Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Eignung der interkalierenden Substanzen Ethidiummonoazid und Propidiummonoazid für eine quantitative
Bestimmung lebender Campylobacter-Zellen aus Lebensmittelproben und Wasser mittels real-time PCR
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Diana Seinige
Hannover
Hannover 2014
Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
1. Gutachter/ in: Prof. Dr. med. vet. Corinna Kehrenberg, PhD Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
Univ. Prof. Dr. med. vet. Günter Klein
Institut für Lebensmittelqualität und –sicherheit
2. Gutachter: Prof. Dr. Waldemar Ternes
Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2014
Teile dieser Arbeit wurden durch Mittel des Sanitätsamt der Bundeswehr (Grant M / SAB X / 9A006) gefördert. Die Standardisierung der Methode wurde durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (BMWi) (Fkz-01FS10019) finanziell gefördert.
Publikationsverzeichnis
Die vorliegende Dissertation basiert in überwiegenden Teilen auf den folgenden Publikationen:
Publikation 1:
SEINIGE,D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014):
Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable Campylobacter Cells.
Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2186-92. doi: 10.1128/AEM.03962-13.
Publikation 2:
SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014):
Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples.
PLoS One. 9 (11):e113812. doi: 10.1371/journal.pone.0113812.
Weitere Aspekte der Dissertation wurden in Form von Artikeln, Vorträgen oder Postern präsentiert:
Zeitschriftenartikel:
SEINIGE, D., C. KEHRENBERG, C., KRISCHEK, A. BINDER u. G. KLEIN (2012):
„Nachweis und Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien mit der PCR am Beispiel von Campylobacter spp.“
Wehrmedizinische Monatsschrift 56. Jahrgang. Heft 8-9. August-September 2012, 198-200
Vorträge:
SEINIGE, D., G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2010):
„Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“.
1. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 02.12.2010
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011):
„Untersuchungen zur Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Campylobacter spp. mittels real-time PCR“.
52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.45 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011):
„Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“.
2. Zwischenbericht, Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 16.11.2011
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011):
„Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“.
Vortrag im Rahmen des Kolloquium für Tiergesundheit und Lebensmittelqualität an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 02.12.2011
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012):
„Quantifizierung und Unterscheidung von lebenden und toten Lebensmittelinfektionserregern mittels PCR im Einsatz“.
Vortrag im Rahmen des Workshop I „Workshop Normung von PCR-Verfahren 2012“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 14.02.2012
SEINIGE, D., G. KLEIN, M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE u. C. KEHRENBERG (2013):
Nachweis von Campylobacter spp. aus Wasserproben. Eignet sich die EMA-real- time PCR?
Vortrag im Rahmen des Workshop II „Neue Entwicklungen zu Nachweismethoden und zur Epidemiologie von Campylobacter spp.“ des Instituts für Lebensmittelqualität und -sicherheit der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Hannover, 12.03.2013
SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2013):
Untersuchungen zur Membranintegrität und zum quantitativen Nachweis von Campylobacter aus Wasserproben mittels qPCR unter Anwendung interkalierender Substanzen.
54. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 24.09.-27.09.2013, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S. 62
Poster:
KEHRENBERG, C., A. ABDULMAWJOOD, G. KLEIN u. D. SEINIGE (2011):
„Quantifizierung lebender Campylobacter spp. aus Wasserproben: Eine Evaluierungsstudie mittels EMA-real-time PCR“.
52. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 27.09.-30.09.2011, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.170 SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2011):
„Eignung der Real-time PCR unter Zusatz von interkalierenden Substanzen zur Quantifizierung und Lebend/Tot-Unterscheidung von Campylobacter spp.“.
Tagung der DVG-Fachgruppe „Bakteriologie und Mykologie“, Leipzig, 27.06.- 29.06.2012, Tagungsband S.217
SEINIGE, D., G. KLEIN, C. KRISCHEK u. C. KEHRENBERG (2012):
„Eignung der EMA real-time PCR Methode zur Detektion lebender Campylobacter auf Geflügelfleisch“.
53. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 25.09.-28.09.2012, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.184 SEINIGE, D., M. VON KÖCKRITZ-BLICKWEDE, G. KLEIN and
C. KEHRENBERG (2013):
Applicability of a qPCR method combined with an intercalating dye for detection and differentiation of viable Campylobacter cells from water samples.
FEMS 2013 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, 21.07.- 25.07.2013
Congress Book S. 229 (Nr. 559)
SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN u. C. KEHRENBERG (2014):
Bestimmung der Signalreduktion toter Campylobacter-Zellen mittels qPCR unter Anwendung der Differenzierungsmittel EMA und PMA.
55. Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG, Garmisch, 23.09.-26.09.2014, Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle S.188 SEINIGE, D., C. KRISCHEK, G. KLEIN and C. KEHRENBERG (2014):
A Comparative Study of the Applicability and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatments for a Selective Detection of Viable Campylobacter Cells by qPCR.
3rd EAVLD Congress der European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, 12 to 15 October, 2014, Pisa, Italy.
Abstract Book S. 215 (Nr. 121)
Inhaltsverzeichnis
Publikationsverzeichnis ... I Inhaltsverzeichnis ... V Abkürzungsverzeichnis ... X Tabellenverzeichnis ... XII Abbildungsverzeichnis ... XII
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 3
2.1. Bakterien des Genus Campylobacter ... 3
2.1.1. Historie ... 3
2.1.2. Taxonomie und Merkmale ... 4
2.1.3. Zoonoseerreger Campylobacter: Infektion und Erkrankungen ... 5
2.1.4. Vorkommen von Campylobacter spp. in Geflügelfleisch ... 6
2.1.5. Wasser-assoziierte Campylobacter Ausbrüche ... 7
2.1.6. Vorkommen von Campylobacter spp. in Wasser ... 8
2.1.7. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Campylobacter spp. ... 9
2.2. Kriterien zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien ... 11
2.2.1. Kultivierbarkeit von Bakterien ... 11
2.2.2. Nachweis von mRNA und rRNA ... 14
2.2.3. Bestimmung der Membranintegrität von Bakterien ... 15
2.2.4. Bestimmung der metabolischen Aktivität der Zelle ... 17
2.3. Rechtliche Regelungen zum Nachweis von darmpathogenen Campylobacter spp. ... 19
2.3.1. Problematik beim Nachweis von Campylobacter in Lebensmitteln unter Verwendung der amtlichen Verfahren ... 21
2.4. Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR und real-time PCR ... 23
2.4.1. PCR Nachweise für Campylobacter spp. ... 23
2.4.2. Real-time PCR Nachweise für Campylobacter spp. ... 25
2.4.3. Anwendung der real-time PCR zum Nachweis von Campylobacter spp.
in Geflügelfleischproben und Wasserproben ... 26
2.4.4. Einsatz von interkalierenden Substanzen für real-time PCR Anwendungen ... 27
2.4.5. Nachteile bei der Anwendung interkalierender Substanzen ... 29
2.5. Zielstellung der Studie... 31
3. Material und Methoden ... 33
3.1. Bakterien Stämme und Spezies-Bestimmung ... 33
3.2. Inaktivierung von Campylobacter spp. und Keimzahlbestimmung mittels kultureller Keimzählung ... 34
3.3. EMA- und PMA- Behandlung der Bakterienproben ... 35
3.4. DNA Isolierung und qPCR Experimente ... 35
3.5. Ermittlung der Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung von hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen ... 36
3.6. Testung der EMA-qPCR Methode zum Nachweis lebender Campylobacter- Zellen auf Geflügelfleischproben ... 37
3.7. Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasserproben ... 37
3.8. Testung von Oberflächenwasser-, Leitungswasser-, Mineralwasser- und Regenwasserproben ... 38
3.9. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ... 39
3.10. Statistische Auswertungen ... 39
4. Zusammenfassung der Ergebnisse ... 41
4.1. Kapitel I – Resultate der Methodenentwicklung ... 41
4.1.1. Untersuchungen zur Quantifizierung von Campylobacter spp. mittels einer qPCR-Methode ... 41
4.1.2. Bestimmung des Einflusses von EMA und PMA auf die Ergebnisse der qPCR ... 42
4.1.3. Nachweis lebender Campylobacter-Zellen in Gemischen aus lebenden und hitzeinaktivierten Zellen ... 44
4.1.4. Limitierungen von EMA und PMA bei Verwendung von hitzeinaktivierten Campylobacter-Zellen in der qPCR ... 46
4.1.5. Erstellung von Standardkurven mit Zugabe von EMA und PMA ... 46 4.1.6. Methodenvergleichsuntersuchung zwischen den Ergebnissen aus der
EMA-qPCR und der mikrobiologischen Referenzmethode ... 48 4.2. Kapitel II – Resultate der Anwendung der Methode an Lebensmitteln ... 49
4.2.1. Anwendung der EMA-qPCR zum Nachweis lebender Campylobacter- Zellen auf gespikten Hühnerfleischproben ... 49 4.2.2. Vergleichende Untersuchung der Membranfiltrations- und
Zentrifugations-methode zur Isolierung von Campylobacter-Zellen aus Wasser ... 51 4.2.3. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile
lebender und toter Campylobacter-Zellen bei Verwendung der
Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode ... 51 4.2.4. Ergebnisse der qPCR mit und ohne EMA bei Verwendung der
Zentrifugations- und Membranfiltrationsmethode ... 52 4.2.5. Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der prozentualen Anteile von
lebenden und toten Bakterienzellen in Leitungswasser- und
Oberflächenwasserproben ... 54 4.2.6. Ergebnisse der qPCR und EMA-qPCR zum Nachweis von
Campylobacter-Zellen aus unterschiedlichen Wasserproben ... 55 4.2.7. Nachweis von lebenden Campylobacter-Zellen in unterschiedlichen
Gemischen aus lebenden und toten Zellen bei Verwendung von
Leitungswasserproben ... 57 5. Publikationen ... 59
5.1. Comparative Analysis and Limitations of Ethidium Monoazide and Propidium Monoazide Treatment for the Differentiation of Viable and Nonviable
Campylobacter Cells ... 59 5.2. Influencing Factors and Applicability of the Viability EMA-qPCR for a Detection and Quantification of Campylobacter Cells from Water Samples ... 61 6. Diskussion ... 63 6.1. I. Abschnitt - Methodenentwicklung ... 64
6.1.1. Einfluss von EMA und PMA auf die Resultate der real-time PCR bei Verwendung von lebenden Zellen ... 64 6.1.2. Erklärungsmodelle für Ct-Wert-Verschiebungen in qPCR-Experimenten
nach Einsatz von Differenzierungsmitteln ... 66 6.1.3. Standardkurven zur Bestimmung der Keimkonzentration von
Campylobacter spp. ... 68 6.1.4. Effektivität von EMA und PMA zur Differenzierung von lebenden und
toten Zellen ... 69 6.1.5. Limitierungen bei Verwendung von Differenzierungsmitteln zur
Detektion lebender Campylobacter spp. mittels qPCR ... 70 6.1.6. Ansätze zur Verbesserung der qPCR-Resultate unter Verwendung von
Differenzierungsmitteln ... 72 6.1.6.1. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuchsansätzen, bei denen
eine Vorbehandlung mit EMA durchgeführt wurde ... 72 6.1.6.2. Verbesserung der qPCR-Resultate bei Versuchsansätzen, bei denen
eine Vorbehandlung mit PMA durchgeführt wurde ... 74 6.1.7. Zusammenhang zwischen dem Inaktivierungsverfahren der Bakterien
und den Ergebnissen der qPCR ... 75 6.2. II. Abschnitt - Testung der etablierten EMA-qPCR an Lebensmittelproben ... 78 6.2.1. Geflügel ... 78
6.2.1.1. Möglichkeit der Anwendung der EMA-qPCR Methode bei natürlich kontaminiertem Geflügelfleisch ... 78 6.2.1.2. Einfluss der Lebensmittelmatrix Geflügelfleisch auf die Resultate der
qPCR ... 80 6.2.1.3. Status der Zellintegrität von Campylobacter spp. auf Geflügelfleisch .
... 80 6.2.2. Wasser ... 83
6.2.2.1. Detektion von lebenden Campylobacter-Zellen aus Wasserproben mittels qPCR-Verfahren ... 83 6.2.2.2. Einfluss der Isolierungsmethode auf Campylobacter-Zellen aus
Wasserproben sowie auf die Ergebnisse der qPCR ... 84
6.2.2.3. Einfluss der verwendeten Wasserart für einen Nachweis lebender
Campylobacter-Zellen aus Wasserproben ... 87
6.2.2.4. Limitierungen bei Verwendung von Oberflächenwasser ... 87
6.2.2.5. Testung von Leitungswasser, Mineralwasser und Regenwasser .... 90
6.3. Schlussfolgerung ... 92
7. Zusammenfassung... 93
8. Summary ... 97
9. Literaturverzeichnis ... 101
Danksagung ... 129
Abkürzungsverzeichnis
ANOVA Varianzanalyse (engl.: analysis of variance) BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
bp Basenpaare (engl.: base pairs)
C. Campylobacter
CCDA Kohle Cefoperazon Desoxycholat Agar (engl.: Charcoal cefoperazone desoxycholate agar)
Ct Schwellenwert-Zyklus (engl.: threshold cycle) DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid) DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
EFSA Europäische Behörde für Lebenmsittelsicherheit (engl.: European food safety authority
EMA Ethidiummonoazid g Erdbeschleunigung
KbE Kolonie-bildende Einheiten
l Liter
log10 Dekadischer Logarithmus
LPSN List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature ml Milliliter
MLST Multilocus sequence typing mRNA messenger RNA
µg Mikrogramm
µm Mikrometer
µmol Mikromol NaCl Natriumchlorid
NTU Nephelometrischer Trübungswert (engl.: nephelometric turbidity unit)
p Signifikanz
PCR Polymerase Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction) PMA Propidiummonoazid
qPCR Quantitative real-time PCR
RFLP Restriction fragment length polymorphism RKI Robert-Koch-Institut
RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)
rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: revolutions per minute) rRNA Ribosomale RNA
SD Standardabweichung (engl.: standard deviation) spp. Spezies
UV Ultraviolett
VBNC Lebend, aber nicht kultivierbar (engl.: viable but non culturable)
W Watt
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verfahren zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien ... 18 Tabelle 2: Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR ... 25 Tabelle 3: Signalreduktion in der qPCR bei Verwendung der Differenzierungsmittel
EMA und PMA oder dem Lösungsmittel DMSO (2%) ... 44
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Standardkurve, erstellt aus seriellen Verdünnungsreihen von C. jejuni DSM 4688 in drei unabhängigen Wiederholungen ... 42
1. Einleitung
Bakterien der Gattung Campylobacter (C.) sind in Europa die häufigsten bakteriellen Lebensmittelinfektionserreger und Verursacher der Campylobacteriose beim Menschen (EFSA 2013). Seit mehreren Jahren stehen sie an Platz eins der nach § 7 des Infektionsschutzgesetzes dem Robert-Koch-Institut gemeldeten bakteriellen Durchfallerreger noch vor den Salmonellen-Erkrankungen. Allein im Jahr 2012 wurden 62.880 Erkrankungsfälle in Deutschland gemeldet (RKI 2013), die Zahl an nicht gemeldeten Krankheitsfällen ist vermutlich jedoch noch deutlich höher (EFSA 2011). Die Übertragung des Zoonoseerregers auf den Menschen erfolgt primär durch den Verzehr von schlecht gegartem, kontaminiertem Geflügelfleisch und Kreuzkontaminationen während der Lebensmittelzubereitung. Neben Geflügelfleisch und Geflügelfleischprodukten zählen auch Oberflächengewässer und verunreinigtes Trinkwasser zu den Infektionsquellen (KOENRAAD et al. 1997, SCHÖNBERG- NORIO et al. 2004). Handlungsoptionen zur Reduktion von Campylobacter spp. in der Lebensmittelkette werden in den letzten Jahren europaweit diskutiert (EFSA 2011). Bislang sind jedoch geeignete Minimierungsstrategien sowie Grenzwerte zum Keimgehalt in Lebensmitteln noch nicht in die Gesetzgebung integriert (EFSA 2011, VO EG 2073/2005). Zur Implementierung effektiver Kontrollsysteme und für eine quantitative Risikoanalyse ist es notwendig, geeignete sensitive Detektionsmethoden zur Verfügung zu haben. Diese sollten als Schnellmethode einen quantitativen Erregernachweis ermöglichen und vor allem auch zeitnahe Ergebnisse erzielen, um einen direkten Eingriff in die Lebensmittelsicherheit gewährleisten zu können (BOTTELDOORN et al. 2008).
Ein solcher quantitativer Erregernachweis von Campylobacter spp. wäre hierbei ein wichtiger Schritt zur Prüfung des von einer bakteriellen Kontamination ausgehenden Gesundheitsrisikos von Lebensmitteln. Mit herkömmlichen mikrobiologischen Methoden ist der Erregernachweis jedoch zeitaufwändig und aufgrund der oft nicht einheitlichen Koloniemorphologie sowie des physiologisch anspruchsvollen
Wachstums des Genus Campylobacter zudem stark erschwert (HELLEIN et al.
2012).
Molekularbiologische Nachweismethoden wie die real-time PCR bieten neben hoher Sensitivität und Spezifität den Vorteil schneller Resultate (BEST et al. 2003). In Kombination mit dem Einsatz eines Differenzierungsmittels ist es mit dieser Methode zudem möglich, lebende und somit infektiöse Zellstadien von toten Zellen zu unterscheiden (RUDI et al. 2005). Für viele Bakterienspezies - wie Legionella spp., Helicobacter pylori und Pseudomonas aeruginosa - wurde die Methode bereits erfolgreich getestet (CHANG et al. 2010, AGUSTÍ et al. 2010, HELLEIN et al. 2012).
Der Einsatz der Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung von Campylobacter wurde in ersten Studien durchgeführt, die Ergebnisse wurden jedoch sehr kontrovers diskutiert (FLEKNA et al. 2007, RUDI et al. 2005). Ziel der eigenen Arbeit war es daher, basierend auf diesen Vorstudien eine geeignete quantitative Bestimmungsmethode für die Bakterienspezies C. jejuni und C. coli zu entwickeln, die es ermöglicht, den Keimgehalt lebender Campylobacter-Zellen von den Lebensmittelmatrices Geflügelfleisch und Wasser nachzuweisen. Die Entwicklung einer quantitativen Schnellmethode zum Erregernachweis und zur Quantifizierung stellt daher einen wichtigen Beitrag dar, um zu einer Reduktion von thermotoleranten Campylobacter spp. in der Lebensmittelkette zu kommen. Dieses ist ein wichtiger Schritt für die Lebensmittelsicherheit und den gesundheitlichen Verbraucherschutz.
2. Literaturübersicht
2.1. Bakterien des Genus Campylobacter
2.1.1. Historie
Erstmalig isolierte der Kinderarzt Theodor Escherich im Jahre 1886 bislang unbekannte spiralig gewundene Stäbchenbakterien aus dem Darminhalt von an Diarrhoe erkrankten Kindern im Säuglingsalter. Zwei Jahre später gelang ihm dies auch bei erkrankten Katzenwelpen (ESCHERICH 1886). Er benannte diese Bakterien zunächst aufgrund ihrer gewundenen Form und Beweglichkeit als
„Vibrionen“ und bezeichnete sie mit dem Namen Vibrio felinus. Nachfolgend wurden auch von MC FADYEAN und STOCKMAN (1913) aus Abortmaterial von Schafen und von SMITH und TAYLOR (1919) aus abortierten Rinderfeten und Plazentateilen spiralförmige Bakterien isoliert, die den Namen Vibrio fetus erhielten. JONES et al.
(1931) fanden Vibrionen bei an Winterdysenterie erkrankten Kälbern und DOYLE (1948) im Colon von erkrankten Schweinen. Sie bezeichneten die Bakterien nach ihrem Fundort entsprechend als Vibrio jejuni bzw. Vibrio coli. Beim Menschen gelang die Isolierung von Vibrionen-ähnlichen Bakterien erstmals durch KING im Jahre 1957 aus Blutkulturen von an hämorrhagischer Enteritis erkrankten Patienten. Dieser Vibrio fetus-ähnliche Stamm hatte jedoch ein Wachstumsoptimum bei 42 °C (anstatt 25 °C) und wurde somit als „Vibrio-like“ bezeichnet. SEBALD und VERON (1963) stellten fest, dass sich der Guanin- und Cytosingehalt der DNA dieses Stammes von der Gattung Vibrio unterschied und benannten diese dann mit dem neuen Gattungsnamen „Campylobacter“, abgeleitet aus dem griechischen Wort für
„gebogener Stab“. Jedoch erst Anfang der 70er Jahre mit der Entwicklung von antibiotikahaltigen Selektivmedien (DEKEYSER et al. 1972, SKIRROW 1977) wurden Bakterien des Genus Campylobacter als Enteritiserreger beim Menschen
anerkannt und eine Routinediagnostik der Campylobacteriose ermöglicht (KIST 2002, BUTZLER 2004).
2.1.2. Taxonomie und Merkmale
Bakterien der Gattung Campylobacter sind spiralig bis korkenzieherförmige, gramnegative, sporenlose Bakterien aus der Klasse der Epsilonproteobacteria welche zur Ordnung der Campylobacterales in der Familie der Campylobacteraceae gehören. Die Gattung Campylobacter beinhaltet derzeit 32 Spezies und 13 Subspezies (LPSN), wobei die drei humanpathogenen Spezies C. jejuni, C. coli und C. lari die größte humanmedizinische Bedeutung haben (MAN 2011, RKI 2013).
Campylobacter spp. besitzen eine Länge von 0,5 - 8,0 µm und weisen einen Durchmesser von 0,2 - 0,5 µm auf (VANDAMME et al. 2000). Ihre Beweglichkeit wird mit Hilfe der monotrichen, bi- oder unipolaren Begeißelung ermöglicht (URSING et al. 1994). Campylobacter haben komplexe nutritive Ansprüche. Sie sind chemoorganotroph und können somit keinen Sauerstoff verstoffwechseln, sondern benötigen Nitrat als Oxidans für ihren Energiestoffwechsel (VANDAMME et al. 1991).
Optimale Anzuchtbedingungen herrschen daher bei einer mikroaeroben Atmosphäre von 5 % O2, 10 % CO2 und 85 % N2 (CORRY et al. 1995, GHARST et al. 2013).
Aufgrund der geringen Sauerstoff- und Sauerstoffradikal-Toleranz werden zur Anzucht von Campylobacter spp. Medien verwendet, die Schutzstoffe gegen Sauerstoffradikale beinhalten, wie zum Beispiel Blut, Eisen oder Pyruvat (SILVA et al. 2011). Sie wachsen auf Blut- oder Selektivnährböden, wie z.B. Karmali-Agar oder modifiziertem Charcoal Cefoperazon Desoxycholat Agar (mCCD-Agar) bei Temperaturen von 35,5 °C - 45,0 °C (SIMBERT 1978, SKIRROW und BENJAMIN 1980, SKIRROW 1994). Das physiologische Habitat der Campylobacter- Spezies C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis ist der Darmtrakt von warmblütigen Tieren, insbesondere Vögeln (KETLEY 1997, ABULREESH et al. 2006). Angepasst an die Körpertemperatur dieser Spezies wachsen die thermotoleranten Arten bei einem Temperaturoptimum von 41,5 °C (VANDAMME et al. 2000, ALLOS 2001). Außerhalb des intestinalen Traktes ist die Tenazität jedoch limitiert, so dass eine Vermehrung
der Bakterien auf Lebensmitteln nicht möglich ist (RKI 2011). Das Überleben von Bakterien des Genus Campylobacter bei Kühltemperaturen ist jedoch gut, und ihre Stoffwechselaktivität bleibt bei Temperaturen um 4 °C erhalten (MAZIERO und OLIVEIRA 2010). Obwohl keine Kälteschockproteine synthetisiert werden, können Campylobacter spp. zum Teil auch Tiefkühltemperaturen überleben (SAMPERS et al. 2009).
2.1.3. Zoonoseerreger Campylobacter: Infektion und Erkrankungen
Beim Geflügel zählen Campylobacter spp. zu den Kommensalen des Intestinaltraktes und persistieren dort überwiegend symptomlos (BERRY et al. 1988, WILLIAMS et al. 2013). Sie besiedeln vor allem den Blinddarm der Tiere und werden von dort aus durch Kontaminationen während des Schlachtprozesses auf die Tierkörperoberfläche verbracht (ELLERBROEK et al. 2010). Die Übertragung des Erregers auf den Menschen erfolgt primär durch den Verzehr von schlecht gegartem, kontaminiertem Geflügelfleisch als auch durch Kreuzkontaminationen bei der Lebensmittelzubereitung sowie über direkten und indirekten Kontakt mit infiziertem Geflügel (EFSA 2010). Weitere Infektionsquellen sind Rohmilch, kontaminiertes, nicht aufbereitetes Trinkwasser sowie rohes Hackfleisch. Auch kolonisierte Heimtiere, insbesondere durchfallerkrankte Katzen und Hundewelpen, können den Erreger übertragen (EFSA 2005, RKI 2013). Zudem sind Infektionen durch kontaminierte Oberflächengewässer und Trinkwasser möglich (BLACKBURN et al.
2004, SMITH et al. 2006, PITKÄNEN 2013). Hauptsächliche Verursacher der Campylobacteriose sind die Spezies C. jejuni und C. coli und bei einigen wenigen Fällen wurde C. lari identifiziert (RKI 2013). Überwiegende Symptome dieser Zoonose sind gastrointestinale Beschwerden mit wässrig-blutigen Durchfällen, die in der Regel nach einigen Tagen selbstlimitierend sind. Antibiotikatherapien sind nur in Ausnahmefällen bei schweren Erkrankungen, Bakteriämien oder bei immunsupprimierten Patienten angezeigt (RKI 2011). In seltenen Fällen können neben Enteritiden jedoch schwerwiegendere Langzeitfolgen wie das Guillain-Barré- Syndrom - eine polyneuropathische Erkrankung des Nervensystems - sowie die
reaktive Arthritis auftreten (NACHAMKIN et al. 1998). Die Inkubationszeit beträgt zwischen 1 - 7 Tagen mit einer durchschnittlichen Krankheitsdauer von ca. einer Woche. Eine Erregerausscheidung nach überstandener Erkrankung ist jedoch noch lange möglich und kann bis zu 3 - 4 Wochen andauern (EFSA 2014). Die Infektionsdosis von thermotoleranten Campylobacter wird als sehr gering angenommen und wurde in einer Studie mit 500 Keimen angegeben (ROBINSON 1981, WALLIS 1994). In einer weiteren Studie an freiwilligen Testpersonen wurden von BLACK et al. (1988) eine Dosis von 104 KbE/ml für eine Infektion ermittelt. Die Infektionsdosis ist jedoch abhängig von der Virulenz des Stammes, der Immunitätslage des Menschen sowie von auf die Bakterien einwirkenden Umweltfaktoren (BfR 2007).
2.1.4. Vorkommen von Campylobacter spp. in Geflügelfleisch
Campylobacter spp. kommen bei vielen Haus- und Nutztieren vor, überwiegend jedoch beim Geflügel (NACHAMKIN 2001, HUMPHREY et al. 2007, EFSA 2011).
Zwischen 20 % und 30 % der Campylobacteriosen werden durch den Konsum oder die Verarbeitung von Hühnerfleisch und dadurch ausgelöste Kreuzkontaminationen verursacht (EFSA 2011). Die Nachweisraten von Campylobacter auf Geflügelfleisch im Einzelhandel sind in einer Studie von MADDEN et al. (1998) mit 38 % angegeben worden. Dabei wurden 120 Verbraucherpackungen von Hühnerteilstücken untersucht. ATANASSOVA und RING (1999) wiesen in einer Studie, bei der 509 Proben ausgewertet wurden, in 45,9 % der Broilerkarkassen Campylobacter spp.
nach. ALTER et al. (2004) konnten sogar bis zu 60 % Campylobacter spp. positive Proben auf Geflügelfleischproben im Einzelhandel nachweisen. In einer Studie von KLEIN et al. (2007), bei der 99 Hühnerkarkassen an einem Schlachthof in Deutschland beprobt wurden, waren 51,5 % der Karkassen mit bis zu 6,5 log10 KbE belastet. Die Mehrzahl der Keime befanden sich hierbei nach Studien von CHANTARAPANONT et al. auf der Oberfläche des Geflügelschlachtkörpers (CHANTARAPANONT et al. 2003, CHANTARAPANONT et al. 2004). So wurde auch in einer vergleichenden Studie der Keimzahlbelastung der Oberfläche von
Hühnerfleisch im Vergleich zum Inneren der Produkte eine deutlich höhere Belastung der Oberfläche ermittelt, wobei 2,4 log10 KbE/g nachgewiesen wurden.
Demgegenüber war die Keimbelastung im Inneren der Produkte vernachlässigbar gering, mit Werten um die Nachweisgrenze (SCHERER et al. 2006). Vermutlich spielt somit die Übertragung des Erregers auf den Menschen durch Kreuzkontaminationen oder kontaminierte Oberflächen der Lebensmittel eine größere Rolle als der Verzehr von ungenügend gegartem Geflügelfleisch (SCHERER et al. 2006, BfR 2007).
2.1.5. Wasser-assoziierte Campylobacter Ausbrüche
Neben Geflügelfleisch zählt auch kontaminiertes Wasser zu den Ausbruchsquellen humaner Campylobacteriosen (HÄNNINEN et al. 2003, GUBBELS et al. 2012). Die Kontamination von Wasser kann dabei durch einen Eintrag von Fäzes von Wassergeflügel, Wild- oder Nutztieren und über Kontaminationen von nicht geklärtem Abwasser in Trink- und Oberflächenwasser erfolgen (KOENRAAD et al.
1994, MERRITT et al. 1999, ABULREESH et al. 2006, HELLEIN et al. 2011). Auch starke Regenfälle und damit einhergehende Abschwemmungen von gedüngten Agrarflächen stellen ein Kontaminationsrisiko dar (CLARK et al. 2003, MELBY et al.
1991, RICHARDSON et al. 2007). Im Jahr 1978 wurde erstmalig von einem wasser- bedingten Campylobacter Ausbruch in Vermont, USA, berichtet (HALEY et al. 1980, VOGT et al. 1982). In den darauffolgenden Jahren wurde eine Vielzahl an weiteren Campylobacteriose-Fällen, ausgelöst durch kontaminiertes Trink- und Oberflächengewässer, beschrieben (SACKS et al. 1986, HÄNNINEN et al. 2003, PITKÄNEN 2013). Campylobacter jejuni war in diesen Fällen die am häufigsten nachgewiesene Spezies (GALLAY et al. 2006, SAID et al. 2003, SCHUSTER et al.
2005). Die meisten dieser Ausbrüche wurden in nordeuropäischen Ländern gemeldet (PITKÄNEN 2013). Aufgrund mangelnder oder ungeeigneter Detektionssysteme oder fehlender Testungen kommen in vielen Ländern Campylobacter-Ausbrüche vor, vermutlich jedoch häufiger als bislang beschrieben (PITKÄNEN 2013).
2.1.6. Vorkommen von Campylobacter spp. in Wasser
Neben Geflügelfleisch sind kontaminiertes Trinkwasser oder mit Spülwasser verunreinigte Lebensmittel bedeutend bei der Erregerübertragung (THOMAS et al.
1998). Zudem stellen auch kontaminierte Oberflächengewässer und Badeseen eine mögliche Infektionsquelle dar (KOENRAAD et al. 1997, SCHÖNBERG-NORIO et al.
2004). Viele Studien zur Keimbelastung von Wasser mit Campylobacter sind qualitativer Natur, einige wenige haben jedoch auch quantitative Ergebnisse erzielt (EDGE et al. 2013, HOKAJÄRVI et al. 2013, PITKÄNEN 2013). Im Allgemeinen war bei diesen Studien eine geringe Keimkonzentration zu detektieren. So haben HELLEIN et al. (2012) in einer Studie mittels quantitativer real-time PCR Keimzahlen von 0,14 - 4,6 x 103 Zellenpro ml in Oberflächenwasser nachgewiesen. In anderen Studien wurden Campylobacter Keimkonzentrationen von unterhalb der Nachweisgrenze liegend bis zu 1,0 x 102 Zellen/ml Oberflächenwasser mit der mikrobiologischen Keimzählung bestimmt (RECHENBURG und KISTEMANN 2009, HOKAJÄRVI et al. 2013). In einer vergleichenden Studie von OBIRI-DANSO et al.
(2001) an verschiedenen Campylobacter Spezies wurde berichtet, dass C. lari in Wasser länger überleben kann als C. jejuni oder C. coli. KORHONEN und MARTIKAINEN (1991) bestätigten jedoch für C. jejuni eine längere Überlebensdauer in der kultivierbaren Form in Teichwasser als für C. coli. Die Mechanismen zum Überleben von Campylobacter spp. im Wassermilieu sind bislang wenig bekannt (GONZÁLES und HÄNNINEN 2012). Einflussfaktoren der Überlebensrate in Gewässern sind zum Beispiel die Temperatur, das Sonnenlicht, die Kompetition mit anderen Mikroorganismen sowie der Gehalt an Nähr- und Sauerstoff (THOMAS et al.
1999). Bei niedrigen Temperaturen, wenig Sonneneinstrahlung und geringen Mengen an kompetetiver Begleitflora wird ein Überleben von Bakterien des Genus Campylobacter begünstigt (SVENSSON et al. 2008). In einer irischen und schwedischen Studie wurde zudem berichtet, dass auch das Vorhandensein von Biofilmen oder in Wasser lebenden Protozoen-Arten, wie Arcanthamoeba polyphaga, in denen die Bakterien intrazellulär überleben, das Fortbestehen in der Umwelt sichern können (SNELLING et al. 2005, AXELSSON-OLSSON et al. 2005).
2.1.7. Verfahren zum Nachweis und zur Charakterisierung von Campylobacter spp.
Der Nachweis und die Differenzierung von Bakterien innerhalb des Genus Campylobacter sind häufig mit Schwierigkeiten verbunden. Aufgrund des langsamen, kulturell anspruchsvollen Wachstums und der oft nicht einheitlichen Koloniemorphologie des Erregers ist der kulturelle Nachweis alleine oft nicht möglich (HELLEIN et al. 2012). Die biochemische Speziesbestimmung lässt sich aufgrund der eingeschränkten biochemischen Aktivität von Campylobacter spp. nicht immer eindeutig erbringen, so dass die Reproduzierbarkeit und Standardisierung dieser Methoden schwierig ist (EBERLE und KIESS 2012).
Die Spezies-Bestimmung von Campylobacter kann auf phänotypischen oder genotypischen Merkmalen beruhen (NACHAMKIN et al. 2008). Im Allgemeinen haben genotypische Methoden jedoch eine höhere Differenzierungskraft als phänotypische Methoden und werden aufgrund dessen in zunehmendem Maße eingesetzt.
Bei der phänotypischen Speziesbestimmung werden phänotypisch erkennbare Charakteristika eines Erregers, wie morphologische Merkmale, das Verhalten in der Gramfärbung oder biochemische Reaktionen bestimmt. Mit der biochemischen Differenzierung erfolgt eine Spezieseinteilung der Isolate durch die Analyse ihrer Stoffwechselaktivität (EBERLE und KIESS 2012). Aufgrund der eingeschränkten biochemischen Aktivität von Bakterien des Genus Campylobacter ist diese Methode jedoch nicht immer alleinig für eine Speziesbestimmung aussagekräftig. Typische biochemische Reaktionen zum Nachweis thermotoleranter Campylobacter spp. sind die Oxidase- und Katalase-Reaktion. Eine Möglichkeit zur Differenzierung von Campylobacter coli und C. jejuni kann mittels Hippurat-Hydrolyse erfolgen, dies führt jedoch nicht immer zum sicheren Erfolg (SKIRROW und BENJAMIN 1980).
Die genotypische Speziesbestimmung ist im Allgemeinen verlässlicher und leichter durchführbar als die phänotypische Bestimmung und beruht auf dem Nachweis von speziesspezifischen genomischen DNA-Abschnitten (NIELSEN et al. 2000,
WASSENAAR und NEWELL 2000). PCR-basierte Verfahren zum Nachweis und zur Speziesdifferenzierung von Campylobacter-Isolaten werden aufgrund der hohen Sensitivität und Spezifität sowie der hohen Verlässlichkeit häufig verwendet.
Zur Feindifferenzierung verschiedener Campylobacter-Isolate sind unterschiedliche Typisierungsmethoden etabliert. Bei der Feindifferenzierung, z.B. in epidemiologischen Studien, ist es sinnvoll, mehrere Methoden miteinander zu kombinieren, zum Beispiel die Serotypisierung mit einer genotypischen Methode oder aber zwei unabhängige genotypische Methoden im Vergleich zueinander (WASSENAAR und NEWELL 2000). Bei der serologischen Typisierung mittels
„Enzyme-linked immunosorbend assay“ (ELISA) oder mittels Agglutinationsreaktionen werden mit Hilfe mono- oder polyklonaler Antikörper hitzestabile O-Oberflächenantigene (Methode nach Penner) oder hitzelabile H- Oberflächenantigene (Methode nach Lior) bestimmt (PENNER und HENNESSY 1980, LIOR et al. 1982). Spezies, die zu demselben Serotyp gehören, sind jedoch nicht immer auch genetisch gleich und umgekehrt (WASSENAAR und NEWELL 2000). Zudem können Kreuzreaktionen auftreten (PRESTON und PENNER 1989), so dass die Serotypisierung nicht immer als alleinige Methode zum Erfolg führt. Zur Typisierung von Campylobacter-Isolaten mittels Bakteriophagen kann aufgrund der unterschiedlichen Empfindlichkeit von Isolaten gegenüber Bakteriophagen bzw.
Phagensätzen eine Auswertung von Lysemustern und somit eine Phagen- Typisierung erfolgen (FROST et al. 1999).
Als genotypische Methoden zur Feindifferenzierung haben sich die Makrorestriktion mit anschließender Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), das „fla typing“ und die Analyse von „amplified fragment length polymorphism“ (AFLP) als geeignet erwiesen. Aufgrund einer genetischen Variabilität (intra- und inter-genetische Rekombinationsereignisse, natürliche Transformation) von Campylobacter spp. in Kombination mit Umweltstressoren (WASSENAAR et al. 1998, WASSENAAR und NEWELL 2000) sind für tiefergreifende epidemiologische Studien sequenzbasierte Methoden wie die „single nucleotide polymorphism“ (SNP)-Analyse, die Auswertung von „restriction fragment length polymorphisms“ (RFLP) oder das „multi locus
sequence typing“ (MLST) sicherere Methoden zur Charakterisierung von Campylobacter spp. (FUJIMOTO et al. 1997, WASSENAAR und NEWELL 2000).
2.2. Kriterien zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien
Die Lebensfähigkeit von Bakterien umspannt einen Gradienten, welcher auf der einen Seite aus sich aktiv vermehrenden Zellen besteht und auf der anderen Seite bis hin zu komplett toten Zellen mit Verlust aller Vitalfunktionen reicht (CARON et al.
1998, RUDI et al. 2005). Die direkte Abgrenzung eines exakten Zeitpunktes des Übergangs von lebenden Zellstadien zu toten Keimen ist jedoch oft nur schwer zu definieren (RUDI et al. 2005).
2.2.1. Kultivierbarkeit von Bakterien
Die Kultivierbarkeit und Vermehrungsfähigkeit der Bakterien auf mikrobiologischen Nährmedien wurde lange Zeit als klassisches Kriterium der Lebensfähigkeit herangezogen (KEER und BIRCH 2003). Mit dieser Methode kann die Anzahl lebensfähiger Bakterien jedoch stark unterschätzt werden, da subletal geschädigte Zellen (BLACKBURN und MCCARTHY 2000), physiologisch anspruchsvoll wachsende Bakterien (WARD et al. 1990) und lebende, jedoch nicht kultivierbare Bakterienstadien (VBNC) hierbei nicht immer detektiert werden (KEER und BIRCH 2003). Zudem ist die Wiederfindungsrate der Bakterien abhängig vom gewählten Nährmedium und eine Bestimmung der Konzentration an toten Zellen in der Probe ist hiermit nicht möglich (RUDI et al. 2005).
Zur Differenzierung lebender und toter Zellstadien sind daher alternative Methoden entwickelt worden, die auf der Detektion unterschiedlicher Vitalparameter der Zelle beruhen. Hierzu zählen die zelluläre Integrität, der Energiestatus, die Persistenz von Nukleinsäuren sowie Parameter der metabolischen Aktivität der Zelle (KEER und BIRCH 2003, FITTIPALDI et al. 2012).
Lange Zeit galten Bakterien als tot, wenn es nicht mehr möglich war, sie auf herkömmlichen mikrobiologischen Medien zu kultivieren. Erstmalig beschrieben XU et al. (1982) ein Stadium, das als „viable but nonculturable“ (VBNC) bezeichnet wurde, in dem die Bakterien zwar kulturell nicht mehr anzuzüchten sind, sie aber aufgrund von vorhandener metabolischer Aktivität noch lebensfähig sind und somit auch für den Menschen als potentiell infektiös gelten (OLIVER 2005, FAKRUDDIN et al. 2013). Zellen treten in dieses Stadium über, wenn sie subletalen Umweltstressoren ausgesetzt sind, wie zum Beispiel einem erhöhtem Sauerstoffgehalt, Nährstoffmangel, suboptimalen Temperaturen, weißem Licht oder osmotischem Stress (OLIVER 2005), um somit einem möglichen Zelltod zu umgehen. Neuere Studien vermuten, dass die Bildung von VBNC-Stadien ein Teil des komplexen „cold shock response“ der Bakterien ist und die fehlende Kultivierbarkeit als ein Nebeneffekt der gesteigerten Sensitivität gegenüber toxischen Peroxiden in herkömmlichen Kulturmedien auftritt (PHADTARE 2004). Neben dem Genus Campylobacter sind bislang über 61 weitere, teils humanpathogene, Bakterienspezies beschrieben worden, die dieses Zellstadium eingehen können, wie zum Beispiel Escherichia coli, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes oder einige Salmonella-Spezies (OLIVER 2005, OLIVER 2010, AGUSTÍ et al. 2010). Bei allen beschriebenen Spezies handelt sich um nicht sporenbildende Bakterien, die in Form des VBNC-Stadiums eine Möglichkeit des Überlebens unter schlechten Umweltbedingungen gefunden haben. Die Zellen zeigen in diesem Stadium morphologische Veränderungen wie eine geschrumpfte, kokkoide Form. Die Integrität der Zellmembran scheint jedoch nicht verändert. Sie besitzen ein hohes Membranpotential (SIGNORETTO et al. 2000), eine herabgesetzte Stoffwechselaktivität, jedoch einen gesteigerten ATP-Gehalt, der in toten und geschädigten Zellen rasch absinkt (SIGNORETTO et al. 2002, OLIVER 2005, OLIVER 2010, FAKRUDDIN et al. 2013). Die Genexpression ist ungestört und somit ist eine Reaktion auf externe Stimuli möglich (KELL et al. 1998, MAALEJ et al. 2004).
Die Zellwand dieser Stadien weist Veränderungen auf. Sie besitzt höhere Querverbindungen der Peptidoglykane, vermehrte Muropeptide, die kovalent gebundene Lipoproteine beinhalten und ein verändertes Protein-Profil der äußeren
Zellmembran (SIGNORETTO et al. 2002, MUELA et al. 2008). VBNC-Zellen haben zudem eine höhere autolytische Aktivität und können eine gesteigerte Antibiotikaresistenz aufweisen, vermutlich resultierend aus der herabgesetzten metabolischen Aktivität der Zelle (OLIVER 2010). Die Integrität der Zellmembran von VBNC-Stadien ist ein bislang wenig erforschtes Thema. Einige Autoren wie ZHENG et al. (1999) und WILLÉN et al. (2000) beschrieben jedoch kokkoide VBNC- Zellformen der Gattung Helicobacter pylori, die in elektronenmikroskopischen Studien eine intakte Bakterien-Doppelmembran aufweisen.
Die Fähigkeit zur Regeneration der VBNC-Zellen mit erneuter Kultivierbarkeit ist nach Bereitstellung optimaler Wachstumsbedingungen möglich (OLIVER 1995, WHITESIDES und OLIVER 1997, OLIVER 2010). Die Virulenz der VBNC-Stadien wird in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert und ist am besten für die Gattung Vibrio belegt. Einige Autoren bescheinigen eine Pathogenität der regenerierten VBNC-Zellen im Tiermodell nach Erlangung der vollen Stoffwechselaktivität der Zelle. OLIVER und BOCKIAN (1995) injizierten Mäusen VBNC-Zellen von Vibrio vulnificus, die daraufhin an der Infektion starben. SUN et al. (2008) bestätigten die Virulenz für Vibrio harveyi. Auch für die Bakterien des Genus Campylobacter ist ein infektiöses Potential bescheinigt. Eine Kolonisierung durch VBNC Stadien von Campylobacter spp. ist im Mausmodell (BAFFONE et al. 2006), im bebrüteten Hühnerei (CAPPELIER et al. 1999) sowie im Huhn (STERN et al. 1994) belegt worden. Beim Menschen gelang zudem eine in vitro Infektion humaner Caco-2 Zellen mit VBNC-Stadien des Genus Campylobacter (CHAISOWWONG et al. 2012).
In einer neuen Studie von PATRONE et al. (2013) wurde mittels einer dreiwöchigen Inkubationsperiode von C. jejuni-Zellen in Frischwasser bei einer Temperatur von 4 °C das VBNC-Stadium der Zellen induziert. Es konnte anschließend gezeigt werden, dass die Zellen die Fähigkeit zur Adhäsion an intestinale Epithelzellen beibehalten. Aus diesen Resultaten wurde vermutet, dass die VBNC-Zellen ihre Infektiösität wiedererlangt haben (PATRONE et al. 2013).
VBNC-Zellen stellen somit ein Reservoir an potentiell infektiösen Bakterienstadien in der Umwelt dar und sind eine nicht zu unterschätzende Gefahr für die humane Bevölkerung (FAKRUDDIN et al. 2013).
2.2.2. Nachweis von mRNA und rRNA
Methoden zum Nachweis des Vitalitätsstatus der Zelle werden oftmals mittels Färbung von Nukleinsäuren oder der Hybridisierung geführt (CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Die Amplifizierung von DNA mittels PCR ist allerdings kein geeigneter Indikator zur Detektion der Lebensfähigkeit einer Zelle, da die DNA nach dem Tod der Zelle noch für längere Zeit persistiert (MASTERS et al. 1994). Alternativ kann jedoch hierfür der Nachweis von RNA anstatt von genomischer DNA erfolgen, denn im Gegensatz zu letzterer werden RNA Moleküle nach dem Zelltod rasch abgebaut (ALIFANO et al. 1994, FITTIPALDI et al. 2012). Der Fokus des RNA-Nachweises wird dabei auf den Nachweis von mRNA gelegt, da es sich hierbei um hoch labile Moleküle mit einer sehr geringen Halbwertszeit von einigen Sekunden handelt, welche ausschließlich von metabolisch aktiven Zellen synthetisiert werden (BLEVE et al. 2003, KEER und BIRCH 2003, MORIN et al. 2004). Somit ist eine Unterscheidung lebender, metabolisch aktiver Zellen mittels mRNA Molekülen dem reinen Nachweis der stabileren DNA Moleküle überlegen (FITTIPALDI et al. 2012). Ein Nachteil bei der Arbeit mit mRNA ist jedoch die Schwierigkeit bei der Bearbeitung und dem Umgang mit der mRNA. Durch die hohe Labilität der Moleküle, kann es häufiger zu Degradierungen durch unzureichende Lagerung oder Bearbeitung oder durch die Kontamination mit RNA-abbauenden Enzymen kommen, so dass der Umgang mit den Proben erschwert werden kann. Die Expression von mRNA ist zudem abhängig vom physiologischen Status der Zelle. Bei langsam wachsenden Bakterien oder metabolisch inaktiveren Zellstadien kann die mRNA Konzentration unterhalb der Detektionsgrenze der „Reverse Transkriptase“ (RT)-PCR liegen und somit falsch negative Resultate erzeugen (FITTIPALDI et al. 2012). Außerdem können in Proben mit hohen Konzentrationen an toten Zellen (>104 Zellen/ml) falsch positive
Ergebnisse durch Reste von übriggebliebenen mRNA-Transkripten entstehen (SHERIDAN et al. 1998, VAITILINGOM et al. 1998, FITTIPALDI et al. 2012).
Neben mRNA ist auch der Nachweis von ribosomaler RNA als Indikator für lebende Zellstadien verwendet worden (KEER und BIRCH 2003). Ein Vorteil gegenüber der mRNA ist das Vorliegen einer hohen Kopienzahl in der Zelle, so dass eine hohe Sensitivität des Assays erzielt werden kann.
Zum Nachweis und zur Quantifizierung von RNA wurden die Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) sowie die „nucleic acid sequence based amplification“ (NASBA) in verschiedenen Studien eingesetzt (UYTTENDAELE et al. 1997, MCKILLIP et al.
1998, DREIER et al. 2004, CHURRUCA et al. 2007, CENCIARINI-BORDE et al.
2009). Der rRNA-Nachweis unter Verwendung dieser Methoden war in einigen Studien allerdings nur erfolgreich bei extremen Abtötungsmethoden, wie dem Autoklavieren oder bei Einsatz von antimikrobiellen Chemotherapeutika (MCKILLIP et al. 1998, SHERIDAN et al. 1998, YARON und MATTHEWS 2002, CENCIARINI- BORDE et al. 2009). Das Detektionslimit für den Nachweis der RNA mittels RT-PCR wurde in einer Studie von Rudi et al. (2005) mit 3 log10 Zellen/g angegeben. Die Primerauswahl sowie die Targetlänge bei der RT-PCR sind weitere Einflussfaktoren, die beim Nachweis der rRNA die Resultate stark beeinträchtigen können (VAN DER VLIET et al. 1994, VILLARINO et al. 2000, YARON und MATTHEWS 2002, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Längere Amlikons zeigten sich dabei in Studien von MCCARTY und ATLAS (1993) als besser geeignet zur Bestimmung des Vitalitätsstatus der mit Chlor behandelten Zellen als die Verwendung kurzer Amplifikate.
2.2.3. Bestimmung der Membranintegrität von Bakterien
Methoden zur Bestimmung der Membranintegrität der Zellen sind häufig verwendete Verfahren zum Nachweis der Lebensfähigkeit von Bakterien (FITTIPALDI et al. 2012, NOCKER et al. 2006, RUDI et al. 2005, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Aufgrund der hydrophoben Eigenschaften der Phospholipidschicht von Zellmembranen ist es
geladenen oder polaren Molekülen daher nur möglich sie zu passieren, wenn sie eine delokalisierte Ladung besitzen (CAO-HOANG et al. 2008). Die Penetration ionisierter Substanzen, wie EMA und PMA, durch die Zellmembran kann somit ein Indikator für den Verlust der zellulären Membranintegrität sein (Farbstoff-Exklusions- Methode) (CAO-HOANG et al. 2008). Fluorophore Farbstoffe wie Propidiumiodid (PI), TO-PRO-3, Hexidiumiodid, SYTOX green oder 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) werden eingesetzt, um die Membranintegrität der Zelle darzustellen (LLOYD und HAYES 1995, NOVO et al. 2000, VIVES-REGO et al. 2000). Ein häufig verwendetes Kit für die Differenzierung lebender und toter Zellen („Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit“) mittels Fluoreszenzmikroskopie beinhaltet die Farbstoffe Propidiumiodid und SYTO9, welches eine Kombination aus den beiden Farbstoffen SYTOX green und SYTO59 ist (ROTH et al. 1997, CAO-HOANG et al.
2008). Der DNA-Farbstoff SYTO9 färbt dabei alle Zellen in der Probe grün an, wohingegen Propidiumiodid selektiv in membrangeschädigte, tote Zellen eindringt und diese rot anfärbt. Für die Auswertung der Ergebnisse dieses Assays ist ein Fluoreszenzmikroskop mit zwei optischen Detektionskanälen nötig. Das Detektionslimit diese Verfahrens wird mit 3 log10 Zellen/g angegeben (RUDI et al.
2005). Dieses lebend-/tot-Kit ermöglicht jedoch keine Unterscheidung zwischen Bakterien unterschiedlicher Spezies und ist somit nicht alleinig für einen Einsatz in der Routinediagnostik an Lebensmittelproben geeignet (RUDI et al. 2005).
Um eine Differenzierung lebender und toter Zellen in Kombination mit der Anwendung der real-time PCR zu erzielen, wurden im Jahr 2003 von NOGVA et al.
DNA interkalierende Farbstoffe wie Ethidiummonoazid (EMA) erstmalig verwendet.
Drei Jahre später erfolgte die Anwendung des weiter entwickelten Moleküls Propidiummonoazid (PMA) von NOCKER et al. (2006). Die Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen mit Hilfe dieser Farbstoffe basiert auf der Membranpermeabilität der Zellen (FITTIPALDI et al. 2012). Bei ihrer Anwendung werden die Substanzen der Zellsuspension vor der PCR zugesetzt und binden nach Photoaktivierung selektiv und irreversibel an die DNA membrangeschädigter, toter Zellen. Die Membranen intakter, lebender Zellen bilden eine Barriere und werden nicht durchdrungen. Ist eine Bindung der Substanz an DNA erfolgt, kann diese in der
darauffolgenden PCR nicht mehr amplifiziert werden. Somit erfolgt ein Nachweis ausschließlich von DNA von vormals membranintakten, lebenden Zellen (RUDI et al.
2005, CENCIARINI-BORDE et al. 2009, FITTIPALDI et al. 2012).
In einer Studie von RUDI et al. (2005) zur Differenzierung lebender und toter Campylobacter jejuni lag die Nachweisgrenze der EMA-qPCR im Vergleich zur RNA Bestimmung sowie dem „BacLight-Kit“ bei 2 log10 Zellen/g und war somit sensitiver als die letztgenannten Methoden.
2.2.4. Bestimmung der metabolischen Aktivität der Zelle
Direkte Indikatoren zur Beurteilung der Vitalität einer Zelle sind die Detektion der respiratorischen Aktivität mittels Hydrolyse von 5-Cyano-2,3-ditotyltetrazoliumchlorid (CTC) unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie oder der Durchflusszytometrie sowie die Bestimmung der Resonanzfähigkeit der Zelle auf Umwelt- und Substratfaktoren mittels „direct viable count-assay“ (DVC-Assay) (NWOGUH et al.
1995, KEER und BIRCH 2003, RUDI et al. 2005, NOCKER und CAMPER 2009). Bei diesem DVC-Verfahren wird mit einem Revitalisierungschritt gearbeitet, bei dem den Zellen ein DNA-Gyrasehemmer, wie z.B. Nalidixinsäure zugegeben wird. Dieser führt in der angewendeten Konzentration zur Inhibition der Zellteilung und dadurch zur Elongation der Zellen, ohne jedoch die metabolische Aktivität der Zelle zu beeinflussen (KOGURE et al. 1979, BESNARD et al. 2000, CENCIARINI-BORDE et al. 2009). Durch das Wachstum der lebenden Zellen mit daraus resultierender Zell- Elongation können sie morphologisch von nichtbeeinflussten, toten Zellen unterschieden werden (NOCKER und CAMPER 2009). In Kombination dieser Technik mit der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-16S rRNA Detektion war es einigen Autoren möglich, lebende, kulturfähige Zellen von lebenden, aber nicht kultivierbaren Zellen (VBNC) zu unterscheiden (BAUDART et al. 2002, REGNAULT et al. 2000, ARMISEN et al. 2004, CENCIARINI-BORDE 2009). Die verschiedenen Methoden zur Differenzierung lebender und toter Bakterien sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Verfahren zur Differenzierung von lebenden und toten Bakterien
2.3. Rechtliche Regelungen zum Nachweis von darmpathogenen Campylobacter spp.
Die EFSA dokumentierte im Jahr 2012 europaweit über 200.000 Fälle von Campylobakteriose beim Menschen (EFSA 2014 b). Die Zahl an Krankheitsfällen, die nicht den zuständigen Behörden gemeldet wurden, ist vermutlich jedoch noch wesentlich höher. Schätzungen zufolge beträgt demnach die Gesamtzahl der Erkrankungen in der EU etwa 9 Mio. Fälle pro Jahr (EFSA 2011). Die aus diesen Erkrankungsfällen resultierenden Kosten für das europäische Gesundheitssystem sind beträchtlich und werden auf etwa 2,4 Milliarden Euro geschätzt (EFSA 2011, EFSA 2014 a, EFSA 2014 b). Für die Überwachung und Prävention dieser Infektionskrankheit ist daher in Deutschland seit dem Jahr 2001 der Nachweis von darmpathogenen Campylobacter-Spezies nach § 7 des Infektionsschutzgesetzes (IfSG) meldepflichtig, sofern eine akute Infektion anzunehmen ist (IfSG 2013).
Gesonderte Regelungen bestehen darüber hinaus für Mitarbeiter der Lebensmittelproduzierenden und -verarbeitenden Betriebe. Für diese sind der alleinige Krankheitsverdacht sowie die Erkrankung gemäß § 6 IfSG meldepflichtig, wenn die betreffende Person eine Tätigkeit in einem Lebensmittelbetrieb nach § 42 IfSG ausübt (IfSG 2013). Weiterhin gilt ein Tätigkeitsverbot im Falle eines Krankheitsverdachts oder bei bestehender Campylobacter-Infektion (§ 42 IfSG 2013).
Da die Infektion des Menschen mit Bakterien des Genus Campylobacter größtenteils über kontaminierte Lebensmittel erfolgt, sind der Erregernachweis und die Quantifizierung im Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB) rechtlich geregelt. Hierzu sind in der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 LFGB zwei verschiedene Methoden beschrieben. Ein mikrobiologischer qualitativer und quantitativer Nachweis des Erregers sowie ein molekularbiologischer, qualitativer Nachweis von spezifischen Genabschnitten des Erregers. Das mikrobiologische Nachweisverfahren wird als ein
„horizontales Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von Campylobacter spp. in
Lebensmitteln“ bezeichnet und basiert auf einem Anreicherungsschritt mit nachfolgender Erregeridentifizierung und –bestätigung (§ 64 LFGB). Mit diesem Nachweisverfahren erfolgte die Übernahme der gleichnamigen DIN EN ISO 10272:2006 in die amtliche Methodensammlung nach § 64 LFGB. Das molekularbiologische, PCR-basierte Nachweisverfahren beschreibt einen
„Qualitativen Nachweis von Campylobacter jejuni und Campylobacter coli in Lebensmitteln - durch Amplifizierung spezifischer Gensequenzen mit der PCR“ (§ 64 LFGB). Hierbei wird eine 450 bp große Region des flaA-Gens amplifiziert, wobei jedoch nicht die nahe verwandten Bakterienspezies C. lari, C. upsaliensis, C. butzleri sowie Helicobacter pylori und Escherichia coli mit detektiert werden (OYOFO et al.
1992).
Da Infektionen des Menschen mit Campylobacter spp. auch über kontaminiertes Wasser hervorgerufen werden können, gelten für das Lebensmittel Trinkwasser die rechtlichen Regelungen der Trinkwasserverordnung (TrinkwV 2001). Hierbei sind in
§ 5 TrinkwV die mikrobiologischen Anforderungen beschrieben. Nach § 5 Nr.1 dürfen Krankheitserreger nicht in Konzentrationen vorhanden sein, die eine Schädigung der Gesundheit des Menschen hervorrufen können. Der Grenzwert für die Gesamtkeimzahl in Trinkwasser liegt bei 100 Kolonie-bildenden Einheiten (KbE) pro ml Wasser. Für einige Indikatorkeime wie Escherichia coli, Enterokokken und coliforme Bakterien sind zusätzlich dazu gesonderte Grenzwerte aufgeführt. Diese dürfen in 100 ml Wasser nach Anreicherung der Proben nicht nachweisbar sein. Für den Keimgehalt von Campylobacter in Trinkwasser liegen jedoch derzeit keine gesonderten Grenzwerte vor.
Für die mikrobiologische Qualitätskontrolle von Wasserproben beschreibt die international gültige ISO Norm 17995:2005 den Nachweis und die Zählung von thermotoleranten Campylobacter spp. Bei diesem kulturellen Verfahren zur Bestimmung der Keimkonzentration werden Wasservolumina von 1000 ml, 100 ml, und 10 ml beprobt, um eine semiquantitative Bestimmung mittels „most probable number“ (MPN)-Verfahren zu erzielen. Eine Aufkonzentrierung der Keime in Wasser erfolgt hierbei mittels Membranfiltration. Anschließend wird eine Anreicherung in
hoch selektivem Preston-Medium sowie weniger selektiver Bolton-Bouillon parallel durchgeführt. Nach Inkubation bei 37 °C für 48 Stunden werden die Keime auf modifiziertem Charcoal Cefoperazon Desoxycholat-Agar (mCCD-Agar) ausplattiert und für weitere 48 Stunden bei 41,5 °C bebrütet. Ein negatives Ergebnis kann somit erst innerhalb von 4 Tagen erzielt werden. Bei positivem Erregernachweis schließen sich weitere Bestätigungsschritte an, die die Untersuchungszeit noch um einige Tage verlängern können (ISO 17995:2005, PITKÄNEN 2013).
Trotz der weltweit hohen Zahlen an Campylobacteriose-Fällen sind bislang auch noch keine spezifischen Grenzwerte für Campylobacter-Keimzahlen in Lebensmitteln tierischen Ursprungs verfügbar. Auf europäischer Ebene wurden jedoch im Jahr 2011 von dem Gremium für biologische Gefahren der EFSA „Empfehlungen zur Reduktion von Campylobacter in Hühnerfleisch“ herausgegeben (EFSA 2011). Diese beinhalten Maßnahmen in der Primärproduktion zur Erregerminimierung vor der Schlachtung (z.B. Biosecurity, Fliegengitter, Herabsetzen des Mastalters) und während der Fleischproduktion (z.B. Hygiene, Desinfektion, logistisches Schlachten, Prävention fäkaler Verunreinigungen, Oberflächendekontamination der Schlachtkörper), sowie Einschätzungen zur Wirksamkeit dieser Maßnahmen für den Endverbraucher (EFSA 2011). Anhand dieser Minimierungsstrategien wird eine Reduktion der Erregerhäufigkeit zwischen 50 % und 90 % angestrebt. Ansatzpunkt ist hierbei ein mikrobiologischer Grenzwert von 1000 oder 500 KbE pro Gramm Hautprobe der Karkassen am Schlachthof, wobei bislang 15 % bzw. 45 % der getesteten Chargen in Deutschland (2008) diesen Kriterien nicht entsprechen (EFSA 2011).
2.3.1. Problematik beim Nachweis von Campylobacter in Lebensmitteln unter Verwendung der amtlichen Verfahren
Campylobacter sind kulturell anspruchsvoll wachsende Bakterien und der mikrobiologische Erregernachweis ist daher oft mit Schwierigkeiten verbunden (SOLOMON und HOOVER 1999, BOTTELDOORN et al. 2008). Auch VBNC-Stadien
können bei Verwendung des mikrobiologischen Verfahrens nicht nachgewiesen werden. Zudem benötigt die nach § 64 LFBG vorgeschriebene mikrobiologische Nachweismethode von der Anreicherung bis zum Bestätigungsschritt bis zu 6 - 7 Tage und ist somit sehr zeitaufwändig (JOSEFSEN et al. 2010). Auch das mikrobiologische Nachweisverfahren für die Detektion von Campylobacter spp. aus Wasserproben ist sehr arbeits- und materialaufwändig und zudem auch zeitintensiv (STELMA und WYMER 2012), vor allem wenn quantitative Ergebnisse erzielt werden sollen (PITKÄNEN 2013). Dadurch können Untersuchungsergebnisse von Lebensmittelproben nicht zeitnah ermittelt werden und ein direkter Eingriff in die Lebensmittelsicherheit ist kaum möglich. Das amtlich beschriebene PCR-basierte Verfahren hat zwar den Vorteil einer Zeitersparnis, so dass schnelle Resultate innerhalb von 3 - 4 Stunden erzielt werden können (RUDI et al. 2005, JOSEFSEN et al. 2010), mit dieser Methode ist jedoch eine Unterscheidung zwischen lebenden und somit infektiösen Bakterienstadien und toten Keimen nicht möglich. Rückschlüsse auf die Infektiösität der Lebensmittelprobe für den Konsumenten können mit diesem Verfahren daher nicht geschlossen werden.
Ähnliche Probleme beim kulturellen Nachweisverfahren von Campylobacter spp. aus Wasserproben nach der ISO 17995:2005 Methode haben auch andere Autoren festgestellt. Bei der Detektion von Campylobacter spp. aus Wasser ist die Art der Wasserprobe von zentraler Bedeutung, vor allem wenn eine hohe Konzentration an fäkaler Begleitflora, wie bei Oberflächenwasser oder Abwasserproben, vorhanden sein kann (PITKÄNEN 2013). Diese Begleitflora könnte während der Anreicherung oder direkten Ausplattierung der Proben zu einer kompetetiven Hemmung der Campylobacter-Zellen führen (ABULREESH et al. 2005). Aufgrund dieser Problematik wurde eine Modifikation der ISO 17995:2005 Methode vorgenommen.
Bei Proben mit einer hohen Begleitflora kann zum Beispiel ein höheres Filtrationsvolumen, die Verwendung größerer Filter oder eine Modifikation der Inkubationszeiten einen positiven Erregernachweis erbringen (HIJNEN et al. 2000, HUNT et al. 2001, HÄNNINEN et al. 2003, PITKÄNEN et al. 2009). Diese Methodenanpassungen sollten jedoch für jede Wasserart differenziert etabliert
werden, da sie die Wiederfindungsrate der Bakterien beeinflussen können (KHAN et al. 2009, PITKÄNEN et al. 2009).
Andere Autoren schlugen die Kombination aus der mikrobiologischen Voranreicherung mit einer anschließenden Bestätigung der Isolate mittels PCR- Verfahren vor. Hierbei wurde jedoch keine Quantifizierung der Bakterien durchgeführt. Zur Bestätigung präsumtiver Campylobacter Isolate ist der Einsatz der PCR Methode alternativ zu herkömmlichen Bestätigungsverfahren möglich (PITKÄNEN 2013). Vorteil der Anwendung von PCR-Verfahren zur Bestätigung von Campylobacter spp. ist, dass hierbei keine Reinkulturen der Isolate benötigt werden (PITKÄNEN et al. 2009). Ein weiterer Vorteil beim Einsatz von PCR Verfahren nach selektiver Voranreicherung ist eine Verkürzung der Nachweiszeit der Erreger von mehreren Tagen auf bis zu 5 Stunden (PITKÄNEN 2013). Die Anwendung der PCR Methoden nach Anreicherung der Bakterien kann zudem das Risiko falsch positiver Resultate minimieren, wenn speziesfremde Begleitkeime das Wachstum von Campylobacter spp. auf festen Nährböden verdrängen (PITKÄNEN 2013).
2.4. Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR und real-time PCR Seit Entwicklung der ersten PCR-basierten Methode zum Nachweis von Campylobacter spp. vor über 20 Jahren (OYOFO et al. 1992) finden PCR Methoden in jüngster Zeit immer häufiger Anwendung (GHARST et al. 2013). Herkömmlichen mikrobiologischen Methoden sind sie aufgrund der zeiteffizienten Durchführung und der Möglichkeit zur Detektion von VBNC-Zellen überlegen (ABULREESH et al.
2006).
2.4.1. PCR Nachweise für Campylobacter spp.
Häufig verwendete PCR-basierte Methoden zum spezifischen Nachweis des Genus Campylobacter amplifizieren Zielsequenzen des DNA-Abschnitts, welcher die 16S rRNA kodiert (JOSEFSEN et al. 2004, PERELLE et al. 2004 und HELLEIN et al.
2012), der 23S rRNA (500bp) (ENGVALL et al. 2002) und der 16S-23S rDNA
„internal transcribed spacer region“ (ITS) (KHAN und EDGE 2007). Für den Spezies- spezifischen Nachweis von C. jejuni wird in einigen Studien das Hippurikase-Gen hipO detektiert (DINGLE et al. 2005, PERSSON und OLSEN 2005). DENIS et al.
1999 beschreiben zudem das „membrane-associated protein“-Gen mapA als erfolgreich zum Nachweis von C. jejuni. Zur Identifizierung von C. coli sind Zielsequenzen des ceuE-Gens (Enterocholin-uptake-periplasmic-binding-protein) als erfolgreich dargestellt (SAILS et al. 2003).
„Multiplex“-basierte Nachweisverfahren von WAAGE et al. (1999) und MOORE et al.
(2001) beschreiben die Flaggelin-Gene flaA und flaB als geeignete Zielsequenzen für PCR-Nachweise von C. jejuni, C. coli und C. lari. Eine weitere molekularbiologische Studie von JENSEN et al. (2005) beschreibt das glyA-Gen, welches die Serin Hydroxymethyltransferase codiert, als geeignetes Target zum speziesspezifischen Nachweis von Campylobacter. Vorteil ist hierbei, dass das Gen hoch konserviert ist, jedoch genug Sequenzvariationen für die speziesspezifische Differenzierung von C. jejuni, C. coli, C. lari und C. upsaliensis zeigt (JENSEN et al. 2005). DENIS et al.
(1999) etablierten ein „multiplex“-basiertes Verfahren, welches die Zielgene 16 rDNA (gattungsspezifisch), mapA (C. jejuni) und ceuE (C. coli) zum Nachweis von Campylobacter aus verschiedenen Lebensmitteln amplifiziert. NAYAK et al. (2005) sowie HELLEIN et al. (2011) etablierten eine „multiplex“ PCR zur Differenzierung von C. jejuni und C. coli. Dabei wurde das cadF-Gen zur genusspezifischen Detektion amplifiziert. Für die speziesspezifische Differenzierung wurde das ceuE-Gen (C. coli) verwendet sowie ein bislang undefiniertes Gen, das eine Sequenz-Übereinstimmung von 67 % mit einem Gen zeigt, welches für eine Oxidoreduktase-Untereinheit von C.
jejuni codiert (C. jejuni). Weitere Autoren beschrieben die ORF-C Sequenz (115 bp) (SAILS et al. 2003) sowie das cpn60-Gen (1512 bp) (BANIHASHEMI et al. 2012) als erfolgreiche PCR Targetgene zum Nachweis von Campylobacter spp. in Lebensmittel- und Wasserproben. Die Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2: Zielgene zum Nachweis von Campylobacter spp. mittels PCR
2.4.2. Real-time PCR Nachweise für Campylobacter spp.
Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR Methode, welche in der Regel eine Amplifikation der Ziel-DNA in einem PCR-Thermocycler und eine anschließende Gelelektrophorese und Anfärbung des Amplifikates umfasst, stellt die quantitative real-time PCR (qPCR) eine Weiterentwicklung der Methodik dar. Mit diesem Verfahren ist eine Möglichkeit geschaffen, Campylobacter spp. nicht nur qualitativ nachzuweisen, sondern auch eine quantitative Aussage treffen zu können. Hierbei erfolgt die PCR-Reaktion sowie die Detektion des PCR-Produktes, je nach verwendetem Sondensystem, in einem zeitnahen oder zeitgleichen Schritt, so dass eine aufwändige Auftrennung und Färbung des PCR-Produktes wie bei der konventionellen PCR entfällt. Dabei wird mittels fluoreszenzmarkierter Farbstoffe
