Zellzyklusproteinen
sowie der pRb-Phosphorylierung
in Tumorzelllinien
vorgelegt von Diplom-Ingenieurin Janine Schmalowsky
aus Berlin
Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Ingenieurwissenschaften - Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. P. Neubauer Berichter: Prof. Dr. R. Lauster Berichter: Prof. Dr. M. Schneider
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 11.06.2009
Berlin 2009 D83
1. EINLEITUNG 1
1.1. Der eukaryotische Zellzyklus 1
1.1.1. Zellzyklus-Regulation und der G1-Restriktionspunkt 3 1.1.2. Zellzyklus-Kontrolle durch das Retinoblastom-Protein 6 1.1.3. Regulation der CDK-Aktivität 9 1.1.4. Cycline und CDKs: Ihre Rolle in der Tumorgenese 11 1.2. CDK-Inhibitoren als Therapeutika von Tumorerkrankungen 13 1.3. Untersuchung der Proteinexpression in der Zelle 17 1.3.1. Autofluoreszierende Proteine 18 1.3.2. „Self-Labeling Protein Tags“ als Alternative zu AFPs 20
1.3.2.1. SNAP-tagTM 20
1.3.2.2. HaloTag® Interchangeable Labeling Technology 21
1.4. Vom Target zum Medikament 23
1.4.1. Automatisierte HCA in der Wirkstofffindung 25
1.5. Ziel der Arbeit 27
2. MATERIAL UND METHODEN 29
2.1. Molekularbiologische Methoden zur Klonierung von CDK2, CDK4,
Cyclin D1 und E1 29
2.1.1. Amplifikation der cDNA-Sequenzen 29
2.1.2. TOPO-blunt Klonierung 33
2.1.3. Kolonie-PCR der pCR®-blunt II TOPO®-Klone 33
2.1.4. Restriktionsverdau 35
2.1.4.1. Restriktionsverdau zur Klonierung in YFP 35 2.1.4.2. Restriktionsverdau zur Klonierung in pSEMS1-26m 37 2.1.4.3. Restriktionsverdau zur Klonierung in pHT2 38
2.1.5. Ligation 39
2.1.6. Hitzeschock-Transformation und Selektion 40 2.1.7. Kolonie-PCR der Transformanden 40
2.1.8. Sequenzbestimmung 42
2.1.9. Präparative Plasmid-Isolierung aus E. coli 42
2.2.1. Co-Immunpräzipitation 43
2.2.2. SDS-Gelelektrophorese 45
2.2.3. Western Blot 46
2.2.4. Immundetektion 46
2.2.5. Nachweis der Substratphosphorylierung im biochemischen
Kinase-Assay 47
2.3. Zellbiologische Methoden 49
2.3.1. Zellkultur 49
2.3.2. Transiente Transfektion von eukaryotischen Zellen 50 2.3.3. Markieren der „self-labeling tags“ 51 2.3.4. Fluoreszenzfärbung von Chromatin 53 2.3.5. Immunfluoreszenzfärbung zellulärer Proteine 54 2.3.6. Lebendzellbetrachtung transfizierter Zellen 55 2.3.7. Test von CDK-Inhibitoren im zellulären Assay 56
2.4. High-Content-Analyse 57
2.4.1. Algorithmus I: Expressionsprofile und Zellzyklusstudien in
Zellpopulationen 60
2.4.2. Algorithmus II: Intrazelluläre Verteilung zellzyklusregulatorischer
Proteine 67
2.4.3. Algorithmus III: Phosphorylierung von endogenem pRb durch Cyclin D1/CDK4 bzw. Cyclin E1/CDK2 71 2.4.4. Algorithmus IV: Intensitätsprofil von Fluoreszenzsignalen 75
3. ERGEBNISSE 77
3.1. Charakterisierung der Expressionsplasmide: pPhi-Yellow-N, HaloTag® und
SNAP-tagTM 77
3.1.1. Beurteilung der Expression 77 3.1.2. Untersuchung der Photostabilität von YFP und den „self-labeling tags“
82 3.2. Klonierung von CDK2, CDK4, Cyclin D1 und Cyclin E1 89 3.3. Transiente Expression der genetischen Konstrukte 90 3.4. Aufreinigung und Enzymaktivität der Fusionsproteine 96 3.4.1. Western Blot Analyse der YFP und HaloTag®-Konstrukte 96
3.4.2. Enzymaktivität der YFP- und HaloTag®-Konstrukte 97 3.5. Die Verteilung der Zellzyklusphasen in Tumorzelllinien 99 3.6. Intrazelluläre Verteilung von CDK2/CDK4 und Cyclin D1/E1 100 3.8. Zellzyklusabhängige Phosphorylierung von endogenem pRb (Ser 807/811)
108 3.9. Einfluss der Überexpression von CDK2/4 und Cyclin D1/E1 auf den
Zellzyklus 112
3.10. Intrazelluläre Verteilung der Fusionsproteine in Abhängigkeit vom
Zellzyklus 122
3.11. Charakterisierung des zellulären Testsystems 124
3.12. Test von CDK-Inhibitoren 125
4. DISKUSSION UND AUSBLICK 131
4.1. Charakterisierung der Expressionsplasmide pPhi-Yellow-N und der
„self-labeling tags“ 131
4.1.1. Transfektions- und Markierungseffizienzen in fixierten Zellen 131 4.1.2. Verwendung von YFP und „self-labeling tags“ zur
Lebendzellbeobachtung 133 4.2. Untersuchung des Einfluss der Expressionsplasmide auf den Zellzyklus 136 4.3. Charakterisierung der Fusionsproteine 137 4.4. Zellzyklusabhängige Expression und intrazelluläre Lokalisation
zellzyklusrelevanter Proteine 139
4.4.1. Zellzyklusabhängige Expression und intrazelluläre Lokalisation von
CDK2/Cyclin E1 139
4.4.2. Zellzyklusabhängige Expression und intrazelluläre Lokalisation von
CDK4/Cyclin D1 142
4.5. Phosphorylierung von endogenem pRb 145 4.6. Charakterisierung der zellulären Testsysteme 148 4.7. Untersuchung von CDK-Inhibitoren in PC3-Zellen 150
4.8. Ausblick 153
6. ANHANG 158 6.1. Sequenzen und Plasmid-Karten 158 6.1.1. Sequenzen der Imageklone (RZPD) 159
6.1.2. CDK4-cDNA-Sequenz 161
6.1.3. Sequenzen der cDNA im pCR®-blunt II TOPO®-Vektor 162 6.1.4. Sequenzen der Fusionsproteine 166
6.2. Materialien und Geräte 172
6.2.1. Materialien 172
6.2.2. Laborgeräte 172
6.2.3. Chemikalien und Reagenzien 173
6.2.3.1. Kits 176
6.2.3.2. Antikörper und Immunglobuline 176 6.2.3.3. Plasmide, DNA und Oligonukleotide 177
6.2.3.4. Testsubstanzen 178
6.2.4. Zusammensetzung der Kultivierungsmedien 178
7. ABKÜRZUNGEN 180
8. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 182
9. LITERATURVERZEICHNIS 186
1. Einleitung
"A lles L eben ist an die Z elle gebunden, und die Z elle ist nicht bloß das G efäß des
L ebens, sie ist selbst der lebende Teil." (R udolph V irchow )
Die Erkenntnis Rudolph Virchows aus dem Jahre 1855, dass sämtliche Lebewesen aus Zellen bestehen und stets durch Teilung aus bereits existierenden Zellen entstehen, gehört zweifellos zu den wichtigsten Meilensteinen in der Wissenschaft.
Eine Vielzahl verschiedener intrazellulärer Kompartimente und Proteinkomplexe mit spezifischen Funktionen steuert in ihrem Zusammenwirken den Stoffwechsel sowie die Teilung der Zelle. Bis heute jedoch ist die Zelle in der Komplexität ihres Aufbaus nicht vollständig verstanden.
1.1. Der eukaryotische Zellzyklus
Zellen besitzen neben ihrer Fähigkeit ein Größenwachstum zu vollziehen auch die, sich durch Zellteilung zu vermehren. Der Zeitraum zwischen zwei Zellteilungen wird Zellzyklus genannt und ist der Weg aller Lebewesen, sich zu vermehren37. Er setzt die Replikation der Chromosomen und deren korrekte Verteilung auf die entstehenden Tochterzellen voraus. Daher hat sich der Zellzyklus zu einem hochkomplexen und streng regulierten Mechanismus entwickelt. Fehlregulationen dieses Mechanismus können zu genetischer Instabilität führen und damit u. U. zur Entstehung von Krebs beitragen.
Im eukaryotischen Zellzyklus (Abb. 1) wird zwischen der Mitose (M-Phase) und der Interphase unterschieden. Die Interphase ist die Zeit zwischen zwei M-Phasen und besteht aus der G1-, S- und G2-Phase, der sich die Mitose und damit die Zellteilung anschließt.
In der G1-Phase (G = gap, engl. Lücke) findet das Zellwachstum statt. Abhängig von Signalen, vermittelt durch Wachstumsfaktoren oder Hormone,
sowie der Verfügbarkeit von Nährstoffen in der zellulären Umgebung wächst die Zelle heran und bereitet sich auf die anschließende DNA-Replikation vor29. Dabei stellt sie sicher, dass genügend Ressourcen für die DNA-Synthese vorhanden sind und keine Schädigung der DNA vorliegt75. Außerdem wirken Umwelteinflüsse und Stress auf die Zelle ein, die maßgeblich die Entscheidung, in die S-Phase und damit in den Zellzyklus einzutreten oder in die Ruhephase (G0-Phase) zu gehen, lenken. Fehler in diesem Verarbeitungsprozess sind eine häufige Ursache für die Entstehung von Krebs75.
Abb. 1: Der eukaryotische Zellzyklus. Der Zellzyklus ist in Interphase,
bestehend aus G1-, S- und G2-Phase sowie Mitose- (M-) Phase unterteilt. Die DNA wird in der S-Phase synthetisiert; die Produktion der übrigen Makromoleküle (RNA, Proteine) trägt in der Interphase zum Zellwachstum bei. Während der Mitose teilt sich die Zelle in zwei identische Tochterzellen. Zellen, die nicht proliferieren, verlassen den Zellzyklus und treten in die Ruhephase (G0) ein.
Am Ende der G1-Phase liegt der G1-Restriktionspunkt (R), an dem die Zelle eine "Alles-oder-Nichts-Entscheidung“ trifft28,119. Nach Überschreiten dieses Kontrollpunktes, wird die DNA-Synthese unabhängig vom Nährstoffangebot und dem eventuellen späteren Fehlen von Wachstumsfaktoren komplett
vollzogen. Die Proteinbiosynthese ist danach relativ resistent gegenüber Inhibitoren96,97. Nach dem G1-Restriktionspunkt trifft die Zelle die Entscheidung zur Selbsterneuerung, Differenzierung oder Apoptose75. Neben dem G1-Restriktionspunkt sind zusätzliche Kontrollpunkte aktiv, die den Fortschritt der Zelle durch jede der Phasen des Zellzyklus kontrollieren115. In der anschließenden S (Synthese)-Phase wird der DNA-Gehalt verdoppelt. Dazu wird die doppelsträngige DNA durch Helikasen aufgewunden und durch die DNA-Polymerase repliziert. Es folgt ein weiterer Zellzyklusabschnitt, in dem die Zelle stoffwechselaktiv ist, die G2-Phase. Die Zelle nimmt dabei durch RNA- bzw. Proteinsynthese an Volumen zu und bereitet sich auf die M-Phase vor. Während dieser Phase prüft die Zelle auch, ob die Replikation der DNA korrekt und vollständig ausgeführt wurde75. Dazu durchläuft sie vor Beginn der M-Phase einen weiteren Kontrollpunkt, der den Fortgang des Zellzyklus reguliert91. Die M-Phase umfasst die Teilung des Zellkerns und der Zelle in zwei identische Tochterzellen (Zytokinese)3.
1.1.1. Zellzyklus-Regulation und der G1-Restriktionspunkt
Der Übergang von einer Zellzyklus-Phase in die folgende wird durch eine Familie der Serin/Threonin-Kinasen, die Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) reguliert117. Diese Enzyme bilden heterodimere Komplexe mit ihren Co-Faktoren, den zellzyklisch exprimierten Cyclinen92. Cycline zeigen keine eigene katalytische Aktivität, während die CDKs ohne die Bindung an ein Cyclin inaktiv sind80,85. Im Unterschied zu den meisten Cyclinen besitzen die CDKs keine Kernlokalisationssequenz, können also ohne deren Bindung nicht an ihren Wirkungsort gelangen140. Derzeit wird zwischen 5 zellzyklusregulierenden Cyclin-Gruppen unterschieden: Cycline vom A-, B-, C-, D- und E-Typ. Die einzelnen Cycline besitzen eine große Sequenzsimilarität (ca. 41-54%)82. Die Cyclin-Box, eine konservierte Region von 100-150 Aminosäuren, ist für die Interaktion mit den CDKs verantwortlich. Humane Cycline enthalten häufig eine „destruction box“ oder PEST-Sequenz, über die ihr Proteinanteil in der jeweiligen Zellzyklus-Phase reguliert wird (Degradation oder „turnover“)34,38.
Während wachstumshemmende Signale die Transkription und Aktivität von Inhibitoren der CDKs stimulieren119,133 und hierdurch Kontrollpunkte wie den G1-Restriktionspunkt aktivieren, vermitteln mitogene Signale durch die Transkription der G1-Phasen Cycline (D-Typ Cycline und Cyclin E)46 sowie die Aktivierung entsprechender Cyclin-abhängiger Kinasen (CDK4/6)31 den Eintritt der Zelle aus der G0-Ruhephase in den Zellzyklus. Hierzu binden und aktivieren Wachstumsfaktoren verschiedene Rezeptortyrosinkinasen, wie den „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und G-Protein-gekoppelte Rezeptoren auf der Zelloberfläche, die anschließend ihre Informationen über verschiedene Signalwege in die Zelle weiterleiten99,62. Von entscheidender Bedeutung für die Zellproliferation ist die Ras-MEK-ERK-Kinase Signalkaskade, die die Aktivität von CDK4/6 mitreguliert. ERK phosphoryliert und stabilisiert c-Myc, einen Transkriptionsfaktor, der die Expression von Cyclin D1 induziert und die von Inhibitoren der CDKs supprimiert111. Der aktive Komplex aus Cyclin D/CDK4 bzw. Cyclin D/CDK6 vermittelt die Phosphorylierung des Retinoblastom-Protein (pRb) in der Mitte der G1-Phase und damit die Einleitung des Zellzyklus28,119 (Abb. 2). Das Prinzip der Aktivierung einer CDK durch ein phasenspezifisches Cyclin findet sich in allen Zellzyklus-Phasen. Cyclin D1 beeinflusst die Transkription, in dem es die Aktivität von Histondeacetylasen (HDAC) und Transkriptionsfaktoren reguliert. Dazu zählen der Östrogen141- und Androgenrezeptor54, der Thyroidhormonrezeptor103 und der „peroxisome proliferator activated receptor-γ“ (PPAR- γ)104. Diese Funktion von Cyclin D1 ist unabhängig von CDK42.
Die späte G1-Phase und der Eintritt in die S-Phase werden durch CDK2 im Komplex mit Cyclin E gesteuert. Dieser Komplex phosphoryliert u. a. das pRb und verschiedene andere Proteine, die in die Duplikation der Centrosomen, Initiation der DNA-Synthese und Induktion der Histon-Transkription involviert sind81. So dissoziiert beispielsweise Nucleophosmin/B23 nach seiner Phosphorylierung durch den Cyclin E/CDK2-Komplex von den Centrosomen und ermöglicht damit deren Duplikation92.
Abb. 2: Regulation des Zellzyklus. Die Stimulation mit Wachstumsfaktoren und
Hormonen führt zur Ausbildung und Aktivierung des Cyclin D/CDK4- bzw. Cyclin D/CDK6-Komplexes in der G1-Phase. Dieser phosphoryliert das Retinoblastom-Protein (pRb), welches daraufhin u. a. den Transkriptionsfaktor E2F aus seiner Bindung entlässt und somit die Transkription E2F-Promotor-regulierter Gene einleitet. In der späten G1- bis zur frühen S-Phase ist der Komplex aus Cyclin E/CDK2 aktiv und übernimmt regulatorische Phosphorylierungen, um die DNA-Replikation zu starten. Cyclin E wird in der späten S-Phase von Cyclin A abgelöst, welches im Komplex mit CDK2 die DNA-Synthese abschließend reguliert. In der G2-Phase geht Cyclin A eine Bindung zu CDK1 ein, um die Mitose einzuleiten und wird durch Cyclin B ersetzt, welches z. B. Mechanismen zum Zerfall der Kernlamina und zur Reorganisation des Zytoskeletts einleitet. Die Degradation von Cyclin B führt zum Verlassen der Mitose und dem Neueintritt der Tochterzellen in die G1-Phase.
Für den weiteren Verlauf der S-Phase sowie der G2-Phase ist Cyclin A im Komplex mit CDK2 und später mit CDK1 verantwortlich. Der G2/M-Übergang wird durch umfangreiche aktivierende Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsschritte des Cyclin B/CDK1-Komplexes initiiert, welcher auch als Reifeförderfaktor MPF („mitosis-promoting factor“) bezeichnet wird80,88. Durch diesen Komplex werden Prozesse reguliert, die zur Mitose und Zellteilung führen101. Dazu gehört die Neustrukturierung der Mikrotubuli und Aktinfilamente, die für den Aufbau und die Funktion der mitotischen
Spindeln verantwortlich sind. Außerdem phosphoryliert der Enzymkomplex Bestandteile der Kernlamina, wodurch deren Integrität zerstört wird, und es zum Zusammenbrechen der Kernhülle in der Prometaphase der Mitose kommt125. Die Inaktivierung von CDK1 durch den proteasom-vermittelten Abbau von Cyclin B110 führt zum Verlassen der M-Phase und einem Neubeginn des Zellzyklus der Tochtergeneration101.
Die Progression der Zelle durch den Zellzyklus wird durch den pRb-Signalweg kontrolliert.
1.1.2. Zellzyklus-Kontrolle durch das Retinoblastom-Protein
Zu den am besten untersuchten Substraten einer CDK gehört das pRb. Die Rb-Familie besteht aus den funktionell und strukturell nahe verwandten Genen der Pocketproteine pRb (p110RB1), p107 und p13017,40.
Bei dem Protein handelt es sich um ein nukleäres Phosphoprotein, das in allen normal proliferierenden Zellen synthetisiert wird. Es verfügt über 16 Konsensus-Sequenzen für CDK-abhängige Phosphorylierungsstellen, wobei deren Relevanz und Verwendung noch nicht im Detail aufgeklärt ist128. An pRb finden sich ebenfalls Bindungsstellen für DNA, virale Onkoproteine83 und Transkriptionsfaktoren57.
Während der Zellzyklusprogression, ab der späten G1-Phase, wird pRb sequentiell hyperphosphoryliert und damit inaktiviert12,15,20,78. Diese Hyperphosphorylierung korreliert mit der zellulären Proliferation, weshalb davon ausgegangen wird, dass dadurch die wachstumshemmende Wirkung von pRb inhibiert wird118. Mit Verlassen des Zellzyklus und Eintritt der Zellen in die Ruhephase (G0), liegt pRb hypophosphoryliert vor, was die terminale Ausdifferenzierung dieser Zellen bewirkt. Überexpression von Cyclin/CDK-Komplexen kann den pRb-induzierten Wachstumsarrest aufheben, indem sie dessen Phosphorylierung bewirken30,33,41.
Im nicht-phosphorylierten Zustand bindet pRb reversibel an Transkriptionsfaktoren wie E2F, ATF-2 oder c-abl11 (Abb. 3), worauf seine wachstumskontrollierende Funktion beruht11,53. Das Repressormotiv in pRb und seinen Homologen p107 und p130 ist evolutionär konserviert und bildet
die Bindungstasche (Pocket-Domäne), über die die Bindung an E2F und der negative Effekt auf die Transkription von S-Phase-Proteinen vermittelt wird1,17. Wird pRb über seine Bindung an E2F an einen Promotor gebunden, hemmt es ebenfalls die umgebenden Transkriptionsfaktoren und blockiert hierdurch die Transkription des betroffenen Gens. Damit wird die Zelle im Zellzyklus arretiert. In einigen Zellen liegt E2F assoziiert an ein DNA-Bindungsprotein (DP) vor. Die Bindung des pRb/E2F/DP-Komplexes an Histondeacetylasen (HDAC) oder Methyltransferasen (MTase) wirkt zusätzlich transkriptionsreprimierend, da diese ihrerseits eine Auswirkung auf die Kompaktheit der Chromatinstruktur und damit auf die Bindung anderer transkriptionsregulatorischer Faktoren haben1,65.
Einzelne Cyclin/CDK-Komplexe bevorzugen unterschiedliche Phosphorylierungsstellen, womit sie jeweils andere Funktionen des pRb inaktivieren. Alle D-Typ-Cycline besitzen beispielsweise eine pRb-Bindungssequenz des LXCXE-Motivs und binden bevorzugt in der Nähe basischer Reste33,60. So erfolgt die Freisetzung der Transkriptionsfaktoren E2F oder c-abl durch die pRb-Phosphorylierung an Ser807 und Ser81153. Gene, deren Transkription über E2F-Bindung reguliert wird, sind bspw. Cyclin E und Cyclin A1. Die beiden genannten Cycline sind ihrerseits in der Lage als Heterodimer mit CDK2 pRb weiter zu phosphorylieren. Cyclin E/CDK2 übernimmt diese Funktion in der späten G1-Phase, während Cyclin A/CDK2 in der S-Phase aktiv wird44,79,109. Allen Kinasekomplexen gemeinsam, ist die Fähigkeit zur Aufhebung der pRb-abhängigen Wachstumssuppression30,33,44. Für die vollständige Inaktivierung von pRb sind die beiden Komplexe aus Cyclin D/CDK4 und Cyclin E/CDK2 notwendig68. Die Hyperphosphorylierung von pRb bleibt bis zum Austritt der Zelle aus der Mitose bestehen und wird vermutlich von den Komplexen Cyclin A/CDK2 und Cyclin B/CDK1 vorgenommen1. Ob die in der G2/M-Phase erfolgten Phosphorylierungen einer weiteren Inaktivierung von pRb dienen, ist noch unklar. Angenommen wird jedoch, dass sie für das Voranschreiten des Zellzyklus notwendig sind53.
Abb. 3: Kontrollierende Funktion von pRb. In nicht-proliferierenden Zellen liegt
pRb unphosphoryliert und gebunden an Transkriptionsfaktoren wie E2F vor. Durch die Rekrutierung verschiedenster Proteine (HDAC, MTAse), die in die Gestaltung der Chromatinstruktur involviert sind, wird pRb/E2F/DP zu einem Transkriptions-Repressor. Während der Zellzyklusprogression wird pRb durch die Komplexe Cyclin D/CDK4 und Cyclin E/CDK2 phosphoryliert, was zu einer Konformationsänderung des Pocketproteins und damit zur Freisetzung von E2F und der ebenfalls gebundenen Enzyme führt. Durch diese Prozesse werden zellzyklusregulierende Gene transkribiert und der Zellzyklus fortgesetzt. Mutationen im Rb-Gen oder die Bindung eines viralen Onkogens an pRb inhibieren die Bindung an E2F, wodurch es zu einem unkontrollierten Zellzyklus kommt.
Zur funktionellen Reaktivierung von pRb nach Verlassen des Zellzyklus ist das Entfernen der inhibitorischen Phosphatgruppen erforderlich, was während der Anaphase durch die Phosphoprotein Phosphatase 1 (PP1) realisiert wird67. Dadurch steht das pRb bei Verlassen des Zellzyklus wieder in seiner Funktion als Bindungspartner für Transkriptionsfaktoren und damit als Wachstumsrepressor zur Verfügung.
In Tumorzellen kann es verschiedenste Fehlregulation des pRb-Proteins geben. Die permanente Aktivierung von E2F, wie sie als Folge von Mutationen im Rb-Gen oder durch das Binden viraler Onkoproteine83 auftritt, führt zu einer ungehinderten Transkription E2F-regulierter Gene.
1.1.3. Regulation der CDK-Aktivität
Innerhalb der Zelle existieren vielfältige Möglichkeiten zur Kontrolle der CDK-Aktivität, womit sich eine große regulatorische Flexibilität in Bezug auf den Zellzyklus ergibt. Die CDK-Aktivität wird im Besonderen durch die Heterodimerisierung mit phasenspezifischen Cyclinen und demzufolge auch durch deren Synthese bzw. proteosomalen Abbau reguliert80,119.
Die Expression von Cyclin E und A beginnt z. B. nach der Phosphorylierung des pRb in der G1-Phase1. Während die Cyclin E-Level in normalen Zellen bereits in der frühen S-Phase wieder sinken, ist Cyclin A bis zum Beginn der Mitose im Nukleus zu finden und steht sowohl CDK2 (S-Phase) als auch CDK1 (G2-Phase) als Interaktionspartner zu Verfügung32. In Tumorzellen wird häufig eine Fehlregulation der Cyclin-Expression und somit eine gesteigerte Aktivität der Cyclin/CDK-Komplexe gefunden32.
Die Bindung der Cycline ist der erste Schritt in der Aktivierung der CDKs. Dabei ist die Interaktion der Cycline mit den entsprechenden CDKs sehr unterschiedlich. Einige Cyclin/CDK-Paare binden mit hoher Affinität ohne den Einfluss weiterer Co-Faktoren oder Modifikationen (Cyclin B/CDK1, Cyclin A/CDK1, Cyclin E/CDK2)23. Andere Komplexe, wie z. B. Cyclin H/CDK7, binden nur sehr schwach, bis die CDK-Untereinheit an einem aktivierenden Thr-Rest phosphoryliert wird oder ein „CDK-activating kinase assembly factor“ (MatI, franz.: Mènage á trois,) an den Komplex gebunden hat23,88,89. Die Ausprägung der Bindung von CDK4 an Cyclin D ist besonders interessant, denn sie benötigt „serum-stimulated-assembly-factors“80. Die meisten CDKs bedürfen zur vollständigen Aktivierung eine Phosphorylierung an einem konservierten Thr, die von CDK-aktivierenden Kinasen (CAK) vorgenommen wird80. Dies gilt bspw. für die Thr160-Phosphorylierung von CDK2 durch Cyclin H/CDK7/MatI43.
Eine weitere wichtige Art zur Regulation der CDK-Aktivität besteht in der Bindung von niedermolekularen Inhibitoren (CDKIs) an den CDK-Cyclin-Komplex80,100. Es werden zwei Familien mit jeweils biochemischen und funktionellen Homologien unterschieden: die Cip-Kip-Familie (CDK inhibitory
polypeptides, Kinase inhibitory proteins), die als universelle bzw. unspezifische CDK-Inhibitoren alle CDKs der G1-Phase hemmen, und die INK4-Familie (inhibitors of CDK4), die als selektive und spezifische CDK-Inhibitoren CDK4 und CDK6 inhibieren133. Die Cip-Kip-Familie beinhaltet p21WAF1/Cip1, p27Kip1 und p57Kip2; zur INK4-Familie gehören p15INK4b, p16INK4a, p17INK4c und p19INK4d. Die funktionellen Mechanismen variieren je nach Familie und sind noch nicht im Einzelnen aufgeklärt. Es ist jedoch bekannt, dass die CDKIs über ihren N-Terminus mit der katalytischen Domäne bestimmter CDKs interagieren. Dadurch erfolgt eine Konformationsänderung, die die Bindung von ATP verhindert98 und die Cyclin/CDK-Komplexe inaktiviert. Das Protein p27Kip1 ist bspw. für die allgemeine Kontrolle der Cyclin E/CDK2-Aktivität während des G1-S-Überganges verantwortlich und wird über mitogene Signale reguliert75. p16INK4a scheint dagegen direkt die Aktivität von CDK4 bzw. CDK6 zu inhibieren, indem es die Position von Cyclin D1 im Komplex mit CDK4/6 übernimmt114. Zusätzlich kann p16INK4a die Aktivität des Cyclin D/CDK4-Komplexes in einem negativen Feedback-Mechanismus an pRb inhibieren114. Unabhängig von den jeweiligen Mechanismen der CDK-Inhibition wurde sowohl für p27Kip1 als auch für p16INK4a gezeigt, dass deren alleinige Überexpression den Zellzyklusarrest herbeiführen kann129.
Essentiell ist für einige Cyclin/CDK-Komplexe auch die Dephosphorylierung durch spezifische Phosphatasen. So führt erst die Entfernung der inhibierenden Phosphatgruppen an Thr14 und Tyr15 von CDK1 durch die Phosphatase Cdc2590 bei vorhergegangener Thr161-Phosphorylierung durch den Cyclin H/CDK7/MatI-Komplex50 zur vollständigen Aktivierung des CDK1/Cyclin B-Komplexes und somit zum Start der Mitose.
Phosphorylierungen beeinflussen Enzymaktivitäten sowie die Lokalisation von Proteinen, vermitteln Protein-Protein-Interaktionen und induzieren Bindungsstellen in den phosphorylierten Proteinen. Die Lokalisation von Cyclin D1 wird bspw. durch die Glycogen-Synthase-Kinase (GSK)-3β-abhängige Phosphorylierung an Thr286 reguliert26. Ungebundenes Cyclin D1 kann jedoch auch unabhängig von GSK-3β proteosomal degradiert werden36.
An Thr286-phosphoryliertes Cyclin D1 bindet an ein Exportin (CRM)4, woraufhin es aus dem Nukleus transportiert wird55. Im Zytoplasma wird Cyclin D1 durch einen Multiprotein-Komplex (SCF-Ubiquitin-Ligase) ubiquitiniert und ist damit für den daran anschließenden proteosomalen Abbau markiert25. Die Degradation aller Cycline wird auf ähnlichem Weg reguliert. Verschieden sind nur die jeweilige Phosphorylierungsstelle und der ubiquitinierende Protein-Komplex71.
Der Abbau von Cyclin E ist ein komplexer Mechanismus und setzt dessen mehrfache Phosphorylierung voraus. Zum einen wird das Cyclin E durch CDK2 am Thr380139 und Ser384137 phosphoryliert. Da dieser Schritt von dem eigenen katalytischen Interaktionspartner (CDK2) vorgenommen wird, spricht man von einer Autophosphorylierung. Die Thr380-Phosphorylierung kann jedoch ebenfalls in Abhängigkeit von GSK-3β erfolgen und ist essentiell für die Bindung an den Fbw7-Rezeptor der SCFFbw7-Ubiquitin-Ligase137, durch die phosphoryliertes Cyclin E proteolytisch degradiert wird56. Zudem gibt es eine Vielzahl weiterer Phosphorylierungsstellen (Thr62, Ser88, Ser327, Ser384). Davon sind zumindest Thr62 and Ser372 für den turnover von Bedeutung137. Erst nach der Multi-Phosphorylierung ist Cyclin E für die Ubiquitinierung und damit den proteosomalen Abbau markiert.
1.1.4. Cycline und CDKs: Ihre Rolle in der Tumorgenese
Wie bereits angesprochen zeichnen sich Krebszellen häufig durch eine Fehlregulation des Zellzyklus und einem damit verbundenen unkontrollierten Wachstum aus. Nahezu alle veränderten Kontrollmechanismen, wie sie in Tumorzellen gefunden werden, betreffen den Übergang von der G1- in die S-Phase und damit die Funktion der Cyclin D/CDK4 bzw. Cyclin D/CDK6 und Cyclin E/CDK2-Komplexe24. Eine funktionelle Verbindung dieser enzymatischen Komplexe stellt der in Tumorzellen typischerweise deregulierte pRb-Signalweg dar (Abb. 2, 3). Hierbei kann es verschiedenste Fehlregulationen des Rb-Proteins geben. Meist ist der pRb-Signalweg durch Mutationen in den Genen für Cyclin D1, CDK4, p16Ink4a oder Rb selbst inaktiviert95,113. So ist bspw. die Inaktivierung beider Rb Allele, vorwiegend
durch Keimbahn-Mutationen, mit der Entstehung von Retinoblastomen im Kindesalter (Tumore der Retina) oder aber Osteosarkomen im Erwachsenenalter assoziiert39. Da sich die Tumore bei Ausfall des funktionsfähigen Genproduktes ausbilden, wird das Rb-Gen als Tumorsuppressorgen bezeichnet. Mutationen innerhalb des Rb-Genes verhindern die Bindung an E2F, wodurch dieses permanent aktiv ist. Virale Onkoproteine können an pRb binden und damit seine Interaktion mit E2F behindern83. In den meisten humanen Tumoren findet man eine Hyperaktivierung von CDK4/6 (Osteosarkome135, Mammakarzinome5, Sarkome52) verursacht durch die Überexpression von CDK4124 bzw. Cyclin D113, Mutationen im Cyclin D1-Gen, die es für p16Ink4a unempfindlich machen24 oder die Inaktivierung bzw. den Verlust von p16Ink4a selbst10,24,136. In allen Fällen erfolgt eine dauerhafte Phosphorylierung und damit Inaktivierung von pRb65,95,113.
Eine besondere Bedeutung hat die Amplifikation oder das Rearrangement der D-Typ Cyclin-Gene in der Pathogenese verschiedener Krebsarten. In 15-20% aller Mammakarzinome liegt das Cyclin D1-Gen amplifiziert vor59, während sogar 50% der Brustkrebspatientinnen eine Überexpression von Cyclin D16 und/oder CDK45 aufweisen. Cyclin D2-Überexpression ist typisch für B-Zell-lymphatische Leukämie21 und chronische lymphatische Leukämie82. Eine Cyclin D3-Überexpression findet man dagegen z. B. bei Nierenzellkarzinomen oder Glioblastomen24.
In der Pathogenese verschiedener Krebsarten ist häufig auch ein verändertes Cyclin E-Expressionsmuster zu finden. Während Cyclin E in gesundem Gewebe zu Beginn der S-Phase abgebaut wird, kann es in Tumorgeweben bis zur G2-Phase synthetisiert werden32. In Cervix32- und Mammakarzinomen127 scheint der Anteil Cyclin E-exprimierender Zellen in der S- und G2-Phase relevant für den klinischen Verlauf bzw. die Prognose der Erkrankung zu sein und wird sogar als diagnostischer Marker eingesetzt. Eine verlängerte Expression kann zwei Ursachen haben. Die erste Möglichkeit ist eine Fehlregulation im Abbau von Cyclin E. Normalerweise wird dieses durch (mindestens) eine Phosphorylierung an Thr380 für die
Ubiquitinierung und damit den proteosomalen Abbau markiert139. Durch seine Bindung an inaktives CDK2 ist es jedoch vor dem Abbau geschützt. Mutationen in den Genen von hCdc4126 und Cul119, zweier Proteine, die aktiv in den Ubiquitinierungsprozess involviert sind, können ebenfalls die Cyclin E-Degradation verhindern. Eine Überexpression von Cyclin E und die damit verbundene erhöhte Aktivität des Cyclin E/CDK2-Komplexes kann die Prozesse in der Bindung und Aktivierung von Cyclin A/CDK2 behindern und sich damit negativ auf die DNA-Replikation auswirken. Genomische Instabilität ist ein typisches Merkmal von Krebszellen102.
1.2.
CDK-Inhibitoren
als
Therapeutika
von
Tumorerkrankungen
Das wachsende Verständnis für die Fehlregulationen innerhalb des Zellzyklus sowie die Kenntnis der betroffenen regulatorischen Gene und involvierten Signaltransduktionswege bilden die Grundlage für die therapeutischen Fortschritte in der Krebstherapie. Ein vielversprechender Ansatz ist die Entwicklung synthetischer Substanzen zur selektiven Inhibition der fehlregulierten CDKs und der damit verbundenen Phosphorylierungen. Knockout-Studien der letzten Jahre lieferten überraschende Resultate. Für verschiedene Krebszelllinien konnte gezeigt werden, dass sie trotz des Verlustes von CDK2 in der Lage sind, normal zu proliferieren73. Dies läßt annehmen, dass andere CDKs die Funktion von CDK2 in der G1- und S-Phase übernehmen können. CDK2-knockout-Mäuse zeigen ebenfalls keine Auffälligkeiten in der Proliferation, sie sind jedoch steril, was vermuten läßt, dass CDK2 eine essentielle Rolle in der Meiose, jedoch nicht in der Mitose besitzt8. In den meisten Zelltypen hat ein Verlust von CDK4 keine negativen Auswirkungen auf die Proliferation, denn seine Funktion kann vermutlich durch CDK6 übernommen werden74. Jedoch führt die Deletion von CDK4 in adulten Pankreaszellen zu einer reduzierten Proliferation und kann einen insulin-defizienten Diabetes bewirken106. Die CDK6-Deletion wirkt in erythroiden Zellen74 anti-proliferativ, wobei andere Zelltypen in diesem
Modell weitgehend unbeeinflusst bleiben. Dies legt nah, dass CDKs zelltypspezifische Funktionen besitzen.
Ein gleichzeitiger knockdown von CDK2 und CDK4 bei Mäusen verhindert die Proliferation embryonaler Kardiomyozyten und resultiert in einem Herzversagen sowie einer Hypophosphorylierung von pRb verbunden mit einer verringerten Expression E2F-abhängiger Gene9. Überraschenderweise zeigt im gleichen Modell das Abschalten aller Gene für Interphasen-CDKs (CDK2, 3, 4 und 6) in Mäusen keine veränderten Expressionslevel für CDK1 und die interagierenden Cycline. Die katalytische Aktivität des CDK1 ist in diesem Fall scheinbar ausreichend für eine Zellzyklusprogression76. Die Ergebnisse der verschiedenen Studien lassen an der spezifischen Funktion der CDKs in der Zellzyklusprogression zweifeln. Daher stellt sich die Frage nach dem Sinn einer selektiven CDK-Inhibition als Anti-Tumortherapie. Doch die Inhibition einer CDK durch kleine Moleküle kann einen anderen Phänotyp bewirken als ein absoluter knockout, da die entsprechende Kinase weiterhin in der Zelle präsent ist76. Die regulatorischen Mechanismen zur Kompensation einer deletierten CDK können sich von den intrazellulären Prozessen unterscheiden, die bei einer funktionsunfähigen CDK ausgelöst werden. Generell ist die Proliferation von der transienten und phasenspezifischen Expression der Cycline sowie deren Bindung an eine bevorzugte CDK abhängig. Diese Bindung ist so spezifisch, dass sie trotz gleichzeitiger Anwesenheit anderer CDKs vorherrschend ist und somit durch kleine Moleküle selektiv gehemmt werden kann.
Bislang existieren keine kommerziell verfügbaren CDK-Inhibitoren zum therapeutischen Einsatz, jedoch einige diesbezügliche klinische Studien73. Flavopiridol (Aventis) ist der erste CDK-Inhibitor, der bereits in mehr als 50 klinischen Studien eingesetzt wurde. Das natürlich vorkommende Flavonoid inhibiert selektiv CDK1 (IC50=30nM)76, CDK2 (IC50=100nM)76, CDK9 (IC50=3nM)76 sowie CDK-aktivierende Kinasen116. Der Wirkmechanismus ist noch nicht bis ins Detail aufgeklärt. Maßgeblich wird jedoch eine Inhibition der Transkription über weitere Proteinkinasen, die an der Signaltransduktion und Regulation des Zellyzklus beteiligt sind, vermutet73. Die Hypothese ist,
dass die über Cyclin H/CDK7 bzw. Cyclin T/CDK9 vermittelte Phosphorylierung der RNA-Polymerase II unterbunden wird. Dadurch werden sowohl die Initiation (Cyclin H/CDK7) der mRNA-Synthese als auch deren Elongation (Cyclin T/CDK9) verhindert. Auf diese Weise werden u. a. die Expression des antiapoptotischen Faktors MCL-1 sowie des Angiogenese-fördernden VEGF-Rezeptors (engl.: vascular endothelial growth factor) herunterreguliert76. Die CDK4-Aktivität in MCF-7-Zellen wird durch die Transkriptionsrepression des Cyclin D1- und D3-Promotors inhibiert115. Dagegen basiert die direkte Inhibition von CDK2 auf der Konkurrenz von Flavopiridol und ATP um die ATP-Bindungstasche116. Derzeit werden klinische Studien zur Untersuchung der Wirksamkeit von Flavopiridol bei der Chronisch Lymphatischen Leukämie durchgeführt76.
Eine ähnliche transkriptionsreprimierende Wirkung zeigt das R-Roscovitin (chem.: 6-Benzylamino-2-(R)-[(1-ethyl)-2-hydroxyethylamino]-9-isopropyl-purine) der Firma Cyclacel. Es inhibiert selektiv die Komplexe Cyclin E/CDK2 (IC50=700nM) und im submikromolaren Bereich ebenfalls Cyclin H/CDK7 sowie Cyclin T/CDK976. Letztere vermitteln über die Kontrolle der Transkription von MCL-1 die antiapoptotische Wirkung von R-Roscovitin69,105. Die Wirksamkeit von Flavopiridol und Roscovitin in klinischen Studien ist jedoch äußerst begrenzt und hat die hohen Erwartungen an die Substanzen bisher nicht erfüllen können73.
GW8510 (chem.: 4-{[(7-Oxo-6,7-dihydro-8H-[1,3] thiazolo [5,4-e] indol-8-ylidene) methyl] amino}-N-(2-pyridinyl) benzensulfonamid) zählt zur Familie der Rezeptortyrosinkinase-Inhibitoren und unterbindet den Übergang von der G1- zur S-Phase. Es hemmt spezifisch CDK2 (IC50=10nM) und weniger potent CDK1 (IC50=110nM) sowie CDK4 (IC50=130nM). In kultivierten diploiden Fibroblasten ist nachweislich die Proliferation eingeschränkt und die Phosphorylierung von pRb reduziert (Sigma). GW8510 weist neuroprotektive Eigenschaften auf, die jedoch nicht auf seine zellzyklusregulierende Wirkung zurückzuführen ist. In Neuronen wurde gezeigt, dass im Unterschied zu biochemischen Testverfahren ausschließlich
CDK5 inhibiert wird. Diese Kinase ist jedoch nicht in die Progression des Zellzyklus involviert47.
Eine weitere Klasse mit anderen CDK-inhibitorischen Eigenschaften sind die Purin-ähnlichen Substanzen, wie Bohemin (chemische Bezeichnung: 2-(3-Hydroxypropylamino)-6-benzylamino-9-isoproylpurin) und Olomoucin bzw. Olomoucinderivate, z. B. N9-Isopropylolomoucin (chemische Bezeichnung: 2-(2′-Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-isopropylpurin). Bohemin ist ein unspezifischer CDK-Inhibitor, der konzentrationsabhängig zu einem Arrest in der G1/S-Phase oder G2/M-Phase führt35.
Ein Guanin-basierter CDK-Inhibitor (CDK2: IC50=17µM, CDK1: IC50=26µM) ist das NU2058, welches in der Therapie des androgenunabhängigen Prostatakrebs vielversprechende Ansätze zeigt. In dieser Studie ist der Gehalt an p27 in Abhängigkeit der NU2058-Konzentration erhöht und die Aktivität von CDK2, die Phosphorylierung von pRb sowie die Expression der sogenannten „early genes“ reduziert108.
Eine weitere Substanzklasse inhibiert nicht nur CDKs sondern auch andere relevante Kinasen (z. B. Aurora A/B)73. Die Substanz ZK 304709 (Bayer Schering Pharma AG) ist ein nanomolarer Inhibitor von CDK 1, 2, 4, 7, 9 und hat eine zusätzliche inhibitorische Wirkung auf VEGFR1-3 und PDGFR-ß73 (engl.: platelet-derived growth factor receptor). Durch deren Inhibition wird die Angionese des Tumorgewebes verhindert.
Eine alternative Form der CDK-Inhibition ist die Blockade der positiven regulatorischen Untereinheit der G1- und S-Phase CDK/Cyclin-Komplexe76. Diese Untereinheit enthält eine hydrophobe Bindetasche, die zur Rekrutierung des Substrates dient und von verschiedenen Proteinen des Zellzyklus einschließlich endogener inhibitorischer Proteine erkannt wird. Zellpermeable Peptide (Cyclin groove inhitors, CGI), die sich an dieser Untereinheit anlagern können, sind nachweislich in der Lage, die CDK2-Aktivität zu hemmen und dadurch selektiv Tumorzellen zu töten77. Aufgrund der CDK-Spezifität der CGI, stellen diese im Unterschied zu den transkriptionsreprimierenden CDK-Inhibitoren eine pharmazeutisch relevante Alternative dar.
Die Unterbindung der Cyclin/CDK-Interaktion ist eine weitere Strategie zur Inhibition der katalytischen Aktivität einzelner CDKs76. In einigen Untersuchungen wurden bereits Peptide identifiziert, die an die Oberfläche von Cyclin A binden und damit die Komplexbildung zu CDK2 verhindern14. Noch hat keine der beschriebenen Substanzklassen in klinischen Studien den Beweis für die Relevanz der CDK-Inhibition in der angewandten Krebstherapie erbracht. Obwohl das Potential einiger Substanzen in diversen
in vitro bzw. in vivo-Untersuchungen dargelegt werden konnte, bleiben noch
viele Fragen bzgl. der Selektivität, des mechanistischen Wirkprofiles und der daraus resultierenden anti-tumorigenen Eigenschaften offen.
1.3. Untersuchung der Proteinexpression in der Zelle
Zur Untersuchung der Expression, Lokalisation oder Quantifizierung intrazellulär exprimierter Proteine können verschiedene Verfahren angewandt werden. Eine Möglichkeit ist das Markieren spezifischer Strukturen (Epitope/Antigene) mit Antikörpern, radioaktiven Markern oder Farbstoffen, die eine Affinität zu einem bestimmten Molekül in der Zelle haben (z. B. Anfärben von Chromatin mit Hoechst-Farbstoff). Dazu bedarf es einer mehr oder weniger umfangreichen Färbe- bzw. Markierungsprozedur. Liegt das zu untersuchende Protein intrazellulär vor, muß die Zelle vor der Markierung in ihrem gegenwärtigen Zustand fixiert und für Antikörper oder Farbstoffmoleküle durchlässig gemacht werden. Dadurch ist die Untersuchung auf einen Endpunkt festgelegt.
Eine flexiblere Technik, die die Untersuchung eines intrazellulären Proteins während seines Lebenszyklus ermöglicht, ist dessen Co-Expression mit einem autofluoreszierenden Protein (AFP)131. Dazu wird die cDNA des zu untersuchenden Proteins mit der cDNA des AFP im Leserahmen fusioniert. Aufgrund der autofluoreszierenden Eigenschaft des resultierenden Fusionsproteins, sind Expression, Lokalisation sowie die Bewegungen in lebenden Zellen mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes detektierbar.
1.3.1. Autofluoreszierende Proteine
Das bekannteste AFP ist das Grün-fluoreszierende Protein (GFP), das 1961 in der Qualle Aequorea victoria entdeckt und daraus isoliert wurde120. GFP hat zwei Anregungsmaxima. Das erste liegt bei einer Wellenlänge von 395nm, das zweite bei 475nm. Die Emissionswellenlänge liegt bei 509nm. Im Ursprungslebewesen erhält das GFP seine Anregungsenergie vom Photoprotein Aequorin, woraufhin GFP, seinem Namen entsprechend, grün fluoresziert122. Mittlerweile gibt es modifizierte Versionen des GFP, die eine Verschiebung des Fluoreszenzspektrums in den gelben (YFP, engl.: Yellow Fluorescent Protein) oder blauen (CFP, engl.: Cyan Fluorescent Protein) Bereich aufweisen. Immer größere Bedeutung erlangen neue AFPs, die aus Korallen isoliert wurden, wie z. B. das rot fluoreszierende Protein aus
Discosoma.
Durch die Vielzahl der inzwischen verfügbaren und nicht zelltoxischen AFPs sowie die Möglichkeit zur Generation von Fusionsproteinen ist das gesamte Fluoreszenzspektrum von 400-750nm für zellbiologische Untersuchungen nutzbar. Hieraus können Einblicke in die Dynamik (Expression, Lokalisation, Translokation, Akkumulation, Degradation) und Kinetik (enzymatische Reaktion, Interaktion mit zellulären Bestandteilen) eines intrazellulär exprimierten Fusionsproteins gewonnen werden64. Die Anwendung von fluoreszierenden Fusionsproteinen in zellulären Systemen ermöglicht es, das Protein in seiner natürlichen Umgebung und seine Reaktionen auf interne oder externe Reize fortlaufend und unter Zellkulturbedingungen zu beobachten.
Limitierend ist jedoch, dass das generierte Fusionsprotein ausschließlich in der Wellenlänge des gewählten AFP fluoreszieren kann. Eine kombinierte Expression von mehreren Fusionsproteinen mit jeweils anderem Fluorophor, kann aufgrund der Überlagerung des Fluoreszenzspektrums zu einem sogenannten „Cross-Talk“ führen. Erwünscht ist dieser Effekt dagegen bei einigen Anwendungen in lebenden Zellen. So können intrazelluläre Protein-Interaktionen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers
(FRET) untersucht werden. Bei einem FRET wird die Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffes (Donor-Fluorophor) auf einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor-Fluorophor) übertragen. Die Intensität des Transfers ist vom Abstand des Donors zum Akzeptor abhängig (<8 nm). Zum Nachweis der Interaktion zweier Proteine, wird eines mit einem Donor- (CFP) und das andere mit einem Akzeptor-Fluorophor (YFP) gekoppelt. Befinden sich beide in enger räumlicher Nähe zueinander, wird die Energie des angeregten CFP auf YFP übertragen und gemessen. Entscheidend bei dieser Methode ist, dass das Spektrum der Donor-Emissionsenergie mit dem der Akzeptor-Absorptionsenergie überlappt. Denkbar wäre auch, ein Protein an unterschiedlichen Positionen sowohl mit dem Donor- als auch mit dem Akzeptor-Fluorophor zu koppeln. Vollzieht dieses Protein eine Konformationsänderung, durch welche sich die Fluorophore annähern, kann dies ebenfalls als FRET gemessen werden130.
Eine ganz andere Technik, die die Beweglichkeit von Proteinen in der Zelle aufzeigen kann, ist FRAP (engl.: fluorescence recovery after photo bleaching). Dazu wird das Fluoreszenzsignal eines AFP-Fusionsproteins innerhalb eines intrazellulären Kompartimentes durch eine intensive Laserbestrahlung ausgeblichen. Die Migration unbestrahlter Fusionsproteine in das Zellkompartiment kann durch das entsprechende Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden18. Starke Laserbestrahlung ist jedoch für die Struktur lebender Zellen schädigend. Aufgrund der negativen Einflüsse von Laserbestrahlung auf die Zelle und ihre Proteine wurde die Entwicklung photo-aktivierbarer AFPs vorangetrieben. Diese entwickeln erst nach kurzer Bestrahlung ein Fluoreszenzsignal, oder sie sind in der Lage, dieses zu ändern, z. B. von grün nach rot (Kaede-Protein) oder von blau nach grün (PS-CFP)16,63.
Die fortwährende Zunahme an AFPs mit veränderten Eigenschaften und der daraus resultierenden Applikationsvielfalt sowie ihre einfache Anwendung, machen AFPs zu einem beliebten Werkzeug der Fluoreszenzmikroskopie. Die Anwendung in der Pharmaindustrie ist jedoch durch diverse patentrechtliche Ansprüche und Lizenzkonditionen stark eingeschränkt.
1.3.2. „Self-Labeling Protein Tags“ als Alternative zu AFPs
Ein relativ neuer und vielversprechender Ansatz, Proteine zu markieren, ist die Technologie der „self-labeling tags“. Darunter werden Proteine verstanden, die sich nach ihrer Expression durch eine enzymatische Reaktion selbst mit einem entsprechenden Liganden markieren.
Molekularbiologisch generierte Fusionsproteine aus dem zu untersuchenden Protein und dem Ligand-bindenden Protein, können im Unterschied zu den AFP-Fusionsproteinen mit einer Vielzahl von Fluorophor-tragenden Liganden markiert werden. Dies ermöglicht eine deutlich größere Flexibilität in der Wahl des Fluorophors, ohne das genetische Konstrukt ändern zu müssen. Dieser Vorteil wird besonders deutlich im Zusammenhang mit anschließenden Markierungen zellulärer Strukturen.
1.3.2.1. SNAP-tagTM
Die SNAP-tagTM Technologie der Firma covalys basiert auf der humanen O6 -Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (hAGT)49. In humanen Zellen ist das Protein im Zellkern lokalisiert und dient der DNA-Reparatur. Dort erkennt es fehlerhaft eingebautes O6-Alkylguanin in DNA-Strängen und überträgt den O6-Alkylrest auf ein Cystein in seinem aktiven Zentrum, wodurch es sich für seine eigene Degradation markiert51. Deshalb wird es auch als „Suizid-Enzym” bezeichnet. Im klassischen Sinne ist dieses Protein kein Enzym, da es sein Substrat kovalent bindet und daher die „enzymatische Reaktion” nur einmal ausführen kann.
Der SNAP-tagTM ist ein Polypeptid, kodiert auf dem Plasmid pSEMS1-26m (siehe Abb. 67 im Anhang), unter der Kontrolle eines CMV-Promotors und besitzt zwei Multiple Klonierungsstellen (MCS, engl.: Multiple Cloning Site), die die Generierung von C- und N-terminalen Fusionsproteinen ermöglichen. Aufgrund der ebenfalls auf dem Plasmid kodierten Resistenz gegenüber Geniticin, sind SNAP-tagTM-Fusionsproteine nicht nur für die transiente Transfektion geeignet sondern auch für die Etablierung stabil-transfizierter Zellen.
Durch Protein-Engineering wurden einige Spezifikationen der hAGT für die technologische Anwendung modifiziert. SNAP-tagTM-Proteine zeigen im Gegensatz zur hAGT keine Preferenz für den Zellkern und reagieren nicht mit DNA-gebundenem Guanin sondern erkennen O6-Benzylguanin (BG) als Substrat an. Durch Ausbildung einer kovalenten Thioether-Bindung wird das Fusionsprotein über das BG-Substrat mit einem Fluorophor oder einer anderen substituierten Gruppe markiert51 (siehe Abb. 4 in Kapitel 2.3.3.). Inzwischen existieren für den SNAP-tagTM eine Vielzahl von Anwendungen. Diese umfassen neben der Auswahl von mehr als 20 Fluorophor- oder Biotin-tragenden Liganden auch die Möglichkeit zum FRET-Assay oder Anwendungen zur Protein-Immobilisierung (www.covalys.com). Die Wahl des jeweiligen Liganden richtet sich nach dem Prinzip des durchzuführenden Assays. Einige Liganden sind zellgängig und können daher in lebenden und fixierten Zellen angewandt werden, während andere erst nach der Permeabilisierung der Zellmembran in die Zellen gelangen und somit ausschließlich in fixierten Zellen eingesetzt werden können. Die zellgängigen Farbstoffe unterscheiden sich wiederum in ihrer Photostabilität, weshalb nicht alle für Experimente mit mehrfachen (Lebendzellbeobachtungen) bzw. langen Belichtungszeiten geeignet sind.
1.3.2.2. HaloTag® Interchangeable Labeling Technology
Die HaloTag®-Technologie von Promega ist ebenfalls ein alternativer Ansatz zur Untersuchung der Proteinexpression in lebenden und fixierten Zellen. Der HaloTag® ist eine genetische Modifikation einer bakteriellen Hydrolase (Haloalkan Dehalogenase) aus Rhodococcus rhodochrous. Das Enzym entfernt Halogengruppen von aliphatischen, halogenierten Substanzen und wird industriell u. a. in biodegradativen Prozessen (Abwasserreinigung) eingesetzt. Durch diverse Mutationen in der Aminosäuresequenz wurde die Hydrolyse-Reaktion verbessert und die Substratbindung verstärkt: erhöhte Kinetik in der Ligandenerkennung und -bindung, kovalente Bindung, verbesserter Zugang zur Ligandenbindungsdomäne (www.promega.com). Da das Enzym nur in Prokaryoten exprimiert wird, ist für die Markierung von
Fusionsproteinen in eukaryotischen Zellen eine hohe Substratspezifität zu erwarten.
Der pHT2-Vektor kodiert für den HaloTag® und steht unter der Kontrolle eines CMV-Promotors. Auf dem Plasmid finden sich zwei sehr kleine MCS, durch die theoretisch sowohl die Generierung eines C- als auch eines N-terminalen Fusionsproteins möglich ist (siehe Abb. 68 im Anhang). Im Unterschied zum SNAP-tagTM ist es mit dem HaloTag® nicht möglich, über einfache Selektion stabil transfizierte Zellen zu gewinnen.
Die HaloTag®-Liganden bestehen aus einem reaktiven Linker und einem Reportermolekül. Durch die Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Linker und dem HaloTag®-Fusionsprotein, ist dieses stabil mit einem Reporter markiert (siehe Abb. 4 in Kapitel 2.3.3.). Auch für den HaloTag® sind inzwischen vielfältige Liganden erhältlich, die entweder ein Fluorophor oder eine andere funktionelle Gruppe (Biotin, Resin) unterschiedlicher Eigenschaften tragen können. Die Wahl des Liganden richtet sich ebenfalls nach dem durchzuführenden Assay und der intrazellulären Lokalisation des Fusionsproteins. Durch die Wahl zwischen zellgängigen und nicht-permeablen Liganden ist es möglich, Proteine in fixierten oder lebenden Zellen zu markieren oder die Expression eines Proteins an der Zelloberfäche und eines weiteren im Zytosol zu untersuchen. Derzeit ist im Gegensatz zur SNAP-tagTM-Technologie kein Ligandenpaar verfügbar, das einen FRET-Assay ermöglichen könnte, aber ein deutlich größeres Spektrum für die sogenannten „downstream“-Applikationen (SDS-PAGE, Western Blot, Massenspektrometrie). Aufgrund der auch unter denaturierenden Bedingungen stabilen Bindung des HaloTag® an seinen Liganden können HaloTag®-Fusionsproteine auf einer Oberfläche immobilisiert (HaloLinkTM Resin), über eine Säule aufgereinigt und anschließend in einem enzymatischen Assay eingesetzt oder auf einer SDS-PAGE bzw. im Massenspektrometer analysiert werden. HaloTag®-Fusionsproteine sind über einen HaloTag®-Antikörper auch in einem Western Blot detektierbar.
1.4. Vom Target zum Medikament
In der Pharmaindustrie steht die Suche nach einem neuen Wirkstoff, neuen Wirkstoffkombinationen, neuen Darreichungsformen und neuen Indikationen für bestehende Medikamente im Vordergrund.
Die Entwicklung eines neuen Medikamentes dauert im Durchschnitt 12 Jahre und beginnt mit der Identifikation eines geeigneten Angriffpunktes (engl.: Target), der innerhalb eines Krankheitsprozesses von entscheidender Bedeutung ist. Targets sind meist Rezeptoren oder Enzyme, deren Funktion durch ein Arzneimittel entweder inhibiert oder verstärkt werden soll. Die Identifikation eines Targets basiert häufig auf molekular- und zellbiologischen Methoden. Proteine, die für den Krankheitsverlauf relevant sind, können mithilfe von DNA-Chips auf eine veränderte Genregulation untersucht werden. Auf diese Weise identifizierte Gene können dann intrazellulär mittels RNA-Interferenz ausgeschalten und somit die Proteinfunktion verifiziert werden.
Der Suche nach dem Target schließt sich die Suche nach potenziellen Wirkstoffen aus riesigen Substanzbibliotheken (Screening), die eine Vielzahl chemischer Verbindungen umfassen, an. Dazu werden geeignete Nachweisverfahren entwickelt (engl.: Assay Development), die sich für die Automatisierung und Miniaturisierung im Hochdurchsatz-Verfahren (HTS, engl.: High-Throughput-Screening) eignen. Mittels biochemischer und zellulärer Methoden werden so innerhalb weniger Wochen kleinste Substanzmengen auf ihre Wirksamkeit untersucht. Diesem Prozess angegliedert ist die High-Content-Analyse (HCA), auf die im Abschnitt 1.4.1. explizit eingegangen wird.
Aus den wirksamsten Verbindungen werden Leitstrukturen entwickelt, die als Vorlage für die chemische Entwicklung optimierter Substanzen dienen. Voraussetzung dafür ist die Kenntnis der Molekülstruktur des Targetproteins. Mit diesem Wissen kann bspw. die Bindungstasche des Wirkstoffes innerhalb des Targets identifiziert werden. Dadurch wird die Synthese neuer Moleküle mit optimiertem Bindungsverhalten ermöglicht. Die Variation der
Leitstruktur dient jedoch auch dem Zweck, eine Substanz zu isolieren, die möglichst wenig Nebenwirkungen zeigt. Dies kann durch die Entfernung oder das Anhängen chemischer Gruppen an das Grundgerüst realisiert werden. Solche chemischen Modifikationen verbessern u. U. auch das Lösungsverhalten oder die Stabilität einer Substanz.
In der sich anschließenden präklinischen Entwicklung wird die Substanz auf ihre pharmakologischen und toxikologischen Wirkungen im Organismus untersucht. Pharmakologisch werden sowohl die pharmakodynamischen als auch die pharmakokinetischen Eigenschaften einer Substanz untersucht. Die Pharmakodynamik prüft, ob die Bindung des Wirkstoffs an das Zielmolekül einen Effekt hat. Die Pharmakokinetik untersucht Aufnahme, Verteilung, Verstoffwechslung und Ausscheidung der entsprechenden Substanz. Zudem wird in einer toxikologischen Prüfung der Wirkstoff hinsichtlich seiner mutagenen und kanzerogenen Eigenschaften getestet. Dazu sind prinzipiell verschiedene Vorgehensweisen möglich. Mit Hilfe von Computerprogrammen können Prozesse simuliert werden, auf deren Grundlage ungeeignete Kandidaten verworfen werden. Die verbliebenen Kandidaten können dann in
vitro an Bakterien oder an Zell- und Gewebekulturen getestet werden, bevor
sie letztlich im Gesamtorganismus näher untersucht werden. Die Prüfung einer Substanz in Tierversuchen ist unerläßlich, um ihre pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften im komplexen Zusammenspiel des Organismus zu erfassen.
Bevor der Wirkstoff in die klinische Entwicklung gelangt, wird die Darreichungsform dahingehend optimiert, dass die Substanz vom Körper optimal aufgenommen werden kann. Erst nachdem die Sicherheit und Verträglichkeit des Präparates an gesunden Probanden getestet und bestätigt wurde, erfolgen umfangreiche klinischen Studien an gesunden Probanden und schließlich an großen Patientengruppen, bis das Medikament dem Patienten zur Verfügung gestellt wird.
1.4.1. Automatisierte HCA in der Wirkstofffindung
Zum Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Wirkstoffen in der Pharmaindustrie werden sowohl biochemische als auch zelluläre Nachweisverfahren eingesetzt, die die Bindung der Substanz an das Target-Molekül oder die Inhibition von Enzymen messen. Dabei wird jedoch keine Aussage über Interaktionen der Substanz mit anderen Bestandteilen des biologischen Testsystems gemacht. Im Gegensatz dazu beurteilt die zellbasierte HCA bereits erste pharmakologische und pathophysiologische Mechanismen48. Die HCA ist definiert als die gleichzeitige Analyse mehrerer zellulärer Parameter nach Einwirken externer Einflüsse132 und erfüllt den Bedarf der Pharmaindustrie an automatisierbaren, zellulären und stabilen Testsystemen. Bei der HCA handelt es sich um eine automatisierte Hochdurchsatzmikroskopie. Diese ermöglicht, eine große Anzahl digitaler, hochauflösender Fluoreszenzbilder in einem definierten, automatisierten Mikroskopieprozess aufzunehmen und anschließend auszuwerten. Die Auswertung der Bildserien erfolgt mittels automatisierter Bildanalyseverfahren. Mit Hilfe dieser Computeralgorithmen werden zelluläre Ereignisse aufgrund von Fluoreszenzsignalen erkannt. Somit können einzelne Signale selbst aus einer Vielzahl Zellen identifiziert und miteinander verglichen werden. Daher liefert die HCA eine statistisch abgesicherte Analyse auch seltener subzellulärer Ereignisse auf Einzelzellebene22.
Der Einsatz der HCA ist in nahezu allen Stadien der Arzneimittelentwicklung denkbar. Diese umfassen die Identifizierung und Validierung des Targets, die Selektion und Optimierung einer Substanzleitstruktur und sogar die ersten pharmakologischen und toxikologischen Untersuchungen bis hin zur präklinischen Entwicklung22.
Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann also nicht nur die direkte Substanzwirkung auf intrazelluläre Strukturen oder den zellulären Metabolismus untersucht werden. Auf diese Weise werden bspw. Veränderungen in der Zellmorphologie, während der Zellteilung oder in Protein-Interaktionen untersucht, die nach Einwirkung externer Faktoren,
wie chemischer Substanzen oder siRNA (engl.: short interfering RNA) auftreten. Daher werden die Zellassays u. a. zur Identifizierung von Genen oder zellulärer Signalwege verwendet, die in Krankheitsverläufen eine Rolle spielen oder um die Funktion von Targetgenen zu bestimmen bzw. die phänotypischen Veränderungen zu untersuchen, die durch die Aktivierung oder das Abschalten von bestimmten Genen hervorgerufen werden.
Durch den Einsatz der HCA zur toxikologischen Untersuchung von Wirkstoffen in humanen Zellsystemen können die Substanzen mit starken Nebenwirkungen bereits eliminiert werden. Dies reduziert entsprechende Tierversuche und hilft die Kosten der Arzneimittelentwicklung zu senken. Die HCA vereint unterschiedliche Technologien der Zellbiologie, Fluoreszenzmikroskopie und Bioinformatik miteinander. Zu Beginn stehen zellbiologische Methoden, die die Markierung intrazellulärer Strukturen mit Fluoreszenzfarbstoffen umfassen und der späteren Bildanalyse als auszuwertende Parameter dienen. Die Qualität der Fluoreszenzfärbung ist daher von größter Bedeutung, denn nur ein optimaler Kontrast von Signal zu Hintergrund und eine homogene Färbung aller Zellen eines Experimentes ermöglicht eine fehlerfreie, automatisierte Bildanalyse. Eine Möglichkeit, auf umfangreiche Färbeprozeduren zu verzichten oder diese zu vereinfachen, ist die Verwendung von AFPs oder auch „self-labeling tags“. Dazu werden Target-Proteine als Fusionsproteine intrazellulär exprimiert und anschließend mit Substanzen behandelt. Dadurch ist die Wirkung der Substanzen auf die Fusionsproteine bzw. auf deren Signaltransduktionswege oder Substratmoleküle direkt ersichtlich.
In einem zweiten Schritt werden die fluoreszierenden Signale durch ein Fluoreszenzmikroskop erfasst und als digitales Bild archiviert. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Form der Lichtmikroskopie. Dabei werden die zuvor fluoreszenzmarkierten zellulären Strukturen mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt. Die Fluorochrome emittieren dieses Licht aufgrund der Stokesverschiebung in einem höheren Wellenlängenbereich. Durch die Verwendung verschiedener optischer Filter können die Anregungs-
und Emissionswellenlängen verschiedener Fluorochrome einer Probe voneinander isoliert werden.
Bei der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie rastert ein Laserstrahl punktweise die Zellen innerhalb der Vertiefungen der Mikrotiterplatten, wobei er in der Fokusebene der zu mikroskopierenden Probe maximal fokussiert ist. Licht aus diesem Fokus wird auf einer sich drehenden Lochscheibe (Nipkow-Scheibe mit engl.: pinholes) abgebildet und gelangt von dort auf einen Detektor, in diesem Fall eine CCD-Kamera (engl.: charge-coupled device). Dabei fallen nur die Fluoreszenzsignale, die aus der Fokusebene kommen, exakt in die pinholes. Die Signalanteile, die aus anderen Ebenen ober- oder unterhalb der Fokusebene in der Probe stammen, werden ausgeblendet. Somit kommt es zu einer (konfokalen) Schichtaufnahme84.
Um einen hohen Durchsatz zu realisieren und den Einsatz der Reagenzien zu reduzieren, sind bei der HCA die Mikroskopie- und Archivierungprozesse miniaturisiert und automatisiert.
Der letzte Arbeitsschritt der HCA-Assays umfasst die Entwicklung und Anwendung von Bildanalysealgorithmen zur Untersuchung und statistischen Auswertung zellulärer Parameter. Programme, wie MetaXpress (Molecular Devices) oder Acapella (Perkin Elmer) enthalten kleinere Unterprogramme, sogenannte Module, mit denen standardisierbare Bildanalyseroutinen (z. B. Ermittlung der Zellzahl) vorgenommen werden können. Die Arbeitsumgebung dieser Programme ermöglicht es jedoch auch, eigene Bildanalysealgorithmen zu entwickeln, die an eine spezifische Fragestellung angepaßt sind. Die Entwicklung der Algorithmen und die sich anschließende Datenanalyse sind in ihrem Aufwand und Umfang von der Fragestellung und der Anzahl untersuchter Parameter abhängig.
1.5. Ziel der Arbeit
In den vergangenen Jahren beschäftigten sich viele Studien mit der Untersuchung der Zellzyklusprogression bzw. den Mechanismen einer
Fehlregulation und den Möglichkeiten, diese durch synthetische Inhibitoren zu beeinflussen. Nahezu alle veränderten Kontrollmechanismen, wie sie in Tumorzellen gefunden werden, betreffen den Übergang von einer Zellzyklusphase in die nächste. Der Übergang von der G1- in die S-Phase und damit die Funktion der Cyclin D/CDK4 bzw. Cyclin D/CDK6 und Cyclin E/CDK2-Komplexe24 sowie der pRb-E2F-Signalweg95,113 sind besonders häufig in die Tumorgenese involviert.
Gegenstand dieser Arbeit ist es daher, die Expression und intrazelluläre Lokalisation der Cyclin D1/CDK4- bzw. Cyclin E1/CDK2-Komplexe sowie die Phosphorylierung von pRb in den einzelnen Zellyzklusphasen zu analysieren und die Wirkung von CDK-Inhibitoren auf diese Prozesse zu charakterisieren. Solche Analysen erforderten bisher meistens eine Fixierung der Zellen gefolgt von einer umfangreichen Färbeprozedur. Wesentlich flexibler ist es, das zu analysierende Protein als Fusionsprotein mit einem AFP oder „self-labeling tag“ intrazellulär zu exprimieren. Dazu sollen die Eigenschaften von YFP, SNAP-tagTM und HaloTag® hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit, Signalstabilität und ihrer Zuverlässigkeit in der Generierung und Reproduktion von Daten miteinander verglichen werden. In diesem Zusammenhang sollen die Auswirkungen einer Überexpression der Fusionsproteine auf die Zellzyklusregulation und die Substanzeffekte untersucht werden. Ziel ist es, eine zellbasierte Referenzapplikation für die HCA bereitzustellen, mit der es möglich ist, den Einfluss von potentiellen CDK-Inhibitoren auf die Aktivität der Fusionsproteine zu untersuchen.
2. Material und Methoden
Eine detaillierte Auflistung der verwendeten Geräte, Materialien, Chemikalien und DNA ist im Anhang unter 6.2. zu finden.
2.1. Molekularbiologische Methoden zur Klonierung von
CDK2, CDK4, Cyclin D1 und E1
Durch die Verwendung molekularbiologischer Methoden wurden genetische Konstrukte aus zellzyklusrelevanten Genen generiert, isoliert und auf ihre Korrektheit überprüft.
Zur Klonierung von CDK2, CDK4 sowie Cyclin D1 und E1 wurden die cDNA-Sequenzen in die Vektoren pPhi-Yellow-N (YFP, evrogen), pHT2 (HaloTag®, Promega) und pSEMS1-26m (SNAP-tagTM, covalys) eingefügt.
Dazu wurden von RZPD die Imageklone pOTB7-CDK2 (Image ID: IRAUp969F0613D6), pOTB7-Cyclin D1 (Image ID: IRAUp969A0348D6) und pOTB7-Cyclin E1 (Image ID: IRAUp969H088D6) bezogen. Die in dem Expressionsplasmid pOTB7 enthaltenen cDNA-Sequenzen von CDK2, Cyclin D1 und Cyclin E1 sind im Anhang unter 6.1.1.1. bis 6.1.1.3. abgebildet. Die cDNA von CDK4 (siehe 6.1.2.) wurde aus humaner Plazenta-cDNA amplifiziert, die freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Prof. Lauster (Dr. M. Rosowski, TU Berlin) zur Verfügung gestellt wurde.
2.1.1. Amplifikation der cDNA-Sequenzen
Die cDNA-Sequenzen von CDK2, CDK4, Cyclin D1 und Cyclin E1 wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR, engl.: polymerase-chain-reaction) aus den Imageklonen bzw. aus humaner Plazenta-cDNA amplifiziert.
Hierzu wurden Primerpaare generiert, die im Leserahmen des Genes liegend einige Basen vor dem Startkodon beginnen (sense Primer) und exakt vor dem Stoppkodon enden (antisense Primer). Alle Primer wurden am 5’-Ende mit einer Schnittstelle für ein Restriktionsenzym versehen (rot markiert), die entsprechend der nicht vorhandenen Schnittstellen in der kodierenden Region des Gens und der vorhandenen Schnittstellen in der „Multiple Cloning
Site“ (MCS) des Expressionsplasmides gewählt wurden. Zur Klonierung in den Vektor YFP und pSEMS1-26m wurde an die sense Primer eine Eco RI-, und an die antisense Primer eine Sal I-Schnittstelle (rot markiert) eingefügt. Um eine Verschiebung des Leserahmens der fusionierten Gene zu verhindern, mussten in die antisense Primer zwei zusätzliche Basen eingefügt werden (grün markiert). Die sense Primer zur Klonierung in pHT2 tragen die Sequenz für eine Nhe I-Schnittstelle und die antisense Primer die Sma I-Sequenz.
Die verwendeten Primer wurden mit Hilfe der Computerprogramme: Primer 3 und Oligonucleotide Properties Calculator generiert und von TIBMolBiol synthetisiert. Die Überprüfung der Restriktionsschnittstellen in den Plasmiden und Inserts erfolgte mit dem NEBcutter V2.0 der Firma New England Biolabs.
Amplifikationsprimer zur Klonierung in YFP und pSEMS1-26m:
CDK2 sense Primer: 5’-ACTGGAATTCGCGAGAGGTATACTGCGTTCC-3’
CDK2 antisense Primer: 5’-ACTGGTCGACTGGAGTCGAAGATGGGGTACTGG-3’ CDK4 sense Primer: 5’-ACTGGAATTCGAGGGTCTCCCTTGATCTGA-3’
CDK4 antisense Primer: 5’-ACTGGTCGACTGCTCCGGATTACCTTCATCCT-3’ Cyclin D1 sense Primer: 5’-ACTGGAATTCCCAGCCAGGACCCACA-3’
Cyclin D1 antisense Primer: 5’-ACTGGTCGACTGGATGTCCACGTCCCGC-3’ Cyclin E1 sense Primer: 5’-ACTGGAATTCGGACAAGACCCTGGCCTCAG-3’ Cyclin E1 antisense Primer: 5’-ACTGGTCGACTGCGCCATTTCCGGCCC-3’
Amplifikationsprimer zur Klonierung in pHT2:
CDK2 sense Primer: 5’-GCTAGCGCGAGAGGTATACTGCGTTCC-3’ CDK2 antisense Primer: 5’-CCCGGGGAGTCGAAGATGGGGTACTGG-3’ CDK4 sense Primer: 5’-GCTAGCGAGGGTCTCCCTTGATCTGA-3’
CDK4 antisense Primer: 5’-CCCGGGCTCCGGATTACCTTCATCCT-3’ Cyclin D1 sense Primer: 5’-ATAGGCTAGCCCAGCCAGGACCCACA-3’
Cyclin D1 antisense Primer: 5’-CCCGGGGATGTCCACGTCCCGC-3’
Cyclin E1 sense Primer: 5’-ATAGGCTAGCGGACAAGACCCTGGCCTCAG-3’ Cyclin E1 antisense Primer: 5’-CCCGGGCGCCATTTCCGGCCC-3’
erwartete Produktgrößen der Inserts:
CDK2: 1044 bp CDK4: 931 bp Cyclin D1: 934 bp Cyclin E1: 1267 bp
PCR-Ansatz Volumen Endkonzentration AccuPrime™ Pfx Reaction Mix (10x) 5µl 1x
AccuPrime™ Pfx DNA Polymerase (2,5U/µl)
1µl 2,5U
sense Primer (10µM) 5µl 50pmol
antisense Primer (10µM) 5µl 50pmol
Template-DNA 500ng-1µg
dH2O auf 50µl auffüllen
Die PCR wurde in einem Mastercycler der Firma Eppendorf durchgeführt.
PCR-Konditionen
Initiale Denaturierung 2min 95°C Denaturierung 1min 95°C
Annealing 1min 58°C 30 Zyklen Elongation 1:30min 68°C
Finale Elongation 10min 68°C
Die elektrophoretische Auftrennung der Amplifikate erfolgte in einem 1%igem Agarosegel bei 130V für ca. 45min. Dazu wurden die PCR-Ansätze mit einem Probenpuffer versetzt. Dieser erhöht die Dichte der DNA-Proben auf Grund des Saccharose-Gehaltes, wodurch sich diese leichter in die Geltaschen pipettieren lassen. Zudem enthält der Puffer Bromphenolblau, so dass die Proben während des Auftragens und Gellaufes verfolgt werden können.
DNA-Probenansatz
PCR-Ansatz 50µl
BlueJuice™ Gel Loading Buffer (10x) 5µl
Um die DNA in den Gelen sichtbar zu machen, wurden diese mit einer SYBR Safe™ DNA Gel Stain-Lösung gefärbt. Die an Nukleinsäuren gebundenen Farbmoleküle haben je ein Anregungsmaximum bei 280 und 502nm sowie ein Emissionsmaximum bei 530nm, was die DNA-Darstellung unter Verwendung eines UV-Transilluminator (Transilluminator-312nm, Saur) ermöglicht.
Ansatz für ein Agarosegel
Agarose 2g
TBE-Puffer 1x 20ml
SYBR Safe™ DNA Gel Stain (10000x) 2µl
Anhand eines ebenfalls auf das Gel aufgetragenen DNA-Größenmarkers wurde die Größe der PCR-Produkte überprüft. Bei Übereinstimmung mit der erwarteten Größe wurden die Amplifikate aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des „PCR clean-up Gel extraction“–Kits (MACHEREY-NAGEL) von Rückständen aus der PCR, wie Primer, Salze und der Polymerase befreit.
