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konnten zeigen, dass die unfolded protein response (UPR), die Hitze-Stress-Antwort und die Glykosylierung die Polymerisation von SRP-2

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Academic year: 2021

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Zusammenfassung

Zusammenfassung

Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist essenziell für die Faltung und post-translationale Modifikation sekretorischer Proteine. Eine Beeinträchtigung dieser Funktion durch Umwelteinflüsse, Alterungsprozesse, oder strukturelle Mutationen verursacht eine Vielzahl von Erkrankungen. Die Ansammlung geschädigter Proteine im ER-Lumen wird durch Regulation der Transkription und Translation sowie durch den selektiven Abbau von Proteinen über ER-associated protein degradation (ERAD) verhindert.

Punktmutationen in dem Serin Protease Inhibitor Neuroserpin führen zu abbauresistenten Proteinaggregaten im ER-Lumen, was mit der neurodegenerativen Erkrankung Familial encephalopathy with neuroserpin inclusion bodies (FENIB) assoziiert wird. Das homologe SRP-2 Protein aus Caenorhabditis elegans weist eine große Ähnlichkeit zum humanen Neuroserpin auf. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass pathogene Punktmutationen (H302R) in SRP-2 ebenfalls zur Anhäufung und Stabilisierung im ER führen. Untersuchungen des Aggregationsverhaltens von SRP-2

H302R

konnten zeigen, dass die unfolded protein response (UPR), die Hitze-Stress-Antwort und die Glykosylierung die Polymerisation von SRP-2

H302R

regulieren.

Der Abbau geschädigter Proteine im ER erfolgt primär über ERAD. Das ERAD-System ist extensiv in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben worden, jedoch ist die physiologische Relevanz in mehrzelligen Organismen wie C. elegans weniger bekannt. Um das ERAD-System grundlegend zu charakterisieren, wurde in dieser Arbeit zunächst mutiertes Pro Cathepsin L (CPL-1*) als Modell- Substrat für fehlerhafte ER-Proteine in C. elegans etabliert. Mittels Immunpräzipitation, Massenspektrometrie und genetischen Screens konnten die E3-Ligase SEL-11, die Protein-Disulfid- Isomerasen PDI-1/2 und das EDEM1 Homolog C47E12.3 als ERAD-Faktoren validiert, sowie die bisher nicht charakterisierten ERAD-Komponenten F48E8.4, Y105E8A.2, F48B9.8 und C03H12.1 identifiziert werden.

Überraschenderweise führten auch Mutationen in den Komponenten der systemischen RNAi Antwort

RDE-1, DRH-1 und RRF-1 zu einer spezifischen Akkumulation des ERAD-Substrats CPL-1*. Eine

Charakterisierung des zugrundeliegenden Mechanismus zeigte, dass RDE-1 und DRH-1 in einem

parallelen Weg zum ERAD-System die Stabilisierung von CPL-1* regulieren. Hierbei kontrollieren diese

nicht den Abbau des Modell-Substrats, sondern das mRNA-Niveau von CPL-1*. Darüber hinaus konnte

gezeigt werden, dass DRH-1 und RDE-1 unter ER-Stress Bedingungen auch das mRNA-Niveau des

Natrium-Protonen-Transporters NHX-2 regulieren. Somit ist in der vorliegenden Arbeit eine neuartige

Regulation sekretierter und membranständiger Proteine in Gegenwart von ER-Stress identifiziert

worden. Im Kontext viraler Infektionen und altersbedingten Erkrankungen tragen diese Erkenntnisse

wesentlich zum molekularen Verständnis pathogener Mechanismen bei.

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Abstract

Abstract

The endoplasmatic reticulum (ER) is essential for the folding and post-translational modification of secreted proteins. A dysfunctional ER as a result of environmental conditions, aging or structural mutations may cause a multitude of diseases. The regulation of translation, transcription and degradation by the ER-associated protein degradation (ERAD) system prevents the accumulation of damaged proteins in the ER-lumen.

Point mutations in the serine protease inhibitor Neuroserpin result in degradation-resistant protein aggregates in the ER-lumen, which are associated with the neurodegenerative disease familial encephalopathy with neuroserpin inclusion bodies (FENIB). The Caenorhabditis elegans homolog SRP- 2 possesses a high degree of similarity to the human Neuroserpin. In this thesis it was shown that also pathogen point mutations (H302R) in SRP-2 result in clustering and stabilisation. Analysis of the aggregation behaviour of SRP-2

H302R

revealed that the unfolded protein response (UPR), the heat-shock response and glycosylation regulate the polymerisation of SRP-2

H302R

.

The degradation of damaged proteins occurs primarily by ERAD. The ERAD-system was extensively studied in the yeast Saccharomyces cerevisiae, however little is known about the physiological relevance in a multicellular organism. In order to characterize the ERAD-System, mutated Pro Cathepsin L (CPL-1*) was established as a model-substrate for misfolded ER-proteins in C. elegans.

Using immunoprecipitation, mass spectrometry and genetic screens the E3-ligase SEL-11, the protein disulfid isomerase PDI-1/2 and the EDEM1 homolog C47E12.3 were validated as ERAD-proteins and the so far uncharacterized ERAD-components F48E8.4, Y105E8A.2, F48B9.8 and C03H12.1 were identified.

Surprisingly, mutations in components of the systemic RNAi response RDE-1, DRH-1 and RRF-1 result

also in a specific stabilisation of the ERAD-substrate CPL-1*. The characterisation of the underlying

mechanism shows that RDE-1 und DRH-1 regulate the stabilisation of CPL-1* in a parallel pathway to

the ERAD-system. However, they do not regulate the degradation of the model-substrate, they rather

control the mRNA-level of CPL-1*. Furthermore it was shown that RDE-1 und DRH-1 also regulate the

mRNA-level of the sodium-proton-transporter NHX-2 in response to ER-stress. In conclusion, this thesis

identified a novel regulation mechanism of secreted and membrane bound proteins in the presence

of ER-stress. These findings may contribute to the molecular understanding of pathogen mechanisms

in the context of viral infections as well as aging related diseases in the long run.

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