1. Auflage 2006
© 2006 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 3-938026-80-4
Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net
Aus dem Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik der Tierärztlichen Hochschule Hannover
&
aus der Veterinärmedizinischen Fakultät, Department of Clinical Veterinary Sciences der Universität Helsinki, Finnland
___________________________________________________________________
Überprüfung der intestinalen Permeabilität bei gesunden Hunden unter Verwendung von Iohexol
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Stefanie Klenner
aus Göttingen
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. W.Ternes Prof. T. Spillmann
1. Gutachter: Prof. W. Ternes 2. Gutachter: Prof. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 02.06.2006
F ür m eine E ltern
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Teile der Arbeit wurden als Poster veröffentlicht:
Klenner, S., Bergmann, K., Coenen, M., Frias, R., Hewicker-Trautwein,M., Ternes,W.
u. T. Spillmann:
Determination of iohexol in canine serum for the assessment of intestinal permeability.
European College of Veterinary Internal Medicine - Companion Animals 15th ECVIM-CA Congress, Glasgow, 01.-03.09.2005
In: Proceedings of the 15th ECVIM-CA Congress, Glasgow, 2005, S. 211
I
Inhaltsverzeichnis
... Seite1. Einleitung ... 1
1.1. Intestinale Permeabilität ... 1
1.2. Iohexol-Analyse ... 2
1.3. Aufgabenstellung... 3
2. Literaturübersicht ... 4
2.1. Intestinale Permeabilität ... 4
2.1.1. Definition ... 4
2.1.2. Physiologie... 4
2.1.2.1. Physiologie der intestinalen Permeabilität allgemein ... 4
2.1.2.2. Beeinflussung der intestinalen Permeabilität durch endogene Faktoren 7 2.1.2.3. Beeinflussung der Permeabilität durch exogene Faktoren... 8
2.1.2.4. Beeinflussung der intestinalen Permeabilität durch Enteropathogene .... 9
2.2. Diagnostik der intestinalen Permeabilität... 10
2.2.1. Bluttests und Urinexkretionstests allgemein ... 10
2.2.1.1. Tests unter Verwendung radioaktiver Substanzen... 11
2.2.1.1.1. 51Chrom- markierte Ethylendiamintetraessigsäure (51Cr-EDTA) ... 11
2.2.1.1.2. 99mTc-Diethylentriaminpentaessigsäure (99mTc-DTPA)... 12
2.2.1.2. Zucker-Tests ... 13
2.2.1.2.1. Einführung in die Zucker-Tests ... 13
2.2.1.2.2. Verhältnis- / Differentialtests ... 15
2.2.1.3. Andere Tests... 18
2.2.1.3.1. Polyethylenglykol (PEG) ... 18
2.2.1.3.2. Weitere Markersubstanzen ... 19
2.3. Indikationen zur Bestimmung der intestinalen Permeabilität ... 20
2.4. Iohexol... 21
2.4.1. Chemische und biochemische Eigenschaften ... 21
2.4.2. Verwendung... 24
2.4.3. Iohexol als Permeabilitätsmarker ... 25
a) Beim Menschen ... 25
II
b) Bei Ratten... 25
c) Bei Kaninchen... 26
d) Beim Hund ... 26
d) Im Vergleich mit anderen Markern... 27
2.5. Analytik mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) ... 28
2.5.1. Notwendigkeit der Probenvorbereitung... 28
2.5.1.1. Flüssig- Flüssig Extraktion (FFE) versus Festphasenextraktion (SPE). 28 2.5.1.2. Iohexolanalytik – Literaturauswertung der Probenvorbereitung ... 29
2.5.2. HPLC ... 30
2.5.2.1. Iohexolanalytik – Literaturauswertung der Iohexol- Bestimmung mittels HPLC ... 30
3. Material und Methoden ... 31
3.1. Analytik... 31
3.1.1. Chemikalien ... 31
3.1.2. Geräte zur Analytik ... 32
3.1.3. Vorversuche und Methodenentwicklung ... 33
3.1.3.1. Festphasenextraktion... 33
3.1.3.1.1. Festphasenextraktionssäulen ... 33
3.1.3.1.2. Herstellung der Pufferlösungen... 34
3.1.3.1.3. Konditionierung ... 34
3.1.3.1.4. Waschlösungen ... 34
3.1.3.1.5. Elutionslösungen... 35
3.1.3.2. HPLC ... 35
3.1.3.2.1. UV-Spektrum ... 35
3.1.3.2.2. HPLC-Säulen ... 36
3.1.3.2.3. Eluent... 36
3.1.3.2.4. Gradient ... 36
3.1.3.3. Interner Standard ... 37
3.1.3.4. Inkubation der Serumproben mit Trypsin ... 37
3.1.4. Versuchsprotokoll ... 37
3.1.4.1. Festphasenextraktion... 38
III
3.1.4.1.1. Festphasenextraktion der Serumproben (s. Abb. 5) ... 38
3.1.4.1.2. Festphasenextraktion der Urinproben ... 41
3.1.4.2. Weitere Behandlung der Elutionslösung ... 41
3.1.4.2.1. Filtration der Serumproben ... 41
3.1.4.2.2. Verdünnen der Urinproben... 42
3.1.4.3. HPLC- Bedingungen ... 42
3.1.4.4. Stamm- und Kalibrierfunktionslösungen ... 43
3.1.4.5. Auswertung ... 43
3.1.5. Validierung der Methode ... 43
3.2. Tierexperimentelle Untersuchungen zum Iohexol Permeabilitäts-Serum Test (IPST) ... 44
3.2.1. Probanden ... 44
3.2.2. Labordiagnostische Untersuchungen... 45
3.2.2.1. Blutentnahme und Aufbereitung... 45
3.2.2.2. Hämatologie... 46
3.2.2.3. Blutchemische Analysen ... 47
3.2.2.4. Bestimmung von Parametern zur Dysbiosediagnostik... 47
3.2.3. Physikalische (bildgebende) Untersuchungen ... 48
3.2.4. Iohexol Permeabilitäts-Serum Test (IPST)... 50
3.2.4.1. Dosisfindung ... 50
3.2.4.2. Referenzwertermittlung... 51
3.2.5. Statistische Auswertung... 52
4. Ergebnisse ... 53
4.1. Vorversuche und Methodenentwicklung... 53
4.1.1. Festphasenextraktionssäulen ... 53
4.1.2. Waschlösungen ... 54
4.1.3. Elutionslösungen... 56
4.1.4. UV-Spektrum ... 56
4.1.5. HPLC-Säulen ... 57
4.1.6. Eluent... 58
4.1.7. Gradient ... 59
IV
4.1.8. Interner Standard ... 60
4.1.9. Enzymbehandlung der Serumproben ... 61
4.2. Validierung der Iohexolanalyse... 62
4.3. Tierexperimentelle Untersuchungen zum Iohexol Permeabilitäts-Serum Test (IPST) ... 65
4.3.1. Ergebnisse der Gesundheitsüberprüfung der Probanden... 65
4.3.1.1. Labordiagnostische Untersuchungen... 65
4.3.1.1.1. Hämatologie... 65
4.3.1.1.2. Blutchemische Analyse ... 65
4.3.1.1.3. Bestimmung der Parameter zur Dysbiosediagnostik ... 66
4.3.1.1.4. Kontrolluntersuchung der veränderten Parameter der Dysbiosediagnostik ... 67
4.3.1.2. Physikalisch (bildgebende) Untersuchungen ... 68
4.3.1.2.1. Röntgenologische Untersuchungen ... 68
4.3.1.2.2. Endoskopische Untersuchung ... 70
4.3.2. Ergebnisse der Untersuchungen zur Dosisfindung ... 71
4.3.3. Ergebnisse der Untersuchungen zur Referenzwertermittlung... 74
5. Diskussion... 76
5.1. Iohexol-Analyse ... 76
5.2. Tierexperimentelle Untersuchungen zum Iohexol Permeabilitäts-Serum Test80 5.2.1. Gesundheitsüberprüfung der Probanden ... 80
5.2.2. Iohexol Permeabilitäts-Serum Test (IPST)... 83
5.2.2.1. Iohexol als Permeabilitätsmarker ... 83
5.2.2.2. Dosisfindung ... 85
5.2.2.3. Referenzwertermittlung... 86
5.3. Ausblick ... 88
6. Zusammenfassung... 90
Summary... 94
7. Literaturverzeichnis ... 97
8. Anhang... 110
V
Abkürzungen
51Cr-EDTA 51Chrom- markierte Ethylendiamintetraessigsäure
99mTc metastabiles Isotop 99Technetium
°C Grad Celsius Abb. Abbildung
ALT Alanin- Amino- Transferase AP Alkalische Phosphatase Baso Basophile Zellen
ca. circa
cE1 canine pankreatische Elastase
cTLI canine Trypsin-Like Immunoreactivity
Da Dalton
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EKG Elektrokardiographie
Eos Eosinophile Zellen FE Flächeneinheit Folsre Folsäure GBq Giga Bequerel
GE Gesamteiweiß
ggr. geringgradig
GLDH Glutamat- Dehydrogenase
h hour, Stunde
H2O Wasser HCT Hämatokrit
Hg Quecksilber
HGB Hämoglobin
HPLC High pressure liquid chromatography, Hochdruckflüsigkeitschromatographie i.v. intra venös
IBD Inflammatory bowel disease, chronisch entzündliche Darmerkrankung
VI KbE Kolonie bildende Einheiten KGW Körpergewicht
KKT Klinik für kleine Haustiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
L:R Laktulose- Rhamnose Verhältnis LD50 Letale Dosis50
Lymph Lymphozyten
MCH Mean corpuscular hemoglobin, Mittlerer Hämoglobingehalt der Einzelerythrozyten
MCHC Mean corpuscular hemoglobin concentration, Mittlere Hämoglobinkonzentration der Erythrozyten
MCV Mean corpuscular volume, Mittleres Erythrozytenvolumen MeOH Methanol
mg Milligramm mgr. mittelgradig
min Minute
ml Milliliter mmol Millimol Mono Monozyten mosm Milliosmol mSv Millisievert MW Mittelwert
n Anzahl
NaCl Natriumchlorid, Kochsalz Neutr Neutrophile Zellen
nm Nanometer
NSAID Nonsteroidal antiinflammatory drug, Nicht-steroidales Antiphlogistikum o.b.B. ohne besonderen Befund
Pa Pascal
PLT Platelets, Thrombozyten
RBC Red blood cells, Rote Blutkörperchen
VII
s. siehe
s.u. siehe unten
SD Standard deviation, Standardabweichung
SH Schleimhaut
SPE Solid phase extraction, Festphasenextraktion Tab. Tabelle
u.a. und andere UV Ultra Violett
Vit B12 Vitamin B12, Kobalamin
WBC White blood cells, Weiße Blutkörperchen WFR Wiederfindungsrate
z.B. zum Beispiel
Å Ångström
VIII
1
1. Einleitung
1.1. Intestinale Permeabilität
Die intestinale Permeabilität hat die Aufgabe, selektiv Molekülen die Passage der Darmwand zu erlauben bzw. zu verwehren. Sie lässt einerseits exogen zugeführte nutritive Bestandteile passieren, bildet jedoch andererseits eine effektive Barriere gegen schädliche Substanzen. Es handelt sich somit um eine im Inneren des Körpers befindliche Grenze gegenüber den, im Lumen des Darmes befindlichen Stoffen.
Beeinträchtigungen dieser Kontrolleinrichtung entstehen durch exogen zugeführte, die Darmschleimhaut schädigende Substanzen, durch chronische Darmkrankheiten oder durch systemische Erkrankungen. Die Verminderung oder der Verlust dieser Schutzeinrichtung setzt den Organismus vermehrt potentiell schädlichen Agenzien aus.
Die Überprüfung der intestinalen Permeabilität kann aus mehreren Gründen sinnvoll sein. Zunächst erhält man direkt einen Einblick über das Ausmaß der Schädigung der Intestinalmukosa bei einem darmkranken Patienten. Das erleichtert die Einschätzung des Schweregrades der Krankheit. Im weiteren Verlauf objektiviert der Test die Beurteilung des Therapieerfolges. Auch Krankheitsrückfälle können durch die primär entstehende erhöhte Darmpermeabilität prognostiziert werden (HALL u.
BATT 1991).
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht in der Überprüfung des positiven oder negativen Einflusses von Medikamenten auf die Darmpermeabilität. Außerdem ist die Bewertung neu entwickelter Futtermittel im Hinblick auf ihre permeabilitätsfördernden Eigenschaften möglich.
2
Eine Vielzahl unterschiedlicher Permeabilitätstests steht bis dato zur Verfügung.
Dieses Angebot wird jedoch durch die Nachteile der einzelnen Tests stark eingeschränkt. Der 51Chrom-markierte Ethylendiamintetraessigsäure- (51Cr-EDTA) Test sowie Zucker-Tests sind momentan am weitesten verbreitet. Der erste Test verwendet eine radioaktive Substanz, welches die Akzeptanz diesem Test gegenüber mindert und geeignete Untersuchungsräume voraussetzt. Einige, in den Zucker-Tests verwandten Zucker unterliegen teilweise einer Metabolisierung im Organismus und sind auf Grund dessen nur eingeschränkt nutzbar.
Das vielseitig in der Human- und Tiermedizin verwendete Röntgenkontrastmittel Iohexol erfüllt alle Eigenschaften eines idealen Permeabilitätsmarkers. Beim Menschen detektierte Iohexol zuverlässig Permeabilitätsveränderungen (HALME et al. 1997). Eine Studie zeigte eine bessere Korrelation der klinischen Symptome mit Iohexol als Permeabilitätsmarker als mit Zuckern (HALME et al. 2000). Mit der in dieser Arbeit entwickelten Analysenmethode zeigten FRIAS et al. (2005 a), dass Iohexol im Vergleich zu dem etablierten 51Cr-EDTA Test gut als Permeabilitätsmarker beim Hund einsetzbar ist.
1.2. Iohexol-Analyse
Traditionell wird Iohexol mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) detektiert. Dieses Chromatographiesystem beinhaltet eine HPLC-Säule, welche leicht durch Matrixbestandteile zugesetzt wird. Eine effiziente Probenvorbereitung ist notwendig, um dieses Problem zu umgehen und die Lebenszeit der HPLC-Säule zu verlängern. Es dominiert die Flüssig-Flüssig-Extraktion (FFE) als Vorbereitung von Serumproben. Urinproben werden verdünnt.
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1.3. Aufgabenstellung
In der vorliegenden Arbeit soll ein einfacher, in der täglichen klinischen Arbeit einsetzbarer Iohexol Permeabilitäts-Serum Test beim Hund entwickelt werden.
Zunächst wird eine Festphasenextraktion (Solid Phase Extraktion, SPE) als Vorbereitung von Serum und Urinproben erarbeitet. Bis heute existiert eine SPE für die Iohexol-Analyse lediglich für die Matrix Wasser (PUTSCHEW et al. 2001). Das Ziel ist eine verstärkte Schonung der HPLC-Säule mit dieser Art der Probenvorbereitung und damit einhergehend auch eine Reduktion der Kosten für die Analyse.
Des Weiteren erfolgt die systematische Überprüfung der Eignung von Iohexol als Permeabilitätsmarker beim Hund. Zunächst wird die Gesundheit der in die Studie einbezogenen Probanden getestet. Besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Darmgesundheit. An gesunden Hunden folgt die Ermittlung der geeigneten Iohexol- Dosierung nach oraler Gabe. Untersuchungen zur Bestimmung des Iohexol- Referenzwertes schließen sich an.
4
2. Literaturübersicht
2.1. Intestinale Permeabilität
2.1.1. DefinitionDie intestinale Permeabilität beschreibt die Durchlässigkeit des Darmepithels. In Studien zur Darmpermeabilität wird darunter vornehmlich die Passage von Molekülen mittels Diffusion verstanden (MENZIES 1984). Passive oder aktive biochemische Transportsysteme üben auf diesen Molekülübertritt keinen Einfluss aus (TRAVIS u. MENZIES 1992).
2.1.2. Physiologie
2.1.2.1. Physiologie der intestinalen Permeabilität allgemein
Seit den achtziger Jahren werden die anatomischen Grundlagen der intestinalen Permeabilität diskutiert und sind immer wieder Gegenstand von wissenschaftlichen Untersuchungen. Noch ist nicht eindeutig geklärt, auf welchem Weg die Permeabilitätsmarker die intestinale Mukosa durchdringen. Es folgt eine kurze Darstellung der gängigsten Hypothesen.
Hypothese I: Einzig parazelluläre Permeation des Darmepithels
HOLLANDER (1993) vertritt die Hypothese, dass alle Permeabilitätsmarker die Darmwand auf parazellulärem Weg durchdringen. Diese Passage erfolgt durch die interzellulär gelegenen Tight junctions (NUSRAT et al. 2000). Diese bestehen aus einem Multiproteinkomplex welcher mit einem Aktomyosinring verbunden ist. Der Multiproteinkomplex vereint mehrere Transmembranproteine mit zytoplasmatischen Proteinen (MIJOSCHI u. TAKAI 2005).
5
Laut dieser Hypothese befinden sich an der Spitze der Darmzotten viele interzelluläre, sehr dichte Tight junctions, welche kleineren Molekülen wie Polyethylenglykol (PEG) 400 oder Monosacchariden die Permeation erlauben.
Größere Moleküle wie Disaccharide und 51Cr-EDTA können die Darmwand jedoch nur durch weniger dichte Tight junctions in Kryptennähe passieren (s. Abb. 1). Da diese Tight junctions schwieriger zu erreichen sind als die Tight junctions an der Villusoberfläche, sind die Permeationsraten für größere Substanzen deutlich niedriger als für Moleküle geringerer Größe (HOLLANDER 1992).
Abb. HOLLANDER (1992)
Abb. 1: Modell der einzig parazellulären Passage durch das Darmepithel. Die Linien zwischen den Zellen symbolisieren die Tight junctions. Die Krypten befinden sich im unteren Bereich der Abbildung.
Dichtere und kleinere Tight junctions an der Villusspitze sind für kleine Moleküle permeabel (kleinere Kugeln). Größere Tight junctions in Kryptennähe erlauben Molekülen von ca. 10 Å (= 1 nm) die Passage (große Kugeln).
6
Neuere Untersuchungen postulieren ebenfalls das Vorhandensein kleiner Poren (Radius < 6 Å = < 0,6 nm) im apikalen Teil der Darmzotten. Der Transport der durchtretenden Moleküle findet passiv durch Konvektion (solvent drag) statt. Der basale Teil der Villi enthält Poren mittlerer Größe (10-15 Å = 1-1,5 nm) durch die keine Konvektion stattfindet. Poren in den Krypten sind groß (50-60 Å = 5-6 nm). Sie sind unerreichbar für den luminalen Darminhalt (FIHN et al. 2000).
FIHN et al. (2000) konnten in ihren Untersuchungen kein 51Cr-EDTA, als Vertreter der größeren Moleküle, in den Krypten nachweisen. Folglich gehen sie nicht davon aus, dass 51Cr-EDTA durch Poren in Kryptennähe die Darmwand passiert. Sie vertreten die These, dass 51Cr-EDTA die Intestinalmukosa durch Poren mittlerer Größe an der Villusbasis durchquert. Mannitol, als Vertreter der kleineren Moleküle, passiert die Membran durch die kleinen, an der Villusspitze gelegenen Poren.
Hypothese II: Durchtritt para- und transzellulär
Die zweite Hypothese beschreibt den Membrandurchtritt auf transzellulärem Weg für Moleküle mit einer Größe kleiner als 0,4 nm und den parazellulären Weg für Moleküle ab einer Größe von 0,5 nm (MENZIES 1984).
Die Bürstensaummembran der Enterozyten ist eine Lipiddoppelschicht. Auf Grund dessen können hydrophile Substanzen diese nicht einfach durchqueren. Dafür benötigen sie integrale Membranproteine. Diese Poren sind im Inneren hydrophil und erlauben lipophoben Substanzen die Diffusion. Da diese Poren sehr klein sind, können nur Substanzen geringerer Größe durch sie hindurch gelangen. Sie sind in größerer Anzahl vorhanden als die parazellulären Durchtrittsstellen (MEDDINGS 1997).
Als relativ kleines Molekül durchquert Rhamnose die Zellmembran durch diese kleinen hydrophilen Poren hoher Inzidenz. Laktulose und 51Cr-EDTA passieren die Intestinalmukosa auf dem parazellulären Weg (MENZIES 1984).
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2.1.2.2. Beeinflussung der intestinalen Permeabilität durch endogene Faktoren
Eine Vielzahl von endogenen Faktoren beeinflusst die intestinale Permeabilität. Alter, Größe und Gewicht, Stress, Zytokine sowie eine erhöhte sportliche Aktivität und die Region, in der der Patient lebt, üben Einfluss auf die intestinale Permeabilität aus.
Das Alter sowie die Rasse spielt bei der Permeabilitätsbeurteilung scheinbar eine Rolle. Das Laktulose-Rhamnose Verhältnis (L:R) ist bei 12 Wochen alten Zwergpudeln, Mittelschnauzern und Riesenschnauzern signifikant höher als bei 22 Wochen alten Welpen (WEBER et al. 2002). Eine negative Korrelation zwischen Alter und Permeabilität konnte ebenfalls bei Kindern gezeigt werden (KALACH et al.
2001). Ein Unterschied zwischen sechs, acht und zwölf Wochen alten Welpen wurde jedoch mit dem Xylose: 3-O-Methyl-D-Glukose Verhältnistest nicht beobachtet (GARDEN et al. 1998). In der gleichen Studie zeigten sechs Wochen alte, gesunde Welpen unterschiedlicher Rassen eine signifikant höhere L:R als gleichaltrige gesunde Irish Setter Welpen, ein Hinweis auf unterschiedliche Permeabilitätsraten bei verschiedenen Rassen. Auch Hunde größerer und schwererer Rassen zeigten im Alter von 12, 22, 36 und 60 Wochen eine höhere L:R als gleichaltrige Welpen kleinerer und leichterer Rassen (WEBER et al. 2002). Ursache dafür könnten größen-assoziierte Unterschiede der intestinalen Mukosaoberfläche, der Porengröße, Anzahl der Tight junctions, Erreichbarkeit der Krypten für den luminalen Inhalt oder Unterschiede im Verhältnis der Tight junctions in den Villuskrypten und der Villusoberfläche sein (WEBER et al. 2002).
Stress übt einen negativen Einfluss auf die intestinale Permeabilität aus (HOLLANDER 2003). Damit in Zusammenhang stehen Erhöhungen bestimmter Zytokine. Als wichtigste Zytokine, die auf die intestinale Permeabilität einwirken, sind Tumor Nekrosefaktor- alpha (TNF-α), Interferon- gamma (IFN-γ) und Interleukin 4 (IL-4) zu nennen (NUSRAT et al. 2000, THOMSON et al. 2003 b). Interleukin 10 (IL- 10) übt dagegen eher einen protektiven Einfluss auf die intestinale Permeabilität aus (WANG u. HASSELGREN (2002)).
8
Sportlich genutzte Hunde zeigen ebenfalls eine Permeabilitätserhöhung. DAVIS et al.
(2005) zeigten eine erhöhte intestinale Permeabilität bei Schlittenhunden nach Durchlaufen eines Hundeschlittenrennens in Alaska. Auch RANDELL et al. (2001) beobachteten bei gesunden Greyhounds, welche täglich als Rennhunde trainiert wurden, erhöhte L:R Werte.
Faktoren der äußeren Umwelt müssen bei der Beurteilung der Permeabilität in Betracht gezogen werden. Patienten aus tropischen Regionen zeigen zum Beispiel eine höhere Permeabilität als Patienten aus anderen Regionen (MENZIES et al.
1999). Wiederholte, subklinische Darminfektionen aufgrund schlechterer Hygiene- standards in den tropischen Regionen stellen vermutlich die Ursache dar.
2.1.2.3. Beeinflussung der Permeabilität durch exogene Faktoren
Die intestinale Permeabilität wird durch nicht-steroidale Antiphlogistika (NSAID) beeinflusst. SIGTHORSSON et al. (1998) fanden heraus, dass bei Patienten, die sechs Monate lang mit NSAID behandelt wurden, das L:R Verhältnis im Gegensatz zur unbehandelten Kontrollgruppe signifikant anstieg. Diese Permeabilitätssteigerung konnte auch nach kurzzeitigem NSAID-Einsatz gezeigt werden (SMECUOL et al.
2001). Dabei bestand ein Unterschied zwischen verschiedenen NSAID. Die Magenpermeabilität wurde durch das NSAID „Naproxen“ signifikant beeinflusst.
Veränderte L:R Verhältnisse wurden in 42 % der mit dem Medikament „Meloxicam“, 62 % der mit „Indomethazin“ behandelten Patienten und in 75 % der mit „Naproxen“
behandelten Patienten beobachtet. „Celecoxib“ übte keinen negativen Einfluss auf die Permeabilität aus.
9
Die Permeabilität wird von der Molarität der oral gegebenen Lösung maßgeblich beeinflusst. Eine isotone Lösung besitzt eine Molarität von 275 mmol/l. Eine Erhöhung der Molarität auf 2029 mmol/l führte beim Menschen im Vergleich zu einer isomolaren Lösung zu einer mehr als doppelt so hohen Laktulose Exkretion im Urin (LAKER u. MENZIES 1977). Diese Untersuchungen wurden mit verschiedenen Substanzen (Saccharose, Glukose, Glycerol, Mannitol, Harnstoff, Natriumchlorid) durchgeführt, welche alle den gleichen Effekt verursachten. Auch MAXTON et al.
(1986) beobachteten eine verstärkte Ausscheidung von Laktulose und 51Cr-EDTA nach Eingabe von hypertonen Lösungen (1500 und 2300 mmol/l). Die Rhamnose Exkretion veränderte sich nicht wesentlich. Eine deutliche Permeabilitätssteigerung kann ab einer Molarität von ca. 1400 mmol/l festgestellt werden (LAKER u. MENZIES 1977). Da durch eine erhöhte Molarität mehr Zucker aufgenommen wird, kann dieser Effekt auch zur Steigerung der Sensitivität des jeweiligen Tests beitragen (SIGTHORSSON et al. 1998).
Gesunde Hunde zeigten nach oraler Aufnahme einer 745 mosm/kg Lösung selbstlimitierenden Durchfall (STEINER et al. 2002). Durch diese hyperosmolare Zuckerlösung wurde jedoch kein Einfluss auf die Zuckerkinetik beobachtet, ein Permeabilitätstest kann somit problemlos durchgeführt werden.
2.1.2.4. Beeinflussung der intestinalen Permeabilität durch Enteropathogene
Bakterien und Viren können über eine Vielzahl von verschiedenen Mechanismen auf die Tight junctions und damit auf die intestinale Permeabilität einwirken. Zu den vier wichtigsten, potentiellen Wirkungen von Enteropathogenen zählen die direkte Spaltung der Strukturproteine der Tight junctions, die Modifikation des Aktin-Myosin- Cytoskeletts, die Aktivierung zellulärer Signalkaskaden und die Verstärkung der Transmigration polymorphkerniger Zellen durch das Epithel (SEARS 2000).
10
2.2. Diagnostik der intestinalen Permeabilität
Um die intestinale Permeabilität adäquat bestimmen zu können, benötigt man einen geeigneten Permeabilitätsmarker. Idealerweise ist dieser stabil, nicht toxisch und biologisch inert. Ein Abbau durch intestinale Enzyme oder Bakterien findet nicht statt.
Er sollte sich vornehmlich in den Extrazellulärraum verteilen, die Darmmembran auf dem Wege der Diffusion durchqueren und vollständig über die Niere ausgeschieden werden (MENZIES 1984, SORENSEN et al. 1997).
Bisher wurde eine Vielzahl an unterschiedlichsten Permeabilitätsmarkern eingesetzt.
Davon erfüllt jedoch keiner alle Kriterien eines idealen Permeabilitätsmarkers.
Radioaktiv markierte Substanzen, Zuckermoleküle, Polymere sowie Röntgen- kontrastmittel bilden die größten Gruppen.
2.2.1. Bluttests und Urinexkretionstests allgemein
Intestinale Permeabilitätsmarker werden oral verabreicht. Ein bestimmter Anteil des Markers wird im Darm absorbiert, gelangt ins Blut und wird renal ausgeschieden. Der Nachweis des Markers kann aus Plasma, Serum oder Urin erfolgen. Erste Untersuchungen wurden mit Urinproben durchgeführt, da die Probenmarker im Urin in ca. 100fach höherer Konzentration vorhanden sind als im Plasma. Somit können in der Regel auch sehr geringe Konzentrationen detektiert werden. Voraussetzung ist jedoch eine möglichst vollständige Exkretion des Permeabilitätsmarkers über die Nieren (MENZIES 1984). Bisher wurden Urinexkretionstests über einen Zeitraum von 5 bis 24 Stunden durchgeführt. Eine quantitative Bestimmung der Permeabilitäts- marker aus dem Urin ist nur möglich, wenn über den Testzeitraum der gesamte produzierte Urin aufgefangen und die Menge bestimmt wird. Dafür müssen Hunde für den Testzeitraum in einem besonderen Stoffwechselkäfig gehalten werden. Die Harnblase muss nach Beendigung des Tests vollständig per Katheter entleert werden. Dieses birgt ein gewisses Infektionsrisiko (FRIAS et al. 2004). Auf Grund dieser Nachteile ist für eine Reihe an Markern eine Bestimmung aus dem Plasma oder Serum wünschenswert.
11
2.2.1.1. Tests unter Verwendung radioaktiver Substanzen
Tests unter Verwendung von radioaktiven Substanzen besitzen den Vorteil einer sehr sensitiven und einfachen Analyse. Die Akzeptanz dieser Tests ist jedoch auf Grund der Radioaktivität der Marker gering. Die weiteste Verbreitung fand 51Chrom- markierte Ethylendiamintetraessigsäure (51Cr-EDTA).
2.2.1.1.1. 51Chrom- markierte Ethylendiamintetraessigsäure (51Cr-EDTA)
EDTA ist ein Komplexbildner, welcher mit dem radioaktiven, synthetisch hergestellten 51Chrom einen stabilen Chelatkomplex eingeht. 51Cr-EDTA besitzt eine Halbwertszeit von 27 Tagen und emittiert β- sowie γ-Strahlung. Die Äquivalentdosis nach Gabe von 0,37 GBq 51Cr-EDTA beträgt weniger als 0,12 mSv (BJARNASON et al. 1995). Diese Dosis ist sechsmal niedriger als die Strahlung, die während der Aufnahme eines Routine Abdomenröntgenbildes emittiert wird (FRIAS et al. 2004).
51Cr-EDTA zeigt keine toxischen Effekte im Organismus. Histologische Veränderungen des Darmes oder der Niere werden nicht beobachtet (AHRENS u.
ARONSON 1971). Es ist chemisch stabil und wird nicht durch Bakterien oder intestinale Hydrolasen abgebaut. 51Cr-EDTA verteilt sich im Extrazellulärraum und wird nach intravenöser Gabe schnell und vollständig über die Niere ausgeschieden.
Alle diese Eigenschaften machen es zu einem nahezu idealen Permeabilitätsmarker (HALL et al. 1989, FRIAS et al. 2004). Die Analyse des Radioisotopes ist leicht und sensitiv (FRIAS et al. 2004).
Nachdem 51Cr-EDTA zunächst erfolgreich beim Menschen zur Permeabilitäts- beurteilung eingesetzt wurde (BJARNASON et al. 1983), folgten Studien an Hunden.
Die 24 h- Urinexkretion beträgt bei gesunden Hunden nach oraler Administration 2,3-17,6 % (Median 13 %) (HALL et al. 1989). 51Cr-EDTA wird ebenfalls im Colon absorbiert. Mögliche, mit erhöhter Permeabilität einhergehende Erkrankungen des Dickdarmes sollten bei der Beurteilung eines 24 h Wertes in Betracht gezogen werden (ANDERSON et al. 2004). Eine Urinentnahme nach sechs Stunden ergibt
12
adäquate Testergebnisse zur Bestimmung der Dünndarmpermeabilität (MARKS u.
WILLIAMS 1998). Kürzlich wurde eine Methode entwickelt, 51Cr-EDTA nach oraler Gabe aus dem Serum zu bestimmen (FRIAS et al. 2004). Der prozentuale Anteil der oral administrierten Dosis betrug im Mittelwert ± die Standardabweichung (Range) nach 2, 3, 4, 5 und 6 Stunden 0,49 ± 0,45 % (0,02- 2,13 %), 0,75 ± 0,52 % (0,03- 1,89 %), 0,82 ± 0,57 % (0,13-2,21 %), 0,70 ± 0,53 % (0,12-1,99 %) und 0,47 ± 0,44
% (0,11-1,79 %). Es ist möglich, diesen Test sowohl im Serum als auch im Plasma durchzuführen (FRIAS et al. 2005 b).
Mit der Methode wurden Erhöhungen der Permeabilität für 51Cr-EDTA bei Hunden mit Gluten- sensitiver Enteropathie, Giardienbefall und Patienten mit bakterieller Überbesiedlung des Dünndarmes detektiert. Diese Permeabilitätsveränderungen wurden auch in Fällen ohne nennenswerte histologische Veränderungen der Mukosa offensichtlich. In der gleichen Studie konnte eine Verminderung der Permeabilität nach einer der jeweiligen Krankheit entsprechenden Therapie gezeigt werden (HALL u. BATT 1990).
2.2.1.1.2. 99mTc-Diethylentriaminpentaessigsäure (99mTc-DTPA)
DTPA bildet mit radioaktivem Technetium einen Chelatkomplex. Die Halbwertszeit von 99mTc-DTPA beträgt 6 Stunden. Auf Grund dessen ist es weniger gut als Markersubstanz geeignet, da eine schnelle Analyse der gewonnenen Proben notwendig ist. 99mTc-DTPA detektiert Permeabilitätsveränderungen ähnlich wie 51Cr- EDTA (RESNICK et al. 1990).
13 2.2.1.2. Zucker-Tests
2.2.1.2.1. Einführung in die Zucker-Tests
Für die Zucker-Tests werden Mono- und Disaccharide sowie synthetisch modifizierte Zucker eingesetzt. Ein Vorteil der Zucker ist ihre biologische Unbedenklichkeit.
Nachteilig wirkt sich der Abbau der Zucker durch bakterielle Enzyme vornehmlich aus dem Colon aus (MEDDINGS 1997). Die Interpretation der Ergebnisse der Zucker-Tests kann durch eine mögliche Metabolisierung einiger Zucker fehlerbehaftet sein (HALL u. BATT 1996).
Die am häufigsten verwendeten Monosaccharide sind Rhamnose, Mannitol, Xylose und Methyl-D-Glukose. Alle Monosaccharide besitzen ein Molekulargewicht < 200 g/mol und einen Durchmesser von < 0,4 nm (UIL et al. 1997). Damit durchdringen sie (je nach Theorie) die apikal an der Darmzotte gelegenen Poren parazellulär bzw.
passieren die Darmwand transzellulär (Hypothese II). Mannitol besitzt den Nachteil, dass es beim Menschen natürlicherweise in kleinen Mengen im Urin vorkommt. Bei der Berechnung der Ergebnisse muss dieser Faktor berücksichtigt werden (LAKER et al. 1982).
Vertreter der Disaccharide sind unter anderem Saccharose, Laktulose, Cellobiose und das Chlorderivat Sukralose. Der Durchmesser dieser Zucker ist > 0,5-0,6 nm bei einem Molekulargewicht von > 300 g/mol (UIL et al. 1997). Auf Grund dieser Größe durchdringen Disaccharide die Intestinalmukosa durch die Poren mittlerer Größe im basalen Teil der Villi oder durch die großen Poren in Kryptennähe. Folgt man der zweiten Hypothese, so erfolgt der Übertritt auf parazellulärem Weg.
Zwei der Disaccharide unterscheiden sich von den anderen Zuckern: Saccharose und Sukralose.
Saccharose (auch: Rohrzucker) wird im Dünndarm durch das Enzym Sukrase- Isomaltase in der Bürstensaummembran der Enterozyten hydrolysiert (THOMSON et al. 2003 a). Dabei entstehen die Monosaccharide Glukose und Fruktose. Da Saccharose im Magen und Duodenum noch intakt vorliegt, kann es
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Permeabilitätserhöhungen in diesen Bereichen nachweisen (MEDDINGS et al. 1993, MEDDINGS u. GIBBONS 1998). Die Detektion weiterer intestinaler Schädigungen erfolgt nicht, da der Marker in diesem Bereich bereits durch das Enzym abgebaut wurde und nicht mehr als vollständiges Molekül ins Blut und in den Urin übertritt. In einer klinischen Studie an Hunden, die ein Hundeschlittenrennen in Alaska absolvierten, konnte jedoch keine Korrelation zwischen Magenulzera und einer erhöhten Saccharosepermeabilität gezeigt werden (DAVIS et al. 2005). Da Serum- und Urinproben jedoch erst 4 und 6 Stunden nach Zuckeradministration entnommen wurden, besteht die Möglichkeit, dass schon vor dieser Probenentnahme ein Serumpeak auftrat.
Bei Sukralose handelt es sich um ein synthetisch chloriertes Saccharose- Molekül mit einem Molekulargewicht von 397 g/mol. Es passiert den Darmtrakt, ohne absorbiert zu werden. Sukralose wird nicht durch Bakterien im Colon abgebaut und erreicht intakt auch hintere Darmabschnitte (MEDDINGS u. GIBBONS 1998).
Veränderte Permeabilitätswerte nach alleiniger Messung von Sukralose aus 24 h Urin zeigen somit Störungen im gesamten Darmtrakt auf.
Alle übrigen Zucker werden im Dickdarm durch Bakterien abgebaut und detektieren auf Grund dessen nur Störungen im vorderen Intestinalbereich.
Die Wiederfindungsraten von Rhamnose, Xylose und Saccharose betrugen nach intravenöser Gabe bei gesunden Hunden nur 72 %, 48 % und 75,7 %. Diese Daten weisen auf eine Metabolisierung der Zucker im Körper hin (HALL u. BATT 1996).
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Nach MEDDINGS und GIBBONS (1998) können die Permeabilitätsmarker in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden:
Klasse 1: Der Marker wird nach verlassen des Magens abgebaut.
Bsp.: Saccharose
Klasse 2: Der Marker passiert schnell den Magen und den größten Teil des Dünndarmes, bevor er abgebaut wird.
Bsp.: Laktulose, Mannitol und Rhamnose
Klasse 3: Der Marker passiert den gesamten Magen-Darmtrakt intakt und wird nicht abgebaut.
Bsp.: Sukralose, 51Cr-EDTA, PEG, Röntgenkontrastmittel
2.2.1.2.2. Verhältnis- / Differentialtests
Die Absorptionsrate eines Permeabilitätsmarkers hängt nicht einzig von der Permeabilität der Darmschleimhaut ab. Nicht-Schleimhaut-Faktoren wie Magen- entleerungsrate, Transitzeit und Verdünnung im Darm, systemische Verteilung, Metabolismus, renale Ausscheidung und Urinentnahme haben einen bedeutenden Einfluss auf die Marker (HALL 1999, MENZIES 1984). Um die Abhängigkeit des Untersuchungsergebnisses durch diese Nicht-Schleimhaut-Faktoren zu umgehen, wurden die so genannten „Verhältnis- oder Differentialtests“ entwickelt. Dabei werden zwei Markermoleküle, welche die Mukosa auf unterschiedlichen Wegen durchdringen (kleine Poren apikal am Villus/ größere Poren basal oder parazellulärer/ transzellulärer Durchtritt), gleichzeitig eingesetzt. Die Bildung des Verhältnisses aus den beiden gemessenen Werten eliminiert den Fehler weitgehend, unter der Annahme, dass beide Proben in gleicher Weise durch die Nicht- Schleimhaut- Faktoren beeinflusst wurden (s. Abb. 2) (MENZIES 1984).
Traditionell wird das Verhältnis aus einem Mono- und einem Disaccharid gebildet.
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Abb. 2: Theorie der Verhältnistests:
Zwei administrierte Marker (x und y) werden durch alle Variablen außer der Mukosapermeabilität in gleicher Weise beeinflusst und ergeben somit einen spezifischen Permeabilitätsindex.
Da die Zucker teilweise metabolisiert werden, läge hier trotz der Anwendung des Verhältnistests ein Fehler vor, da beide Zucker nicht in gleichem Maße beeinflusst würden (HALL u. BATT 1996).
Erweiterungen der Verhältnistests:
Um gleichzeitig die Permeabilität des Dünn- sowie des Dickdarmes zu untersuchen, wurden die „3-Zucker-Tests“ entwickelt. Dabei werden zwei Zucker aus dem Verhältnistest (zum Beispiel Laktulose und Rhamnose) mit Sukralose kombiniert. Die
Abb. HALL (1999)
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Zucker aus den Verhältnistests werden durch im Colon vorhandene Bakterien abgebaut und detektieren in diesem Bereich keine Permeabilitätsveränderungen.
Sukralose widersteht der bakteriellen Hydrolyse und wird im Colon absorbiert. Aus einer nach 24 h entnommenen Sammelurinprobe subtrahiert man den Laktulosewert vom Sukralosewert und erhält somit die Rate der Colonabsorption. Der 3-Zucker- Test wurde erfolgreich bei Patienten nach NSAID Einnahme eingesetzt (SMECUOL et al. 2001). Jedoch zeigte eine andere Arbeitsgruppe eine Absorption von Laktulose im Dickdarm. Damit würde der 3-Zucker-Test unbrauchbar (ANDERSON et al. 2004).
Eine weitere Abwandlung des Testes ist die gleichzeitige Administration von Saccharose, um die Magenpermeabilität mit zu bestimmen (MEDDINGS u.
GIBBONS 1998, DAVIS et al. 2005).
Bestimmung der Zucker:
Eine gemeinsame Bestimmung von Rhamnose, Methyl-D-Glukose, Xylose, Saccharose und Laktulose aus caninem Urin kann mittels Anionenaustauscher Chromatographie und gepulster amperometrischer Detektion durchgeführt werden (STEINER et al. 2000). Die Bestimmung mehrerer Zucker aus dem Urin ist mittels HPLC ebenfalls möglich (SORENSEN et al. 1993).
SORENSEN et al. (1997) entwickelten eine HPLC Methode, nach der Rhamnose, Laktulose, Methyl-D-Glukose und Xylose gleichzeitig im Blut detektiert werden können. Kürzlich wurde an Kaninchen und Mäusen eine Methode zur Analyse von Laktulose und Rhamnose aus einem Tropfen Blut entwickelt (KATOUZIAN et al.
2005).
Urinexkretionstests unter Verwendung von Laktulose, Rhamnose, Xylose, Methyl-D- Glukose und Saccharose sollten mindestens über einen Zeitraum von sechs Stunden durchgeführt werden, um die gastrointestinale Permeabilität akkurat bestimmen zu können. Dies stellten STEINER et al. (2002) fest, nachdem sie die Pharmakokinetik der verschiedenen Zucker untersuchten.
18 2.2.1.3. Andere Tests
2.2.1.3.1. Polyethylenglykol (PEG)
PEGs existieren in vielen unterschiedlichen Polymergrößen. Die Spannweite reicht von Polymeren mit einem Molekulargewicht von 200 g/mol bis zu einem Molekulargewicht von 20.000 g/mol. Die chemische Summenformel lautet H(OCH2CH2)nOH, wobei „n“ die Anzahl der vorhandenen Monomere symbolisiert.
PEG 400 besteht aus neun verschiedenen Polymereinheiten, deren Molekular- gewicht von 242 bis 594 g/mol reicht (0,4-0,6 nm). Diese besitzen zwischen fünf und 13 Ethylenoxideinheiten. Das durchschnittliche Molekulargewicht sind 400 g/mol.
Aufgrund des Molekulargewichts wird der Name „PEG 400“ verwendet (CHADWICK et al. 1977).
PEGs wurden auf Grund ihrer unterschiedlichen Größe in vielen verschiedenen Bereichen eingesetzt. Neben dem Einsatz in der pharmazeutischen und chemischen Industrie wurden sie auch weithin als Lebensmittelzusatzstoff genutzt (CHADWICK et al. 1977).
Die toxikologische Unbedenklichkeit der PEGs wurde in einer Vielzahl von Studien überprüft. CHADWICK et al. (1977) administrierten eine PEG Lösung in einer 10fach höheren Dosis als die beschriebene Maximaldosis für PEGs an Labortiere (20 g PEG 400). Es wurden keine Nebenwirkungen beobachtet. Auch die intravenöse Gabe von 0,3 g/kg PEG 400 an Hunden und Kaninchen blieb ohne Effekt. Weitere Experimente zeigten, dass PEGs widerstandfähig gegenüber bakterieller Verdauung sind und eine Metabolisierung der Moleküle im Körper nicht stattfindet. PEG 400 verteilt sich auf den Extrazellulärraum und wird über die Niere ausgeschieden. Die prozentuale Rate der oral gegebenen PEG 400 Lösung, welche aus dem Darm absorbiert und mit dem Urin exkretiert wird, beträgt 42,5 ± 2,4 % (MAXTON et al. 1986) bzw. 52,2 % (CHADWICK et al. 1977).
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Wie bereits erwähnt, variiert die Größe der Polymere von PEG 400 beträchtlich.
Kleinere Polymere besitzen ein Molekulargewicht ähnlich dem von Rhamnose (242 g/mol das PEG, 164 g/mol Rhamnose), größere Polymere ähneln eher der Größe von 51Cr-EDTA (359 g/mol), und sogar noch größere PEG-Polymere (594 g/mol) sind vorhanden.
Die Annahme, dass Moleküle gleicher Größe auch ähnliche Permeabilitätsraten haben müssten, konnte jedoch für PEG 400 und Rhamnose nicht bestätigt werden (MAXTON et al. 1986). Die kleineren Polymere durchdrangen die Mukosa dreimal häufiger als Rhamnose. Die Permeation der größeren Polymere war sogar um 160fach größer als die von 51Cr-EDTA oder Laktulose. In-Vitro-Versuche zeigten eine hohe Lipidlöslichkeit der PEGs. Polyethylenglykole können auf Grund dessen die Lipiddoppelschicht der Enterozyten direkt durchdringen. Größere Polymere passieren die Membran ebenfalls auf dem parazellulären Weg, kleinere Polymere durchdringen die Poren in der Zellmembran. Diese verschiedenen Permeationswege erschweren die Auswertung und Beurteilung der Permeabilitätsuntersuchungen mit PEGs. Deshalb wird von einer Verwendung von PEGs als Permeabilitätsmarker abgeraten (UKABAM u. COOPER 1984).
2.2.1.3.2. Weitere Markersubstanzen
Verwendung als Permeabilitätsmarker fanden weiterhin Polyvinylpyrrolidine (PVP) (VELLENGA et al. 1992) sowie die Meerrettich- Peroxidase (O’BRIEN et al. 2002) und verschiedene Proteine (JAKOBSSON et al. 1986). Auf diese Marker soll hier auf Grund ihrer eher seltenen Anwendung in der Permeabilitätsdiagnostik nicht weiter eingegangen werden.
20
2.3. Indikationen zur Bestimmung der intestinalen Permeabilität
Screening bei Krankheiten
Die intestinale Permeabilität kann bei einer Vielzahl von Krankheiten erhöht sein.
Primär zählen dazu intestinale Krankheiten. Aber auch eine sekundäre Erhöhung in Zusammenhang mit systemischen Krankheiten wird beobachtet.
HALL (1999) summierte Krankheiten mit potentiell veränderter Permeabilität auf:
• primäre intestinale Schädigung
• akute virale Gastroenteritis
• Enterotoxine (Alkohol, NSAID, cytotoxische Medikamente)
• Gluten- sensitive Enteropathie
• Chronisch- entzündliche Darmerkrankung (IBD)
• Parasiten (z. B. Askariden, Giardien)
• Protein-Verlust Enteropathie (PLE)
• Dünndarmdysbakterie (SIBO)
• Cardiovaskuläre Operationen
• Verbrennungen
• Diabetes mellitus
• Hepatitis
• Pankreatitis
• Urämie
Veränderungen der intestinalen Permeabilität beim Hund wurden in Fällen mit Dünndarmdysbakterie (RUTGERS et al. 1996), chronisch intestinaler Darm- erkrankung (SORENSEN et al. 1997), Gluten- sensitiver Enteropathie der Irish Setter (GARDEN et al. 1998), Futtermittelüberempfindlichkeit (RUTGERS et al. 1995) sowie in Zusammenhang mit multiplen Traumen (STREETER et al. 2002) nachgewiesen.
21 Feststellung des Therapieverlaufes
Eine weitere Indikation zur Überprüfung der intestinalen Permeabilität besteht in der Kontrolle des Therapieverlaufes. Eine Vielzahl von Studien beim Menschen und beim Hund beschrieb die Normalisierung der intestinalen Permeabilität nach adäquater Therapie (NOONE, et al. 1986, UKABAM u. COOPER 1984, HALL u. BATT 1990).
Die Überprüfung der intestinalen Permeabilität kann weiterhin sinnvoll sein, um den Rückfall einer Erkrankung zu prognostizieren. Dieses ist beim Menschen mit Morbus Crohn (WYATT et al. 1993) sowie beim Irish Setter mit Gluten- sensitiver Entero- pathie (HALL u. BATT 1991) nachgewiesen.
Überprüfung der Wirkung von Medikamenten auf den Darm
Einige Medikamente üben einen negativen Einfluss auf die intestinale Permeabilität aus. Dazu gehören NSAID (SMECUOL et al. 2001) sowie cytotoxische Medikamente (FAZENY-DORNER et al. 2002). Ein weiteres Einsatzgebiet der Permeabilitätstests ist die Überprüfung der Wirkung von nutritiven Bestandteilen auf den Darm (OHTA et al. 2003), wie z.B. Probiotika (JAIN et al. 2004).
2.4. Iohexol
2.4.1. Chemische und biochemische Eigenschaften
Iohexol ist ein nicht-ionisches, iodiertes Röntgenkontrastmittel (s. Abb.3) mit einem Molekulargewicht von 821 g/mol und einem durchschnittlichen Querschnitt von 12 Å (ca. 1,2 nm). Der Iodanteil des Iohexolmoleküls beträgt 46,4 % (HAAVALDSEN 1980). Die Osmolalität von Iohexol in der Formulierung Omnipaque®-350 beträgt 0,82 Osm/kg H2O (bei 37 °C). Das Iohexol-Verteilungsvolumen beim Me nschen beträgt 0,27 l/kg, welches auf eine Verteilung in den Extrazellulärraum hinweist (OLSSON et al. 1983).
22
MUTZEL et al. (1980) führten mehrere In-Vitro-Versuche zu den biochemisch- pharmakologischen Eigenschaften von Iohexol durch. Im Vergleich mit dem nicht- ionischen, monomeren Kontrastmittel Metrizamid und dem nicht-ionischen dimeren Kontrastmittel Ioxaglat zeigte Iohexol die niedrigste Proteinbindungsrate (Iohexol band zu 1,5 ± 0,3 %, Metrizamid zu 4,3 ± 0,3 % und Ioxaglat zu 7,6 ± 1,5 %). Die benötigte Konzentration, um eine 50 %ige Hemmung des Enzyms Lysozym zu bewirken, betrug bei Iohexol 148 mg Iod/ml, bei Metrizamid 136 mg Iod/ml und bei Ioxaglat 91 mg Iod/ml. Das gute Abschneiden von Iohexol bei diesen beiden Versuchen lässt auf eine sehr geringe Toxizität von Iohexol schließen. Die Ergebnisse der weiteren Versuche untermauern diese Folgerung. Die Histamin- freisetzung durch Metrizamid war 2,5fach, die durch Ioxaglat sogar 10fach höher als die durch Iohexol. Nach Iohexolapplikation kam es zu den geringsten Veränderungen der Erythrozytenmorphologie. Weitaus höhere Konzentrationen an Iohexol als an Metrizamid und Ioxaglat waren notwendig, um eine Komplementkaskade des Immunsystems zu aktivieren.
In klinischen Versuchen wurde gezeigt, dass Iohexol bis zu Dosen von 500 mg Iod/kg von gesunden Menschen sehr gut vertragen wird und keine nennenswerten Veränderungen der Blutparameter auftreten (AAKHUS et al. 1980).
Bei der Entwicklung der nicht-ionischen Kontrastmittel wurde die Länge der substituierten Seitenketten (s. Abb. 3) erhöht. Das Molekulargewicht der Substanzen stieg auf Grund dessen, während die Osmolalität sank (BOURIN et al. 1997). Im Gegensatz zu dem nicht-ionischen Kontrastmittel Iohexol ist die Osmolalität des ionischen Kontrastmittels Diatrizoat annähernd doppelt so hoch.
Eine hohe Osmolalität hat einen bedeutenden Einfluss auf die Toxizität eines Röntgenkontrastmittels (BETTMANN u. MORRIS 1986). Auf Grund ihrer niedrigen Osmolalität sind nicht-ionische Kontrastmittel verträglicher als ihre Vorgänger, die ionischen Kontrastmittel. Da der hydrophobe Kern der nicht-ionischen Kontrastmittel im Gegensatz zu ionischen Kontrastmitteln durch hydrophile Seitenketten maskiert
23
wurde, besitzen diese Moleküle eine bessere Wasserlöslichkeit. Diese Eigenschaft in Verbindung mit dem Fehlen von ionischen Ladungen führt zu einem reduzierten Interaktionspotential der nicht-ionischen Kontrastmittel mit anderen Molekülen im Körper, macht sie inert und trägt ebenfalls zu einer verminderten Toxizität bei (DAWSON 1993). Nebenwirkungen treten nach Applikation von Iohexol im Gegensatz zu der Verwendung von Diatrizoat signifikant weniger auf (HILL et al.
1993). Auch STEINBERG et al. (1992) beobachteten nach der Nutzung von Iohexol weniger Nebenwirkungen als nach Gebrauch eines ionischen- Kontrastmittels.
Die toxikologische Unbedenklichkeit von Iohexol wurde in den 80er Jahren in einer Vielzahl von Studien überprüft. SHAW und POTTS (1985) fassten die Ergebnisse der am Sterling-Winthrop Research Institut, Rensselaer, New York durchgeführten Versuche zusammen. Iohexol stellte sich in verschiedensten Tierversuchen verträglicher dar als ionische Kontrastmittel. Die LD50 war zwei- bis dreimal höher im Vergleich zu ionischen Kontrastmitteln. In Untersuchungen zur subakuten Toxizität wurden keine Medikamenten- assoziierten Veränderungen des Verhaltens, der biochemischen oder der hämatologischen Parameter beobachtet. Bei tragenden Ratten hatte Iohexol keinen Einfluss auf die Tragzeit, Welpensterblichkeit, Wurfgröße, Welpengewicht oder Erscheinung der Welpen. Weder teratogene noch embryotoxische Effekte wurden durch Iohexol beobachtet. Auch Untersuchungen zur Mutagenität verliefen negativ.
Beim Kaninchen führte die direkte Applikation von Iohexol (7,5 ml Omnipaque®- 140/kg) in die Bauchhöhle nicht zu einer Peritonitis. Iohexol verursachte keine pathogenen Veränderungen, wurde schnell absorbiert und über die Nieren ausgeschieden (SKINNEMOEN et al. 1987).
Iohexol ist auch bei Patienten mit Schilddrüsenerkrankungen einsetzbar. Es kann jedoch zu temporärem Hyperthyreoidismus kommen, deshalb ist eine Kontrolle der Schilddrüsenparameter nach Iohexoladministration bei diesen Patienten notwendig (NYGAARD et al. 1998).
24
Nach intravenöser Administration wird Iohexol in unveränderter Form aus- geschieden. Ein Metabolismus des Moleküls findet nicht statt (AAKHUS et al. 1980, HARAPANHALLI et al. 1993).
Die biologische Halbwertszeit von Iohexol beträgt beim Menschen nach i.v. Gabe 121 Minuten. Die Exkretion erfolgt über glomeruläre Filtration in den Nieren.
Innerhalb von 24 Stunden konnten 100 % der i.v. administrierten Menge im Urin detektiert werden (OLSSON et al. 1983, AAKHUS et al. 1980). LUNDQUIST und LEANDER (1991) beobachteten, dass Iohexol zu 1,3-1,7 % der intravenös gegebenen Menge über die Galle ausgeschieden wurde.
2.4.2. Verwendung
Iohexol ist ein Röntgenkontrastmittel und wird traditionell vornehmlich in diesem Bereich bei Erwachsenen sowie Kindern eingesetzt. Die Darstellung der Gefäße (Angiographie), des Harntraktes (Urographie), des Rückenmarkkanals (Myelo- graphie) oder allgemein die Verstärkung von Signalen bei einer Computer- tomographie sind nur einige Anwendungsbeispiele für Iohexol. Weitere Einsatzgebiete finden sich auf dem Gebiet der Arthrographie (Darstellung eines Gelenkes) oder während einer endoskopisch retrograden Cholangio- (Pankreato-) graphie (Darstellung des Gallen- bzw. Bauschspeicheldrüsenganges). Bei Untersuchungen des Gastrointestinaltraktes ist Iohexol zur Beurteilung der Magen- Darm-Motorik sowie zur Beurteilung der Durchgängigkeit des Magen-Darm-Traktes sinnvoll einsetzbar.
In der Tiermedizin wird Iohexol hauptsächlich in der Computertomographie oder zur Bestimmung der „Glomerulären Filtrationsrate“ und des „Effektiven Renalen Plasmaflusses“ der Niere angewandt (FARTHING et al. 2005, MEUCCI et al. 2004).
Die röntgenologische Darstellung des Magen-Darm-Traktes ist ein weiteres Einsatzgebiet (SCHWARTZENTRUBER et al. 1986).
25 2.4.3. Iohexol als Permeabilitätsmarker
Wenige Studien (s.u.) wurden bisher durchgeführt, um Iohexol als intestinalen Permeabilitätsmarker zu bewerten. Die chemischen Eigenschaften von Iohexol sowie die Größe von 12 Å lassen auf einen parazellulären Übergang durch die Intestinalmuskosa bzw. auf eine Passage durch die Poren mittlerer Größe an der Villusbasis sowie durch die großen Poren in Kryptennähe schließen. Die bisherigen Ergebnisse der Permeabilitätsuntersuchungen lassen auf einen erfolgreichen zukünftigen Einsatz von Iohexol als Permeabilitätsmarker schließen.
a) Beim Menschen
HALME et al. (1993) setzten Iohexol erfolgreich zum Nachweis einer akuten Entzündung des Ileums bei Patienten mit Morbus Crohn ein. Die Permeation von Iohexol durch die Mukosa erhöhte sich in diesen Patienten im Gegensatz zu der gesunden Kontrollgruppe signifikant. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Patienten mit einer aktiven Entzündung des Colons erzielt (HALME et al. 1997). Von einer Verschlimmerung der Erkrankung kann ab einer Iohexolexkretion in 24 h Urin von
>0,5 % der oral administrierten Dosis ausgegangen werden. Eine Unterscheidung zwischen inaktiver und schwerer IBD war möglich, jedoch ungenau zwischen Patienten mit einer milden Erkrankung und Patienten in Remission. Eine Erhöhung der Permeabilität bei Patienten mit einer rein rektalen Erkrankung konnte nicht gezeigt werden.
b) Bei Ratten
Die Iohexolkonzentration im Plasma bei darmgesunden Ratten betrug nach oraler Gabe von 7,5 ml Omnipaque®-300/kg 7,9 ± 7,2 µg/ml. Sie stieg auf 27,6 ± 6,8 µg/ml bei Ratten mit obstruiertem Darm und auf 617 ± 1051 µg/ml in Ratten mit ischämischem, teilweise nekrotischem und entzündetem Darm (SKINNEMOEN et al.
26
1987). ANDERSEN et al. (2001) erzeugten experimentell eine bakterielle Über- besiedlung des Dünndarmes bei Ratten, indem sie den Dünndarm aufschnitten, das proximale Ende verschlossen und das distale Ende in einer Schleife an eine noch weiter distal gelegene Öffnung des Dünndarms adaptierten. An einer weiteren Gruppe von Ratten wurde ein Darmstück reseziert und eine End-zu-End Anastomose vorgenommen. Diesen Gruppen, sowie den Ratten der nicht- operierten Kontroll- gruppe, wurde Iohexol oral zugeführt und die Urinexkretion nach 6 Stunden bestimmt. Ein signifikanter Anstieg der Iohexolkonzentration im Urin konnte bei den operierten Ratten gezeigt werden.
c) Bei Kaninchen
SKINNEMOEN et al. (1987) führten Versuche mit Kaninchen durch. Zwei Gruppen von Kaninchen wurde 0,25 ml bzw. 0,5 ml Darbazin (Prochlorperazin und Isopropamide) zur Verlangsamung der Darmpassagezeit injiziert. Nach zwei Stunden betrug die Plasmakonzentration von Iohexol nach oraler Gabe von 7,5 ml Omnipaque®-140 (bzw. -300)/kg 58,5 bzw. 107 µg Iohexol/ml Plasma. Ein Abfall der Iohexolkonzentration auf 33,3 bzw. 50,5 µg/ml konnte nach 8 Stunden beobachtet werden.
d) Beim Hund
Fünf klinisch gesunden Hunden wurde Iohexol in einer Konzentration von 700 mg Iod/kg (= 2 ml Omnitrast®-300/kg) oral verabreicht und die Plasma Iod- Konzentration sowie die Iod-Urinexkretion bestimmt. Die Plasma-Iod-Konzentration erreichte nach 30 Minuten ein Maximum von 0,33 mg Iod/ml (= 711 µg Iohexol/ml). Langsam fiel dieser Wert dann auf 0,12 mg Iod/ml (= 259 µg Iohexol/ml) nach 6 Stunden ab. Die basal gemessene Iodkonzentration im Plasma betrug 0,09 mg Iod/ml (= 259 µg Iohexol/ml) (AGUT et al. 1995). Nach 6 Stunden wurden 0,56 ± 0,17 % (Median ± SD) der oral gegebenen Menge im Urin exkretiert.
27 d) Im Vergleich mit anderen Markern
Im Vergleich zu 51Cr-EDTA ist Iohexol gut als Permeabilitätsmarker beim Hund einsetzbar (FRIAS et al. 2005 a). HALME et al. (2000) fanden heraus, dass die Iohexolexkretion besser mit einem klinischen Aktivitätsindex bei Patienten mit chronischen Darmerkrankungen korrelierte als der Laktulose- Mannitol- Verhältnis- test.
28
2.5. Analytik mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
2.5.1. Notwendigkeit der ProbenvorbereitungBiologische Flüssigkeiten besitzen eine Vielzahl an Substanzen, welche sich negativ auf eine HPLC-Analyse auswirken. Eine effektive Probenvorbereitung besteht darum in der Aufreinigung der Probe verbunden mit dem Vorbeugen der Verstopfung der HPLC-Säule, dem Verhindern einer Bindung des Analyten an Protein sowie dem Verhindern der enzymatischen Degradation des Analyten (INGWERSEN 2000). Mit Hilfe einer effektiven Probenvorbereitung wird somit die HPLC-Säule geschont und Kosten werden gespart.
2.5.1.1. Flüssig- Flüssig Extraktion (FFE) versus Festphasenextraktion (SPE)
Das Verfahren der FFE beinhaltet den Transfer des Analyten von einer flüssigen Phase (A) in eine zweite, sich nicht mit der ersten mischende Phase (B). Durch intensives Verschütteln bildet sich aus den zwei Flüssigkeiten eine Emulsion, während dessen die zu untersuchende Substanz aus der Phase A in die Phase B überwechselt. Nach Beendigung des Schüttelns bilden sich erneut zwei Phasen, die getrennt werden können.
Bei einer SPE besteht eine Phase aus einer Festsubstanz, welche in einer kleinen Säule komprimiert vorliegt. Nach Aufgabe der flüssigen Phase und des Analyten adsorbiert dieser an die oberen Lagen der Festsubstanz.
Bei der FFE bildet sich lediglich einmal ein Gleichgewicht zwischen den beiden Phasen aus. Ein Gleichgewicht zwischen der flüssigen und der festen Phase bildet sich in vielfacher Form in der SPE, da der Analyt mehrere Lagen der Festsubstanz durchläuft und dabei immer wieder auf freie Adsorptionsstellen trifft. Mit der SPE ist somit ein höherer Prozentsatz an Aufreinigung zu erzielen als mit der FFE (FRITZ 1999).
29
2.5.1.2. Iohexolanalytik – Literaturauswertung der Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung zur Iohexol-Analyse erfolgt in der überwiegenden Anzahl der Studien nach der Methode von EDELSON et al. (1983). Plasmaproben werden durch eine FFE aufgereinigt. Dabei wird die Probe mit Wasser, Perchlorsäure und Chloroform vermischt. Nach Zentrifugation wird die wässrige Phase mit Natronlauge versetzt, gefiltert und ein Aliquot analysiert. SKINNEMOEN et al. (1987) vereinfachten diese Methode noch, indem sie die Serumproben nur mit Wasser verdünnten, danach mit Chloroform versetzten, schüttelten, die Proben zentrifugierten und die wässrige Phase sofort in die HPLC- Anlage injizierten. Anstatt Chloroform wurde auch Trifluoressigsäure zum Ausfällen der Plasmaproteine verwendet (FARTHING et al. 2005). HARAPANHALLI et al. (1993) versetzten die Plasmaproben vor der Analyse mit der Pufferlösung ihrer mobilen Phase (s. Kapitel 2.6.2.1.). Wiederfindungsraten von Iohexol wurden nach FFE mit Perchlorsäure, Trichloressigsäure, Dichlormethan und Aceton bestimmt (MEUCCI et al. 2004). Am besten schnitt Dichlormethan mit Wiederfindungsraten von 92 ± 4 % ab.
Urinproben wurden nur mit Wasser verdünnt und sogleich analysiert (SKINNEMOEN et al. 1987, FARTHING et al. 2005). EDELSON et al. (1983) filtrierten und zentrifugierten die verdünnten Urinproben noch vor der Analyse.
Soweit bekannt ist, wurde bis jetzt noch keine Festphasenextraktion als Proben- vorbereitung für die Analyse von Iohexol im Serum und Urin beschrieben. Einzig für wässrige Proben wurde eine Festphasenextraktion entwickelt (PUTSCHEW et al.
2001). LiChrolut® EN (Merck) Kartuschen wurden mit jeweils neun Milliliter Methanol und ultra reinem Wasser (pH 3,5) konditioniert. Die Konditionierung von Envi-Carb Säulen wurde ebenfalls mit Methanol und Wasser durchgeführt, jedoch bei pH 2. Die Probenaufgabe auf die LiChrolut® EN Säulen erfolgte bei pH 2. Danach wurde die Probe mit einer Flussrate von 200 ml/h filtriert. Das aufgefangene Filtrat wurde auf pH 2 eingestellt und auf die Envi-Carb Säulen gegeben. Bei einer Flussrate von 300 ml/h wurde erneut filtriert. Nachdem die Säulen mit Vakuum getrocknet wurden,
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erfolgte die Elution mit sechs Milliliter Methanol (LiChrolut® EN) bzw. mit einer 1:1 Mischung aus Acetonitril und Wasser (Envi-Carb).
2.5.2. HPLC
2.5.2.1. Iohexolanalytik – Literaturauswertung der Iohexol- Bestimmung mittels HPLC
Iohexol wird schon seit vielen Jahren mittels HPLC bestimmt. Überwiegend wurden C18-Säulen mit den Maßen 250 mm x 4,6 mm bei einer Körnchengröße von 5 µm mit oder ohne Vorsäulen verwendet (SKINNEMOEN et al. 1987, PUTSCHEW et al.
2001, MEUCCI et al. 2004).
Als mobile Phase wurden 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 und Methanol in einem Verhältnis 94:6 (v/v) (EDELSON et al. 1983), Acetonitril/ Wasser im Verhältnis 7:93 % (SKINNEMOEN et al. 1987) oder eine Mischung aus Trifluoressigsäure und Methanol in einem Gradientenprogramm eingesetzt (FARTHING et al. 2005). Bei Letzterem wurde die HPLC-Säule nach ungefähr 75 Injektionen für eine Stunde mit einem Acetonitril/ Wasser Gemisch (90:10, v/v) gespült, um unpolare Substanzen von der Säule zu eluieren.
Eine weitere Gruppe entwickelte einen Puffer für die mobile Phase (HARAPANHALLI et al. 1993). Dieser bestand aus 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat und 0,2 mM Na2EDTA, eingestellt auf einen pH von 3,1 mittels Orthophosphorsäure und Acetonitril. Durch diesen Puffer eluierten die endogenen Plasmabestandteile zeitgleich mit dem Lösungsmittelpeak und verursachten weniger Störungen im Chromatogramm.
Kürzlich wurde ein weiterer Puffer evaluiert (MEUCCI et al. 2004). Dieser bestand aus 50 mM Natriumdihydrogenphosphat sowie 0,5 mM Tetrabutylammoniumchlorid.
Der pH wurde auf 4,1 eingestellt und Methanol der flüssigen Phase zugefügt, bis ein letztendliches Verhältnis von 90:10 (v/v) erreicht war. Dieser Phosphatpuffer wurde gewählt, da er nicht bei einer Wellenlänge von 245 nm absorbiert und die Iohexoldetektion somit interferenzlos durchgeführt werden konnte.
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3. Material und Methoden 3.1. Analytik
Der analytische Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Probenvorbereitung und Analyse des Röntgenkontrastmittels Iohexol in den Matrizes Serum und Urin mittels HPLC. Zunächst werden die Chemikalien und Geräte aufgeführt. Den Beschreibungen der Vorversuche und der Methodenentwicklung folgen das eigentliche Versuchsprotokoll sowie die Validierung der Methode.
3.1.1. Chemikalien
Iohexol ist ein nicht- ionisches Röntgenkontrastmittel (s. Abb. 3). Es dient in dieser Studie als Permeabilitätsmarker und soll im caninen Serum nach oraler Gabe detektiert werden.
O N OH
N N HO
O I O
OH
OH I H
I
H OH
Abb. 3: Strukturformel Iohexol
(5-[N-(2,3-Dihydroxypropyl)- acetamido]- 2,4,6-triiodo-hydroxypropyl)- isophthalamid)
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Natriumdiatrizoat- Dihydrat (folgend nur noch Diatrizoat genannt), fungierte als Kontrollsubstanz. Es handelt sich um ein ionisches Röntgenkontrastmittel, welches sich in der chemischen Analyse ähnlich wie Iohexol verhält. Strukturell bestehen beide Substanzen aus einem aromatischen Ring mit drei Iodgruppen sowie verschiedenen Resten (s. Abb. 3 und Abb. 4).
I I
I
N N
O O
O
H H
O
Na
H O
H
O H H
Weitere Chemikalien wurden in den Vorversuchen, der Methodenentwicklung, der Probenvorbereitung und der HPLC-Analyse verwandt. Die genaue Definition der Chemikalien, sowie Angaben zum Hersteller und Artikelnummern finden sich im Anhang (s. Tab. 11).
3.1.2. Geräte zur Analytik
Die Probenvorbereitung besteht aus einer Festphasenextraktion. Die eigentliche Iohexol-Analyse erfolgt mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und UV- Detektion. Die genaue Beschreibung aller Geräte, sowie Angaben zum Hersteller finden sich im Anhang (s. Tab. 12).
Abb. 4: Strukturformel Natriumdiatrizoat-Dihydrat
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3.1.3. Vorversuche und Methodenentwicklung
Die folgende Methodik zur Iohexol-Analyse wurde für die Matrizes Urin und Serum entwickelt. Die experimentellen Untersuchungen am Hund beschränkten sich auf Grund methodologischer Probleme bei der Sammlung von 6- bzw. 24 Stunden Urin jedoch auf die Untersuchung der Serumproben.
3.1.3.1. Festphasenextraktion
Die Ausgangsbedingungen der Festphasenextraktion lehnen sich an die von PUTSCHEW et al. (2001) durchgeführten Versuche an. Nach der Entwicklung einer Festphasenextraktion für Urinproben schlossen sich Modifizierungen der Festphasenextraktion für die Untersuchung der Serumproben an.
Die Konditionierung der 200 mg LiChrolut®EN Festphasenkartusche erfolgte mit 2 ml Methanol und 2 ml Phosphatpuffer pH 9. Nach Aufgabe von 1 ml der Probe bestand der Waschschritt in der Zugabe von 0,7 ml Aqua tridest. Nachfolgend wurde die Probe mit 1 ml Methanol und 1 ml Phosphatpuffer pH 2 eluiert.
Die Optimierung dieser Ausgangsbedingungen fand schrittweise statt. Verschiedene Festphasenkartuschen, Konditionierungslösungen, Waschlösungen und –volumina sowie unterschiedliche Elutionsmittel, wurden erprobt. Es folgte eine Untersuchung der Probenaufgabelösung, der Wasch- und der Elutionslösung.
3.1.3.1.1. Festphasenextraktionssäulen
Neben den LiChrolut®EN Festphasenkartuschen wurden die Kartuschen LiChrolut® RP-18 (Merck, Darmstadt), Chromabond® SA, Chromabond® SiOH (beide Macherey- Nagel, Düren), sowie Speedisk® Column H2O-Philic Sc-DVB (J. T. Baker, Phillipsburg, USA) auf ihre Adsorptionseigenschaften gegenüber Iohexol überprüft.
