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Identifizierung und Charakterisierung von Retrosequenzen der tumorrelevanten HMGA Gene im menschlichen Genom

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Academic year: 2021

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(1)Identifizierung und Charakterisierung von Retrosequenzen der tumorrelevanten HMGA Gene im menschlichen Genom. Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. -. im Fachbereich Biologie / Chemie der Universität Bremen. vorgelegt von Cornelia Blank Bremen, November 2003. 1. Gutachter: Prof. Dr. J. Bullerdiek 2. Gutachter: Prof. Dr. U. Bonk.

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(3) Inhaltsverzeichnis. Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... IV 1.. Einleitung..............................................................................................1. 2.. Material und Methoden ........................................................................9. 2.1.. Material ..................................................................................................9. 2.1.1.. Geräte und Verbrauchsmaterial .............................................................9. 2.1.2.. Chemikalien .........................................................................................10. 2.1.3.. Puffer und Lösungen ............................................................................12. 2.1.4.. Nährmedien für prokaryotische und eukaryotische Kulturen ................14. 2.1.5.. Enzyme und Antikörper ........................................................................15. 2.1.6.. Nukleinsäuren ......................................................................................15. 2.1.6.1.. DNA (genomisch, copy) .......................................................................15. 2.1.6.2.. Klone ....................................................................................................16. 2.1.6.3.. Plasmide / Vektoren .............................................................................16. 2.1.6.4.. DNA-Molekulargewichtsmarker ............................................................16. 2.1.6.5.. Oligonukleotide ....................................................................................17. 2.1.7.. Bakterienstämme .................................................................................19. 2.1.8.. Menschliche Zelllinien ..........................................................................19. 2.1.9.. Gewebe................................................................................................19. 2.1.10.. Nukleinsäure-Isolierungskits ................................................................19. 2.1.11.. Transfektionsreagenz...........................................................................20. 2.1.12.. Luciferase Assay-Kit.............................................................................20. 2.1.13.. Computerprogramme ...........................................................................20. 2.1.14.. Internetprogramme und Datenbanken..................................................20. 2.2.. Methoden .............................................................................................21. 2.2.1.. Primärzellkultur ....................................................................................21. 2.2.1.1.. Zellkultur von benignen menschlichen Lungenhamartomen ................21. 2.2.1.2.. Zellkultur von menschlichen Lymphozyten...........................................22. 2.2.2.. Zytogenetische Methoden ....................................................................22. 2.2.2.1.. Aufarbeitungen von Zellkulturen zur Metaphasen Präparation.............22. 2.2.2.2.. GTG-Färbung .......................................................................................23. 2.2.2.3.. Karyotypanalyse...................................................................................23. 2.2.3.. Molekular-zytogenetische Methoden....................................................23. 2.2.3.1.. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ...........................................23. I.

(4) Inhaltsverzeichnis. II. 2.2.4.. Molekulargenetische Methoden ........................................................... 25. 2.2.4.1.. DNA-Isolierung und Aufreinigung......................................................... 25. 2.2.4.2.. RNA-Isolierung..................................................................................... 27. 2.2.4.3.. cDNA-Synthese ................................................................................... 27. 2.2.4.4.. Amplifikation von DNA-Fragmenten durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)................................................................................................... 28. 2.2.4.5.. Auftrennung von DNA-Fragmenten und RNA ...................................... 31. 2.2.4.6.. Aufreinigung und Elution von DNA-Fragmenten .................................. 31. 2.2.4.7.. Sequenzierung..................................................................................... 32. 2.2.4.8.. DNA-Blot .............................................................................................. 32. 2.2.4.9.. Nicht-radioaktive Hybridisierung mit Anti-Dig FAB ............................... 33. 2.2.4.10. DNA-Verdau......................................................................................... 33 2.2.4.11. Klonierung............................................................................................ 34 2.2.4.12. Herstellung eines HMGA1L1-Expressionskonstruktes......................... 35 2.2.4.13. Luciferase Reporter Vektor Assay ....................................................... 35 2.2.5.. In silico Analysen ................................................................................. 38. 2.2.6.. Statistik und andere Berechnungen ..................................................... 38. 3.. Ergebnisse.......................................................................................... 41. 3.1.. Identifizierung und Sequenzanalyse von HMGA cDNA-ähnlichen Sequenzen im menschlichen Genom .................................................. 41. 3.1.1.. Identifizierung von HMGA cDNA-ähnlichen Sequenzen ...................... 41. 3.1.1.1.. Anwesenheit von HMGA cDNA-ähnlichen Sequenzen ........................ 41. 3.1.1.2.. Mindestanzahl und chromosomale Lokalisation der HMGA1 cDNAverwandten Sequenzen ....................................................................... 42. 3.1.1.3.. Identifizierung der HMGA1 cDNA-verwandten Sequenzen.................. 43. 3.1.1.4.. Zusammenfassung .............................................................................. 46. 3.1.2.. Sequenzanalyse der HMGA1 cDNA-homologen Sequenzen .............. 47. 3.1.2.1.. Suche nach Direct Repeats ................................................................. 47. 3.1.2.2.. Vergleich. des. HMGA1. cDNA-homologen. Bereiches. mit. den. korrespondierenden HMGA1 Regionen ............................................... 48 3.1.2.3.. PolyA Trakte ........................................................................................ 49. 3.1.2.4.. Länge der identifizierten HMGA1 Retrosequenzen.............................. 50. 3.1.2.5.. Zusammenfassung .............................................................................. 50.

(5) Inhaltsverzeichnis. 3.2.. III. Untersuchungen. zur. Entstehung. der. identifizierten. HMGA1. Retrosequenzen im menschlichen Genom...........................................50 3.2.1.. Abstammung der HMGA1 Retrosequenzen .........................................50. 3.2.1.1.. Entstehungsmechanismus: Duplikation oder direkte Retrotransposition? .....................................................................................................51. 3.2.1.2.. Retrotranskribierte mRNAs von HMGA1 ..............................................51. 3.2.1.3.. Zusammenfassung...............................................................................56. 3.2.2.. Retrotransposition der HMGA1 Retrosequenzen .................................57. 3.2.2.1.. Retrotranspositionszeitpunkt der HMGA1 Retrosequenzen .................57. 3.2.2.2.. Integrationsort der HMGA1 Retrosequenzen .......................................60. 3.2.2.3.. Zusammenfassung...............................................................................66. 3.3.. Untersuchungen. zur. biologischen. Funktion. der. HMGA1. Retrosequenzen im menschlichen Genom...........................................67 3.3.1.. Transkription der HMGA1 Retrosequenzen .........................................67. 3.3.1.1.. Mögliche Aktivierungsmechanismen der HMGA1 Retrosequenzen .....67. 3.3.1.2.. Suche nach Transkripten der HMGA1 Retrosequenzen ......................73. 3.3.2.. Analyse der hypothetischen Aminosäure (AS)–Sequenz der HMGA1 Retrosequenzen ...................................................................................79. 3.3.2.1.. Analyse der hypothetischen AS-Sequenz in silico ...............................79. 3.3.2.2.. Vergleichende. Protein-Bindungsstudien. exemplarisch. zwischen. rekombinantem HMGA1L1 und HMGA1 ..............................................83 3.3.2.3.. Zusammenfassung...............................................................................84. 3.3.3.. HMGA1 Retrosequenzen und Tumorgenese .......................................85. 3.3.3.1.. Hypothese: HMGA1 Retrosequenzen besitzen ein eigenes tumorigenes Potential. ..............................................................................................86. 3.3.3.2.. Hypothese: HMGA1 Retrosequenzen dienen HMGA Genen als Aberrationspartner................................................................................90. 3.3.3.3.. Zusammenfassung...............................................................................96. 4.. Diskussion ..........................................................................................97. 5.. Zusammenfassung...........................................................................119. 6.. Literatur.............................................................................................121. Anhang I - IX.

(6) Abkürzungsverzeichnis. IV. Abkürzungen χ2 µl, µm ADP AS ATBAC bp, kb BSA C CASH cDNA cm C-terminal Da dATP, dCTP, dGTP, dTTP; dUTP, dNTP dH2O DMSO DNA / DNase DR EDTA EST Ex fg FG FISH g GCGTG h Hg HMGA1 / 2 HMGA1 / 2 HMGA1L/2L HMGA1L/2L HMGB1 / 2 / 3 HMGB1 / 2 / 3 HMGB1L/2L/3L HMGB1L/2L/3L HMGN1 / 2 / 3 HMGN1 / 2 / 3 HMGN1L/2L/3L HMGN1L/2L/3L HUGO J. Chi-Quadrat Mikroliter, -meter Adenosindiphosphat Aminosäure Adenin- bzw. ThyminEngl.: bacterial artificial chromosome Basenpaare, Kilobasenpaare Engl.: bovine serum albumin Celsius Engl.: chromosome assignment using somatic cell hybrids copy DNA Zentimeter Carboxy-terminal Dalton Desoxyadenin- / -cytosin- / -guanin- / -thymin- / uracil- / nukleosid-5´triphosphat Bidestilliertes Wasser Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure / Desoxyribonuklease Engl.: direct repeat, Synonym für TDS, Sequenzduplikation Ethylendiamintetraacetat Engl.: expressed sequence tag, cDNA-Fragment Exon Femtogramm Freiheitsgrad Fluoreszenz in situ Hybridisierung Erdbeschleunigung (g = 981 cm x s-2) Guanin- bzw. CytosinG Bänderung mit Trypsin und Giemsa Engl.: hour, Stunde Innendruckeinheit Quecksilbersäule High mobility Gruppen Protein AT-Hook 1 / 2 bzw. Gen High mobility Gruppen Protein AT-Hook 1 / 2 ähnliche AS-Sequenz bzw. DNA-Sequenz High mobility Gruppen Protein Box 1 / 2 / 3 bzw. Gen High mobility Gruppen Protein Box 1 / 2 / 3 ähnliche AS-Sequenz bzw. DNA-Sequenz High mobility Gruppen Protein Nucleotid bindende Domäne 1 / 2 / 3 bzw. Gen High mobility Gruppen Protein Nucleotid bindende Domäne 1 / 2 / 3 ähnliche Aminosäuresequenz bzw. DNA-Sequenz Engl.: human genome organization Joule.

(7) Abkürzungsverzeichnis. LI LINE Lsg. LTR M min ml, mm, mM NCBI NFDM nt. ORF OT p PA PAC PBS PCH PCR pmol RACE RLU RNA RT RTemp SDS sec SEM SINE SSC TIS TSD u UL / UA UTR UV V Vol. V. Lipom Engl.: long interspersed nuclear element, Repeat-Element Lösung Engl.: long terminal repeat Molar Minute Milliliter, -meter, -molar National Center for Biotechnology Information Engl.: non fat dried milk, Trockenmilch Nukleotid Engl.: open reading frame, offenes Leseraster Objektträger Irrtumswahrscheinlichkeit Pleomorphes Adenom der Ohrspeicheldrüse P1 abgeleitetes, artifizielles Chromosom Engl.: phosphat buffered saline pulmonares chondroides Hamartom Engl.: polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreation Pikomolar Engl.: rapid amplification of cDNA ends Engl.: relative light units, relative Lichteinheiten Ribonukleinsäure Reverse Transkription Raumtemperatur Engl.: sodium dodecyl sulfate Sekunde Engl.: simple and efficient method, Transformationsmethode Engl.: short interspersed nuclear element, Repeat-Element Engl.: saline-sodium citrate Engl.: target integration site, Integrationsort Engl.: target site duplication, Synonym für Direct Repeat Engl.: unit, Einheit Uterus Leiomyom / Uterus Adenom Untranslatierte Region Ultraviolett Volt Volumen.

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(9) Einleitung. 1. Einleitung Kürzlich publizierte Sequenzierungen und vorläufige Analysen ergaben eine überraschend geringe Anzahl von 30.000 bis 40.000 Genen im menschlichen Genom (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Die Exon-kodierenden Bereiche der Gene stellen lediglich einen Anteil von ca. 1,1 bis 1,5% dar. Die restlichen 99,5% des ca. 3 Milliarden Basenpaare zählenden menschlichen Genoms bestehen aus sogenannter nicht-kodierender DNA (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Mehr als ein Drittel dieser - früher als "junk" DNA bezeichneten - nichtkodierenden Regionen stellen die Retrotransposons dar (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001). Sie vervielfältigen sich durch reverse Transkription einer RNA und Insertion in das Genom (Retrotransposition). Zu diesen Retroelemente gehören neben den L(ong) T(erminal) R(epeat) Elementen, den L(ong) I(nterspersed) N(uclear) E(lement)s und den S(hort) I(nterspersed) N(uclear) E(lement)s die Retrosequenzen von Protein-kodierenden Genen (Weiner et al., 1986; Brosius, 1999; Prak und Kazazian, 2000; Deininger und Batzer, 2002). Ihre Anzahl wird im menschlichen Genom auf 8.000 bis 20.000 geschätzt (Deininger und Batzer, 2002; Harrison et al., 2002; Zhang, H. et al., 2003). Retrosequenzen aktiver Protein-kodierender Gene sind in verschiedenster Hinsicht interessante Forschungsobjekte: • Inaktive Retrosequenzen (Retropseudogene) werden für Untersuchungen von Mutationsraten / -muster im Rahmen der Neutralen Theorie der Evolution herangezogen (Casane et al., 1997; Li, 1997) und dienen zur Rekonstruktion phylogenetischer Stammbäume (Friedberg und Rhoads, 2002). • Sie geben eine Momentaufnahme der transkribierten mRNAs ihrer UrsprungsGene zum Zeitpunkt der Retrotransposition wieder. • Sie werden als Transkriptionsnachweis für das jeweilige Ursprungsgen in Zellen der Keimbahn verwendet, da vererbte Retrosequenzen nur in diesen Zellen retrotranskribiert worden sein können (Savtchenko et al., 1988; StrichmanAlmashanu et al., 2003; Zhang, H. et al., 2003). • Sie. bilden. und. /. oder. erweitern. Genfamilien.. Bei. einigen. aktiven. Retrosequenzen (Retrogenen) wird eine Beeinflussung der Expression der Proteine ihrer Familie auf verschiedene Weise vermutet:. 1.

(10) Einleitung. So wird z. B. eine posttranskriptionelle Regulation des Ursprungsgens durch die Transkripte seiner Retrosequenz diskutiert (Korneev et al., 1999; Hirotsune et al., 2003). Bei vielen transkriptionell aktiven Retrosequenzen wird zudem eine eigene Translation in ein Protein vermutet. So wird z. B. für aktive autosomale Retrosequenzen von gonosomalen Genen eine kompensatorische Wirkung während der Meiose diskutiert (Retroposon Compensatory Mechanism Theory)(Mccarrey und Thomas, 1987; Dahl et al., 1990; Hendriksen et al., 1997). Da die Ursprungsgene im Pachytän durch die Bildung des XY-Bodies inaktiviert werden, wird eine Übernahme ihrer Funktion durch die homologen aktiven Retrosequenzen für diesen Zeitraum vermutet. Eine tatsächliche Translation von Retrosequenzen wurde bisher jedoch nur in wenigen Fällen nachgewiesen (Seeler et al., 1998). • Retrosequenzen von krankheitsrelevanten Genen spielen beim Menschen eine besondere Rolle: Wird die Expression des Ursprungsgens als diagnostischer oder prognostischer Marker eingesetzt, kann es bei entsprechenden RT-PCR Nachweisen durch Kontamination mit genomischer DNA zu Verwechselungen mit der Retrosequenz kommen (Ruud et al., 1999). Seltener werden sie direkt mit der Entstehung von Erkrankungen, wie z. B. Tumorerkrankungen, in Verbindung gebracht. Ein eigenes tumorigenes Potential wird für das menschliche Defender Against Apoptotic Cell Death Retrogene (DAD-R) diskutiert (Kuittinen et al., 2000). Desweiteren wurde das inaktive murine Retropseudogen des Tumorsuppressorgens p53 als Aberrationspartner seines Ursprungsgens in einem strahleninduzierten Tumor identifiziert (Tanooka et al., 1998). Es bewirkte dessen Mutation durch homologe Rekombination. Meistens handelt es sich bei Retrotransposons von Protein-kodierenden Genen um inaktive cDNA Kopien, da sie ursprünglich von (prozessierter) mRNA stammen und somit keine Introns und keinen eigenen Promotorbereich besitzen. Außerdem akkumulieren sie nach ihrer Entstehung häufig Mutationen (Substitutionen, Deletionen, Insertionen), die im Open Reading Frame (ORF)-homologen Bereich des Retrotransposons zur Verschiebung des hypothetischen Leserasters und / oder zu einem vorzeitigen Stopp-Kodon führen können (Vanin, 1985). Generell werden sie - wie auch die anderen Retrotransposons - von duplizierten DNA Abschnitten, sogenannte Target Site Duplications (TSD) oder Direct Repeats (DR) 2.

(11) Einleitung. eingerahmt. Auf ihre Herkunft als mRNA weist am 3´-Ende ein PolyA-Trakt hin (Vanin, 1985). Bei der Retrotransposition der mRNA von Protein-kodierenden Genen wird u. a. eine Rekrutierung der Endonuklease (EN) / Reversen Transkriptase (RT) des LINE L1 vermutet (Prak und Kazazian, 2000; Deininger und Batzer, 2002). Diverse Reportergen Assays (Tchenio et al., 1993; Maestre et al., 1995; Esnault et al., 2000) und Sequenzanalysen der unmittelbaren Integrationsstellen (Jurka und Klonowski, 1996) weisen auf eine Beteiligung des L1 Enzyms an der Entstehung der Retrosequenzen hin. Viele Retrosequenzen von aktiven Protein-kodierenden Genen sind bekannt, welche trotz einiger Mutationen durch die folgenden Mechanismen aktiviert wurden: • durch aberrante Transkription des 5´-flankierenden Bereiches inkl. eigener Promotor-Sequenz. und. weiteren. regulatorischen. Elementen. des. Ursprungsgens (z. B. humanes, Testis-spezifisches Phosphoglycerat Kinase Gen 2 (PGK-2) (Boer et al., 1987; Robinson et al., 1989; Mccarrey et al., 1996)) • durch Nutzung eines internen, kryptischen Promotorbereiches mit Hilfe von externen regulatorischen Elementen (z. B. N-myc2 (Marmota monax) (Fourel et al., 1992)) • durch Insertion in die unmittelbare Nähe eines funktionellen Promotorbereiches eines fremden aktiven Gens (z. B. das menschliche, Testis-spezifische Zfa (Ashworth et al., 1990)). • durch Insertion in den 3´-Bereich eines aktiven Gens, so dass die Retrosequenz (komplett oder teilweise) zu einem Exon des Gens wird und Fusionstranskripte entstehen. Bei der Entdeckung des Fusionsgens SP100 / HMG wurde für diesen Vorgang der Begriff "Exonization" eingeführt (HMGB1L3 (Rogalla et al., 2000)). Ca. 8.000 der geschätzten 20.000 Retrosequenzen wurden bisher identifiziert (Zhang, H. et al., 2003) und stammen von 10% aller menschlichen Gene (Zhang, H. et al., 2003). Auffällig ist der hohe Anteil an retrotranskribierten Genen, die in translationale Prozesse involviert sind (z. B. menschliche ribosomale Proteine, (Zhang, Z. et al., 2002) oder in der nuklearen Regulation eine Rolle spielen (z. B. Histone H3.3, (Zhang, H. et al., 2003))(Venter et al., 2001). 3.

(12) Einleitung. Gegenstand dieser Arbeit ist die Identifizierung und nähere Charakterisierung einer Untergruppe der High Mobility Group (HMG) Protein Gen Familie, der HMGA Gene. Die HMG Familie wird als eine der größten Retropseudogenfamilien beim Menschen angesehen (Landsman und Bustin, 1986; Landsman et al., 1986; Srikantha et al., 1987). Ihre Mitglieder kodieren für nukleare Nicht-Histon-Proteine, welche mit geringer Spezifität DNA binden, als architektonische Faktoren DNAund Chromatin-Struktur verändern und verschiedene DNA-abhängige Prozesse wie Transkription, Replikation, Rekombination und DNA-Reparatur - beeinflussen können (Bustin und Reeves, 1996; Bustin, 1999). Generell werden die Gene der HMG Familie - auf Grund ihrer DNA-bindenden Domänen - in drei Gruppen unterteilt: HMG Nukleosom bindende Proteine (HMGN); HMG Box bindende Proteine (HMGB); HMG AT-Hook bindende Proteine (HMGA). Die Anzahl von Retrosequenzen wird bei HMGN1 und HMGN2 auf 50 bis 90 bzw. 35 bis 50 geschätzt (Landsman et al., 1986; Landsman et al., 1986; Landsman et al., 1989; Popescu et al., 1990), im Fall von HMGB1 auf 20 bis 70 ähnliche Sequenzen im menschlichen Genom (Wen et al., 1989; Stros und Dixon, 1993). Bislang wurden die Retrosequenzen von keiner der oben genannten HMG Gruppen umfassend charakterisiert. Jedoch wurden bisher zwei HMG Retrogene identifiziert: • HMGN4, welches von HMGN2 abstammt und durch Insertion in den 3´-Bereich eines funktionellen Promotors aktiv vorliegt (Birger et al., 2001). • HMGB1L3, welches aus HMGB1 hervorging und durch Exonization als evolutiv neues Exon in der Spleißvariante SP100 / HMG des aktiven Gens des nuklearen Proteins SP100 partiell exprimiert wird (s. oben)(Seeler et al., 1998; Rogalla et al., 2000). Genauere Untersuchungen zu den Retrosequenzen der HMGA Familie wurden bis zu Beginn der vorliegenden Arbeit ebenfalls noch nicht durchgeführt. Es lag lediglich eine Schätzung von drei bis neun HMGA1 Retrosequenzen vor (Eckner und Birnstiel, 1989; Johnson et al., 1989), von denen eine cDNA Kopie partiell sequenziert wurde. Des Weiteren war über menschliche Retrosequenzen von HMGA2, dem anderen Mitglied der HMGA Gruppe, nichts bekannt. Die Proteine HMGA1 und HMGA2 spielen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von verschiedenen mesenchymalen Geweben, bei der Entstehung von Neoplasien und bei der Progression von Metastasen.. 4.

(13) Einleitung. Folglich steht das Ausmaß der Ähnlichkeit der gefundenen Retrosequenzen zu ihrem. Ursprungsgen,. d.. h.. die. Existenz. von. eigenen. HMGA-ähnliche. Eigenschaften, und eine mögliche eigene Funktionalität und biologische Relevanz als HMGA-ähnliche Sequenzen im menschlichen Genom im Mittelpunkt dieser Arbeit. HMGA Proteine stellen wichtige architektonische Transkriptionsfaktoren dar (Thanos und Maniatis, 1992), welche u. a. die Bildung von stereospezifischen Multi-Protein-Komplexen (Enhanceosomen) in Promotorregionen (Kim und Maniatis, 1997; Merika et al., 1998; Munshi et al., 1998; Yie et al., 1999; Agalioti et al., 2000) beeinflussen und somit positiv oder negativ die Expression von über 45 verschiedenen eukaryotischen und viralen Genen kontrollieren (Brunetti et al., 2001; Melillo et al., 2001; Reeves und Beckerbauer, 2001). HMGA Proteine besitzen drei DNA-bindende Domänen (AT-Hooks), mit denen sie an AT-reiche Sequenzen in der "minor groove" der DNA-Doppelhelix binden können. Sie wirken auf die Organisation des Chromatins bzw. der Chromosomen ein, indem sie u. a. Nukleosom "Core" Partikel positionieren und sich selbst an die Ein- bzw. Austrittsstelle der DNA des Nukleosoms heften (Wu et al., 1983; Strauss und Varshavsky, 1984). Auf Grund dieser wichtigen Aufgaben der eigentlichen HMGA Proteine, beschäftigt sich. diese. Arbeit. auch. mit. der. Frage,. ob. einige. der. vorgefundenen. Retrosequenzen aktiv im Genom vorliegen. HMGA Retrogene könnten mit ihren HMGA-ähnlichen Transkripten bzw. Proteinen Einfluss auf den Expressionslevel oder das Expressionsmuster von HMGA-Proteinen in menschlichen Zellen nehmen. Normalerweise. wird. HMGA2. fast. ausschließlich. in. proliferierenden,. mesenchymalen, undifferenzierten Zellen im Laufe der Embryogenese exprimiert, während HMGA1 zusätzlich in geringer Menge auch in differenzierten Geweben nachgewiesen werden kann (Bussemakers et al., 1991; Zhou et al., 1995; Chiappetta et al., 1996; Rogalla et al., 1996; Abe et al., 2000). HMGA Proteine üben einen bedeutenden Einfluss auf die Entstehung von vielen benignen und malignen Tumoren aus: Hier wurde häufig eine Überexpression der Proteine gefunden, so dass HMGA1 Expression als Indikator für neoplastische Transformation (Goodwin et al., 1985; Giancotti et al., 1987; Giancotti et al., 1989; Chiappetta et al., 1998) und für Progression maligner Tumoren vorgeschlagen 5.

(14) Einleitung. wird (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1995). Außerdem liegen in vielen mesenchymalen benignen Tumoren Aberrationen innerhalb ihrer chromosomalen Loci, 6p21 (HMGA1) und 12q13~15 (HMGA2), vor (Ashar et al., 1995; Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996; Kazmierczak et al., 1996; Williams et al., 1997; Xiao, S. et al., 1997; Kazmierczak et al., 1998). Aberrationen im HMGA2-Locus führen häufig zu Fusionstranskripten zwischen HMGA2 und einer Reihe anderer Gene (Ashar et al., 1995; Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996). Im Fall von HMGA1 sind nur wenige Fusionspartner bekannt (Xiao, S. et al., 1997; Blank et al., 2001). Weiterhin wurden in Tumoren mit HMGA Überexpression häufig auch 3´-trunkierte Transkripte gefunden (Geurts et al., 1997; Tkachenko et al., 1997; Kazmierczak et al., 1998; Klotzbucher et al., 1999). In den betreffenden 3´-Regionen beider Gene wurden posttranskriptionell regulative Regionen identifiziert (Eckner und Birnstiel, 1989; Borrmann et al., 2001), die durch ihr Fehlen vermutlich die Überexpression der Gene in diesen Tumoren verursachten (Borrmann et al., 2001). Im Rahmen dieser Arbeit wird ein möglicher Einfluss von HMGA Retrosequenzen auf die Entstehung von benignen Tumoren untersucht. Für viele bekannte chromosomale Aberrationen bzw. Bruchpunkte in diesen Tumoren sind die betroffenen (Target) Gene nicht bekannt (Mitelman et al., 2002). In diesen Fällen könnten HMGA Retropseudogene von der Aberration betroffen sein und somit in einem kausalen Zusammenhang zu der jeweiligen Tumorentstehung stehen. Dabei wäre eine Aktivierung von inaktiven HMGA Retrosequenzen oder eine Veränderung. der. Expression. von. aktiven. Retrosequenzen. durch. die. chromosomale Aberration möglich. In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, ob die HMGA cDNA Kopien ihren Ursprungsgenen durch homologe Rekombination als. Aberrationspartner. dienen. und. somit. deren. veränderte. Expression. verursachen können. Die. Grundvoraussetzung. für. eine. mögliche. biologische. Relevanz. der. Retrosequenzen, z. B. in der Tumorgenese, ist jedoch eine hohe Ähnlichkeit zu ihrem entsprechenden Ursprungsgen. HMGA1 besitzt eine Länge von ca. 10,1 kb, unterteilt in sieben Introns und acht Exons, von denen die vier letzten Protein kodierende Bereiche darstellen (Friedmann et al., 1993). Es wurden bisher drei Spleißvarianten, HMGA1a (kodierend für 107 Aminosäuren (AS) und ~11,7 kDa), HMGA1b (kodierend für 96 AS und ~10,6 kDa) und HMGA1c (kodierend für 179 6.

(15) Einleitung. AS und ~19,6 kDa) nachgewiesen, die sich voneinander durch verschiedene Deletionen in der kodierenden Region unterscheiden (Eckner und Birnstiel, 1989; Johnson et al., 1989; Friedmann et al., 1993; Nagpal et al., 1999). Weiterhin sind vier verschiedene Promotorbereiche und Transkriptionsstartpunkte beschrieben, die zu unterschiedlichen 5´-untranslatierten Regionen (UTRs) der mRNAs führen (Friedmann et al., 1993). In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Abstammung von identifizierten HMGA1 Retrosequenzen durchgeführt, um eine Momentaufnahme der HMGA1 Transkription und mRNA Prozessierung zum Zeitpunkt ihrer Retrotransposition zu ermöglichen. HMGA2 misst eine Länge von ca. 141,8 kb und besitzt vier Introns, 5 Exons und zwei Promotorbereiche (NCBI GenBank Accessionnr. NT_029419)(Ashar et al., 1996; Chau et al., 1999; Rustighi et al., 1999). Das Protein besteht aus 109 AS und wiegt ~12 kDa. Zusammenfassend. beschäftigt. sich. die. vorliegende. Arbeit. mit. den. Retrosequenzen der entwicklungs- und tumorbiologisch relevanten HMGA Gruppe, die einer der Retrosequenz-reichsten Genfamilien des menschlichen Genoms darstellt. Bislang wurde noch für keine HMG Gruppe eine umfassende und detaillierte Untersuchung ihrer Retrosequenzen durchgeführt. Im Rahmen dieser. Arbeit. wurden. HMGA. Retrosequenzen. identifiziert. und. näher. charakterisiert. Zur Charakterisierung wurden die Sequenzen analysiert und mit ihrem Ursprungsgen auf DNA- und Protein-Ebene verglichen, ihre Abstammung und Retrotransposition näher untersucht sowie Hinweise auf eine mögliche biologische Relevanz - speziell im Bezug auf die Entstehung von benignen Tumoren - gesucht.. 7.

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(17) Material und Methoden. 2. Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Geräte und Verbrauchsmaterial Aufsatzkamera CCD-Camera Autoklav Tecnoclav 120 Brutschrank Forma Scientific 3194 Deckgläschen 24 x 60mm Destillierapparat Milli-Ro Plus 10 Durchlichtmikroskop Axioplan (Filtersatz: 01, 09, 15) Filterpapier Miracloth Folien-Schweißgerät 100 GE Gasbrenner Gefrier-Kühlkombination Sikafrost Comfort Gefriertruhe (-20 °C) Öko-Arctis Super Gefriertruhe (-80 °C) HC9-20V-T-A Gelelektrophoresekammern (mit Gelkämmen): Horizon 11.14, Horizon 20.25 Glaswaren (z.B. Glasküvetten, Erlenmeyer-Kolben) Heissluftsterilisator, 180 °C Impfbank LaminAir HA 2448 GS Laserdrucker 16/600PS, Phaser 440 Magnetrührer / Heizplatte IKA-Combimag RET Mikrowelle R-5V12 Nylonmembran Hybond N+ Objektträger mit Mattfeld, 26 x 76 mm Pasteurpipetten 200 PCR-Reaktionsgefäß 0,2 ml, 0,5 ml Petrischalen mit Nocken Phasenkontrastmikroskop Diavert mit automatischer Fotoapparatur Vario-Ortomat pH-Meter ph 535 MultiCal. Pinzetten, Pipettier-Bälle, Impföse, Spatel etc. Pipettenspitzen 10µl, 100µl, 1000µl (gestopft) Pipetus Polaroid Land-Kamera MP4, Polaroid-Film Typ 665. Neuberger Tecnomara Labotect Omnilab Millipore Zeiss Calbiochem Polystar Junkers Siemens AEG Heraeus Sepatech Gibco BRL Schott-Duran Heraeus Sepatech Heraeus Sepatech Macintosh IKA Sharp Amersham Assistent Brand Biozym Sarstedt Leitz Wissenschaftl. Techn. Werkstätten, Weilheim Omnilab Eppendorf (Biozym) Hirschmann Laborgeräte Polaroid 9.

(18) Material und Methoden. Quarzküvetten 1000µl Reaktionsgefäße 0,5ml, 1,5ml, 2,0ml Röhrchen (Zentrifugen-) mit Schraubverschluss: 13ml, 27ml, 50ml, 150ml Schlauchfolie Schüttelinkubator 3033 Spannungsquellen: 600V/250 mA, Gene Power Supply Spectrophotometer Uvikon 940 SpeedVac Concentrator CVC Stangenpipetten 5ml, 10ml, 20ml Stoppuhr Thermoblock: Mastercycler gradient, Microprocessor Controlled Incubation System Crocodile Tischzentrifuge Capsule HF-120 UV-Crosslinker Fluo-Link UV-Durchlichttisch Reprostar II Vakuum-Blottingappartur Variopipetten, div. 0,5 – 1000 µl Vortex REAX 2000 Waage Sartorius analytic A 200S, universal U 4100 Wärmeschrank Wasserbad Therma-Boy Wasserstrahlpumpe Whatmanpaper 3MM Zellkulturflaschen 25 cm2 / 50ml, 6-Well Schalen Zentrifugen: Hermle Z 320 K, Varifuge 20 RS Rotor: HSS 4500, Sigma 2K15 Rotor: 12139, 12145, Sigma 3K12 Rotor: 11133. Helma Eppendorf Sarstedt, Nunc Omnilab GFL Hölzel, Pharmacia Kontron Instruments Savant Brand Junghans Eppendorf, Appligene oncor T. Seiko Co. Biometra Camag BioRad Eppendorf SL-Petten Heidolph Sartorius Heraeus Sepatech Lauda Brand Whatman Nunc Eppendorf, Heraeus Sepatech, Sigma. 2.1.2. Chemikalien Die aufgeführten Chemikalien entsprechen dem Reinheitsgrad p.a. soweit nicht anders angegeben. AgarAgar, high gel strength Agarose Albumin aus Rinderserum (BSA) Ampicillin Na-Salz Antibiotikastammlösung 10.000 U Penicillin, 10.000 µg/ml Streptomycin Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab Fragmente (150U, 200µl) Bacto-Hefe Extrakt, -Trypton 10. Serva Promega Serva, Sigma Serva Biochrom Roche Serva.

(19) Material und Methoden. Biotinylated Anti-Avidin D (0,5mg, Lösung) Blocking Reagens Bromphenolblau Calziumchlorid (CaCl2) Chloramphenicol (Trockensubstanz) Chloroform Colcemid-Stammlösung Collagenase A (aus Clostridium hystollyticum, lyophilisiert) CPD Star™ Cresol Rot DABCO (1,4-Diazubicyclo[2.2.2]Octane) Desoxyribonukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Dextransulfat (50%) Diethylpyrocarbonat (DEPC) Digoxigenin-11-ddUTP Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Dithiotreithol (DTT) (0,1 M) Entellan Essigsäure ≥ 99,8% Ethanol 100% Ethidiumbromid (10.000x) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) EUKOBROM Ficoll 400 Fixiersalz Fixogum (Kleber) Fluorescein Avidin D (5 mg, Lösung) Formaldehyd 37 Formamid Giemsa-Stammlösung Glucose Glycerol Hanks Trockensubstanz Instamed Trockenmedium 199 (Earl´s Salze, mit L-Glutamin, ohne NaHCO3) Isopropanol Isopropylthiogalaktosid (IPTG) Kälberserum, fötal Kaliumacetat (K-Ac), Kaliumchlorid (KCl), Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4). Vector Laboratories Roche Merck Riedel-de Haën Serva Fluka Biochrom Roche, Serva Cellmark Diagnostics Merck Sigma Promega Oncor Serva Roche Fluka Janssen Gibco BRL Merck Fluka Riedel-de Haën Oncor Merck Tetenal Sigma Tetenal Marabu Vector Laboratories Merck Fluka Merck Janssen Acros Biochrom Acros Acros Promega Gibco Riedel-de Haën. 11.

(20) Material und Methoden. Kanamycinsulfat Magnesiumchlorid-6-hydrat (MgCl2) Magnesiumsulfat (MgSO4) Maleinsäure Manganchlorid (MnCl2) Methanol, abs. Mineralöl (DNase-, RNase-, Protease-frei) Morpholinopropansulfonsäure (MOPS) Natriumacetat (NaAc) Natriumchlorid (NaCl) Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4), Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumhydroxid (NaOH) Phenol 90% Propidium-Jodid Salzsäure (HCl) Tartrazin tri-Natriumcitrat-2 hydrat (Na3-Citrat) Trispuffer Hydrochlorid (Tris-HCl), Trizma-Base (Tris-Base) Trizol LS Reagenz Trockenmilch Protifar plus (fettarm), NFDM Trypsin (Trockensubstanz) Trypsin/EDTA-Lösung (0,05% / 0,02%) in PBS ohne Calcium bzw. Magnesium Tween 20 (Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate) X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid) Xylen Cyanol FF. Serva Riedel-de Haën Merck Merck Merck Riedel-de Haën Sigma Sigma Riedel-de Haën Fluka Riedel-de Haën Riedel-de Haën Sigma Riedel-de Haën Merck Riedel-de Haën Sigma Life Technologies Nutricia Difco Biochrom Sigma Merck Merck. 2.1.3. Puffer und Lösungen Anti-Avidin-Lösung (5 ng/µl). 1 µl Bio Anti-Avidin D; 99 µl NFDM (5%) / SSC (4x). Anti-Dig-Lösung (30 ng/µl). 15 ml Anti-Dig-AP Fab (0,2 µg/µl); 85 µl NFDM (5%) / SSC (4x). Antifade-Solution. 18 ml Glycerol; 0,36g DABCO; 2 ml 0,2 M Tris / 0,02%NaN3; 10 µg Propidium-Jodid. Blocking-Reagenz-Stammlsg. 10% Blocking-Reagenz; in dH2O (10%) Collagenase (0,35%). 0,35 g Collagenase A; ad 100 ml 1x PBS (pH7,8). Denaturierungspuffer. 0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl. Depurinierungspuffer. 0,25 N HCl. DNA Gelbeladungspuffer (6x) 0,05% Xylen Cyanol FF; 0,1% Cresol Rot; 0,25% Tartrazin; 15% Ficoll 400; 5 mM Tris-HCl (pH 8,0) 12.

(21) Material und Methoden. dNTP Mix A. 10 mM dATP; 10 mM dCTP; 10 mM dGTP; 10 mM dTTP. EDTA-Lösung. 0,5 M EDTA, pH 8. Entwickler-Bad. 250 ml EUKOBROM; 1,5 l Leitungswasser. Erststrang-Puffer (5x). 250 mM Tris-HCl (pH 8,3); 375 mM KCl; 15 mM MgCl2. Ethidiumbromid Lösung A. 1 mg/ml Ethidiumbromid. Ethidiumbromid Lösung B. 10 mg/ml Ethidiumbromid. ExpressHyb Hybridization Solution. BD Biosciences ClonTech. FITC 1-Lösung (25 ng/µl):. 0,5 µl Fluorescein Avidin D;. FITC/NFDM(5%) / SSC (4x). 99,5 µl NFDM (5%) / SSC (4x). FITC 2-Lösung (25 ng/µl):. 0,5 µl Fluorescein Avidin D;. FITC / SSC(4x). 99,5 µl SSC (4x). Fixativ. 3 Vol Methanol; 1 Vol Essigsäure. Fixier-Bad. 200 g Fixiersalz; ad 2 l Leitungswasser. Formamid (70%) / SSC (2x). 70% Formamid; 30% SSC (2x). Formamid(50%) / SSC (2x). 50% Formamid; 50% SSC (2x). Giemsa-Färbelösung (1%). 5 ml 1/15M KH2PO4; 5 ml 1/15M Na2H2PO4; 5 ml Ethanol, vergällt; 1 ml Giemsa-Stammlsg.; ad 100 ml dH2O. Giemsa-Färbelösung (2%). 5 ml 1/15M KH2PO4; 5 ml 1/15M Na2H2PO4; 5 ml Ethanol, vergällt; 2 ml Giemsa-Stammlsg.; ad 100 ml dH2O. GTE-Puffer. 50 mM Glucose; 10 mM EDTA; 25 mM Tris-HCL; pH 8,0. Hypotone KCl (0,05 M). 3,73 g KCl; ad 1000 ml dH2O. Hypotone Medium 199-Lösung (1:6). 1 Vol Medium 199-20; 5 Vol dH2O. IPTG-Stammlösung. 0,1 M IPTG in dH2O. Kaliumacetat-Puffer. 60 ml 5M Kaliumacetat; 11,5 ml Essigsäure; ad 100 ml dH2O. MOPS (10x). 200 mM MOPS (pH 7,0); 50 mM Na-Ac; 10 mM EDTA; RNase frei. NaOH / 1% SDS. 0,2 M NaOH; 1% SDS. Neutralisierungspuffer. 1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl (pH 7,2); 1 mM EDTA. Neutralisierungspuffer für RNA Gele. 1,8 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5). NFDM (5%) / SSC (4x). 5% NFDM; SSC(4x) 13.

(22) Material und Methoden. PBS (1x). 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM NaH2PO4; 1,47 mM KH2PO4; pH 7,4. Phenol. Phenol; abgepuffert. Puffer 1. 0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl; 0,2 M NaOH; pH 7,5. Puffer 3. 0,1 M Tris-HCl; 0,1 M NaCl; 50 mM MgCl2; pH 9,5. RNAse-Reaktionslösung (für FISH). 200 µl RNAse-Stammlsg.; 200 µl SSC (4x). RNAse-Stammlösung (für FISH). 40 mg RNase; 200 µl STE (=TNE) Puffer. SDS-Stammlösung (10%). 10% Natriumdodecylsulfat (SDS); in dH2O; pH 7,2. Soerensenpuffer. 410 ml 1/15 M KH2PO4; 590 ml 1/15 M Na2H2PO4; pH 6,8. SSC (20x). 3 M NaCl; 0,3 M Na3-Citrat. SSC (4x) / 0,05% Tween20. 0,05% Tween20; SSC (4x). SSPE-Puffer (20x). 174 g NaCL; 27,6 g Na2HPO4; 7,4 g EDTA; ad 1000 ml dH2O; pH 7,4. STE- (TNE-) Puffer. 10 mM TrisHCl pH 8,0; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA pH 8,0. TAE-Puffer (50x). 2 M Tris-Base; 50 mM EDTA (pH 8,0); 5,71% Essigsäure. TE-Puffer. 10 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1 mM EDTA (pH 8,0). Trypsin-Lösung (GTG-Färbung bei FISH). 1,2 mg Trypsin; 50 ml Soerensenpuffer. X-Gal-Stammlösung. 50 mg/ml X-Gal in Dimethylformamid. Zell-Lysis-Puffer. 10 mM Tris; 400 mM NaCl; 2 mM EDTA; pH 8,2. 2.1.4. Nährmedien für prokaryotische und eukaryotische Kulturen Chromosomenmedium B Biochrom für Lymphozyten Hanks-Lösung Hanks Trockensubstanz; 4,7 ml NaHCO3-Lösung; 20 ml Antibiotika Stammlösung; ad 1000 ml dH20 LB-A-Agarplatten. LB-Medium; 100 µg/ml Ampicillin; 1,5% AgarAgar. LB-AIX-Agarplatten. LB-Medium; 100 µg/ml Ampicillin; 0,5 mM IPTG; 80 µg/ml X-Gal; 1,5% AgarAgar. LB-K-Agarplatten. LB-Medium; 25 µg/ml Kanamycin;1,5% AgarAgar. 14.

(23) Material und Methoden. LB-Medium pH 7,0. 10 g Bacto-Trypton; 5 g Bacto-Hefe Extrakt;10 g NaCl. Medium 199. Instamed Trockenmedium 199; 29,3 ml NaHCO3-Lösung; ad 1000 ml dH20. Medium 199-20. 78% Medium 199; 20% fötales Kälberserum; 2% Antibiotika-Stammlösung; steril filtriert. SOB-Medium. 2% Bacto-Trypton; 0,5% Bakto-Hefe Extrakt; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl. SOC-Medium. SOB-Medium; 20 mM Glucose; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4. 2.1.5. Enzyme und Antikörper Lysozym (50 mg/ml). Serva. MMLV Reverse Transkriptase (200 U/µl) Proteinase K (20 µg/µl) Restriktionsnuklease (20 U/µl) mit 10x Restriktionspuffern und BSA RNase A (100 µg/µl), DNase frei RNase Mix (200 µg/µl) T4 Ligase mit 5x T4 DNA-Ligase Puffer Biotin- / DIG-Nick Translation Mix Taq DNA Polymerase (5 U/µl) mit 10x PCR-Puffer ohne MgCl2, 25 mM MgCl2 Trypsin-Lösung (0,05% (w/v)). Gibco BRL Roche Promega Roche Roche Gibco BRL Roche Sigma Biochrom. 2.1.6. Nukleinsäuren 2.1.6.1.. DNA (genomisch, copy). genomische DNA: menschliche Fibroblasten (von P. Rogalla), Fibroblasten von Pan troglodytes (Schimpanse), Gorilla gorilla (Flachland-Gorilla), Hylobates lar (Weisshandgibbon), Macaca mulata (Rhesusaffe)(Primaten-DNA von A. Flohr), menschliche Plazenta (Gibco), Lachs-Testis (ssDNA, Sigma), CASH-DNA (Mensch-Nager-Hybrid-DNA, Coriell Cell Repositories) cDNA: menschliche Fibroblasten und HeLa Zelllinie (von P. Rogalla), menschliche Lymphozyten, Lebertumor, embryonales Gewebe (von A. Flohr). 15.

(24) Material und Methoden. 2.1.6.2.. Klone. Die nachfolgenden PAC-Klone stammen aus der menschlichen genomischen PAC-Library von Genome Systems und wurden per PCR-Screening identifiziert. Die Größe der Insert beträgt ca. 100 kb und beinhaltet HMGA1 Retropseudogene. Nr. 1 2 3. Name, Vektor, Wirt PAC COB-032, dAd10SacBII, E. coli DH10B PAC CEG-533, dAd10SacBII, E. coli DH10B YDd-3, pET3a, E. coli BL21. 2.1.6.3.. Klon Adresse Kontrollnr. 161:D16 20032 202(G3) 20533 von P. Rogalla. Plasmide / Vektoren. HMGA2 cDNA ORF kloniert in pET3a. von P. Rogalla pET3a Vektor (4640 bp, u. a. mit Promotor-Sequenz, +bla, Novagen AmpR+) pGEM-T Easy Vektor (3018 bp, u. a. +lacZ, AmpR+) Promega pGL3-Control (pGL3-C) Vektor (5256 bp, u. a. mit Enhancer-, Promega Promotor-Sequenz, luc+, AmpR+) pGL3-Enhancer (pGL3-E) Vektor (5064 bp, u. a. mit Promega Enhancer-, ohne Promotor-Sequenz, luc+, AmpR+) pRL-TK-Control Vektor (4045 bp, u. a. Promotorsequenz, Promega renilla luc+, AmpR+) Näheres über Aufbau der einzelnen Vektoren ist den jeweiligen Begleitzetteln zu entnehmen.. 2.1.6.4.. DNA-Molekulargewichtsmarker. λ-DNA⋅EcoRI (Marker II) λ-DNA⋅EcoRI + HindIII (Marker III) DNA Molecular Weight Marker V PBR328-DNA⋅BglI + HinfI (Marker VI) DNA Molecular Weight Marker VIII pGEM-3-DNA HinfI + pGEM-3-DNA⋅RsaI DNA⋅SinI (pGEM-Marker) 1 kb Plus DNA Ladder RNA-Leiter. 16. +. Roche Roche Roche Roche Roche pGEM-3- Promega Invitrogen Promega.

(25) Material und Methoden. 2.1.6.5.. Oligonukleotide. Alle Primer stammen von der Firma Pharmacia soweit nicht anders angegeben. HMGA1L1-spezifische Primer für Sequenzierung* und Nachweis: Primername *COB-1091up *COB-1148do *COB-722 *COB-up1 *HMGA1-for1 *HMGA1-rev1 IY1upH3 (Linker für HindIII). IY1doX1 (Linker für XbaI). *IY651do *IY651up COB-2184do COB-6up COB-72-92 COB-doE. Sequenz 5´-GGT GGT GGG GAC ATT GCT TTT T-3´ 5´-GGG AAG CCA GAG GGA ACA ATG-3´ 5´-CTG TGG CTT TTG CTC CTG GTA A-3´ 5´-TAG AAA TGA CTG GAG CAA AAA CTT-3´ 5´-AGG AAA AGG ACG GCA CTG AGA-3´ 5´-TCC TCT TCC TCC TTC TCC AGT TT-3´ 5´-CCC AAG CTT GGG AAT TGA TGT TGC CTT ATG TG-3´. Position (nt.) 781 - 802 838 - 858 2222 - 2243 -103 - -80 171 - 191 389 - 411 -78 - -59. 5´-GCT CTA GAG CAG TTT GCC CTG TGA CCT C3´. 2157 - 2175. 5´-GGT AGC AGC AGC AAT GAC AGA T-3´. 1462 - 1483 1462 - 1483 1875 - 1898 -305 - -284 -239 - -219 430 - 448. 5´-ATC TGT CAT TGC TGC TGC TAC C-3´ 5´-GAT AGG GTT GAT GCA GTT TTT GTC-3´ 5´-CCC AAG CCT GCT TTG TTT TCA G-3´ 5´-GCA ACA ATT GTG GAA GCA GAC-3´ 5´-CCG AAT TCT CAT TGC TCC TCC TCC GAG-3´. (Linker für EcoRI) 5´-GGA AGA TCT CAA TTG ATG TTG CCT ATG TGA AAA A-3´. -79 - -55. 5´-GGA AGA TCT GAG ATG AAT TGA GAC TCG ATA GAC CTG-3´. -358 - -332. 5´-GGA AGA TCT GCA AGA TGC CAT CAA ATG AAT AAA A-3´. -921 - -897. 5´-CCC AAG CTT CCC CGG CTC AGA GTC TCA ATT A-3´. 26 - 47. (Linker für HindIII). COB-upNd. 5´-GGC CAT ATG AGC GAG TCG ATC TCG AAG-3´. 128 -145. 5´-ACG GCT CCA AGA AGG CTC TCC TA-3´. 65 - 87 181 - 200 451 - 469 327 - 346. COB-Frag1 (Linker für BglII ). COB-Frag2 (Linker für BglII). COB-Frag3 (Linker für BglII). COB-Fraglow (Linker für NdeI). HMGA1L-for1 *HMGA1L-for2 *HMGA1L-rev1 HMGA1L-rev2. 5´-TGG CAC TGA GAA GCG GAG CT-3´ 5´-GCA GGC GAC ACG CAA GCA C-3´ 5´-TTT CCA GGT CTT GGC AGC GT-3´. 17.

(26) Material und Methoden. HMGA1L2-spezifische (Sequenzierungs-*) Primer: Primername *CEG-245up *CEG-677up *CEG-83do *CEG-898up *HMGA1-for2 *HMGA1-rev1 CEG-1119up CEG-2028do. Sequenz 5´-ACA GTA CCT TCT TTA GCA CAA-3´ 5´-CTG GAG AAG GAG GAA GAG GAG GGC AT-3´ 5´-CAG ATG AGC CTG AAG TCT TGA CAG AA-3´ 5´-GAA GAA AAG AAA AAC CCA GGA GAG A-3´ 5´-TCC ACC TGC TCC TTA GAG-3´ 5´-TCC TCT TCC TCC TTC TCC AGT TT-3´ 5´-AGA GAA GGG AAG ATG AGT GAG TCG-3´ 5´-TTA GGG GAG GTT GGG AAA GAA T-3´. Position (nt.) -787 - -767 361 - 386 -232 - -206 -139 - -115 68 - 85 358 - 380 82 - 105 991 - 1012. HMGA1 cDNA- / HMGA2 cDNA-spezifische Primer: Primername HMGA2-for1 HMGA2-for2 HMGA2-for3 HMGA2-rev1 HMGA2-rev2 HMGA1-for1 HMGA1-for2 HMGA1-rev1 HMGA1-rev2 HMGA1-rev3. Sequenz 5´-CTT CAG CCC AGG GAC AAC-3´ 5´-CGC CTC AGA AGA GAG GAC-3´ 5´-GTT GAG CCC TCT CCT AAG-3´ 5´-TCC TCC TGA GAC GGC TTC-3´ 5´-CTA GTC CTC TCG GCA GAC-3´ 5´-AGG AAA AGG ACG GCA CTG AGA-3´ 5´-TCC ACC TGC TCC TTA GAG-3´ 5´-TCC TCT TCC TCC TTC TCC AGT TT-3´ 5´-ATG TTA GCC TTG TCC AG-3´ 5´-CTT GGT TTC CTT CCT GGA GTT GT-3´. weitere Primer: Primername Sequenz 5´-GTG AAG GTC GGA GTC AAG G-3´ GAPDH-2 GAPDH-3 5´-GGT GAA GAC GCC AGT GGA CTC-3´ Lower1do 5´-TTC AGA ATG TCA ACA AAA CAG C-3´ 1UTR5up 5´-AGA CAG CGC CGG GGC AAG-3´ GAP-Bgl2 (Linker für BgllI) 5´-GAA GAT CTT CGC CCA AGA CCT CTT TTC CCA CTT T-3´ GAP-Hin3 (Linker für HindIII ) 5´-CCC AAG CTT GGG GCA GCG GCG CGA ACA CAT-3´ M13 rev 5´-TTC ACA CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3´ M13 uni 5´-ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG-3´ pET3aSelow 5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CAC-3´ pET3aSeedo 5´-TCA CGA GGC CCT TTC GTC TTC-3´ AP2 (Gibco BRL) 5´-AAG GAT CCG TCG ACA TC-3´. 18.

(27) Material und Methoden. 2.1.7. Bakterienstämme E. coli K12 JM 109 Promega Gibco BRL E. coli K12 DH5α E. coli BL21 Amersham Biosciences Die Bakterien lagen transformationskompetent vor (präpariert nach dem "Standard Protokoll für die SEM Präparation kompetenter Zellen")(Inoue et al., 1990). 2.1.8. Menschliche Zelllinien HeLa-Zelllinie etabliert aus Zellen eines menschlichen Zervix-Karzinoms. 2.1.9. Gewebe Es wurden insgesamt 19 benigne menschliche Lungenhamartome ausgewertet. Acht stammen aus dem Allgemeinen Krankenhaus Harburg, Abteilung Pathologie, sieben wurden von der Gemeinschaftspraxis für Pathologie in Hemer und vier aus dem Städtischen Klinikum "St. Georg", Institut für Pathologie und Tumordiagnostik in Leipzig geschickt. Normales Testisgewebe wurde freundlicherweise vom Zentralkrankenhaus "St. Jürgen-Strasse" für Expressionsstudien zur Verfügung gestellt.. 2.1.10.. Nukleinsäure-Isolierungskits. Nukleinsäure-Isolierungskits wurden von der Firma QIAGEN verwendet. Die Inhaltsstoffe der nachfolgenden Lösungen sind den jeweiligen Protokollen – falls angegeben zu entnehmen. QIAprep® Miniprep Kit: QIAprep Spin Säulen mit Auffang-Cup, Puffer P1, P2, N3, PB, PE, EB, RNase A. QIAGEN® Plasmid Midi, Maxi Kit: QIAGEN Säulen, Puffer P1, P2, P3, QBT, QC, QF, RNase A QIAquick® PCR Purification Kit: QIAquick Spin-Säulen mit Auffang-Cup, Puffer PB, PE, EB QIAEX-II® Gel Extraction Kit: QIAEX-II Suspension, Puffer QX1, PE, EB TM. Oligotex mRNA Kit: Oligotex Suspension, 2x Binding Puffer, OW2 Waschpuffer, DEPCH2O, Eluationspuffer, Spin-Säulen mit Auffang-Cup. 19.

(28) Material und Methoden. 2.1.11.. Transfektionsreagenz. SuperFectTM Transfektion Reagenz (QIAGEN®). 2.1.12.. Luciferase Assay-Kit. Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System (Promega): mit Luciferase Assay Puffer II, Luciferase Assay Substrat, Stop&Glo®Puffer, Stop&Glo® Substrat (Trocken Produkt), Stop&Glo®Substrat Lösung, Stop&Glo®Reagenzgefäss (leer), Passiv Lysis Puffer 5x. s. auch Kapitel 2.1.6.3 (S.16). 2.1.13.. Computerprogramme. Word, Powerpoint, Excel (Microsoft Software 2002) MacType Version 5.4.2, MacProbe Version 4.0 (Perceptive Scientific Instruments (PSI) Software) PrimerSelect, MegAlign, Mapdraw,EditSeq, SeqManII, GeneQuest (DNA*Star Software Version 5.00). 2.1.14.. Internetprogramme und Datenbanken. Comprehensive Survey of Processed Pseudogenes in Human Genome (Zhang, H. et al., 2003): http://bioinfo.mbb.yale.edu/genome/pseudogene.html FirstEF© (Davuluri et al., 2001): http://rulai.cshl.org/tools/FirstEF/ GeneDoc (Nicholas et al., 1997): http://www.psc.edu/biomed/genedoc HUGO Gene Nomenclature Committee Datenbank (Povey et al., 2001): http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/ Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer (2002). (Mitelman et al., 2002): http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman MGI: Genes and Markers (Eppig et al., 2002; Blake et al., 2003): http://www.informatics.jax.org/ NCBI GenBank-Datenbank, BLAST / 2 BLAST, Spidey, Map Viewer, Locus Link (Altschul et al., 1990): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/static/MVstart.html, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/ RepeatMasker V 7/7/01 (Smit & Green n.v.): http://ftp.genome.washington.edu/RM/RepeatMasker.htm. 20.

(29) Material und Methoden. 2.2. Methoden 2.2.1. Primärzellkultur 2.2.1.1. Pathologisch. Zellkultur von benignen menschlichen Lungenhamartomen begutachtete. Gewebeproben. von. benignen. menschlichen. Lungenhamartomen wurden in 13 ml-Röhrchen mit Hanks-Lösung von den einzelnen Instituten bzw. Praxen zugeschickt. Die Proben wurden folgendermaßen verarbeitet: Tumormaterial wurde mit Pinzette und Skalpell in einer Petrischale zerkleinert, die Tumorstückchen mit 4 ml 0,35%iger Collagenase versetzt und in einer 50 mlZellkulturflasche für ca. vier bis fünf Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 95%iger Luftfeuchte inkubiert. Vereinzelte Tumorzellen wurden mit ca. 4 bis 5 ml Medium 199-20 in einem 13 ml-Röhrchen resuspendiert, für 10 min bei 800 U/min zentrifugiert und das Zell-Pellet mit etwas Überstand vermischt, in ein bis drei 50 ml-Zellkulturflaschen mit jeweils 5 ml Medium 199-20 für 24 h im Brutschrank wie oben inkubiert. Die Anheftung der Zellen am Boden der Flaschen wurde am Phasenkontrastmikroskop überprüft. Pro Woche wurden bei angewachsenen Zellen zwei Medienwechsel durchgeführt, indem das verbrauchte Medium durch jeweils 5 ml frisches, auf 37 °C angewärmtes Medium ersetzt wurde. Falls die Zellen sich nicht angeheftet hatten, wurde die Suspension wiederholt zentrifugiert und das Pellet in die mit frischem Medium 199-20 versetzte Kulturflasche zurückgeführt. Die Inkubation von angewachsenen Zellen erfolgte nach den oben genannten Bedingungen. Konfluente Zellschichten wurden durch Inkubation mit 1 ml 37 °C warmen Trypsin für ca. 5 min wie oben subkultiviert, mit etwas Medium 199-20 resuspendiert und auf zwei bis drei neue mit Medium 199-20 versetzte Kulturflaschen verteilt. Die. Durchführung. der. geschilderten. Methoden. (mit. Ausnahme. der. mikroskopischen Überprüfungen) erfolgte unter sterilen Bedingungen an der Impfbank. Eine erste Aufarbeitung geschah mit den Zellen der ersten Passage gefolgt von zwei bis drei weiteren in den nachfolgenden Passagen.. 21.

(30) Material und Methoden. 2.2.1.2.. Zellkultur von menschlichen Lymphozyten. Zur Durchführung der FISH-Versuche (s. Kapitel 2.2.3.1, S. 23) wurden KurzzeitKulturen von menschlichen Lymphozyten angelegt. Hierfür wurde 1 ml peripheres menschliches Vollblut für 3 Tage in 10 ml Chromosomenmedium B bei 37 °C semisteril kultiviert und anschließend die Metaphasen präpariert.. 2.2.2. Zytogenetische Methoden 2.2.2.1.. Aufarbeitungen Präparation. von. Zellkulturen. zur. Metaphasen. 2.2.2.1.1.. Aufarbeitung von Lymphozyten-(Suspensions-) Kulturen. Nach einer dreitägigen Kultivierung wurde das Vollblut mit 100 µl des SpindelgiftDerivates Colcemide versetzt. und nach einer zweistündigen Inkubationszeit bei 37 °C folgendermaßen weiterverarbeitet: Das Blut wurde bei 1000 U / min 10 min zentrifugiert, das Zell-Pellet einer hypotonen 1/15 M KCL-Behandlung bei 37 °C für 20 min unterzogen und erneut zentrifugiert. Die aufgequellten Lymphozyten-Zellkerne wurden mit 7 ml Fixativ vorsichtig vorfixiert, zentrifugiert, weitere dreimal fixiert und zentrifugiert und als Lymphozytenzellkern-Fixativ-Suspension über Nacht bei -20 °C gelagert. Die Suspension wurde auf 4 °C gekühlte, in dH2O gewässerte Objektträger getropft. Die hierdurch freigelegten Metaphasen wurden für weitere drei Tage bei 37 °C auf den Objektträgern getrocknet. 2.2.2.1.2.. Aufarbeitung von Lungenhamartomen (adherenten Zellen). In dicht bewachsene Kulturflaschen mit einem hohen Mitose-Index wurden 50 µl Colcemid gegeben und nach einer Inkubationszeit von drei bis vier Stunden - wie im Folgenden beschrieben - aufgearbeitet: Die Zellen wurden mit ca. 4 ml 1x PBS gewaschen, mit 1 ml 37 °C warmen Trypsin für 5 min bei 37 °C versetzt und die abgelösten Zellen anschließend mit 5 ml hypotoner, 37 °C warmer Medium 199-Lösung für 20 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert. Zellkerne und Metaphasen wurden mit 5 ml Fixativ vorfixiert und anschließend dreimal mit 10 ml Fixativ fixiert und zentrifugiert bei 1000 U / min für 10 min. Die Tumorzellkern-Fixativ-Suspension wurde über Nacht bei +4 °C aufbewahrt und am nächsten Tag wie in Kapitel 2.2.2.1.1 (S.22) beschrieben auf Objektträger aufgetropft und getrocknet. 22.

(31) Material und Methoden. 2.2.2.2.. GTG-Färbung. Die präparierten Metaphasen von Lymphozyten- bzw. Tumorzellkulturen wurden einer GTG-Banding (modifiziert nach (Seabright, 1971)) zum Zwecke einer Karyotypanalyse unterzogen. Hierzu wurde 15 mg Trypsin in 50 ml 37 °C warmen Sörensen-Puffer für mindestens 6 min gelöst. Die Präparate wurden für 7 sec darin geschwenkt, in einer 2%igen Giemsa-Lösung für 10 min gefärbt und nach dem Spülen in dH2O luftgetrocknet. Eine dauerhafte Konservierung der gebänderten Präparate erfolgte durch freies Eindecken mit Entellan. Präparate für FISH-Experimente (s. Kapitel 2.2.3.1, S. 23) wurden einer leicht modifizierten GTG-Färbung unterzogen: Der chromosomale Proteinverdau erfolgte mit 1,2 mg Trypsin für lediglich 6 sec. Die Präparate wurden 7 min in einer 1%igen Giemsa-Lösung gefärbt. Danach wurden für jedes ChromosomenMapping zehn Metaphasen mit langen, gespreiteten Chromosomen durch den Einsatz einer digitalen Aufsatz-Kamera und der PSI-Software MacType aufgenommen, die Koordinaten festgehalten und bearbeitet. Anschließend wurden die OTs mit einer 70%igen Ethanol-Lösung bei RTemp auf dem Schüttler entfärbt, luftgetrocknet und über Nacht bei 60 °C inkubiert.. 2.2.2.3.. Karyotypanalyse. Es wurden Karyotypanalysen für Lungenhamartome durchgeführt, indem 20 Metaphasen pro Fall von GTG-gefärbten Präparaten (s. Kapitel 2.2.2.2, S. 23) an einem. Durchlichtmikroskop. Karyotypisierungsprogramm. digitalen MacType. aufgenommen (PSI). bearbeitet. und. mit. dem. wurden.. Eine. Bandenauflösung der Chromosomen von mehr als 400 Banden pro hapoidem Karyotyp wurde angestrebt. Fünf der zwanzig Metaphasen wurden am Computer karyotypisiert, die restlichen wurden gezählt und ggf. die Chromosomen an der Aufnahme zugeordnet.. 2.2.3. Molekular-zytogenetische Methoden 2.2.3.1.. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). FISH Experimente wurden zum chromosomalen Mapping der PCR-gescreenten PAC-Klone durchgeführt. Als Präparate wurden Objektträger mit fixierten Metaphasen von menschlichen Lymphozyten verwendet (s. Kapitel 2.2.1.2, S. 22 und 2.2.2.1.1, S. 22). 23.

(32) Material und Methoden. 2.2.3.1.1.. Markierung der Sonden-DNA durch Nick Translation. Die Sonden bestanden aus der isolierten DNA der PAC-Klone COB-032 bzw. CEG-533, in der mittels Nick-Translation Biotin-markierte Nukleotide (Biotin-16dUTPs). oder. Digoxigenin-markierte. Nukleotide. (DIG-11-dUTPs). eingebaut. wurden. Das Labelling wurde nach dem Protokoll des Biotin-/DIG-Nick Translationmix im Handbuch "Nonradioactive in situ hybridization application manual" von Roche Diagnostics durchgeführt. Hierfür wurde 1 µg PAC-DNA mit dH2O auf 16 µl aufgefüllt, mit 4 µl des jeweiligen Nick Translationsmixes versetzt und für 90 min bei 15 °C inkubiert. Die Nick Translation wurde mit 1 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) bei 65 °C / 10 min gestoppt. Das Gemisch wurde letztendlich mit 19 µl TE-Puffer (pH 8,0) verdünnt und bei +4 °C gelagert. 2.2.3.1.2.. In-situ-Hybridisierung. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung wurde modifiziert nach dem Protokoll von Kievits et al. (1990) durchgeführt. Die Präparate wurden 1 h bei 37° mit RNase A verdaut, in 2x SSC gewaschen, mit einer aufsteigenden Ethanolreihe (70% - 80% - 90% -100%, -20 °C) dehydriert und anschließend bei RTemp und danach bei 60 °C getrocknet. Die Chromosomen wurden in einer 70 °C heißen 70% Formamid / 2x SSC-Lösung für genau 2 min denaturiert, in eisgekühlten 2x SSC gewaschen, mit der obigen Ethanolreihe entwässert und bei RTemp und 60 °C getrocknet. Parallel wurden pro OT 8 µl markierte Sonden-DNA mit 4 µl ssDNA, 1 µl humaner Plazenta DNA, 25 µl Formamid, 10 µl Dextransulfat, 2,5 µl 20x SSC und 2,5 µl SSPE vermengt, bei 75 °C für 5 min denaturiert und für weitere 20 min bei 37 °C inkubiert. Dieser Hybridisierungsmix wurde auf Eis bis zum Auftragen auf den OT gekühlt, der schließlich luftblasenfrei abgedeckt und mit Fixogum-Kleber versiegelt über Nacht in einer Feuchte-Kammer bei 37 °C inkubierte. Am nächsten Tag wurden die Präparate mittels einer 42 °C warmen 50% Formamid / 2x SSC-Lösung für 15 min posthybridisiert, in einem gleichwarmen 2x SSC-Bad für 8 min inkubiert, in 1x PBS gewaschen und mit 100 µl 5% NFDM / 4x SSC für 10 min bei 37 °C in einer Feuchtekammer präinkubiert. Färbung der Biotin-markierten Sonden: Präparate wurden mit der FITC-Lösung 1 für 20 min bei 37 °C inkubiert, mit 4x SSC / 0,05% Tween20 und 4x SSC gewaschen, mit 100 µl Anti-Avidin für weitere 20 min versetzt, mit 4x SSC. 24.

(33) Material und Methoden. gewaschen, mit der FITC-Lösung 2 inkubiert und schließlich mit 4x SSC und 1x PBS gewaschen. Färbung der DIG-markierten Sonden: OTs wurden mit 100 µl Anti-Dig-Lösung für 20 min inkubiert und dreimalig mit 1x PBS gewaschen. Anschließend wurden die Präparate im Dunkeln bei RTemp getrocknet, mit ca. 40 µl Antifade-Solution und einem Deckglas bedeckt und nach frühestens 15 min am Mikroskop und Computer ausgewertet. 2.2.3.1.3.. Auswertung. Die Auswertung der FISH-Versuche erfolgte an den zuvor ausgesuchten Metaphasen (s. Kapitel 2.2.2.1.1, S. 22) an einem UV-Durchlichtmikroskop mit digitaler Aufsatzkamera und mit dem Macintosh Programm MacProbe.. 2.2.4. Molekulargenetische Methoden 2.2.4.1.. DNA-Isolierung und Aufreinigung. 2.2.4.1.1.. PAC- Isolierung. Die Isolierung der PAC-Klone COB-032 und CEG-533 erfolgte nach dem "PAC Manual" von Genome Systems. Es wurden 50 ml IPTG-induzierte LB-Kanamycin-Kulturen nach dem Pelletieren in 5 ml GTE-Puffer resuspendiert, bei RTemp vorsichtig mit 150 µl Lysozym für 5 min versetzt, mit 10 ml 0,2 M NaOH / 1% SDS und anschließend mit 7,5 ml 3M KAc vermischt und für 5 min auf Eis inkubiert. Das Gemisch wurde bei 10000 x g für 10 min zentrifugiert und das Pellet mit RNase A und RNase crude Mix für 60 min bei 37 °C verdaut. Die DNA konnte letztendlich durch eine Phenol / ChloroformExtraktion und Isopropanol-Fällung in dH2O gelöst werden. 2.2.4.1.2.. Plasmid-Präparation. Zum Beginn einer Plasmid-Präparation wurden die betreffenden Bakterienklone von LB-Agarplatten oder aus 15%igen Glycerolstocks in 5 oder 6 ml LB-Kulturen mit entsprechenden Antibiotikum überimpft und für ca. 8 bis 13 h bei 37 °C und 500 U/min im Schüttelinkubator inkubiert.. 25.

(34) Material und Methoden. QIAprep® Plasmid Miniprep Diese Präparation wurde bei der Isolierung von bis zu 20 µg Plasmid-DNA angewendet. Die 5 ml Bakterien-LB-Kultur wurde hierfür bei 3700 x g bei 4 °C für 20 min pelletiert und mit dem Puffer P1 resuspendiert. Weitere Arbeitsschritte sind im Protokoll des Handbuchs "QIAprep® Miniprep Handbook" (1998) nachzulesen. QIAGEN® Plasmid Midiprep Mit Hilfe des QIAGEN® Plasmid Midi Kit konnten Plasmid-DNA-Mengen von maximal 100 µg isoliert werden. Die 5 ml Bakterien-LB-Kulturen wurde 1:500 bis 1:1000 mit selektivem LB-Medium auf ein Volumen von 25 ml bei high-copyPlasmiden und 100 ml bei low-copy-Plasmiden verdünnt und für 12 bis 16 h wie die Vorkultur inkubiert. Bei 3700 x g und 4 °C für 20 min wurden die Hauptkulturen anschließend pelletiert und mit dem Puffer P1 resuspendiert. Die nachfolgenden Arbeitsschritte entsprechen dem Protokoll im Handbuch "QIAGEN® Plasmid Purification Handbook" (1998). Aus den jeweiligen 5 bis 6 ml LB-Kulturen wurde ggf. 1 ml zur weiteren Aufbewahrung der Klone in 15%-Glycerolstocks und / oder in Stab-Stocks überführt. 2.2.4.1.3.. Isolierung von genomischer eukaryotischer DNA. Es wurde genomische eukaryotische DNA aus je 70 mg Gewebe bzw. einer mit Zellen dicht bewachsenen Zellkulturflasche in folgender Weise isoliert: Das Gewebe wurde im Mörser bzw. die Zellkulturen mit Trypsin und 1x PBS (s. Kapitel 2.2.1.1, S. 21) homogenisiert, mit 750 µl Zelllysis-Puffer versetzt, gevortext und anschließend mit 83 µl 10%igem SDS versehen. Das Zell-Lysis-Gemisch wurde in 2 x 20 µl Proteinase K 12 h bei 50 °C bzw. 15 min bei 70 °C inkubiert und in 20 µl RNase 1 h bei 50 °C verdaut. Anschließend wurden 125 µl gesättigtes NaCl hinzugegeben, für 30 sec kräftig geschüttelt und bei 2000 x g für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, mit 1 Vol Isopropanol mehrmals vorsichtig invertiert und bei 13000 x g für 3 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 2 ml 70%igem Ethanol einmal gewaschen und nach einer weiteren Zentrifugation ca. 5 bis 10 min luftgetrocknet und die DNA in ca. 200 µl dH2O eluiert. Eine Konzentrationsbestimmung erfolgte photometrisch.. 26.

(35) Material und Methoden. 2.2.4.2.. RNA-Isolierung. Gesamt-RNA-Isolierung Die RNA-Isolierung wurde nach dem Life-Technologies-Protokoll von Trizol LS Reagenz "Instructions for RNA isolation" durchgeführt. Es wurde RNA entweder aus ca. 100 mg grob homogenisiertem Gewebe oder aus Zellen von einer konfluent bewachsenen Kulturflaschen isoliert. Hierbei wurden die Zellen mit 1 ml Trizol für 5 min bei RTemp inkubiert, mit 270 µl Chloroform für 15 sec kräftig geschüttelt und nach einer Inkubationzeit von 15 min bei RTemp für 15 min bei 12000 x g und 4 °C zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde abgenommen und weiterverarbeitet, indem 670 µl Isopropanol zugegeben, geschwenkt, für 10 min bei RTemp inkubiert und für 10 min zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde zweimal mit 1 ml 75%igem, eiskaltem Ethanol gewaschen hierfür bei 7500 x g und 4 °C für 5 min jeweils zentrifugiert, für ca. 5 bis 10 min luftgetrocknet und bei 57 °C im Wasserbad in 60 - 100 µl RNase freiem destillierten Wasser gelöst. Es wurden 6 µl RNA-Lösung für die photometrische Quantifizierung und 2 µl für die gelelektrophoretische Charakterisierung des Eluats separat aufbewahrt. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -80 °C. mRNA-Isolierung Mit dem Oligotex™ RNA Kit von Qiagen erfolgte die mRNA-Isolierung aus Gesamt-RNA. Das Prinzip dieses Vorganges ist die Bindung von mRNAMolekülen an dT30Oligonukleotid-haltige Kügelchen (Oligotex particles), von denen sie mit Hilfe eines Eluationspuffers nach zwei Waschvorgängen letztendlich gelöst werden. Näheres ist dem entsprechenden Protokoll zu entnehmen. Die isolierte mRNA wurde anschließend photometrisch quanitifiziert.. 2.2.4.3.. cDNA-Synthese. Die cDNA-Synthese aus mRNA erfolgte nach dem entsprechenden Gibco BRL Protokoll. Sie diente zur Durchführung von RT-PCRs an menschlichem Testisgewebe. Es wurden 1 µg mRNA und 20 pmol AP2-Primer mittels DEPC dH2O auf ein EndVol von 12 µl gebracht, bei 70 °C für 5 min und auf Eis für 1 min inkubiert, 4 µl 5x Erststrang-Puffer, 2 µl DTT und 1 µl dNTP-Mix A hinzugegeben. Mit einem EndVol von 19 µl wurde der Ansatz durchmischt, 1 min bei 42 °C inkubiert, 1 µl MMLV Reverse Transkriptase bei 42 °C hineinpipettiert und für 30 min bei 42 °C 27.

(36) Material und Methoden. und für 5 min bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurde die cDNA bei -20 °C gelagert. Eine qualitative Bewertung der cDNA erfolgte mittels PCR mit Housekeeping-Primern (s. Kapitel 2.2.4.4.6, S. 30).. 2.2.4.4.. Amplifikation von DNA-Fragmenten durch PolymeraseKettenreaktion (PCR). 2.2.4.4.1.. PCR zur Amplifikation von HMGA cDNA-ähnlichen Sequenzen im menschlichen Genom. Es wurden 25 pM der HMGA1 bzw. HMGA2 cDNA-spezifische Primer HMGA2for1, HMGA2-for2, HMGA2-for3, HMGA2-rev1, HMGA2-rev2, HMGA1-for1, HMGA1-for2 und HMGA1-rev1 für die Amplifikation von genomischen Fragmenten von HMGA-ähnlichen Retrosequenzen verwendet. Als Template-Substrat diente 100 ng genomische menschliche DNA. Die Positiv-Kontrollen bestanden entweder aus 100 fg pET3a Plasmid-DNA mit HMGA2 cDNA-Insert oder aus 250 ng HMGA1 HeLa cDNA. Die PCR wurde jeweils in einem 100 µl-Volumen mit 10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, dNTP-Mix A, 200 nM je Primer und 1 Unit/100 µl Taq DNA Polymerase durchgeführt. Die Amplifikation erfolgte nach einem 5-minütigem Denaturierungsschritt bei 94 °C in 35 Zyklen (1 min Denaturierung bei 94 °C, 1 min Annealing bei 50-60 °C und 2 min Elongation bei 72. °C). und. endete. mit. einem. zusätzlichen. 5-. bis. 10-minütigen. Polymerisationsschritt bei 72 °C. 2.2.4.4.2.. CASH-PCR. Für die Zuordnung von HMGA1 cDNA-verwandten Sequenzen zu menschlichen Chromosomen wurden die Primerpaare HMGA1-for1 / HMGA1-rev1 und HMGA1for2 / HMGA1-rev1 eingesetzt (s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28). Als Template-Substrat diente ca. 1 µg DNA von somatischen Mensch / Nager-Hybrid-Zellen, welche jeweils nur ein menschliches Chromosom beinhalten. Die amplifizierten PCRProdukte wurden in einem 1,2%igem Agarose-Gel aufgetrennt, auf Nylonmembran geblottet und mit einer Digoxigenin-markierten Sonde hybridisiert (s. Kapitel 2.2.4.4.3, S. 28). 2.2.4.4.3.. Generierung von Digoxigenin-markierten Sonden mittels PCR. Die Herstellung einer Digoxigenin-markierten HMGA1 cDNA-spezifischen Sonde erfolgte mit dem Primerpaar HMGA1-for2 / HMGA1-rev2 (s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28). Als Template-Substrat wurde HeLa cDNA verwendet. Die Menge an Dig28.

(37) Material und Methoden. markiertem UTP zu unmarkiertem TTP entsprach dem Verhältnis von 1:3. Als Erfolgskontrolle der PCR wurde das 636 bp-Digoxigenin-markierte DNA-Fragment mit einem unmarkiertem 636 bp-Fragment und einer Negativ-Kontrolle (bidestAnsatz) in einem 2%igem Agarose-Gel aufgetragen und abgeglichen. Der restliche PCR-Ansatz wurde mittels der QIAquick® Spin PCR ProduktAufreinigung (s. Kapitel 2.2.4.6, S. 31) weiter verarbeitet und die Konzentration photometrisch bestimmt. 2.2.4.4.4.. PCR-Nachweis von HMGA1L1 in genomischer Primaten-DNA. Mit Hilfe der Primerpaare HMGA1-for1 / HMGA1L-rev1 und COB-up1 / COB-2184 wurden zwei PCRs zum Nachweis von HMGA1L1 in genomischer Fibroblasten DNA von folgenden Primatenarten durchgeführt: Pan troglodytes (Schimpanse), Gorilla gorilla (Flachland-Gorilla), Hylobates lar (Weißhandgibbon) und Macaca mulata (Rhesusaffe). Genomische menschliche DNA wurde als Positiv- und dH2O als Negativ-Kontrolle verwendet. PCR erfolgte wie in Kapitel 2.2.4.4.1 (S.28) beschrieben mit folgenden Änderungen: 20 µl-Ansätze, Annealing Temperatur: 60°C bzw. 54°C, Elongationsphase 1,5 min bzw. 2,5 min. Das Produkt der zweiten PCR im Ansatz mit Hylobates lar DNA wurde kloniert und partiell sequenziert (s. Kapitel 2.2.4.11, S. 34 / 2.2.4.7, S. 32). 2.2.4.4.5.. PCR zur Herstellung bzw. Überprüfung von DNA-Inserts. Zur näheren Sequenzierung des 3´-Endes des PAC-Klons CEG-533 wurde mit den Primern CEG-1119up und CEG-2028do ein 931 bp langes Fragment amplifiziert, wobei das Annealing für 1 Minute bei 58 °C und Elongation für 2,5 Minuten durchgeführt wurde (weiteres s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28). Für einen Luciferase-Reportergen-Assay wurden drei Fragmente (126 bp, 404 bp, 968 bp) aus dem 5´-Bereich HMGA1L1 mit den Forward-Linker-Primern HMGA1L1-Frag1, -Frag2, -Frag3 (BglII-Schnittstelle) und jeweils dem ReverseLinker-Primer HMGA1L1-Frag-low (HindIII-Schnittstelle) aus COB-032-PAC-DNA amplifiziert (30 Zyklen: Annealing bei 67 – 71 °C, zweiminütige Elongation, weiteres s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28). Anschließend wurden die Fragmente nach Auftrennung im Gel (s. Kapitel 2.2.4.5.1, S. 31) und Eluation mit QiaExII (s. Kapitel 2.2.4.6, S. 31) für den Assay verwendet (s. Kapitel 2.2.4.13, S. 35). Zur Herstellung eines Expressionskonstruktes für HMGA1L1 wurde COBupNd / COBdoE ein 338 bp langes Fragment mit PAC COB-032-DNA als Template 29.

(38) Material und Methoden. amplifiziert (Annealing bei 60 °C, Elongation: 1 Minute, weiteres s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28), welches anschließend im Gel aufgetrennt (s. Kapitel 2.2.4.5.1, S. 31) und mit Hilfe von Qiaquick PCR Purification aufgereinigt wurde (s. Kapitel 2.2.4.6, S. 31). Eine Überprüfung der Ligation und Transformation der oben erwähnten amplifizierten Inserts wurde bei gewachsenen Klonen mit den folgenden Primerpaaren durchgeführt: gleiche Primerpaare wie für Insert-Herstellung bei dem CEG-533-Fragment, dem Hylobates lar HMGA1L1-Fragment aus Kapitel 2.2.4.4.4 (S. 29) und bei den Luciferase-Reportergen-Konstrukten; pET3aSelow / PET3aSeedo für das HMGA1L1 Expressionskonstrukt. Entsprechende Klone wurden mit einer gestopften Pipettenspitze gepickt, in 70 µl bidest gelöst und für 10 min bei 94 °C denaturiert. Die Proben wurden mit 30 µl Mastermix (inkl. Primern) jeweils versetzt und nach der PCR (s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28) mittels Gelelektrophorese überprüft (s. Kapitel 2.2.4.5.1, S. 31). 2.2.4.4.6.. Reverse Transkription (RT)-PCR. Es wurden RT-PCRs a) als Qualitätskontrolle für cDNA-Proben und b) als Transkriptionsanalyse von HMGA1L1 durchgeführt. a) Die Überprüfung der cDNA-Qualität geschah mit einem Primerpaar des Housekeeping-Gens. Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase. (GAPDH). GAPDH-2 / GAPDH-3 und dem Primerpaar des High Mobility Group Proteins 1 (HMG1) 1UTR5up / Lower1do in einem 50 µl-Volumen bei einer Annealing Temperatur von 55 °C (weiteres s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28). b) Die Transkriptionsanalyse von HMGA1L1 erfolgte mit den HMGA1L1spezifischen Primerpaaren HMGA1L-for2 / HMGA1L-rev1 und HMGA1L-for1 / HMGA1L-rev1 an cDNAs von folgendem menschlichen Proben: Fibroblasten, HeLa-Zelllinie, Lymphozyten, Lebertumor, embryonales Gewebe, Testis. Alle Proben wurden aus mRNAs synthetisiert, um die Gefahr einer Kontamination mit genomischer DNA zu verringern. Als Positiv-Kontrolle diente isolierte PACDNA von HMGA1L1 (COB-032) und als Negativ-Kontrolle dH2O. Die Amplifikationszyklen wurden bei der ersten RT-PCR 34 mal (mit einer Annealing Temperatur von 69 °C) und bei der zweiten 29 mal wiederholt (mit einer Annealing Temperatur von 70 °C) (weiteres s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28).. 30.

(39) Material und Methoden. 2.2.4.5.. Auftrennung von DNA-Fragmenten und RNA. 2.2.4.5.1.. Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA. Für. die. gelelektrophoretische. Auftrennung. von. DNA-Fragmenten. aus. Restriktionsverdau (s. Kapitel 2.2.4.10, S. 33) bzw. PCR (s. Kapitel 2.2.4.4.1, S. 28) wurden je nach deren Größe 1 - 2%ige Agarosegele mit 1x TAE-Puffer gekocht. Für die Anfärbung der DNA wurde in das abkühlende, noch flüssige Gel je nach dessen Vol 0,5 bis 1,5 µl Ethidiumbromid Lösung A gegeben. Die DNAMarker und –Proben wurden jeweils mit 1/6 Vol 6x Gelbeladungspuffer vermengt, in die Geltaschen pipettiert und bei einer konstanten Spannung von 2-6 V/cm für 3 bis 20 h in 1x TAE-Puffer aufgetrennt. Der Fluoreszenznachweis der aufgetrennten DNA erfolgte im UV-Durchlicht bei 254 nm und wurde mit einer Polaroid MP-4 Land-Kamera (Blende = 5,6 / Belichtungszeit = 60 - 150 sec) auf Polaroid-Film Typ 665 dokumentiert. 2.2.4.5.2.. Gelelektrophoretische Auftrennung von RNA. Die Auftrennung von RNA im Agarosegel diente der qualitativen Beurteilung der isolierten Gesamt-RNA (s. Kapitel 2.2.4.2, S. 27). Hierfür wurde ein 1,5%iges Agarosegel mit 1x TAE-Puffer gekocht und während des Abkühlens je nach Volumen des Gels mit 1 - 2 µl Ethidiumbromid-Lösung A versetzt. Parallel wurde 2,5 µl RNA-Probe mit 5 µl Formamid gemischt und für 10 min bei 65 °C erhitzt. Der Auftrag in das Gel erfolgte bei den RNA-Proben mit 2 µl Glycerol und bei dem DNA-Marker VI mit 2 µl des DNA Gelbeladungspuffer (6x). Die Ansätze wurden jeweils aufgefüllt auf 10 µl mit 1x TAE-Puffer.. 2.2.4.6.. Aufreinigung und Elution von DNA-Fragmenten. QIAquick® Spin PCR Purification Zur. Reinigung. der. weiterzuverwendenden. PCR-Produkte. von. Primern,. Nukleotiden und Polymerasen wurde das QIAquick PCR Purification Kit verwendet. Es reinigt einzel- und doppelstängige DNA-Fragmente mit einer Größe von 100 bp bis 10 kb. Die Durchführung erfolgte gemäß dem Protokoll im Handbuch "QIAquick® Spin Handbook" (2002).. 31.

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