Synthesis of Natural DNA Modifications and Their Detection in DNA - Identification and Total Synthesis of a Novel DNA Photolesion

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Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie

der Ludwig-Maximilians Universität München

Synthesis of Natural DNA Modifications and Their Detection in DNA -

Identification and Total Synthesis of a Novel DNA Photolesion

Synthese natürlicher DNA Modifikationen und deren Detektion in DNA -

Identifikation und Totalsynthese eines neuartigen DNA Photoschadens

Martin Werner Münzel aus

Koblenz

2011

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Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek

Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar.

1. Aufl. - Göttingen : Cuvillier, 2011 Zugl.: München, Univ., Diss., 2011 978-3-86955-882-0

Telefon: 0551-54724-0 Telefax: 0551-54724-21 www.cuvillier.de

1. Auflage, 2011

Gedruckt auf säurefreiem Papier 978-3-86955-882-0

Erklärung

Diese Dissertation wurde im Sinne von § 13 Abs. 3 bzw. 4 der Promotionsordnung der LMU München vom 29. Januar 1998 (in der Fassung der sechsten Änderungssatzung vom 16.

August 2010) von Prof. Dr. Thomas Carell betreut.

Ehrenwörtliche Versicherung

Diese Dissertation wurde selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.

München, den 31.05.2011 Martin Münzel

Dissertation eingereicht am: 31.05.2011

1. Gutachter: Prof. Dr. T. Carell 2. Gutachter: Prof. Dr. D. Trauner Mündliche Prüfung am: 15.07.2011

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"No great discovery was ever made without a bold guess."

Isaac Newton

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Parts of this work was already published or presented at conferences Publications

M. Münzel,U. Lischke, D. Stathis,T. Pfaffeneder, F. A. Gnerlich, C. A. Deiml, S. C. Koch, K. Karaghiosoff,T. Carell, in review. Improved Synthesis and Evaluation of Oligonucleotides Containing 5-Hydroxymethylcytosine, 5-Formylcytosine and 5-Carboxylcytosine.

T. Pfaffeneder, B. Hackner, M. Truss, M. Münzel, M. Müller, C. A. Deiml, C. Hagemeier, T.

Carell, Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 7008-7012. Discovery of 5-Formylcytosine in Embyronic Stem Cell DNA.

M. Münzel, D. Globisch, T. Carell, Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50, 6460-6468.

"5-Hydroxymethylcytosine, the Sixth Base of the Genome. (Review Article)

M. Münzel, C. Szeibert, A. F. Glas, D. Globisch, T. Carell, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 5186-5189. Discovery and Synthesis of New UV-Induced Intrastrand C(48)G and G(84)C Photolesions.

D. Globisch, M. Münzel, M. Müller, S. Michalakis, M. Wagner, S. Koch, T. Brückl, M. Biel, T. Carell, PLoS One 2010, 5, e15367. Tissue Distribution of 5-Hydroxymethylcytosine and Search for Active Demethylation Intermediates.

M. Münzel, D. Globisch, C. Trindler, T. Carell, Org. Lett. 2010, 12, 5671-5673. Efficient Synthesis of 5-Hydroxymethylcytosine Containing DNA.

M. Münzel, L. Lercher, M. Müller, T. Carell, Nucleic Acids Res. 2010, 38, e192. Chemical Discrimination Between dC and ^5MedC via their Hydroxylamine Adducts.

M. Münzel, D. Globisch, T. Brückl, M. Wagner, V. Welzmiller, S. Michalakis, M. Müller, M.

Biel, T. Carell, Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2010, 49, 5375-5377. Quantification of the Sixth DNA Base Hydroxymethylcytosine in the Brain.

Patent Application

Patent application EP10191078.4, "Building Blocks and Methods for the Synthesis of 5-Hydroxymethylcytosine Containing Nucleic Acids" Inventors: Thomas Carell, Martin Münzel, filed 2010-11-12.

Further Publications

M. Volgraf, J. P. Lumb, H. C. Brastianos, G. Carr, M. K. Chung, M. Münzel, A. G. Mauk, R. J.

Andersen, D. Trauner, Nat. Chem. Biol. 2008, 4, 535-537. Biomimetic Synthesis of the IDO Inhibitors Exiguamine A and B

C. Gerlach, M. Münzel, B. Baum, H. D. Gerber, T. Craan, W. E. Diederich, G. Klebe, Angew.

Chem., Int. Ed. 2007, 46, 9105-9109. KNOBLE: a Knowledge-Based Approach for the Design and Synthesis of Readily Accessible Small-Molecule Chemical Probes to Test Protein Binding

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Conference Presentations

Oral presentation: "The Sixth DNA Base - Detecting Modified DNA Bases", Roche Symposium - Leading Chemists, Basel, Switzerland, October 2010. (Roche Symposium Award Winner)

Oral presentation: "The Sixth DNA Base", EMBO Conference Chemical Biology, Heidelberg, Germany, September 2010

Poster presentation: "The Sixth DNA Base Hydroxymethylcytosine in the Brain", Frontiers of Chemistry - from Molecules to Systems, Paris, France, May 2010

Oral presentation: "Modified DNA Bases", New Frontiers of (Bio)Chemistry, from Nanopatterning to Toxicity, Garching, Germany, February 2010

Poster presentation: "Hydroxylamine Based Detection of 5-Methylcytosine Sites in DNA", Gordon Conference on Bioorganic Chemistry, Andover, NH, USA, June 2009

Oral presentation: "Investigation of DNA-Hydroxylamine Adducts and their Application in Epigenetic Sequencing" at Bayer Crop Science, Monheim, Germany, May 2009

Poster presentation: "Elucidating the Molecular Mechanism of Hydroxylamine Mutagenesis", Synthesefest - a Celebration of Organic Chemistry, Munich, Germany, March 2009

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Danksagungen

An dieser Stelle möchte ich einigen Menschen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Zunächst danke ich meinem Doktorvater Prof. Thomas Carell, dass er mir die Möglichkeit gegeben hat, in seinem AK meine Promotion anzufertigen. Weiterhin möchte ich für die große wissenschaftliche Freiheit danken, die den Doktoranden gewährt wird. Die hervorragende Ausstattung der Arbeitsgruppe und die stets motivierende Arbeitsatmosphäre sind auch sein Verdienst.

Prof. Dirk Trauner danke ich nicht nur für die Übernahme des Koreferats sondern auch noch einmal dafür, dass ich eine sehr spannende und lehrreiche Zeit in seiner Arbeitsgruppe in Berkeley verbringen durfte. Das dort gewonnene Wissen und die dort gemachten Erfahrungen haben wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Bei den Mitgliedern der Prüfungskommission (Prof. Karaghiosoff, Prof. Biel, Prof. Bracher und Prof. Knochel) bedanke ich mich für die Mitwirkung an der mündlichen Prüfung.

Ich danke Frau Slava Gärtner, Frau Sabine Voss und Frau Kerstin Kurz für ihre Unterstützung in bürokratischen, chemischen und biochemischen Belangen.

Dr. Stylianos Michalakis und Susanne Koch danke ich für eine außerordentlich gute und fruchtbare Zusammenarbeit. Es war eine Freude, mit euch zu arbeiten! Dr. Theo Kraus danke ich für die Bereitstellung interessanter Proben für unsere Messmethode. Auch Dr. Michiel Vermeulen und Nelleke Spruit gebührt ein herzlicher Dank für die gute Zusammenarbeit.

Ein großer Dank geht an Dr. Markus Müller für seine Hilfe bei allen biochemischen Belangen und seinen großen Enthusiasmus bei der Etablierung neuer Methoden und Techniken.

Weiterhin danke ich besonders für Lösung der Kristallstrukturen und natürlich für viele Diskussionen über Wissenschaft und über Gott und die Welt.

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Daniel Globisch danke ich sehr herzlich für die exzellente Zusammenarbeit in den letzten zwei Jahren. Es hat Spaß gemacht, mit dir zu arbeiten! Besonders freue ich mich, dass unsere Freundschaft nie unter der Arbeit gelitten hat.

Besonders möchte ich mich auch bei dem Rest des alten hmC-Teams (Tobias Brückl, Mirko Wagner, Dr. Markus Müller) für die ausgezeichnete und fruchtbare Zusammenarbeit bedanken. Es ist weiterhin sehr schön zu sehen, dass die Arbeit von Toni Pfaffeneder und Benjamin Hackner hervorragend weitergeführt wird.

Bei Tobias Brückl und Christian Trindler möchte ich mich herzlich für die spannenden Diskussionen über die synthetische Chemie und ihre Freundschaft bedanken. Tim Gehrke gebührt ein großer Dank für die Unterstützung in allen möglichen Fragen in der Chemie und Biochemie und für seine ruhige und besonnene Art. Stephanie Schorr danke ich für ihre Hilfe in biochemischen Fragen und für die Organisation von unzähligen Schnitzel-Abenden.

Korbinian Heil danke ich für das Teilen seiner Photoschaden-Kompetenz und viele lustige Diskussionen im Klinikum und Kaffeeraum. Thomas Reißner, Emine Kaya, Andreas Glas, Sabine Schneider und der ganzen Gruppe (besonders meinen ehemaligen Laborkollegen) danke ich für die Unterstützung, für die tolle Arbeitsatmosphäre, für viele lustige Parties und unvergessliche AK Ausflüge.

Ich danke allen HPLC- und Synthie-Beauftragen für ihre hervorragende Arbeit, besonders für ihre Geduld, wenn ich hektisch Sonderwünsche hatte.

Ich danke allen Fußballern (Daniel Globisch, Michael Gattner, Michael Ehrlich, Christian Deiml, Felix Gnerlich), dafür dass ich während der Doktorarbeit nur wenige Kilos zugenommen habe.

Dem Fonds der Chemischen Industrie danke ich für ein Kekulé Stipendium.

Ich danke meinen Praktikanten Claudia Szeibert, Andrea Kneuttinger, Jessica Steinbacher und Amra Mulahasanovic für ihre hervorragende Arbeit. Besonders freue ich mich, dass sich drei von euch entschieden haben, dem AK Carell treu zu bleiben. Großen Spaß hat mir auch die Arbeit mit meinen Masterstudenten Lukas Lercher, Bianca Wöhrl und Claudia Szeibert gemacht. Ich habe viel von euch gelernt.

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Für das Korrekturlesen dieser Arbeit danke ich Dr. Milan Vrabel, Dr. Markus Müller, Christian Deiml, Tim Gehrke, Korbinian Heil, Andrea Kneuttinger, Michael Ehrlich, Stefan Schießer und Helmut Münzel.

Ein unglaublich großer Dank gebührt meinen Eltern, meinen Geschwistern und meinen Großeltern für die Unterstützung in finanzieller und moralischer Form. Danke, dass ihr da seid!

Der letzte und größte Dank geht an meine Freundin Charlotte Borchsenius Meyer, dafür, dass sie für mich ihre dänische Heimat verlassen hat und nach München gezogen ist, dafür dass ich trotz ewigem zu-spät-von-der-Uni-nach-Hause-kommen und permanentem über-die-Arbeit- reden immer das Gefühl hatte geliebt zu werden. Ich hoffe, wir werden immer so glücklich sein, wie in den letzten 3 Jahren!

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Summary

Mammalian DNA is assembled from the canonical nucleosides 2'-deoxyadenosine (dA), 2'-deoxyguanosine (dG), thymidine (dT) and 2'-deoxycytidine (dC), of which only dC can be further modified. The first and for a long time only known modification is methylation at the C(5) position to give 5-methyl-2'-deoxycytidine (^5-MedC). This nucleoside is a key player in epigenetics and has an important role in the regulation of gene expression. Aberrant methylation patterns on DNA are associated with a variety of diseases like cancer and neurodevelopmental disorders. In 2009 two reports described the presence of 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine (^5-HOMedC) in mammalian DNA. Knowledge about this modification is still limited, but evidence is accumulating that it also plays an important role in the epigenetic regulation of gene expression.

To be able to get further insights into the functions of the modified DNA bases a stable isotope dilution method for the parallel quantification of the global levels of ^5-MedC and

5-HOMe

dC was developed based on an existing technique for RNA analysis. The method allows the detection of the modified DNA bases with high accuracy and sensitivity. The general workflow is depicted in Figure 1.

Figure 1: General principle of the stable isotope dilution quantification method.

After DNA is isolated from a tissue, it is enzymatically hydrolyzed to the nucleoside level. To this mixture a specific amount of stable isotope labeled standards of the modified nucleosides is added. After HPLC-MS analysis the comparison of the MS-integrals of the natural and isotope labeled compounds allows a very precise quantification of the natural nucleoside.

The chosen approach requires isotope labeled compounds which had to be synthesized. An overview of the molecules 1-8, which were prepared as standards for mass spectrometry, is given in Figure 2. The key steps of most syntheses were Pd(0) catalyzed functionalizations of 5-iodo-2'-deoxycytidine. For the different compounds a sp²-sp³ coupling with CH/D₃MgI (^5-MedC 1 and [D₃]-^5-MedC 2), a formylation with CO and Bu₃SnH/D (^5-HOMedC 3, [D2]-^5-HOMedC 4 and 5-formyl-2'-deoxycytidine ^5-CHOdC, 6) and an esterification with CO and -TMS-EtOH (5-carboxy-2'-deoxycytidine ^5-COOHdC, 7) were employed.

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Figure 2: Molecules that were synthesized as standards for mass spectrometric analysis.

Once the labeled nucleosides were available, the detection method was used to quantify the amounts of ^5-HOMedC and ^5-MedC in different mouse tissues. The results are depicted in Figure 3A+B and revealed that the levels of ^5-HOMedC are tissue dependent. This was very surprising, because the amounts of ^5-MedC do not show this tissue specificity. The highest ^5-HOMedC- content is clearly found in the central nervous system (CNS). Non-neuronal brain tissues like liver and kidney, but also the pituitary gland exhibit low values of ^5-HOMedC. White matter contains less ^5-HOMedC than gray matter. Taken together, this suggests that a high ^5-HOMedC content is characteristic of neurons and that the presence of the base is possibly connected to neuronal function. The distribution in different tissues and in different cell types could be further validated by immunostaining studies with an antibody that is specific for ^5-HOMedC.

Additionally, the amount of ^5-HOMedC was investigated in healthy and cancerous tissues. To this end 82 brain tumor biopsies and 46 non-cancerous tissues were studied. The results revealed that the ^5-HOMedC content is dramatically reduced in tumors (Figure 3C). This was even the case for gangliogliomas, which stem from neuronal cells. Furthermore, a significant trend could be observed that ^5-HOMedC levels decrease with the tumor grade. These results imply that measurement of the amount of ^5-HOMedC in a tissue could allow the reliable early diagnosis of cancer.

In a further study it was shown that the amounts of ^5-HOMedC increase during brain development (Figure 3D). During the first 20 years the amount raises six-fold and stays constant in adulthood. These findings suggest that ^5-HOMedC plays a role in the maturation of the brain.

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VII Figure 3: Amount of DNA modifications in different tissues. A) ^5-HOMedC content (blue) of mouse tissues. B) ^5-MedC content (yellow) of mouse tissues. C) ^5-HOMedC content in human cancerous and non-cancerous tissue. D) ^5-HOMedC values during brain development. dark blue: gray matter. light blue:

white matter.

On the molecular basis, it was suggested that ^5-HOMedC is an intermediate of an active demethylation pathway. Two conceivable pathways were developed and investigated during the work of this thesis (Figure 4A). ^5-HOMedC could be further oxidized to ^5-CHOdC and

5-COOH

dC, which then decarboxylates to dC. Furthermore, ^5-HOMedC could be deaminated to 5-hydroxymethyl-2'-deoxyuridine (^5-HOMedU), which would be removed by the base excision repair pathway. The search for the putative demethylation intermediates in mouse tissues did.

however, not result in the finding of any of them (Figure 4B). The results show that it is unlikely that ^5-HOMedC only functions as an intermediate of oxidative demethylation but that it rather has important epigenetic functions itself. It cannot be excluded, however, that these demethylation pathways exist.

For the research on modified DNA bases it is essential to have access to oligodeoxynucleotides (ODN) that contain the nucleobases at defined sites. Therefore, phosphoramidite building blocks for the solid phase synthesis of DNA strands which contain the modified bases are needed. During the work for this thesis, phosphoramidites for

5-HOMe

dC, ^5-CHOdC, and ^5-COOHdC were designed, synthesized and successfully incorporated

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into DNA. These now allow detailed biochemical in vitro studies of the modified DNA nucleosides.

Figure 4: A) Putative active demethylation pathways that were studied. B) Amounts of the modified nucleosides in mouse olfactory bulb (70 μg DNA analyzed). The red lines indicate the detection limit.

The LC-MS quantification method allows very precise determination of the global amount of

5-HOMe

dC and ^5-MedC. In many biological problems it is, however, essential to have exact information about the genomic location of the modified base. To address this, a novel method for epigenetic ^5-MedC sequencing was developed. It relies on different coding properties of the hydroxylamine adducts of dC and ^5-MedC (Scheme 1). The adducts preferentially exist in the imino-tautomeric form. In the dC adducts 9 the C(4)=N double bond adopts the E-conformation, which codes like a dT and therefore is mutagenic. Due to the steric strain imposed by the methyl group the ^5-MedC adducts 10 prefer the Z-imino isomers, which are not mutagenic. The methylation status of a cytosine site can therefore be probed by incubation of DNA with a hydroxylamine derivative and subsequent sequencing of the DNA.

Scheme 1: Principle of the ^5-MedC sequencing method. R² = a) H, b) Me, c) Et, d) Allyl, e) tBu, f) Bn

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IX During the work for this thesis different hydroxylamine derivatives were investigated.

Altogether six O-alkyl-hydroxylamine-dC adducts 9a-f were synthesized and incorporated into DNA by solid phase DNA synthesis. Their mutagenic potential was studied by primer extensions, real time primer extensions and a sequencing based mutagenicity assay.

O-allylhydroxylamine proved to be the best suited hydroxylamine derivative for the sequencing method. Sequencing of a part of the p15 promoter was possible after incubation of ODNs with NH₂Oallyl and subsequent pyrosequencing (Figure 5A). The sequencing principle was proven by crystal structures of ODNs in complex with a polymerase (Figure 5B).

Figure 5: A) O-allylhydroxylamine based epigenetic sequencing of a 84 base long stretch of the p15 promoter. B) Crystal structure of a 9d - dA base pair, showing Watson Crick hydrogen bonds.

During attempts to synthesize analogues of the T(6-4)C photoproduct two novel DNA photolesions were discovered in which the N(4) position of dC reacted with the C(8) position of dG (Figure 6). Formation is possible both in 3' and in 5' direction. It was proven that the lesions form both in ODNs that contain the hydroxylamine-dC adduct 9a and in ODNs that only contain the canonical nucleosides. The identity of the compound was unequivocally proven by a total synthesis of the lesion. Key step of the synthesis was a challenging Buchwald-Hartwig coupling of dG- and dC-derived precursors.

Figure 6: Formation of the C(4-8)G photolesion from canonical DNA nucleosides.

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Zusammenfassung

Die DNA von Säugetieren besteht aus den kanonischen Nukleosiden 2'-Desoxyadenosin (dA), 2'-Desoxyguanosin (dG), Thymidin (dT) und 2'-Desoxycytidin (dC). Von diesen kann nur dC weiter modifiziert werden. Die erste und für lange Zeit einzige bekannte Modifikation ist Methylierung an der C(5) Position, die zu 5-Methyl-2'-Deosoxycytidin (^5-MedC) führt. Dieses Nukleosid ist eines der wichtigsten Moleküle in der Epigenetik und spielt in der Regulation der Genexpression eine entscheidende Rolle. Fehlerhafte Methylierungsmuster auf der DNA werden mit Krankheiten wie Krebs und neuronalen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht. Vor weniger als zwei Jahren, im Jahr 2009, erschienen zwei Publikationen, die 5-Hydroxymethyl-2'-desoxycytidine (^5-HOMedC) in DNA nachwiesen. Das Wissen über diese DNA Modifikation ist immer noch begrenzt, aber es verdichten sich die Anzeichen, das auch dieses Nukleosid eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Genexpression spielt.

Während dieser Doktorarbeit wurde eine HPLC-MS Isotopenverdünnungsmethode entwickelt, die es erlaubt, alle modifizierten DNA Basen mit hoher Sensitivität und Genauigkeit zu bestimmen. Das generelle Prinzip der Technik ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Generelles Schema der Isotopenverdünnungsmethode zur Quantifizierung.

Nachdem DNA aus einem Gewebe isoliert wurde, wird sie enzymatisch zu den Nukleosiden verdaut. Im nächsten Schritt wird eine definierte Menge an isotopenmarkierten Nukleosiden zugegeben. Nach HPLC-MS Analyse kann die genaue Menge der DNA Modifikation durch Vergleich der MS-Integrale des natürlichem und isotopenmarkiertem Nukleosids bestimmt werden.

Die gewählte Methode benötigt isotopenmarkierte Nukleoside, weshalb diese während dieser Doktorarbeit synthetisiert werden mussten. Abbildung 2 gibt einen Überblick über die Moleküle, die als Standards für die Massenspektrometrie verwendet wurden. Der Schlüsselschritt der meisten Synthesen war eine Pd(0) katalysierte Funktionalisierung von 5-Iodo-2'-desoxycytidin. So wurde eine sp²-sp³ Kupplung mit CH/D₃MgI (für leichtes und schweres ^5-MedC), eine Formylierung mit CO und Bu3SnH/D (für leichtes und schweres

5-HOMe

dC sowie für 5-Formyl-2'-desoxycytidin ^5-CHOdC) und eine carbonylierende Veresterung mit CO and -TMS-EtOH (für 5-Carboxy-2'-desoxycytidin ^5-COOHdC) verwendet.

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Abbildung 2: Moleküle, die als Standards für die Massenspektrometrie synthetisiert wurden.

Im nächsten Schritt wurden die isotopenmarkierten Verbindungen als Standards in der Quantifizierung von ^5-HOMedC und ^5-MedC in verschiedenen Geweben verwendet. Die Resultate sind in Abbildung 3A+B dargestellt und zeigen, dass die ^5-HOMedC-Werte gewebespezifisch sind. Dies ist insofern überraschend, da ^5-MedC nicht dieses Verhalten zeigt.

Die höchsten ^5-HOMedC Werte wurden im zentralen Nervensystem (ZNS) gefunden.

Nicht-neuronale Gewebe wie Leber, Niere, aber auch die Hypophyse zeigen niedrige Werte.

Weiterhin erhält weiße Substanz im Gehirn weniger ^5-HOMedC als graue.

Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass ein hoher Gehalt an ^5-HOMedC charakteristisch für Neuronen ist und dass das Nukleosid möglicherweise an neuronaler Funktion beteiligt ist. Die Verteilung von ^5-HOMedC konnte weiterhin mit einem spezifischen Antikörper bestätigt werden.

Zusätzlich wurde ^5-HOMedC in Krebsgewebe untersucht. Für diese Studie wurde der Gehalt in 82 Gehirntumorbiopsien und in 46 nicht-kanzerösen Geweben untersucht. Die Resultate zeigten eindeutig, dass die Menge an ^5-HOMedC in Tumorgewebe dramatisch reduziert ist.

(Abbildung 3C). Diese Beobachtung gilt auch für Gangliogliome, die sich aus neuronalen Zellen entwickeln. Weiterhin konnte ein signifikatner Trend, dass ^5-HOMedC Werte mit zunehmenden Tumorgrad abnehmen, beobachtet werden. Diese Resultate legen nahe, dass die Messung von ^5-HOMedC Werten eine zuverlässige Frühdiagnose von Krebs erlauben könnte.

Weiterhin kann man spekulieren, dass reduzierte ^5-HOMedC-Werte der Grund für und nicht nur eine Folge von Krebs ist.

In einer weiteren Messreihe konnte gezeigt werden, dass die Menge an ^5-HOMedC während der Gehirnentwicklung zunimmt (Abbildung 3D). Während der ersten 20 Lebensjahre steigen die Werte um den Faktor sechs und bleiben im Erwachsenenalter konstant. Dies könnte auf eine Role von ^5-HOMedC während der Reifung des Gehirns hindeuten.

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XIII Abbildung 3: Verteilung der DNA Modifikationen in verschiedenen Geweben. A) Menge an ^5-HOMedC (blau). B) Menge an ^5-MedC (gelb). C) Menge an ^5-HOMedC in gesundem Gewebe und in Gehrintumoren. D) ^5-HOMedC Werte während der Gehirnentwicklung. dunkelblau: graue Substanz.

hellblau: weiße Substanz. SSW: Schwangerschaftswoche

Es wurde vorgeschlagen, dass ^5-HOMedC ein Intermediat eines Mechanismus zur aktiven DNA Demethylierung ist. Zwei mögliche Wege wurden in dieser Arbeit postuliert und untersucht (Abbildung 4A). ^5-HOMedC könnte zunächst zu ^5-CHOdC und ^5-COOHdC oxidiert und im letzten Schritt decarboxyliert werden. Alternativ könnte ^5-HOMedC zu 5-Hydroxymethyl- 2'desoxyuridine (^5-HOMedU) deaminiert werden. Dieses Nukleosid würde durch Basenexzisionsreperatur entfernt und durch dC ersetzt. Die Suche nach diesen Demethylierungsintermediaten im Gehirn lieferte jedoch kein Ergebnis (Abbildung 4B). Dies zeigt, dass es unwahrscheinlich ist, dass ^5-HOMedC ausschließlich ein Intermediat der Demethylierung ist. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die oben beschriebenen Reaktionswege existieren. Hier ist die Untersuchung weiterer Zelltypen notwendig.

Für die Forschung an modifizierten DNA Basen ist es sehr wichtig, Zugang zu Oligodesoxynukleotiden (ODN) zu haben, die die Modifikation an einer definierten Stelle tragen. Daher wurden während dieser Doktorarbeit Phosphoramiditbausteine für ^5-HOMedC,

5-CHO

dC, und ^5-COOHdC entwickelt, synthetisiert und via Festphasensynthese in DNA

Synthesis of Natural DNA Modifications and Their Detection in DNA - Identification and Total Synthesis of a Novel DNA Photolesion

Synthesis of Natural DNA Modifications and Their Detection in DNA -

Identification and Total Synthesis of a Novel DNA Photolesion

Synthese natürlicher DNA Modifikationen und deren Detektion in DNA -

Identifikation und Totalsynthese eines neuartigen DNA Photoschadens

"No great discovery was ever made without a bold guess."

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