Breuer u. Breucr: Aminosäuren im Blut bei Lebercirrhotikern mit porto-cavaler Anastomose 191 Z. Klin. Chem. Klin. Biochem.
13. Jg. 1975, S. 191-196
Konzentrationen von Aminosäuren im Blut verschiedener Gefäßabschnitte von Patienten mit Leber- cirrhose während und nach Anlegen einer porto-cavalen Anastomose
Von/. Breuer
1) undÄ Breuer
Aus dem Institut für Klinische Biochemie der Universität Bonn
(Eingegangen am 29. Januar 1975)Bei Patienten mit Lebercirrhose wurden die Aminosäurenkonzentrationen mit Hilfe der Ionenaustauscher-Chromatographie im Serum von Blutproben aus verschiedenen Gefäßabschnitten während und nach Anlegung einer porto-cavalen Anastomose untersucht. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte nach einem nicht-parametrischen Test.
Die Bestimmung der Aminosäuren wurde bei drei Frauen und acht Männern intra operationem im Blut folgender Gefäß ab schnitte durchgeführt (n = Zahl der Blutproben): Armvene (n = 8), arteria femoralis (n = 2), vena cava (n = 7), vena portae (n = 9) und aorta abdominalis (n = 5). Mit Ausnahme von Ornithin (aorta abdominalis gegen vena cava) zeigten die Aminosäuren-Konzentrationen in den genannten Gefäßabschnitten keine statistisch gesicherten Unterschiede.
Ein bis drei Jahre nach Anlegung einer porto-cavalcn Anastomose wurden die Aminosäuren-Konzentrationen bei vier Frauen und fünf Männern im Blut der Armvene und der arteria femoralis ermittelt. Die Konzentrationen von Glutaminsäure, Phenylalanin und Lysin waren im Armvenenblut signifikant höher als im Blut der arteria femoralis.
Die Konzentrationen von Valin, Leucin und Isoleucin waren bei den Patienten mit Lebercirrhose gegenüber Normalpersonen deutlich erniedrigt.
Unter Berücksichtigung der an Normalpersonen erhobenen Befunde kann aus den hier mitgeteilten Ergebnissen der Schluß gezogen werden, daß die Anlegung einer porto-cavalen Anastomose keine erkennbaren Auswirkungen auf den Stoffwechsel der Aminosäuren bei Patienten mit Lebercirrhose hat.
Concentrations ofamino acids in the blood of different vessels of patients with cirrhosis of the liver during and after the introduction of a porto-caval anastomosis
In patients with liver cirrhosis the concentrations of amino acids were measured by ion exchange chromatography in the serum of blood samples taken from various vessels during and after the performance of a porto-caval anastomosis. Statistical evaluation was carried out with a nonparametric test.
In three female and eight male pateints, amino acids were determined intra operationem in blood samples of the following vessels (n = number of blood samples): arm vein (n = 8), arteria femoralis (n = 2), vena cava (n = 7), vena portae (n = 9) and aorta abdominalis (n = 5). With exception of ornithine (aorta abdominalis versus vena cava), no statistically significant differences in the concentrations of amino acids were observed in the various blood vessels.
One to three years after the introduction of the porto-caval shunt, amino acid concentrations were measured in blood from the arm vein and arteria femoralis in four female and five male patients. The concentrations of glutamic acid, phenylalanine and lysine were significantly higher in blood from the arm vein than in blood of the arteria femoralis.
The concentrations of valine, leucine and isoleucine were markedly lower in patients with liver cirrhosis than in normal persons.
On the basis of the present findings and of the results obtained with normal subjects, it may be concluded that porto-caval anastomosis does not exert a noticeable effect on the metabolism of amino acids in patients with liver cirrhosis.
Bei Patienten mit Lebercirrhose ist die Anlegung einer porto-cavalen Anastomose indiziert, wenn auf Grund einer portalen Hypertension Ösophagusvarizenblutun- gen zu befürchten oder bereits erfolgt sind. Selbst bei strenger Indikätionsstellung treten postoperativ immer wieder Encephalopathien auf, die auf eine Störung des Eiweißstoffwechsels als Folge des operativen Eingriffs
*) Jetzige Anschrift: Abteilung für Klinische Chemie, Medizi- nische Forschung, E. Merck, Darmstadt.
zurückgeführt werden. Eine Nachprüfung dieser Fest- stellung wird durch die Tatsache erschwert, daß im Einzelfall der Verlauf der Grundkrankheit (und damit auch das Auftreten einer Encephalopathie), sofern der Patient nicht operiert worden wäre, kaum vorhersehbar ist. Umso wichtiger erscheinen Untersuchungen objekti- vierbarer Parameter des Eiweißstoffwechsels, zu denen u. a. die Aminosäuren gerechnet werden können. In der vorliegenden Arbeit wird über das Verhalten von Aminosäurenkonzentrationen während und nach
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Brcucr u. Brcuer: Aminosäuren im Blut bei Lcbercirrhotikern mit porto-cavaler AnastomoseAnlegung einer porto-cavalen Anastomose bei Patienten
mit Lebercirrhose berichtet; dabei wurde besonderer Wert auf die Prüfung möglicher Konzentrationsunter- schiede in verschiedenen Gefäßabschnitten gelegt/Es zeigte sich, daß die Operation offenbar keinen wesent- lichen Einfluß auf das Verhalten der Aminosäuren im Blut ausübt.
Methodik
Chemikalien, Lösungen und Puffer
Asparagin (Serva Entwicklungslabor, Heidelberg) und Glutamin (Fluka, Buchs, Schweiz) waren „puriss."; die Aminosäuren waren von p.a. Reinheitsgrad (Scrva Entwicklungslabor, Heidel- berg). Die Standard-Aminosäuren-Lösung enthielt 18 Amino- säuren in Konzentrationen von je 2,5 mmol/1 (Technicon, Bad Vilbel) und wurde vor Gebrauch mit 0,1 mol/1 Salzsäure verdünnt; die Endkonzentration der Aminosäuren betrug 0,1 mmol/1. Caprylsäure und Thiodiäthylenglykol (Fluka, Buchs, Schweiz) sowie Brij 35 und Ninhydrin (Serva Entwicklungslabor, Heidelberg) waren „puriss.". Hydrindantin (Serva Entwicklungs- labor, Heidelberg) sowie alle übrigen Chemikalien (Merck, Darm- stadt) waren p.a. Reinheitsgrad. Methanol wurde vor Gebrauch destilliert und Wasser mit Hilfe eines Ionenaustauschers deioni- siert.
Die Zusammensetzung der Pufferslösungen für die Elution der Aminosäuren von den Kationenaustauscher-Säulen ist in Tabelle l angegeben.
Säulenchromatographie
Die Auftrennung der Aminosäuren erfolgte mit Hilfe eines 5-Säulen-Aminosäurenanalysators (Technicon, Bad Vilbel).
Die Chromatographierohre hatten einen inneren Durchmesser von 6 mm und eine Länge von 140 cm; sie waren bis zu einer
Höhe von 130 cm mit einem sauren Kationenaustauscherharz (Chromobead Typ A; Technicon, Bad Vilbel) gefüllt. Bei dem Harz handelt es sich um ein sulfoniertes Polystyrol, das zu 8%
mit Divinylbenzol quer vernetzt ist; es liegt in sphärischen Partikeln von 17 ± 2 Durchmesser (1) vor.
Nach dem Auftragen der enteiweißten Serumproben und der Standard-Aminosäuren wurde unter Verwendung der „Auto- grad-Technik" nach Peterson & Sober (2) sowie Piez & Morris (3) mit verschiedenen Pufferlösungen eluiert. Das genaue Elu- tionsschema ist in Tabelle 2 angegeben. Die Arbeitstempera- turen der Chromatographiesäulen betrugen während der ersten
Tab. 2. Elutionsschema für die Trennung von Aminosäuren an lonenaustauscherharz. Die Chromatographierohre wurden mit Chromobeadharz Typ A (Technicon, Bad Vilbel) ge- füllt; die Elution der Aminosäuren erfolgte unter Verwen- dung der Autograd-Technik (2, 3).
Puffer Kammer 21 34 56 8/ 9
Endkonzentrationen von Gemisch
AB BB*
CC DD DD
ml 7575 755 7075 7575 7575
Natrium ' [mol/1]
0,20,2 0,2 0,2 0,21,2 1,21,2 1,2
Methanol [*]
10• 1
55 0 00 00 0
pH-Wert 2,872,87 2,87 2,87-3,8 10,03,8 10,010,0 10,0
* Dieses Gemisch enthält keinen Zusatz von Methanol
6 1/2 h der Analyse 60 °C (bis zur Elution von Phenylalanin) und in den nächsten 3 h 40 °. Während der letzten Stunde der Analyse wurde die Temperatur von 40 °C auf 60 °C erhöht.
Bei einer Analysendauer von 10 1/2 h betrugen die Durchfluß- mengen 0,9 ml/min und der Druck 300 bis 400 pounds/square inch. Die Ausmessung der Aminosäurengipfel erfolgte halbauto- matisch mit einem Technicon Integrator/Calculator (TIC). Die quantitative Bestimmung von Prolin und Citruilin wurde nach einem früher (4) angegebenen Verfahren durchgeführt.
Enteiweißung der Serumproben
Das Serum wurde unmittelbar nach der Blutentnahme in üblicher Weise gewonnen. Die Serumproben wurden mit dem gleichen Volumen 50 g/l Sulfosalicylsäure versetzt und 10 min bei 2000 g zentrifugiert. Die enteiweißten Proben wurden ent-.
weder sofort zur Chromatographie verwendet oder bis zur Analyse bei -15 °C gut verschlossen aufbewahrt.
Normalpersonen und Patienten
Die Normalpersonen waren frei von erkennbaren Erkrankungen;
es wurden fünf Frauen (Alter 18-27 Jahre, Mittel 23 Jahre) und fünf Männer (Alter 30-35 Jahre, Mittel 32 Jahre) unter- sucht. Die Blutentnahmen erfolgten aus einer Armvene nach
Tab. 1. Zusammensetzung der Citrat-Pufferlösungen für die Elution von Aminosäuren von Kationenaustauscher-Säulen. Die Puffer- lösungen wurden bis zum Gebrauch in Kunststoff-Flaschen bei - 15 °C aufbewahrt.
Bestandteile
tri-Natriumcitrat-2-hydrat Natriumchlorid
Wasser
Natronlauge (2 mol/1) Methanol
Caprylsäure Thiodiäthylenglykol Brij 35-Lösung Salzsäure Wasser
Pufferlösung A
58,84g -3200ml
lOOmi 400ml 4 m l 20ml40ml etwa 80ml ad 4000 ml
B 58,84 g -3400 ml
100ml 200ml 4 m l 20 ml etwa 80ml40ml ad 4000 ml
C 58,84 g -3600 ml
100ml
— 4ml
40ml20ml etwa 70ml ad 4000 ml
D 58,84 g 233,79g 3600 ml
100ml
— - 4ml etwa 20ml40ml ad 4000 ml
pH-Wert* 2,87 2,87 3,80 10,00
* Die Einstellung des pH-Wertes erfolgt auf genau 0,02 Einheiten durch Zugabe von Salzsäure
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Breucr u. Breuer: Aminosäuren im Blut bei Lebercirrhotikern mit porto-cavaler Anastomose 193 12stündiger Nahrungskarcnz zwischen 08.00 und 09.00 Uhr
morgens.
Die Patientengruppc A umfaßte drei Frauen (durchschnittliches Alter 40 Jahre) und acht Männer (durchschnittliches Alter 36 Jahre) mit Lebercirrhose und Ösophagusvarizen. Blut wurde im Laufe des Vormittags intra operationem unmittel- bar vor Anlegung einer porto-cavalen Anastomose (End-zu-Seit bzw. Seit-zu-Seit Anastomose) aus folgenden Gefäßabschnitten entnommen: Armvene, arteria femoralis, aorta abdominalis, vena cava inferior und vena portae.
Die Patientengruppc B umfaßte vier Frauen (durchschnittliches Alter 44 Jahre) und fünf Männer (durchschnittliches Alter 40 Jahre) mit Lebercirrhose, die ein bis drei Jahre nach Anle- gung einer porto-cavalen Anastomose untersucht wurden; die Patienten befanden sich in relativ gutem Allgemeinzustand.
Die Blutentnahmen erfolgten aus einer Armvene sowie aus der arteria femoralis nach 12stündiger Nahrungskarenz zwischen 08.00 und 09.00 Uhr morgens.
Weitere Einzelheiten über die Patienten der Gruppen A und B (Chirurgische Universitätsklinik Bonn; Direktor: Professor Dr. A. Gütgemann) vgl. I.e. (5).
Statistische Berechnungen
Die jeweiligen Aminosäurenkonzentrationen wurden in den gleichen Gefäßabschnitten der drei Personengruppen auf Lokationsunterschiede untersucht. Diese Prüfung erfolgte bei zweiseitiger Alternativhypothese mit dem Rangsummen-Test für unabhängige Stichproben nach Mann- Whitney- Wücoxon (vgl. (6)) bzw. beim Vorliegen von Bindungen mit einer diesbe- züglichen Verallgemeinerung von Krauth (7). Die Irrtumswahr- scheinlichkeiten wurden nach Stucky & Volmar (8) exakt be- rechnet.
Innerhalb derselben Personengruppe wurden die Aminosäuren- konzentrationen der verschiedenen Abnahmeorte ebenfalls auf Lokationsunterschiede geprüft. Die Prüfung erfolgte wiederum bei zweiseitiger Alternativhypothese mittels der Randomi- sierungsmethode von Fisher (vgl. I.e. (6)), und zwar durch Randomisierung der Paarbeobachtungen selbst. Die Irrtums- wahrscheinlichkeiten wurden mittels Enumeration exakt be- rechnet.
Ergebnisse
Aminosäurenkonzentrationen in verschiedenen Gefäß- abschnitten bei Patienten unmittelbar vor Anlegen einer porto-cavalen Anastomose
in Tabelle 3 sind die Aminosäurenkonzentrationen zu- sammengestellt, die intra operationem in verschiedenen Gefäßabschnitten ermittelt wurden. Auf eine getrennte Angabe der Werte für Frauen und Männer wurde wegen der relativ geringen Zahl der Patienten verzichtet. Wie die statistische Untersuchung ergab, waren die Konzen- trationen folgender neun Aminosäuren in der Armvene bei Lebercirrhotikern signifikant niedriger als bei Nor- malpersonen: Citrullin, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Lysin und Argiriin.
Die Konzentrationen der Aminosäuren in den fünf unter- suchten Gefäßabschnitten der Lebercirrhotiker wurden einer gegenseitigen statistischen Prüfung unterzogen.
Lediglich in einem Falle (aorta abdominalis gegen vena cava) wurde für den erhöhten Ornithinwert eine Signifikanz (5%-Niveau) errechnet. Die erniedrigten Werte für Asparaginsäure (aorta abdominalis gegen vena cava) sowie für Glycin, Valin, Cystin und Isoleucin
(aorta abdominalis gegen vena portae) wurden nicht als statistisch signifikant (l0%-Niveau) angesehen.
Aminosäurenkonzentrationen bei Patienten mit porto- cavalen A Jiastomosen
Tabelle 4 gibt die Werte wieder, die bei neun Patienten mit Lebercirrhose ein bis drei Jahre nach Anlegung einer porto-cavalen Anastomose im Serum aus einer Armvene und aus der arteria femoralis bestimmt wurden; auch hier wurde aufgetrennte Angaben für weibliche und
männliche Patienten verzichtet. Im Serum aus der Arm- vene waren die Konzentrationen von Asparaginsäure, Glutaminsäure, Tyrosin und Phenylalanin bei den ope- rierten Patienten signifikant höher (5- bzw. l %-Niveau) als bei Normalpersonen, während die Konzentrationen von Valin, Isoleucin und Leucin signifikant (l ^Niveau) niedriger waren.
Bei einem Vergleich innerhalb der Gruppen der Leber- patienten zeigte sich, daß folgende Aminosäurenkonzen- trationen im Serum aus der Armvene signifikant (5 %- Niveau) höher waren als im Serum der arteria femoralis:
Glutaminsäure, Phenylalanin und Lysin.
Diskussion
Die zahlreichen, bisher durchgeführten Studien über die Konzentrationen von Aminosäuren beschränkten sich im wesentlichen auf Untersuchungen des Armwenen- blutes; dies gilt insbesondere für Patienten mit Leber- cirrhose (9—14). Nur in wenigen Fällen wurden Amino- säurenbestimmungen im Blut aus einer Arterie (15, 16,
18) und der venahepatica(15, 17, 18) durchgeführt;
diese erfolgten hauptsächlich im Zusammenhang mit der Untersuchung über die Beteiligung von Aminosäuren an der Gluconeogenese („Alanin-Zyklus") (17-19).
In der vorliegenden Arbeit wird erstmals über die gleich- zeitige Messung von Aminosäurenkonzentrationen in fünf verschiedenen Gefäßabschnitten bei Patienten mit Lebercirrhose berichtet. Es zeigte sich, daß in den einzel- nen Gefäßabschnitten die mittleren Konzentrationen zahlreicher Aminosäuren verschieden waren. Die Signi- fikanz dieser Unterschiede konnte jedoch, wie eine ein- gehende statistische Prüfung ergab, lediglich in einem Falle gesichert werden. Die daraus abzuleitende relative Gleichverteilung der Aminosäuren in den zentral und peripher gelegenen arteriellen und venösen Gefäßen dürfte in erster Linie auf die Nahrungskarenz zurückzu- fuhren sein, die der Operation vorausging. Daraus kann — bei aller Zurückhaltung - der Schluß gezogen werden, daß beim Menschen größere Konzentralionsunterschiede der Aminosäuren in den verschiedenen Gefäßgebieten nur wenige Stunden nach einer Nahrungsaufnahme auf- treten. Diese Feststellung deckt sich mit Beobachtungen von Scliarrer & Zucker an der Ratte (20) und von Shimada & Zimmerman an neugeborenen Schweinen (21). Nach Verabreichung einer aminosäurenhaltigen
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Breuer u. Brcuer: Aminosäuren im Blut bei Lebercirrhotikern mit porto-cavaler Anastomose 195 Tab. 4. Konzentrationen von Aminosäuren im Serum verschiedener Gefäßabschnitte von Patienten mit Lebercirrhose ein bis drei
Jahre nach Anlegung einer porto-cavalen Anastomose.
Zum Vergleich sind die Werte aus der Armvene von Normalpersonen aufgeführt.
Die Angaben in der Tabelle sind Mittelwerte (± Standardabweichung) von vier weiblichen und fünf männlichen Patienten, n = Anzahl der untersuchten Serumproben.
Normalpersonen Armvene Aminosäuren
Asparaginsäure Threonin Serin
Glutaminsäure Prolin Citrullin Glycin Alanin
o-Aminobuttersäure Valin
Cystin Mcthionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Ornithin Lysin Histidin Tryptophan Arginin
*) sign. = signifikant
2) sign. = signifikant Signifikanzangabe: +
/lj 163,431,7 136,5 269,9 116,1 259,043,8 410,4 238,431,8 108,2
27,369,4 121,4 60,563,8 175,389,8 93,9 113,1
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n 1010 1010 99 1010 1010 109 1010 99 1010 9- 9
Lebercirrhotiker 1 Armvene
lMmol/l]
58,5 ± 152,0 * 146,8 ± 5 16,6 ± 165,1 ± 61,5 ± 249,9 ± 364,0 ± 144,026,8 109,1 42,239,7 115,1 ±76,1
91,1 ± 102,1 ± 153,0 ± 97,8 ± 132,0 ±-
48,522,0 122,145,2 57,119,0 122,350,7 26,822,4 18,315,5 22,115,3 40,929,1 45,625,3 32,0 56,1 entsprechenden Konzentrationen entsprechenden Konzentrationen auf dem 5 %-Niveau, -H- auf dem 1 %-Niveau
bis 3 Jahre nach Operation arteria femoralis n
89 98 33 99 99 59 99 99 99 -9 8 im Serum im Serum
sign.'MMmol -H- 50,7 131,9 134,2 ++ 435,5 151,4 215,428,7 336,9
•H- 138,723,8 33,891,8
•H- 41,5 ++ 69,0
•M- 105,1 + 78,1 102,9 138,2 95,923,6 132,8
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n sign.2) 99
99 + 33 99 99 49 99 99 99 91 9 der Normalpersonen
von venösem Blut derselben Patienten
Nahrung stiegen bei beiden Spezies die Konzentrationen von Aminosäuren im portalen Blut deutlich an, während im systemischen Blut nur geringfügige postprandiale Änderungen gemessen wurden; die Unterschiede der Aminosäurenkonzentrationen waren 6 bis 12h nach der Nahrungsaufnahme wieder verschwunden. Die Konzentrationen von neun Aminosäuren im Armvenen- blut, das während der Operation der Patienten mit Lebercirrhose gewonnen wurde, waren signifikant niedriger als die entsprechenden Werte bei Normalper- sonen. Diese Befunde stehen im Gegensatz zu den Be- richten der Literatur (9-14) und unseren eigenen, weiter unten zu besprechenden Ergebnissen, nach denen die Konzentrationen von Aminosäuren im peripheren Blut von Patienten mit Lebercirrhose eher höher sind als bei Lebergesunden. Als Ursache für die erniedrigten Aminosäurenkonzentrationen bei den hier untersuchten ' Patienten (Tabelle 3) dürften die prae und intra operatio- nem stattfindenden Flüssigkeitsverschiebungen in Frage kommen. Daraus ergibt sich, daß Ergebnisse, die während einer Operation gewonnen wurden, nicht notwendiger- weise mit Befunden, die unter anderen Bedingungen er- mittelt wurden, vergleichbar sind.
Während über die Veränderungen der Aminosäurenkon- zentrationen bei Patienten mit Lebercirrhose im wesent- lichen übereinstimmende Ergebnisse vorliegen (9—14),
sind entsprechende Untersuchungen mit statistischer Sicherung bei Patienten mit Lebercirrhose nach Anle- gung einer portocavalen Anastomose wegen Ösophagus- varizen nur vereinzelt durchgeführt worden (13, 22).
Die wichtige Frage der Funktionstüchtigkeit der Leber nach dem — in vielen Fällen lebensrettenden — opera- tiven Eingriff rechtfertigte weitere Studien über den Aminosäurenstoffwechsel. Aus den hier vorgelegten Ergebnissen geht hervor, daß ein bis drei Jahre nach er- folgter porto-cavaler Anastomose die Konzentrationen von drei Aminosäuren (Isoleucin, Leucin und Valin) im peripheren Blut statistisch signifikant gegenüber Lebergesunden erniedrigt waren. AuchKnauffet al.
(22) haben erniedrigte Konzentrationen von Iso- leucin und Leucin (neben Lysin) bei Patienten mit porto-cavaler Anastomose beobachtet, während Zinne- man et al. (13) bei drei Patienten die Konzentrationen von Leucin und Valin (neben anderen Aminosäuren) erniedrigt fanden. Statistisch signifikante Erhöhungen wurden bei den hier untersuchten Patienten für die Kon- zentrationen von Glutaminsäure, Phenylalanin, Tyrosin und Asparaginsäure festgestellt. Knauffet al. (22) beob- achteten ebenfalls Erhöhungen von Glutaminsäure, Glutamin, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin und Treo- nin bei ihren Patienten. Ähnliche Befunde erhoben Zinneman et al (13).
Z. Klin. Chem. Klin. Biochein. / 13. Jahrg. 1975 / Heft 5
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Breuer u. Breuer: Aminosäuren im Blut bei Lebercirrhotikern mit pofto-cavaler AnastomoseFaßt man die Ergebnisse zusammen, die ein bis drei
Jahre nach Anlegung einer porto-cavalen Anastomose bei Patienten mit Lebercirrhose gewonnen wurden, so ergibt sich folgendes Bild. Die Konzentrationen von Aminosäuren im Blut sind zum Teil erniedrigt, wenn man die Werte mit denjenigen von Normalpersonen vergleicht. Da jedoch ähnliche (und zum Teil deutlicher ausgeprägte) Veränderungen auch bei Patienten mit
Lebercirrhose ohne porto-cavale Anastomose auftreten, hat der operative Eingriff keine erkennbare Wirkung auf den Stoffwechsel der Aminosäuren.
Danksagung
Wir danken Herrn Dr. W. Stucky, Wissenschaftliche Datenver- arbeitung, E. Merck, Darmstadt,· für die Durchführung der statistischen Berechnungen.
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Prof. Dr. H. Breuer Inst. f. Klin. Biochem.
5300 Bonn-Venusberg
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