets mittels eines SDS-Lysis-Puffers aus 1:7 Proteinase-Inhibitor Complete Mini sowie RIPA-Puffer suspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach der anschließenden Zentrifugation bei 14000 g für 15 min bei 4 °C konnte das extrahierte Protein als Überstand abgenommen werden.

2.2.2.2 Bestimmen der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentration der einzelnen Proben wurde mittels der Bradford-Methode bestimmt. Dafür wurde zunächst eine Standardkurve mittels einer Standardreihe definierter Proteinkonzentrationen von 0,125 µg/ml bis 20 µg/ml festgelegt. Dazu wurden 800 µl

(34)

Aqua bidest. mit 200 µl des Bradford-Reagenz, 1 µl des zuvor verwendeten SDS-Lysis Puffers sowie 10 µl des jeweiligen Standards versetzt. Für die Bestimmung der Probenkonzentration wurde anstatt des Standards 1 µl der jeweiligen Probe zu 800 µl Aqua bidest. und 200 µl Bradfordreagenz gegeben. Alle Ansätze wurden für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, und mittels des Photometers Genesys 10 Bio wurde über die photometrisch gemessene Absorptionsrate bei 595 nm die Proteinkonzentration bestimmt.

Basierend auf der ermittelten Proteinkonzentration wurden je 20-35 µg Protein der Proben mit Aqua bidest. auf dasselbe Volumen angeglichen und mit 5x-SDS-Puffer zur negativen Ladung der Proteinbestandteile versetzt. Diese SDS-Probenlysate wurden für 5 min bei 95 °C inkubiert. Die SDS-Probenlysate konnten nun direkt mit SDS-Gelelektrophorese und Western Blot weiteranalysiert oder bei -20 °C bis zur Durchführung des Wester Blots gelagert werden.

2.2.2.3 Extraktion der G- und F-Aktin Proteinfraktionen

Zur Gewinnung des G- und F-Aktin-Anteils wurde das G/F-Aktin Kit der Firma Cytoskeleton verwendet. HaCaT-Keratinozyten wurden in Versuchsplatten mit 100 mm Durchmesser mit 2*10^5 Zellen/Platte in DMEM-Basalmedium ausgesät, über fünf Tage inkubiert und 72, 48 und 24 h vor Experimentende mit 5 ng/ml TGFβ1 stimuliert. Dem Kit entsprechend wurde zunächst Lysis-Puffer bestehend aus F-Aktin-Stabilization-Puffer, Proteinase-Inhibitor sowie ATP-Lösung aus dem Kit hergestellt:

Tabelle 11: Herstellung des Lysis-Puffers im G/F-Aktin Kit

Reagenzien Menge

F-Actin Stabilization Puffer 1000 µl

ATP-Lösung 10 µl

Protease-Inhibitor 10 µl

Der Lysis-Puffer wurde für 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde das Medium aus den Versuchsplatten entfernt, die Zellen wurden mit 500 µl Lysis-Puffer pro Platte abgeschabt, in Eppendorf-Röhrchen übertragen, mittels Auf- und Abpipettieren homogenisiert und die Zellsuspension für 10 min bei 37 °C inkubiert. 300 µl der Suspension wurden in frische Röhrchen übertragen und für 5 min bei Raumtemperatur und 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in Ultrazentrifugen-Röhrchen übertragen

(35)

und diese bei 37 °C für 1 h bei 100.000 g ultrazentrifugiert. Der Überstand mit dem enthaltenen G-Aktin wurde abgenommen, mit SDS-Puffer versetzt und bei -20 °C gelagert.

Das Pellet bestehend aus F-Aktin wurde mit 300 µl F-Aktin-Depolymerization-Puffer versetzt, für 1 h auf Eis inkubiert und durch regelmäßiges Auf- und Abpipettieren homogenisiert. Anschließend wurde die F-Aktin-Suspension ebenfalls mit SDS-Puffer versetzt und bei -20 °C bis zur weiteren Analyse gelagert. Zusätzlich zu den Proben wurden aus dem Kit Standards für G-Aktin mit 50 µg, 100 µg und 200 µg Proteinkonzentrationen generiert. Die Analyse der Proben-Lysate erfolgte mittels Auftragen auf SDS-Gelelektrophorese und Western Blot.

2.2.2.4 SDS-Gelelektrophorese und Western Blot

Die Analyse erfolgte durch Auftrennen der Proteinbanden in der SDS-Gelelektrophorese.

Je nach Größe der untersuchten Proteine wurden 8%, 10% und 12% SDS-Mini-Gele in der Zusammensetzung entsprechend der Angaben in Tabelle 12 hergestellt.

Tabelle 12: Bestandteile SDS-Mini-Gele

Sammelgel 1x

Aqua bidest. 1,05 ml

30 % Acrylamid/Bisacrylamid 0,25 ml

1 M TRIS-HCl (pH 6,8) 0,19 ml

10 % SDS 15 µl

10 % APS 15 µl

TEMED 3 µl

Trenngel 8% 10% 12%

Aqua bidest. 2,3 ml 2,0 ml 1,7 ml

30 % Acrylamid/Bisacrylamid 1,3 ml 1,7 ml 2,0 ml

1 M TRIS-HCl (pH 8,8) 1,3 ml 1,3 ml 1,3 ml

10 % SDS 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml

10 % APS 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml

TEMED 5 µl 5 µl 5 µl

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Nach Auftragen der Proteinlysate wurde eine Spannung von 150 Volt angelegt, bis eine Verlagerung der Wanderungsfront an die untere Randkante des Gels erfolgt war.

Anschließend erfolgte das Übertragen der Proteine aus dem Gel auf eine Nitrocellulose- Membran mittels Semi-Dry-Blotter bei 150 mA, je nach Größe der untersuchten Proteine für 55  65 min. Die Übertragung des Proteins auf die Membran wurde mittels einer Ponceau-S-Färbung überprüft. Je nach verwendetem Antikörper wurde die Membran für 1 h bei Raumtemperatur in 5%-Blockmilch oder 5%-BSA (Bovine Serum Albumin) geblockt. Anschließend erfolgte die Inkubation des Primärantikörpers über Nacht bei 4 °C.

Nach dreimaligem Waschen erfolgte für 1 h die Inkubation mit den HRP-gekoppelten Sekundär-Antikörpern bei Raumtemperatur. Nach erneutem Waschen wurden die Membranen im abgedunkelten Raum für 4 min mit ECL-Lösung inkubiert und das Chemilumineszenz-Signal anschließend mit dem LAS4000-Aufnahmegerät detektiert. Die densitometrische Auswertung der detektierten Signalbanden erfolgte mit dem Programm Image J.

2.2.3 Analyse der Ribonukleinsäure(RNA)-Expression

2.2.3.1 RNA-Extraktion

Für die RNA-Extraktion erfolgte ein Aussäen von 3-3,5*10^5 Zellen in DMEM- Basalmedium in 6-Well-Zellkulturplatten. Nach Adhäsion der Zellen erfolgte ein Mediumwechsel mit DMEM-Basalmedium in allen Wells. Die Zellen wurden für weitere vier Tage inkubiert und jeweils 6 Wells 48, 24, 10, 6 und 2 h vor Experimentende mit 5 ng/ml TGFβ1 stimuliert. Die Probengewinnung zu Ganzzell-Lysaten erfolgte wie unter 2.2.2.1 beschrieben.

Für die RNA-Isolierung aus den Ganzzell-Lysaten wurde das InnuPREP-RNA-Mini-Kit von Jena Analytics verwendet. Die Zellpellets wurden mit 300 µl RL-Puffer suspendiert und mit einer 20G-Spritze homogenisiert. Die Suspension wurde in einen Spin-Filter überführt bei 10.000 g für 5 min zentrifugiert. Der Durchfluss mit wurde mit 300 µl 70%- Ethanol versetzt und in einen neuen Spin-.Filter übertragen. Es erfolgte eine erneute Zentrifugation bei 10.000 g, der Durchfluss wurde verworfen. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung der im Spin-Filter fixierten RNA mittels Zentrifugation nach Hinzugabe zweier Waschpuffer. Um die RNA aus dem Spin-Filter zu lösen, wurde RNAse-freies Wasser auf den Spin-Filter gegeben und 2x bei 10.000 für je 1 min zentrifugiert. Das erhaltende RNA-Lysat wurde bei -80 °C gelagert. Zuvor wurde photometrisch die

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Konzentration und Reinheit der RNA-Probe mittels Absorptionsmessung bei 260 nm und 280 nm im Photometer Genesys 10 Bio bestimmt.

2.2.3.2 Complementary-DNA(cDNA)-Synthese

Für die Herstellung der cDNA wurden das Invitrogen-Superscript-IV-Kit sowie der Anchored-Oligo-dT-Primer verwendet. Basierend auf der ermittelten RNA-Konzentration wurden je nach gewünschter Menge cDNA 11 µg oder 22 µg RNA aus den RNA-Lysaten mit RNAse-freiem Wasser auf dasselbe Volumen angeglichen.

Ein Primer-Mix aus Kit-Bestandteilen wurde hergestellt und zusammen mit dNTP (Desoxyribonukleosidtriphosphate) aus dem Kit zu den RNA-Proben gegeben und bei 65 °C für 5 min inkubiert, in denen die Anlagerung der Primer erfolgte.

Tabelle 13: Ansatz zur cDNA Umschreibung

Bestandteile 1x Ansatz

Primermix:

 75% Anchored Oligo dT

 25% Random Hexamer Primer

2 µl

dNTP 2 µl

Anschließend wurde der Mastermix aus Kit-Bestandteilen in folgendem Verhältnis hergestellt:

Tabelle 14: Mastermix für cDNA-Herstellung

5x SSIV(SuperScript IV)-Puffer 4 µl 100 mM DTT (Dithiothreitol) 1 µl

RNase-Inhibitor 1 µl

Reverse Transkriptase 1 µl

Die Proben wurden für 10 min bei Raumtemperatur mit dem Mastermix inkubiert, für weitere 10 min bei 55°C und anschließend bei 80 °C für 10 min. Die hergestellte cDNA konnte nun für die Analyse in der Real Time PCR eingesetzt oder bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

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2.2.3.3 Real Time PCR

Für die Analyse der mRNA-Expression mittels Real Time PCR wurden für die untersuchten Gene zunächst Standardreihen von 5*10^2 aM bis 5*10^(-4) aM aus einem zuvor hergestellten Standard mit definierter Stoffmenge generiert. Die Herstellung des Master-Mix für die Vervielfachungsreaktion erfolgte aus genspezifischen Primern sowie dem Chemilumineszenz EVA-Green in folgendem Verhältnis:

Tabelle 15: Master-Mix qPCR Reaktion

EVA-Green 2 µl

Primer forward 0,5 µl

Primer reverse 0,5 µl

Anschließend wurden je 3 µl des Mastermix mit 7 µl der Standards bzw. der umgeschriebenen cDNA pro Well auf eine 348-Well-Platte pipettiert. Die 348-Well-Platte wurde im Thermocycler Quant Studio 5 entsprechend des in Tabelle 16 beschriebenen Inkubationszyklus inkubiert.

Tabelle 16: Real-Time-PCR Inkubationszyklus

Phase Temperatur Dauer Wiederholungen

Annealing 95°C 15 min. 1x

Copying

95°C 15 sek.

40x

60°C 20 sek.

72°C 20 sek.

Dissociation

95°C 15 sek.

1x

60°C 15 sek.

95°C 15 sek.

Die Vervielfachungs-Effizienz der untersuchten Gene sowie die CT-Werte der aufgetragenen Proben wurden mittels der QuantStudio™-Design&Analysis-Software ausgewertet. Anschließend wurden das relative Expressionsniveau der TGFβ1-stimulierten