Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover
Professor Dr. med. S. Suerbaum
Isogene Shiga-Toxin-Mutanten von enterohämorrhagischen Escherichia coli zur Entwicklung einer oralen Lebendvakzine und
zur Klärung von Fragen der Pathogenese von EHEC-Infektionen
Dissertation
Zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Agnes Meuser aus Hannover
Hannover 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.05.2007.
Gedruckt mit Genehmimigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: PD Dr. med. Florian Gunzer
Referent: Prof. Dr. Jan Buer Koreferent: PD Dr. med. Anke Franzke
Tag der mündlichen Prüfung; 10.05.2007
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Hans-Heinrich Kreipe Prof. Dr. Andreas Klos Prof. Dr. Reinhard Brunkhorst
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Escherichia coli 1
1.2 Obligat pathogene E. coli 1
1.3 Enterohämorrhagische E. coli (EHEC) 2
1.3.1 Epidemiologie 3
1.3.2 Durch EHEC verursachte Krankheitsbilder 4
1.3.3 Virulenzfaktoren 6
1.3.4 Shiga-Toxine 6
1.3.5 Die Shiga-Toxin kodierenden Bakteriophagen 10
1.3.6 Bildung anderer Toxine 11
1.3.7 EHEC-Adhärenz 11
1.3.8 Das große Virulenzplasmid 12
1.3.9 Säurepersistenz von EHEC 13
1.3.10 Das RecA-Protein 13
1.3.11 Therapie 14
1.3.12 Diagnostik und Prävention 16
1.4 Möglichkeiten bakterieller Vakzinierung 18
1.5 Immunprophylaxe aus der Sicht des öffentlichen Gesundheitswesens 20
1.6 Zielsetzung 22
2. Strategie zur Herstellung isogener Mutanten 23 2.1 Klonierung eine Teils der stx2-Untereinheit in pUC19 23
2.2 Sequenzgerichtete Mutagenese 24
2.3 Klonierung in pMHH1 26
2.4 Reparatur des Suizidvektors pTUV6 30
2.5 Gewinnung isogener stx-Mutanten 33
3. Material 36
3.1 Geräte 36
3.2 Verbrauchsmaterialien 37
3.3 Chemikalien 39
3.4 Kits 40
3.5 Restriktionsendonukleasen 41
3.6 DNA-Molekulargewichtsmarker 42
3.7 Protein-Molekulargewichtsmarker 42
3.8 Nährmedien 42
3.9 Lösungen und Puffer 43
3.10 Material und Lösungen zur Durchführung des Zytotoxizitätstests 46
3.11 PCR-Primer 47
3.12 Bakterienstämme 51
3.13 Zellkulturen 52
3.14 Vektoren 52
4. Methoden 54
4.1 Polymerase-Chain Reaction (PCR) 54
4.2 Sequenzgerichtete Mutagenese durch PCR 57
4.3 Aufreinigung von PCR-Produkten 61
4.4 Agarose-Gelelektrophorese 62
4.5 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 63
4.6 Klonierung 63
4.6.1 Sequenzspezifische Spaltung von DNA mit Restriktiosenzymen 64
4.6.2 Ligation 64
4.7 Transformation 65
4.7.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen 66
4.7.2 Elektroporation 66
4.7.3 Herstellung Calcium-Chlorid-kompetenter Zellen 67
4.7.4 Transformation durch Wärmepuls 67
4.8 Plasmid-DNA-Präparation 68
4.8.1 Plasmid-Schnell-Präperation 68
4.8.2 Plasmid-Midi-Präperation 69
4.9 Konjugation 70
4.9.1 Selektion von Transkonjuganten 71
4.9.2 Induktion des zweiten Crossovers 72
4.9.3 Mutantenscreening 72
4.10 Isolierung chromosomaler DNA 73
4.11 Dialyse der chromosomalen DNA 74
4.12 Sequenzspezifische Spaltung chromosomaler DNA 74 4.13 Digoxigeninmarkierung einer DNA-Sonde über Random priming 74
4.14 Dot Blot 75
4.15 Southern Blot 76
4.16 DNA-DNA-Hybridisierung 76
4.17 Chemilumineszenz-Detektion durch CSPD 77
4.18 Proteinfällung mit Ammoniumsulfat und Dialyse 78
4.19 Proteinbestimmung mit Bradford-Assay 78
4.20 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Coomassie-blue-Färbung 78
4.21 Western-Blot 79
4.22 Erkennung und Anfärbung transferierter Proteine im Immunoblot 80
4.23 Phagen-Plaque-Test 80
4.24 Elektronenmikroskopie 81
4.25 Zytotoxizitätstest 81
4.26 Stx-ELISA (Enzym-linked immuno-absorbent assay) 82
5. Ergebnisse 84
5.1 Überprüfung der vorgenommenen Mutagenesen durch Restriktionsana-
lyse 84
5.2 Konstruktion einer stx2-Mutante von EHEC 86-24 mit Hilfe des
Plasmids pVAC 86
5.2.1 Konjugation und Mutantenscreening 86
5.2.2 Southern Blot zur Überprüfung der Mutante 88
5.2.3 Sequenzierung der Mutante 89
5.3 Konstruktion einer stx1-negativen Mutante von EHEC EDL973 mit
Hilfe des rekombinanten Plasmids pTUV6r 89
5.3.1 Konjugation und Mutantenscreening 89
5.3.2 Southern Blot zur Überprüfung der Mutante 90 5.4 Isolierung und Charakterisierung eines phagenlosen EHEC EDL973 92
5.4.1 Isolierung 92
5.4.2 Phänotypische Charakterisierung 92
5.5 Phänotypische Charakterisierung der Mutanten 92 5.5.1 Biochemisches Profil und Antibiogramm 92
5.5.2 Phagen Plaque Test 93
5.5.3 Elektronenmikroskopie 93
5.5.4 ELISA 95
5.5.5 Immunoblot 95
5.5.6 Zytotoxizitätstest 97
6. Diskussion 99
6.1 Bisherige Ansätze zur Konstruktion einer Vakzine gegen EHEC 99 6.2 Die isogene stx2-Mutante von EHEC 86-24 103 6.3 Die isogene stx1-negative Mutante von EHEC EDL973 106
7. Zusammenfassung 108
8. Literaturverzeichnis 109
Anhang
Abkürzungsverzeichnis 131
Danksagung 135
Curriculum Vitae 136
Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nrn. 5 und 6 der Promotionsordnung der MHH 137
Promotionsprüfung 138
1. Einleitung
1.1 Escherichia coli
Escherichia coli gehört zur Spezies der Enterobakterien. Die Namensgebung geht auf den österreichischen Pädiater Theodor Escherich zurück, der den Keim 1885 erstmalig aus dem Stuhl von Kleinkindern mit Durchfallerkrankungen isolierte [Escherich, 1886].
E. coli ist der vorherrschende fakultative Anaerobier der menschlichen Kolonflora.
Innerhalb von Stunden nach der Geburt kolonisiert das gramnegative, peritrich begeißelte Stäbchen den kindlichen Gastrointestinaltrakt. Wirt und Bakterium leben unter ausgeglichenen Verhältnissen in Symbiose: Durch den Abbau von Sauerstoff im Dickdarm leistet E. coli einen wichtigen Beitrag zum Erhalt des anaeroben Milieus. Ist der Wirt jedoch geschwächt oder immunsupprimiert, kann E. coli als Opportunist Infektionen wie Harnwegsinfekte, Sepsis, purulente Infektionen, Meningitis, Cholangitis sowie nosokomiale Pneumonien u.a. verursachen.
Serologisch lassen sich O-(Lipopolysaccharid), H-(flagellare) und K-(kapsuläre) Antigene unterscheiden. Die pathogenen E. coli-Stämme werden durch die O- und H- Antigene serotypisiert.
1.2 Obligat pathogene E. coli
Neben den fakultativ pathogenen E. coli zählen auch obligat pathogene Keime zur Gattung der E. coli. Man unterscheidet bei den darmpathogenen E. coli fünf Hauptgruppen:
1. Enterpathogene E. coli (EPEC) 2. Enterotoxische E. coli (ETEC) 3. Enteroinvasive E. coli (EIEC) 4. Enteroaggregative E. coli (EAEC) 5. Enterohämorrhagische E. coli (EHEC).
So verschieden diese fünf Gruppen in Hinblick auf ihre einzelnen Virulenzmechanismen auch sein mögen, läßt sich dennoch eine gemeinsame Infektionsstrategie wiedererkennen: Trotz Peristaltik und Konkurrenz um Nährstoffe mit der physiologischen Standortflora können
darmpathogene E. coli mit Hilfe spezifischer Fimbrien die intestinale Mukosa besiedeln.
Sogar im normal nicht besiedelten Dünndarm gelingt dies [Nataro et al., 1998].
Ist die Kolonisierung des Darmes etabliert, schließen sich die bemerkenswert unterschiedlichen pathogenetischen Strategien der darmpathogenen E. coli an. Dabei sind drei Diarrhoe auslösende Modelle beschrieben: 1. Enterotoxin-Produktion (ETEC und EAEC), 2.
Invasion (EIEC) und 3. Intimin-Adhärenz mit sogenannten attaching and effacing Läsionen (EPEC und EHEC).
Genetisch liegen dieser Vielfalt Virulenz-Plasmide und Pathogentitätsinseln zugrunde.
Mit der zuletzt genannten Gruppe der darmpathogenen E. coli, den EHEC, beschäftigt sich diese Arbeit.
1.3 Enterohämorrhagische E. coli (EHEC)
Zwei epidemiologische Beobachtungen führten 1983 zur Entdeckung von EHEC: Riley et al.
[Riley et al., 1983] untersuchten zwei Ausbrüche einer gastrointestinalen Erkrankung, die durch schwere abdominale Krämpfe, wäßrige Durchfälle, gefolgt von blutigen Durchfällen mit wenig oder keinem Fieber gekennzeichnet war. Auslöser dieser als hämorrhagische Kolitis (HC) bezeichneten Erkrankung waren unzureichend gegarte „Hamburger“ einer Schnellrestaurant-Kette. Aus Stuhlkulturen von Patienten isolierte man E. coli mit dem bisher selten in Erscheinung getretenen Serotyp O157:H7. Noch im selben Jahr stellten Karmali et al. die Verbindung zwischen einer Infektion mit Zytotoxin-produzierenden E. coli-Stämmen und dem hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS) her [Karmali et al., 1983]. In Deutschland wurde erstmals 1988 ein Ausbruch von HUS durch E. coli O157:H7 beschrieben [Karch et al.,1990].
Die Bezeichnung „verotoxinbildende E. coli “ (VTEC) stammt von der Beobachtung, daß bestimmte E.
coli-Stämme ein Toxin mit zytotoxischem Effekt auf Verozellen produzieren [Konowalchuk et al., 1977].
Verozellen stammen von einer Affennierenzellinie ab. Eine andere Bezeichnung, „Shiga-Toxin produzierende E.
coli“ (STEC), bezieht sich auf die Ähnlichkeit des Zytotoxins mit dem von Shigella dysenteriae Typ 1 exprimierten Shiga-Toxin. In dieser Arbeit wird der Begriff „enterohämorrhagische E. coli“ (EHEC) gebraucht.
Er umfaßt E. coli-Stämme, die klinisch eine HC und / oder das HUS verursachen können.
Diese E. coli-Stämme produzieren Shiga-Toxine, verursachen A/E-Läsionen und besitzen ein 60 MDa großes Plasmid [Levine, 1987].
1.3.1 Epidemiologie
Seit den ersten sporadischen Nachweisen von EHEC Mitte der 80er Jahre hat die Zahl der EHEC-Infektionen weltweit zugenommen. Die Inzidenz in Mitteleuropa schätzt man auf 1 bis 1,5 Patienten pro 100.000 Kinder und Jugendliche unter 16 Jahren. Argentinien besitzt die höchste Inzidenz mit mehr als 20/100.000 [Zimmerhackl et al., 2002]. In Deutschland sind EHEC nach Salmonellen zusammen mit Campylobacter zweithäufigster bakterieller Enteritiserreger [Karch et al., 2000]. Während in den USA und Großbritannien der Serotyp O157:H7 bei EHEC-Infektionen deutlich überwiegt, werden in Deutschland zunehmend andere Serotypen wie O26:H-/H11, O103:H-/H2/H28, O111:H-/H2, O145:H28 und O157:H- nachgewiesen [Karch et al., 2000]. Bei ca. 65% bei allen Isolaten von Patienten mit HC oder HUS ist der Serotyp O157 anzutreffen.
EHEC-Infektionen können in jedem Lebensalter auftreten, sind jedoch besonders häufig bei Kindern im Alter von ein bis fünf Jahren [Remuzzi et al.,1998]. Neben Kindern erkranken auch ältere Menschen vermehrt. In Deutschland ist das HUS die häufigste Ursache eines akuten Nierenversagens im Kindesalter [Pistor, 1995], wobei die Inzidenz des HUS zwischen der ersten und zweiten Lebensdekade stark abfällt [Tarr et al., 2001]. Bei den EHEC- assoziierten HUS-Patienten besteht eine jahreszeitliche Häufung mit einem Gipfel in den Sommermonaten von Juni bis September [Boyce et al.,1995].
Bei der Übertragung spielen die niedrige Infektionsdosis von oft weniger als 100 Keimen [Karch et al., 1996a] und eine ausgeprägte Umweltresistenz eine wichtige Rolle. EHEC sind gegenüber Kälte, niedrigen pH-Werten, Austrocknung und hohen Salzkonzentrationen ausgesprochen resistent. Drei Übertragungswege von EHEC auf den Menschen gelten als gesichert:
1. Kontaminierte Lebensmittel, Trink- und Badewasser 2. Direktübertragung von Mensch zu Mensch
3. Tierkontakt
Am häufigsten werden EHEC über kontaminierte Lebensmittel übertragen. Rinder bilden neben Ziegen und Schafen für den Menschen das wichtigste Überträgerreservoir [Griffin et al., 1991]. Eine Untersuchung an gesunden Nutztieren in Hessen ergab, daß 18% der untersuchten Rinder, 32% der Schafe und 75% der Ziegen Shiga-Toxin produzierende E. coli trugen [Zschöck et al., 2000]. Ausbrüche unter Besuchern von Streichelzoos sind beschrieben
[Crump et al., 2000; Warshawsky et al., 2002]. Tierische Lebensmittelprodukte wie unzureichend gegarte Fleisch- und Rohmilchprodukte stellen häufige Infektionsquellen dar [Griffin et al.,1991; Tarr, 1995]. Aber auch pflanzliche Lebensmittel wie Salat, Rettich- und Alfalfasprossen, Früchte und Säfte, die durch tierischen Kot, Wasser oder fehlerhafte Lebensmittelhygiene kontaminiert wurden, kommen als Infektionsquellen in Frage [Besser et al.,1993; Swinbanks, 1996; Wachtel et al., 2002]. Infektionen durch Trink- und Badewasser sind beschrieben worden [Keene et al.,1994; Ackmann et al.,1997].
Durch die niedrige Infektionsdosis ist eine Direktübertragung von Mensch zu Mensch möglich. Besonders Gemeinschaftseinrichtungen, wie Kindertagesstätten und Pflegeheime, sind diesem Risiko ausgesetzt [Carter et al., 1987]. Asymptomatische Dauerausscheider können eine Infektionsquelle darstellen [Epidemiol. Bull.,1999].
Wegen der Gefahr von Laborinfektionen [Rao et al., 1996] wurden EHEC 1997 der biologischen Risikoklasse L3** zugeordnet.
1.3.2 Durch EHEC verursachte Krankheitsbilder
Nach einer ein- bis achttägigen Inkubationszeit kommt es meist zu wäßrigen Durchfällen, die bei einem Teil der Patienten in eine hämorrhagische Kolitis übergehen. Klinische Symptome sind abdominale Schmerzen, evtl. Fieber und Übelkeit mit Erbrechen. Bei Kindern tritt die HC in etwa 20% der Fälle auf. Auch bei Erwachsenen über 65 Jahren tritt die HC vermehrt auf. Blutige Durchfälle sind ein Hinweis für eine schwere Infektion mit erhöhtem Risiko, ein HUS zu entwickeln. Bei Erwachsenen unterscheiden sich die meisten EHEC-Infektionen nicht von Enteritiden anderer Genese mit selbstlimitierenden wäßrigen Durchfällen. Bei Säuglingen können EHEC als seltene intestinale Komplikation eine nekrotisierende Kolitis oder eine Darminvagination auslösen. Bei Erwachsenen wurde eine durch EHEC verursachte chronische Kolitis beobachtet, die differentialdiagnostisch von einer Colitis ulcerosa abgegrenzt werden muß [Karch et al., 2000].
Wichtigste extraintestinale Komplikation ist das HUS. Dieses Syndrom wurde erstmalig 1955 von dem Schweizer Pädiater Gasser beschrieben und ist durch eine Trias aus akuter hämolytischer Anämie, Thrombozytopenie und Nierenversagen gekennzeichnet [Gasser et al., 1955]. Trotz des großen Wissenszuwachses über EHEC ist der exakte Mechanismus, durch den EHEC das HUS auslösen, nicht bekannt. Erschwert wird die Erforschung des HUS durch das Fehlen eines Tiermodells, das alle Aspekte der menschlichen Erkrankung reproduzieren könnte. Ätiologisch kommt ein großes Spektrum verschiedenster Erkrankungen für die
Auslösung eines HUS in Betracht (s. Tabelle 1). Etwa 10% der HUS-Fälle sind nicht infektiöser Natur.
Infektiöse Ursachen Sporadische, nicht-infektiöse Ursachen
E. coli-assoziiert Idiopathisch
Shigella-assoziiert Familiär
Neuraminidase-assoziiert Medikamente
HIV-Infektion Tumoren
Andere Schwangerschaft
Systemischer Lupus erythematosus Transplantation
Sklerodermie
Maligne / fortgeschrittene Hypertonie bei Glomerulo- nephritis
Tabelle 1: Ätiologie des HUS nach Neild, 1994
Histopathologisch finden sich geschwollene glomeruläre Epithelzellen und Verschlüsse des glomerulären Mikrogefäßsystems durch Thrombozyten und Fibrin [Zoja et al., 1992]. Die resultierende Ischämie führt über eine abnehmende glomeruläre Filtrationsrate zum akuten Nierenversagen [Moake, 1994]. Im Blutausstrich finden sich Fragmentozyten bei fulminanter intravasaler Hämolyse. Ein EHEC induziertes HUS tritt bei ca. 5-10% der infizierten Kleinkinder auf und ist die häufigste Ursache des akuten Nierenversagens im Kindesalter [Rowe et al., 1998; Karch et al., 2000]. Neben Kindern haben auch ältere Menschen und Immunsupprimierte ein erhöhtes Risiko ein HUS zu entwickeln. Klinisch verschlechtert sich wenige Tage nach Beginn der Durchfälle der Allgemeinzustand. Es kommt zu Erbrechen, Abdominalschmerzen, Blässe, Ikterus, Petechien und schließlich zum akuten Nierenversagen.
Noch immer versterben zwei bis fünf Prozent der Patienten trotz Einsatzes von Intensivmaßnahmen [Verweyen et al., 1999]. Schwerwiegende Folgen, wie chronische Niereninsuffizienz, Bluthochdruck und neurologische Defizite, treten bei ca. 30% der Überlebenden auf [Griffin, 1995; Tarr, 1995].
Neben dem klassischen HUS werden auch inkomplette Formen, beispielsweise mit isolierter hämolytischer Anämie oder einer Pankreatitis, beobachtet. Andere extraintestinale Komplikationen stellen nicht selten zentralnervöse Symptome, wie Krämpfe, Paresen oder Koma dar. Diese Symptome leiten zu dem mit dem HUS klinisch verwandten Krankheitsbild der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) hin. Die bereits 1924 von Moschcowitz [Moschcowitz, 1924] beschriebene TTP ist ein dem HUS klinisch sehr ähnliches Bild, bei dem im Gegensatz zum HUS neurologische Komplikationen im Vordergrund stehen und die Erkrankten zumeist Erwachsene sind. Wie beim HUS liegen mikroangiopathische hämolytische Anämie und arterielle Gefäßverschlüsse vor [Moake,
1994]. Während beim HUS hauptsächlich die Nieren betroffen sind, werden bei der TTP Herz, Gehirn und Pankreas bevorzugt. Allerdings scheinen beide Erkrankungen unterschiedliche pathogenetische Ursachen zu haben [Furlan et al., 1998]. Bei der TTP aktiviert der ungehemmte von-Willebrand-Faktor (vWF) die Gerinnung mit lokaler Thrombenbildung.
Im Tierreich gelten EHEC als Auslöser der Ödemkrankheit bei Schweinen, an der vornehmlich Absatzferkel erkranken [Appel et al., 1989]. Verursachende EHEC-Stämme produzieren Stx2e (edema diseaese toxine), eine Stx2-Variante [MacLeod et al., 1991]. Es kommt zu generalisierten Ödemen, Koordinationsstörungen und Paralysen mit einer hohen Letalität.
1.3.3 Virulenzfaktoren
Eine zentrale pathogenetische Rolle spielen die Shiga-Toxine (s. 1.3.4). Weitere wichtige Virulenzfaktoren sind auf der chromosomalen Pathogenitätsinsel LEE (s. 1.3.7) und dem großen Virulenzplasmid pO157 (s. 1.3.8) kodiert. Die Virulenzmerkmale Stx1/2, Intimin und Enterohämolysin sind bei fast allen EHEC der Serogruppen O157, O26 und O111 vorhanden.
Diese Serogruppen sind Haupterreger der HC und des HUS. Humaninfektionen mit EHEC- Stämmen, die kein Intimin exprimieren, treten dagegen selten auf. Die Säurepersistenz (s.
1.3.9) bedingt die geringe Infektionsdosis von 10 bis 100 Keimen.
1.3.4 Shiga-Toxine
Stx nehmen mit ihrer Wirkung als Zyto-, Entero- und Neurotoxine eine zentrale Rolle in der Krankheitsentstehung und –progression ein. 1996 kam es zu einer Übereinkunft, die früher als Verotoxine oder Shiga-like-Toxine bezeichneten Zytotoxine nach dem Shiga-Toxin von Shigella dysenteriae Typ 1 zu benennen (s. Tab. 2).
Frühere Nomenklatur Neue Nomenklatur
Gene Protein
Shiga toxin / Stx) stx Stx
Shiga-like toxin I (SLT-I) oder Verotoxin 1 (VT1) stx1 Stx1
SLT-II oder VT2 stx2 Stx2
SLT-IIc oder VT2c stx2c Stx2c
SLT-IIe oder VT2e stx2e Stx2e
Tabelle 2: Nomenklatur der Shiga-Toxin Familie nach Calderwood et al. [Calderwood et al., 1996].
Die Shiga-Toxine können in die zwei Hauptgruppen Stx1 und Stx2 unterteilt werden. Das hochkonservierte Stx1 unterscheidet sich von dem Shiga-Toxin aus Shigella dysenteriae Typ 1 durch eine einzige Aminosäure, während Stx2 und seine Varianten ca. 56% Homologie zu Stx1 aufweist [O´Brien et al., 1992]. Antikörper gegen Shigella dysenteriae Typ 1 neutralisieren Stx1 jedoch nicht Stx2 und seine Varianten.
Viele EHEC-Stämme produzieren nicht nur ein Stx, sondern können bis zu drei Toxine in unterschiedlichen Kombinationen bilden. Epidemiologische Daten weisen eine höhere Inzidenz einer HC oder eines HUS bei alleinigen Stx2-Produzenten als bei EHEC-Stämmen, die Stx1 oder Stx1 und Stx2 gemeinsam produzieren [Ostroff et al., 1989]. Welche Mechanismen könnten für die höhere zytotoxische Potenz von Stx2 verantwortlich sein? Die Menge der Stx-Rezeptoren auf der Zelloberfläche scheint nicht mit der Sensitivität gegenüber dem Toxin zu korrelieren [Louise et al., 1995]. Allerdings könnte sich die Interaktion der Rezeptoren mit dem jeweiligen Toxin unterscheiden. Der Lipidanteil der Rezeptoren beeinflußt nachgewiesenermaßen die Affinität des Toxins zum Rezeptor [Kiarash et al., 1994;
Pellizzari et al., 1992]. Eine andere mögliche Erklärung ist, daß stx2 in höherem Maße als stx1
transkribiert wird [Paton et al., 1998]. Auch wäre denkbar, daß Stx2 in vivo stabiler ist als Stx1 [Tesh et al., 1993]. Außerdem wurde beobachtet, daß einige Stx-Varianten von intestinalem Mukus aktiviert werden und sich dadurch die Virulenz im Mausmodell erhöht [Melton-Celsa et al., 1996]. Im Tierversuch mit gnotobiotischen Schweinen erwiesen sich EHEC-Stämme, welche ausschließlich Stx2 produzieren, als neurotroper als Stämme, die Stx1 oder beide Stx-Typen produzieren [Donohue-Rolfe et al., 2000].
Shiga-Toxine besitzen eine AB5-Struktur. Die 32 kDa große A-Untereinheit des Shiga- Toxins wird durch eine bakterielle Protease proteolytisch in ein ca. 28 kDa großes Peptid (A1) und ein kleines 4 kDa Peptid (A2) gespalten. Die zwei Peptidketten sind durch eine Disulfidbrücke verbunden. Das enzymatische Zentrum befindet sich in der A1-Peptidkette, während die kurze A2-Kette die A-Domäne mit fünf identischen jeweils 7,7 kDa großen B- Untereinheiten verbindet. Der B-Pentamer ist für die Bindung des Toxins an einen spezifischen Glycolididrezeptor verantwortlich. Dieser Globotriaosylceramid (Gb3)-Rezeptor befindet sich auf der Oberfläche von eukaryotischen Zellen. Gb3 ist das Target von Stx.
Globotetraosylceramid (Gb4) ist der Zielrezeptor für die Stx2e-Variante, welche beim Schwein die Ödemkrankheit auslöst. In der menschlichen Niere insbesondere in der Cortex- Region findet sich eine hohe Anzahl von Gb3-Rezeptoren. Im Cortex finden sich auch die meisten renalen Läsionen bei HUS-Patienten. Zwar korreliert die renale Gb3-Konzentration nicht mit der altersbezogenen HUS-Inzidenz [Boyd et al., 1989], doch könnte diese
Beobachtung durch einen veränderten Fettsäuregehalt des Gb3-Rezeptors verursacht sein [Pellizzari et al., 1992; Kiarash et al., 1994]. Eine hinreichende Erklärung für den extraintestinalen Organotropismus ist jedoch letztlich noch nicht gefunden.
Abb.1: Schematisiertes Strukturmodell der Shiga-Toxine.
Nach der Bindung bilden sich Clathrin-besetzte Einsenkungen aus, die das Holotoxin umschließen und als abgeschnürte Vesikel endozytieren. Ein Teil der Endosomen wird in sensitiven Zellen retrograd über den Golgi-Apparat zum endoplasmatischen Retikulum transportiert. Auf diesem Weg wird die enzymatisch-aktive A-Untereinheit vom restlichen Toxin abgespalten und wird schließlich in das Zytoplasma transloziert [Sandvig et al., 1992].
Im Zytoplasma entfernt die freie A1-Untereinheit, die eine N-Glycosidase ist, einen Adeninrest von der 28S rRNA-Untereinheit. Dadurch wird die Proteinbiosynthese unterbrochen, was zum Zelltod führt.
Die Gene für Stx1 und Stx2 sind als Operon auf einem Bakteriophagen angeordnet (s.
1.3.5), während die Stx-Varianten oft chromosomal kodiert sind [O´Brien et al., 1984;
Marques et al., 1987]. Nach einem Promotor liegen die Strukturgene für die A- und B- Untereinheit hintereinander. Sie sind durch 12-15 nicht kodierende Basenpaare voneinander getrennt. Viele der als konserviert beschriebenen Aminosäuren liegen in der enzymatisch aktiven Region. Diese wird bei Stx1 wesentlich mitbestimmt durch die Glutaminsäure an Position 167, bei Stx2 an Position 166 [Hovde et al., 1988; Jackson et al., 1990]. Ersetzt man diese Glutaminsäure durch eine andere Aminosäure, z.B. Aspartat, sinkt die Toxizität des reifen Proteins um das Hundertfache ab [Jackson et al., 1990]. Andere für die Toxizität des Proteins wichtige Bereiche sind das Tyrosin an Position 76 und die Aminosäuren zwischen Position 200 und 211.
Die Positionsangaben der Aminosäuren in dieser Arbeit für stx2 beruhen auf die Sequenzanalysen von Jackson et al. [Jackson et al., 1987b; 1990], die für stx1 auf die
S S
A1 A2 B
Sequenzanalysen von Kozlov et al. [Kozlov et al., 1988]. Die Positionsangaben der Aminosäuren beziehen sich auf das reife Protein.
Shiga-Toxine sind am Entstehen von Diarrhoen beteiligt [Kaper et al., 2004]. Im Tierversuch mit Kaninchen schädigte Stx selektiv die absorptiven Villi, wodurch es zu einer Nettosekretion kam [Kandel et al., 1989]. Auch eine systemische Beteiligung wird angenommen, da intravenös injiziertes gereinigtes Stx1 oder Stx2 bei Kaninchen unblutige Durchfälle auslösen kann [Richardson et al., 1992]. Studien mit Stx-Mutanten ließen den Schluß zu, daß Stx essentiell für die Ausbildung blutiger Durchfälle und der HC ist [Nataro et al., 1998].
Stx wird auch für das Entstehen des HUS verantwortlich gemacht. Schäden an Endothelien und Leukozytenaktivierung stehen zentral bei der Entwicklung von mikroangiopathischen Läsionen. Man nimmt an, daß Stx1 aus dem Darmlumen transzellulär durch intakte intestinale Epithelzellen in die Zirkulation in einem energieverbrauchenden Prozeß transloziert werden kann [Acheson et al., 1996b]. Dieser Prozeß scheint unabhängig vom Vorhandensein des Gb3–Rezeptors zu sein. Patienten mit blutiger Diarrhoe haben ein größeres Risiko, ein HUS zu entwickeln. Das weist auf eine erleichterte Toxin-Passage bei intestinalem Epithelschaden hin. Stx2 scheint parazellulär in den Kreislauf einzutreten [Hurley et al., 1999]. Allerdings wurde das Toxin bisher noch nicht in der Blutbahn von HUS- Patinenten nachgewiesen. Eine Erklärung hierfür könnte sein, daß Erythrozyten mit niedriger Affinität das Toxin binden und zu Geweben mit hoher Stx-Affinität transportieren [Paton et al., 1998]. Es konnte gezeigt werden, daß Stx1 sich an Granulozyten bindet und zu glomerulären Endothelzellen transportiert wird [te Loo et al., 2000]. Granulozyten selbst sind in der Lage, die Stx-Synthese zu steigern [Wagner et al., 2001]. Zielzellen von Stx sind besonders Endothelzellen der Glomeruli und Arteriolen der Niere [Obrig et al., 1988; Zoja et al., 1992]. Aber auch Zellen des Kolons, des ZNS, des Pankreas und anderer Organsysteme können geschädigt werden.
Die Wirkung von Stx ist nicht auf die Hemmung der Proteinbiosynthese beschränkt. Stx induziert in Makrophagen und anderen Leukozyten die Expression von Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α), Interleukin-1 beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6) und weiteren Zytokinen [van de Kar et al., 1992; Inward et al., 1997]. Diese Zytokine aktivieren Leukozyten und erhöhen zusammen mit den Lipopolysacchariden (LPS) die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber Stx durch eine erhöhte Expression von Gb3 [Louise et al., 1992; Eisenhauer et al., 2001]. Renale Tubulusepithelzellen können Ziele Stx-vermittelter Apoptose sein [Kazunari et al., 2001].
Apoptose scheint an der Ausbildung des HUS beteiligt zu sein. Auch in intestinalen
Epithelzellen kann Stx Apoptose induzieren [Kaper et al., 2004 ]. Weiterhin bindet Stx an Thrombozyten und aktiviert diese [Karpman et al., 2001]. Der Thrombozytenverbrauch beim HUS wird sowohl direkt durch Stx sowie sekundär durch endotheliale Schäden verursacht.
Außerdem stimuliert Stx die Sekretion von ungewöhnlich großen Multimeren vom von Willebrand Faktor durch glomeruläre Endothelzellen [Pysher et al., 2002]. Eine abnorme Proteolyse von diesen Multimeren scheint für Thrombozyten aggregationsfördernd zu sein [Tsai et al., 2001]. Es wird vermutet, daß es durch Stx zu einer Störung zwischen pro- und antikoagulatorischen Einflüssen kommt.
Die Rolle, die Stx in der Pathogenese bei Infektionen mit EHEC spielt, ist noch nicht vollständig geklärt. Eine Ursache hierfür ist das Fehlen eines Tiermodells, welches alle Aspekte der humanen Infektion mit EHEC nachahmen könnte. Neben Modellen mit Mäusen, Kaninchen, Windhunden und Affen hat sich das Modell mit gnotobiotischen Schweinen als besonders geeignet erwiesen, weil sie neben lokalen auch auf die systemischen Effekte von Stx reagieren [Tzipori et al., 1985;Gunzer et al., 2002; Francis et al., 1989]. Gnotobiotische Schweine werden unter sterilen Bedingungen entbunden und gehalten.
1.3.5 Die Shiga-Toxin kodierenden Bakteriophagen
Die Strukturgene für Stx1 und Stx2 befinden sich auf lysogenen lambdoiden Phagen [O´Brien et al., 1984]. Als Prophage ist die Phagen-DNA ins chromosomale Genom des Bakteriums integriert. Wenn z.B. UV-Strahlung oder das zytotoxische Alkylanz Mitomycin C die bakterielle DNA schädigen, wird die Replikation gehemmt und die Exzision des Prophagen mit anschließendem lytischem Zyklus und gesteigerter Stx1- und Stx2-Produktion induziert.
Es wird angenommen, daß die Toxin-Gene mit der Phagen-DNA amplifiziert werden und ein stx-Promotor durch einen Phagen-kodierten positiven Regulator in erhöhtem Maße aktiviert wird [Mühldorfer et al., 1996; Neely et al.,1998]. Durch die Phagen-induzierte Bakteriolyse wird Toxin freigesetzt. Klinisch wurde beobachtet, daß mit Mitomycin C behandelte onkologische Patienten ein höheres Risiko haben, an einem HUS zu erkranken [Acheson et al., 1989; Lesene et al., 1989]. Niedrige Konzentrationen von Norfloxacin erhöhten die Transkribtion von Prophagengenen von E. coli EDL933 [Herold et al.,2005].
Phagen sind wichtige Vektoren für den horizontalen Transfer von Pathogentitätsfaktoren zwischen Bakterien. Die Übertragung von Pathogenitätsfaktoren durch Phagen, die sogenannte lysogene Konversion, wurde für verschiedene pathogene Bakterien beschrieben [Bishai et al.,1988; Cheetham et al.,1995]. Isolate von Citrobacter freundii und Enterobacter spp. können manchmal stx2-Gene besitzen [Schmidt et al., 1993; Paton et al., 1996].
Neuentstandene Klone von EHEC-Stämmen könnten durch die Infektion mit lysogenen stx- Phagen aus der Umwelt entstehen [Boerlin, 1999].
1.3.6 Bildung anderer Toxine
EAST1 ist ein aus 39 Aminosäuren bestehendes Enterotoxin, das durch das astA-Gen chromosomal kodiert wird. Es wurde ursprünglich bei EAEC gefunden. Savarino et al.
konnten das Gen jedoch auch in EHEC-, EPEC- und ETEC-Stämmen nachweisen [Savarino et al.,1996]. Dabei trugen alle getesteten 75 EHEC-Isolate der Serogruppe O157:H7 das astA- Gen. In einer anderen Studie wurde eine Prävalenz des Gens von 88% unter allen untersuchten EHEC-Stämmen gefunden [de Sousa et al., 2001]. Möglicherweise fördert dieses Toxin die Entstehung der wäßrigen Durchfälle, die oft in einer frühen Krankheitsphase bei Infektionen mit EHEC beobachtet werden können.
Das EHEC-Hämolysin (Hly) ist ein 107 kDa großes Protein, das in Wildtyp-Bakterien sowohl zellassoziiert als auch in geringem Maße zellfrei vorkommt [Karch et al.,1996a]. Es wird in etwa 90% bei Stx-positiven Stämmen gefunden [Beutin et al.,1994a]. Die Gene des porenbildenden Zytotoxins sind in dem sogenannten EHEC-Hämolysin-Operon organisiert.
Dieses Operon ist bei EHEC-Isolaten der Serogruppe O157 auf einem großen Virulenzplasmid mit der Bezeichnung pO157lokalisiert. Im Gegensatz zum chromosomal kodierten E. coli α-Hämolysin kann die Hämolyse nicht auf herkömmlichen Blutagar-Platten, sondern nur auf Enterohämolysin-Platten beobachtet werden. Diese Platten enthalten gewaschene Schaf-Erythrozyten und zugesetztes Ca2+[Beutin et al.,1994b].
Mögliche Funktion des EHEC-Hly ist die Freisetzung von Eisen, das eine Wachstumsstimulierung von EHEC im Darm bewirkt [Law et al., 1995]. Bei Hämolysin- exprimierenden EHEC-Stämmen trat ein HUS signifikant häufiger auf, als bei EHEC- Stämmen ohne EHEC-Hly [Schmidt et al., 1996b]. Bei HUS-Patienten wurden im Serum Antikörper gegen EHEC-Hly gefunden [Schmidt et al., 1995]. Es besteht eine Assoziation zwischen der Produktion von Shiga-Toxinen und Enterohämolysin [Beutin et al.,1989].
1.3.7 EHEC-Adhärenz
Ähnlich den EPEC durchdringen EHEC den Mukus und adhärieren unter Bildung von Mikrokolonien an die Mukosazellen. Hierbei gelangen die Bakterien bis ca. 10 nm an die Plasmamembran der Enterozyten. Unmittelbar unter der Anheftungsstelle lösen sich die Mikrovilli auf, und es bilden sich becherförmig eingestülpte Sockel. An diesen sogenannten pedestals haften die Bakterien [Knutton et al., 1989]. Die Interaktion von Bakterien und
Zellwand bewirkt eine Neuanordnung des Zytoskeletts. Umfassend werden diese Vorgänge als attaching and effacing (A/E) bezeichnet.
Viele Gene, die bei EHEC für die Ausbildung der A/E-Läsionen notwendig sind, liegen auf einer chromosomalen 35,5 kb großen Pathogenitätsinsel. Diese Region wird als Locus of enterocyte effacement (LEE) bezeichnet [McDaniel et al., 1995]. Auf diesem Lokus liegt das eaeA-Gen [Yu et al., 1992]. Dieses Gen wurde in ca. 87% der isolierten Stämme bei HUS- Fällen gefunden [Bockemühl et al., 1997], was auf eine enge Assoziation mit einem HUS schließen läßt. Das Genprodukt Intimin ist für die Ausprägung der A/E-Läsionen wichtig [Tzipori et al.,1995]. Das 97 kDa große Protein der äußeren Membran ist für die Adhärenz an die Epithelzelle verantwortlich. EHEC- und EPEC-Intimin weisen bis auf den C-terminalen Bereich große Homologien auf [Frankel et al., 1995]. Dieser an der Bindung an die Wirtszellen beteiligte Bereich [Frankel et al., 1994] könnte für den unterschiedlichen Gewebetropismus von EHEC (ileale Peyer’ Plaques) und EPEC (Dünndarm) verantwortlich sein [Phillips et al.,2000]. Es konnten verschiedene Intimin-Typen identifiziert werden [Abu- Bobie et al., 1998; Oswald et al.,2000]. Intimin γ ist spezifisch für EHEC O157 und scheint die Kolonisierung auf die Peyer’ Plaques zu beschränken [Fitzhenry et al., 2002]. Die wichtige pathogenetische Rolle wird durch hohe Serumtiter von Intimin-Antikörpern bei mit EHEC infizierten Personen unterstrichen [Jenkins et al., 2000].
LEE beinhaltet außerdem die Gene für einen Intimin-Rezeptor (Tir/EspE) [Kenny et al., 1997; Deibel et al.,1998] und ein TypIII-Sekretionssystem, welches die Proteine EspA, EspB und EspP sezerniert. Diese ebenfalls LEE-kodierten Proteine werden für die Signaltransduktion in den Wirtszellen und die Bildung der A/E-Läsionen benötigt.
1.3.8 Das große Virulenzplasmid
Fast alle EHEC-Stämme tragen ein Virulenzplasmid, dessen Größe zwischen 93,6 und 104 kb variiert [Schmidt et al., 1996a; Makino et al.,1998]. Die Bezeichnung bezieht sich auf den jeweiligen Serotyp, z.B. pO157 beim Serotyp O157. Es sind mehrere auf dem Plasmid kodierte Proteine beschrieben worden.
pO157 trägt u.a. das EHEC-Hämolysin Operon [Schmidt et al.,1996a] (s. 1.3.6).
Die in einer Anzahl von EHEC-Stämmen gefundene Serinproteinase EspP spaltet den humanen Gerinnungsfaktor V [Brunder et al., 1997]. Man vermutet, daß die Spaltung von Faktor V die lokale Blutgerinnung stört und zu den bei EHEC-Kolitis typischen Schleimhauthämorrhagien führt. Auch ein zytotoxischer Effekt auf Verozellen wurde berichtet [Djafari et al.,1997].
Außerdem sind auf pO157 die Gene für ein Typ II-Sekretionssystem [Schmidt et al., 1997] und für eine bifunktionelle Katalase-Peroxidase [Brunder et al., 1996] lokalisiert.
Dieses Enzym mit bisher unbekannter Funktion wird zusätzlich zu chromosomal kodierten Katalase-Peroxidasen exprimiert.
Die pathogenetische Rolle des Plasmids ist unklar. In vivo und in vitro Studien ergaben widersprechende Angaben über die Adhärenz an Epithelzellen. Verschiedene Studien berichten über die Ausbildung Plasmid-kodierter Fimbrien [Karch et al., 1987; Fratamico et al., 1993; Brunder et al., 2001]. Als mögliche Funktion wird auch die Produktion von Exopolysacchariden diskutiert [Fratamico et al. 1993]. Epidemiologische Untersuchungen weisen auf eine Korrelation zwischen dem Vorhandensein des Plasmids und dem Auftreten eines HUS hin [Schmidt et al., 1996b]. Diese Aussage unterstützend konnten in Patienten- Seren Antikörper gegen Plasmid-kodierte Pathogenitätsfaktoren gefunden werden [Brunder et al.,1996 und 1997, Schmidt et al.1995].
1.3.9 Säurepersistenz von EHEC
Viele EHEC zeigen Überlebensraten von über 10% nach zweistündiger Inkubation in einem Medium mit einem pH-Wert von 2,5 [Waterman et al., 1996]. Verdauungsaktiver Magensaft hat einen pH-Wert <3,0. EHEC sind somit in der Lage, die Magenpassage in einem hohen Prozentsatz zu überleben, was zu geringen Infektionsdosen von 10 bis 100 Keimen [Karch et al.,1996a] ähnlich wie bei Schigellen führt. Auch in säurehaltigen Lebensmitteln wird so ein Überleben ermöglicht [Miller et al.,1994; Leyer et al.,1995].
EHEC besitzen zwei voneinander zu unterscheidende Systeme, um niedrige pH-Werte zu überdauern. Beim System der Säuretoleranz wird bei gemäßigt saurem pH-Wert von ca. 5,9 die Fähigkeit induziert, selbst bei einem niedrigen pH-Wert von 3,3 überleben zu können [Goodson et al.,1989]. Beim System der Säureresistenz wird von Bakterien in der stationären Phase ohne vorangehende Induktion im sauren Milieu der alternative Sigmafaktor RpoS (S für starvation) gebildet [Lange et al.,1991; Small et al.,1994]. Dieses Regulatorgen bewirkt eine 103-104-fach erhöhteResistenz gegen niedrige pH-Werte im Vergleich zu wachsenden Bakterien.
1.3.10 Das RecA-Protein
Das RecA-Protein, eine 352 Aminosäuren lange DNA-abhängige ATPase, regelt u.a. den wichtigen Prozeß der homologen Rekombination. Bei der Reparatur von DNA- Doppelstrangbrüchen spielt die homologe Rekombination eine wichtige Rolle. Voraussetzung
für den Austausch genetischer Information, der Rekombination, sind homologe Bereiche gleicher oder ähnlicher Nukleotidsequenz. Den Vorgang der homologen Rekombination kann man sich bei der Konstruktion von Mutanten zunutze machen.
Zunächst wird die doppelsträngige DNA durch eine RecBCD-Helikase entwunden und ein Strang geschnitten. Mit Hilfe von RecA-Proteinen und ssb- (single strand binding) Proteinen wird ein homologes Stück doppelsträngiger DNA gebunden und entwunden. Es kommt zu Basenpaarungen zwischen der Spender- und Empfänger-DNA und einer sich überkreuzenden Struktur. An der Überkreuzungsstelle folgt die Spaltung und Neuverknüpfung der DNA durch eine Ligase. Hierbei können zwei verschiedene DNA- Doppelstränge entstehen: Entweder ist nur ein Strang oder beide von der Rekombination betroffen [Smith, 1991].
Weiterhin ist es Aufgabe des RecA-Proteins auf eine Zellschädigung durch UV-Licht oder andere schädliche Einflüsse wie z.B. Mitomycin C mit einem SOS-Reparatursystem zu antworten [Witkin, 1991]. Dieses System beinhaltet eine gesteigerte Synthese von Reparaturenzymen, verzögerter Zellteilung, reduzierter Zellatmung und die Freisetzung von temperenten Phagen. RecA kann verschiedene Proteine spalten. Beispiele hierfür sind der LexA-Repressor, der die Synthese von Reparaturenzymen kontrolliert, und der Repressor des Bakteriophagen λ, dessen Spaltung eine Überführung des temperenten Phagen in den lytischen Zyklus bewirkt [Mustard et al., 2000; Roberts et al., 1978].
Im Mausmodell wurde gezeigt, daß RecA-Mutanten eine deutlich herabgesetzte Virulenz im Vergleich zum EHEC-Wildtyp aufwiesen [Fuchs et al., 1999]. Die Autoren vermuteten als Erklärung für dieses Phänomen eine höhere Stx2-Synthese, die durch eine RecA kontrollierte spontane Stx2-spezifische Phageninduktion herbeigeführt wird.
1.3.11 Therapie
Da eine kausale Therapie von EHEC-Infektionen und vor allem vom HUS nicht zur Verfügung steht, richtet sich die symptomatische Therapie auf die Abwendung vermeidbarer Komplikationen. Hierzu zählen bei beginnendem HUS der Versuch der forcierten Diurese, eine ausgeglichene Flüssigkeits- und Elektrolytbilanz sowie der rechtzeitige Einsatz der Dialyse. Sie sollte bei linear ansteigenden Harnstoffkonzentrationen im Serum spätestens am dritten Tag nach Einsetzen des HUS begonnen werden. Da es sich bei Kindern mit HUS hauptsächlich um Kleinkinder handelt, ist die Peritonealdialyse die Methode der Wahl. Diese Methode ist, besonders bei Säuglingen und Kleinkindern, technisch einfacher und mit weniger Kreislauf- und Blutungskomplikationen behaftet. Allerdings gilt die
Peritonealdialyse bei aktivem intestinalen Geschehen als veraltet. Bei extrarenalen Komplikationen ist eine Hämodialyse zu erwägen, da sie die Kombination mit einer Plasmapherese erlaubt. Die Plasmapherese kann insbesondere bei zerebralen Veränderungen versucht werden [Zimmerhackl et al., 2002]. Jedoch liegen hier noch keine kontrollierten Studien vor.
EHEC sind in den meisten Fällen gegen Antibiotika gut empfindlich. Dennoch sollte eine antibiotische Therapie unterbleiben [Zimmerhackl, 2000], da Patienten mit EHEC-induzierten Diarrhoen häufiger ein HUS entwickelten, wenn sie Antibiotika erhielten [Wong et al. 2000].
In Übereinstimmung zu dieser Studie konnte in vitro eine erhöhte Shiga-Toxin-Produktion unter Antibiotikastreß nachgewiesen werden [Grif et al., 1998]. Wie kann es zu diesem erhöhten Risiko von HUS unter Antibiotika kommen? Eine mögliche Erklärung ist die Freisetzung präformierten Shiga-Toxins durch eine von Antibiotika ausgelöste Zellyse.
Außerdem greifen Antibiotika die intestinale Normalflora an, was zu einem Selektionsvorteil von EHEC führen könnte. Auch ein Eingreifen von Antibiotika in den Stoffwechsel von EHEC wäre denkbar. So ist es wahrscheinlich, daß durch die Antibiotika eine SOS-Antwort der Bakterien induziert wird, die eine Lyse des integrierten Phagengenoms und somit eine gesteigerte Toxinproduktion zur Folge hat [Kimmitt et al., 2000]. Gyrasehemmer erhöhten die Transkribtionsrate von Genen des Prophagen von E. coli EDL933 [Herold et al.,2005]. Auch Steroide sollten mit der seltenen Ausnahme des atypischen HUS [Zimmerhackl et al., 2002]
nicht eingesetzt werden, da sie nicht zur Verbesserung des Krankheitsverlaufes beitragen [Perez et al.,1998].
Neuere Therapieformen zielen auf eine Elimination des Shiga-Toxins vor seinem Eintritt in den Kreislauf. Lactobin ist ein aus bovinem Kolostrum gewonnenes Präparat und enthält Antikörper gegen Shiga-Toxin, welche in vitro eine potente Wirkung gegen Stx und EHEC- Hämolysin haben [Lissner et al.,1996]. In einer klinischen Studie zeigte sich bei behandelten Kindern mit EHEC-Infektionen im Vergleich mit Kontrollen eine Verringerung von Stuhlfrequenz und Durchfalldauer [Huppertz et al., 1999]. Extraintestinale Komplikationen traten bei keinem der behandelten Kinder auf. Ein anderes Präparat, SynsorbPK, enthält ein Globotriaosylzeramid-(Gb3) Rezeptoranalogon, das das Toxin im Darmlumen binden soll.
Toxin, welches bereits die intestinalen Mukosa erreicht hat, kann allerdings nicht mehr neutralisiert werden. Außerdem wird wegen der relativ hohen Toxinmengen im Stuhl ein großer molarer Überschuß benötigt. Nach einer ähnlichen Strategie entwickelten Paton et al.
einen E. coli-Stamm, der auf seiner Oberfläche ein Stx-Rezeptoranalogon trägt und freies Stx absorbieren kann [Paton et al., 2000]. Im Tierversuch wurden Mäuse mir einer 100% fatalen
Dosis mit EHEC infiziert. Tiere, denen die rekombinanten Bakterien oral gegeben worden waren, überlebten die Infektion mit der sonst tödlichen Dosis EHEC.
Ein anderer Ansatz befaßt sich mit TNFα, der als Entzündungsmediator an der klinischen Ausprägung von EHEC-Erkrankungen beteiligt ist. Im Mausmodell wurde von Isogai et al.
ein protektiver Effekt von Antikörpern gegen TFNα beschrieben [Isogai et al., 2001].
Eine schützende Wirkung von Lactobacillus casei wird von Ogawa et al. im Kaninchenmodell beschrieben [Ogawa et al., 2001]. Dabei führte die tägliche Gabe dieser Bakterien zu einer verminderten Kolonisierung mit EHEC und einer Verkürzung der Durchfalldauer nach Infektion der Versuchstiere.
Ein Impfstoff ist in näherer Zukunft nicht zu erwarten.
1.3.12 Diagnostik und Prävention
EHEC machen häufig weniger als 1% der aeroben Darmflora aus. Daher ist es schwierig, EHEC in der Überzahl apathogener E. coli zu identifizieren.
In der Regel ist die Keimausscheidung auf 5-20 Tage nach der Infektion begrenzt, kann aber in Einzelfällen bei klinisch unauffälligem Bild wochenlang andauern [Epidemiol. Bull., 1999, Karch et al., 1996a]. Allerdings gelingt der Nachweis von EHEC in Stuhlproben von HUS-Patienten in etwa zwei Dritteln nicht mehr [Tarr, 1995].
Bei der Isolierung von E. coli O157:H7 und anderen Stx-produzierenden E. coli- Stämmen stehen verschiedene Indikatornährböden zur Verfügung: Im Gegensatz zu der Mehrzahl anderer E. coli-Stämme fermentieren E. coli O157:H7 Sorbitol nicht und bilden auf Sorbitol-McConkey-Agar (SMAC) farblose Kolonien [Farmer et al., 1985; Sanderson et al., 1995], während Kolonien von Sorbitol-fermentierenden E. coli-Stämme pinkfarben sind.
Ungefähr 90% aller EHEC-Serotypen lassen sich auf Enterohämolysin-Platten nachweisen [Beutin et al., 1994b]. Außerdem kann E. coli O157:H7 durch die äußerst sensitive immunomagnetische Separation aus der großen Menge anderer E. coli isoliert werden [Cubbon et al.1996, Karch et al.,1996b].
Andere diagnostische Methoden zielen unabhängig vom Serotyp auf den Nachweis der Shiga-Toxine. Phänotypisch kann man das Stx mit einem ELISA, dem Verozellen- Zytotoxizitätstest oder im Kolonie-Immunoblot detektieren [Tarr, 1995]. Genotypisch stellt die PCR von stx-Genen eine sehr sensitive und sichere Methode dar [Bastian et al., 1998].
Nachteile der PCR sind zum einen der teils schnelle Verlust der stx-Genen nach in vitro Kultivierung [Karch et al., 1992] zum anderen der beträchtliche finanzielle und zeitliche Aufwand. Mittlerweile wurde eine real-time-PCR mit fluoreszenzmarkierten Sonden in einem
LightCycler-Gerät entwickelt, mit der man in kurzer Zeit stx1, stx2 und stx2e nachweisen kann [Bellin et al., 2001]. Ein weiteres molekulargenetisches Verfahren ist die Kolonieblot- Hybridisierung. Bei einem positivem Toxinnachweis sollte zur Ergebnisbestätigung der Erreger isoliert werden, das Isolat charakterisiert und erneut auf Stx getestet werden [Bundesgesundheitsblatt 1997].
Da insbesondere bei HUS-Patienten der direkte EHEC-Nachweis aus Stuhlproben unsicher ist, sollte bei diesen Patienten eine zusätzliche Untersuchung auf LPS-Antikörper gegen EHEC im Serum erfolgen [Chart et al., 1991; Epidemiol. Bull., 1999]. Die bei HUS- Patienten regelmäßig gefundenen LPS-Antikörper können im Hämagglutinationstest (HAT), im Immunoblot und mittlerweile auch in Speichel [Ludwig et al., 2002] nachgewiesen werden. Erschwerend hierbei ist die hohe Anzahl verschiedener EHEC-Serotypen.
Die Serodiagnostik in bezug auf Stx-Antikörper liefert keine verläßlichen Angaben [Chart et al., 1999]. In menschlichen Seren wurde eine unspezifische Stx-neutralisierende Aktivität gefunden, die nicht auf Immunoglobuline zurückzuführen war. Es zeigte sich, daß Seren von HUS-Patienten und der Kontrollgruppe nicht zu unterscheiden waren. Mögliche Erklärunge für dieses Phänomen könnte die extrem hohe Toxizität von Stx sein: Die Mengen von freiem Toxin sind wahrscheinlich zu gering, um eine Immunantwort hervorrufen zu können. Auch bindet Stx schnell an Endothelzellen [Tesh et al., 1991], so daß die Stx-Menge in der Zirkulation zu gering für eine immunologische Erkennung sein könnte. Eine weitere Erklärung ist die zytotoxische Wirkung auf B-Lymphozyten [Cohen et al., 1990]. Nur wiederholte Kontakte mit Stx scheinen zu einem deutlichen Titeranstieg zu führen. Eine Stx2- Antikörper-Antwort wurde sowohl bei HUS-Patienten wie auch bei Kontrollgruppen häufiger als eine Antwort auf Stx1 beobachtet [Ludwig et al., 2001].
Präventiv ist allgemein zu umsichtiger Lebensmittel- und Personenhygiene zu raten.
Angesichts der hohen Durchseuchung der Rinderbestände ist vor dem Verzehr roher oder unzureichend hitzebehandelter Milch- und Fleischprodukte zu warnen. Kleinkinder sollten bei Tierkontakten, insbesondere bei Rindern, Ziegen und Schafen beaufsichtigt werden und sich anschließend gründlich die Hände waschen. Seit 1997 ist es in der Milchverordnung gesetzlich verboten, unpasteurisierte Milch und Vorzugsmilch an Gemeinschaftseinrichtungen zu liefern. EHEC-Patienten sind nach § 34 des Infektionsschutzgesetzes (IfsG) von der Öffentlichkeit abzusondern. EHEC-ausscheidende Personen gelten wegen der geringen Infektionsdosen als hochkontagiös und müssen besondere Hygienemaßregeln treffen.
Gegebenenfalls muß eine Tätigkeit im Bereich der Lebensmittelherstellung und –verarbeitung ausgesetzt werden (§ 42 IfsG).
Es besteht eine Meldepflicht an das zuständige Gesundheitsamt gemäß § 6 des Infektionsschutzgesetzes bei Verdacht und Erkrankung an enteropathischem HUS, unabhängig vom Erregernachweis sowie von nachgewiesenen EHEC-ausscheidenden Personen.
1.4 Möglichkeiten bakterieller Vakzinierung
Die grundsätzlichen Möglichkeiten bakterieller Vakzinierung werden von Schild et al. 1999 zusammenfassend dargestellt [Schild et al., 1999]: Erste bakterielle Impfstoffe waren lebende Stämme, die von virulenten Kulturen isoliert wurden. Diese Stämme wurden durch Subkulturen attenuiert. Mögliche Vorgehensweisen waren u.a. ein Bakterienwachstum unter unnatürlich hohen Temperaturen oder auf besonderen Nährmedien. Beispiele sind der 1880 von Pasteur entwickelte Anthrax-Impfstamm für die Milzbrandimpfung und der 1928 gewonnene Bacillus-Calmette-Guérin (BCG) für die Mycobacterium tuberculosis-Impfung.
Häufige Nachteile von attenuierten Lebendimpfstoffen waren starke Schwankungen in Sicherheit und Effektivität.
Eine andere Methode der Impfstoffherstellung ist das Abtöten des ganzen Bakteriums.
Solche Totimpfstoffe wurden meist durch milde Hitzeeinwirkung oder chemische Behandlung gewonnen und bestehen aus dem ganzen, nicht aufgeschlossenen Erreger. Aus empirischen Versuchen sind Impfstoffe gegen Cholera, Pertussis, Pest und Thyphus hervorgegangen. Bei anderen Organismen, wie Gonokokken, Meningokokken, Pneumokokken und Mykobakterien, zeigten diese Vorgehensweisen keinen Erfolg. Bei diesen Bakterien variieren Antigene während des in-vivo-Wachstums in der Expression oder es ist zur Entwicklung einer Immunität eine T-Lymphozytenreaktion vom verzögerten Typ notwendig. Schwierigkeiten bei der Herstellung von Totimpfstoffen bestehen in variabler Expression protektiver Faktoren von verschiedenenen Bakterienstämmen und von gleichen Stämmen durch unterschiedliche Wachstumsbedingungen. Das kann eine mangelnde Effektivität des Impfstoffes zur Folge haben.
Bakterielle Toxoid-Impfstoffe sind der erste erfolgreiche Versuch, Impfstoffe zu produzieren, die auf bestimmte Pathogenitätsfaktoren zielen. Eine Möglichkeit, die Immunität zu erhalten, ist der Einsatz von Toxin-Antitoxin-Komplexen. Bei dieser Methode müssen die optimalen Verhältnisse zwischen Toxin und Antitoxin genau kontrolliert werden. Wegen
einer möglichen Dissoziation der Komplexe oder einer inkompletten Inaktivierung wurde der Einsatz von Chemikalien vorgezogen. Mit Formaldehyd hergestellte Toxoid-Impfstoffe gegen Diphterie und Tetanus sind noch heute im Einsatz.
Neuere Ansätze in der Impfstoffentwicklung zielen auf spezifische Merkmale ab:
Modernere Impfstoffe können aus Polysacchariden oder Protein-Polysaccharid-Verbindungen bestehen. Polysaccharide werden aus Antigenen der Kapsel von bekapselten Bakterien, wie Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Typ B oder Salmonella typhi gewonnen. Um immunogen zu sein, müssen die Moleküle eine Mindestgröße besitzen. Begrenzt ist ihre Effektivität, weil Polysaccharide T-Zell unabhängige Antigene sind, keine wirksame Stimulierung von Antikörper-Isotypen- und Subklassenwechsel bewirken, geringe Antikörper-Affinität erzielen und keine sekundäre Immunantwort über Gedächtniszellen stimulieren. Außerdem rufen sie keine Immunreaktion bei sehr jungen Kindern hervor.
Höhere Effektivität wird durch das Koppeln von den Poly- oder Oligosacchariden an Proteincarrier erreicht. Mit solchen Protein-Polysaccharid-Konjugaten wird eine gute T-Zell- Reaktion hervorgerufen. Eine Vielzahl von Impfstoffen gegen bekapselte und unbekapselte Bakterien sind mit dieser Strategie hergestellt.
In einem anderen Ansatz werden gereinigte Protein-Untereinheiten eingesetzt. Relativ einfach ist das bei Infektionen, die durch Toxine hervorgerufen werden. Bei Infektionen mit komplexerer Pathogenese erwies es sich allerdings als schwieriger, die geeigneten Zielantigene zu finden. Dabei scheint sich die Effizienz mit steigender Anzahl von Antigenen zu erhöhen. Auch die Methode, mit der das Toxin unschädlich gemacht wird, kann die Resultate beinflussen. Die Proteinkomponenten können entweder über Reinigung aus dem Wildtyp angereichert werden oder mit rDNA-Technik in einem Wirtsstamm gewonnen werden. Nachteil der zuletzt genannten Methode ist, daß rDNA-Proteine im Wirtsstamm nach der Translation anders modifiziert werden können als das im Wildtyp der Fall ist. Weiterhin können teilweise komplexe Proteine in fremden Wirtssystemen nicht zusammengesetzt werden. Die rDNA-Technik ist besonders für Bakterien interessant, die in in vitro nicht zu kultivieren sind, wie Treponema pallidum oder Mycobacterium leprae. Routinemäßig eingesetzt werden Impfstoffe aus rekombinanten Proteinen gegen Meningokokken Gruppe B, Hepatitis B und Pertussis.
Eine aktuelle Strategie ist die Entwicklung attenuierter Lebendstämme durch gezielt eingeführte Mutationen. Dies kann z.B. durch die „site-directed mutagenesis“ geschehen. Die
Mutationen können Gene für wichtige Stoffwechselfunktionen oder spezifische Virulenzfaktoren betreffen. Diese Methode wurde in dieser Arbeit angwandt.
1.5 Die Immunprophylaxe gegen EHEC-Infektionen aus der Sicht des öffentlichen Gesundheitswesens
Bei der Einführung einer Immunprophylaxe müssen eine Vielzahl von Fragen im Bereich des öffentlichen Gesundheitswesens, des internationalen Handels und Reiseverkehrs bedacht werden. Der Epidemiologe Robert V. Tauxe wägt in einer Zusammenfassung das Für und Wider vier grundsätzlicher immunprophylaktischer Strategien ab, die jeweils auf die Immunisierung verschiedener Populationsgruppen abzielen [Tauxe, 1998]. Generell sind die Vor- und Nachteile dieser Strategien mit den prinzipiellen Präventionsmaßnahmen gegen Zoonosen zu vergleichen: Verbesserung von Lebensmittelsicherheit, Wasserversorgung und Hygiene.
Als erste Möglichkeit wird die Immunisierung der gesamten menschlichen Bevölkerung gegen EHEC mit dem Ziel eines Infektionsschutzes besprochen. Kommt es durch die Impfung zu einer verminderten Vermehrung der Bakterien im Impfling, bedeutet dies auch eine gewisse Reduktion der Übertragung von Mensch-zu-Mensch. Da das Überträgerreservoir, welches Tiere darstellen, nicht beeinflußt würde, würde die wichtigste Infektionsquelle für den Menschen bestehen bleiben. Da EHEC-Infektionen alle Altersgruppen betreffen, müßte durch Auffrischimpfungen eine lebenslange Immunität erzielt werden, was eine hohe Compliance der Bevölkerung voraussetzt. Neben den Kosten für so ein aufwendiges Impfprojekt wären weitere wirtschaftliche Auswirkungen zu erwarten: Bei dieser Strategie wird vorausgesetzt, daß die Lebensmittelsicherheit unzureichend ist. Als logische Konsequenz müßten Besucher des Impflandes ebenfalls geschützt werden. Auch müßte ein Schutz von Konsumenten exportierten Fleisches erwogen werden.
Als zweite Strategie wird die aktive Immunisierung von Hochrisikogruppen, Kindern unter 15 Jahren und älteren Menschen, diskutiert. Ein lebenslanger Schutz wäre nicht notwendig. Um Komplikationen zu verhindern, wäre eine solche Vakzine an wichtigen pathogenetischen Faktoren, wie den Shiga-Toxinen, ausgerichtet. Auswirkungen auf den internationalen Handel und Reiseverkehr seien zu erwarten. Wie bei der erst genannten
Strategie wäre es problematisch, die Effizienz der Vakzine zu testen: Hierzu müßten die Inzidenz hoch und die Probandenzahl groß sein.
Eine dritte Möglichkeit sei die Impfung von Nutztierbeständen, mit Hauptaugenmerk auf Rindern und somit auf der Ausschaltung der Hauptinfektionsquelle. Da EHEC bei diesen Tieren keine Krankheitssymptome hervorruft, müßte die Vakzine eine Kolonisation verhindern. Wegen der hohen Durchseuchung von Nutztierbeständen wäre es relativ einfach, den Impfstoff zu testen. Im Prinzip müßte ein solcher Impfstoff von der Nahrungsmittelindustrie akzeptiert werden, da er ihre Lebensmittel sicherer und damit attraktiver machen würde. Dem gegenüber stehen die aufzubringenden Kosten und ein nur indirekter Nutzen für die Nahrungsindustrie, da die Tiere krankheitsfrei sind. Auch der Nahrungsmittelimport würde beeinflußt werden.
Schließlich wäre eine passive Immunisierung mit antitoxischem Immunglobulin für eine kleine Gruppe von Menschen mit vorübergehend hohem Risiko, z.B. Familienmitglieder eines Kindes mit einer EHEC-Infektion, denkbar. Der Schutz gegen Komplikationen würde unmittelbar, wenn auch zeitlich begrenzt eintreten und wäre zur Kontrolle von Ausbrüchen geeignet. Allerdings zeigten Tierversuche, daß ein Schutz nur bei einer schnellen Gabe des Antitoxins innerhalb von 48 Stunden nach einer Infektion wirksam ist [Yamagani et al., 2001].
1.6 Zielsetzung
Dieser Arbeit liegen zwei voneinander unabhängige Ziele zugrunde:
Erstes Ziel war die Entwicklung einer isogenen stx2-Mutante des EHEC-Stammes 86-24 durch gezielte Mutagenese. Diese sollte gewährleisten, daß von der Mutante mutagenisiertes Toxin mit im Idealfall eliminierter Toxizität bei gleichzeitig erhaltener Immunogenität exprimiert wird. Zur sicheren Senkung der Toxizität des Stx2 sollten an drei verschiedenen Stellen im stx2-Gen Veränderungen vorgenommen werden. Neben einem Aminosäurenaustausch und einer Deletion von zwölf Aminosäuren war die wichtigste Mutation die Umwandlung von Glutamat an Position 166 zu Glutamin im aktiven enzymatischen Zentrum des Toxins. Fernziel ist es, durch diese Arbeit einen weiteren Schritt zur Entwicklung eines EHEC-Impfstoffes zu gehen.
Zweites Ziel war die Konstruktion einer isogenen Shiga-Toxin 1 negativen Mutante des EHEC-Stammes EDL973. Diese Mutante wird im Rahmen tierexperimenteller Studien mit gnotobiotischen Schweinen eingesetzt werden, um die Rolle von Stx1 in der Pathogenese von Erkrankungen des Menschen durch EHEC besser zu verstehen. Fernziel ist es, die in diesen Versuchen gewonnenen Erkenntnisse zur weiteren Entwicklung von präventiven und therapeutischen Maßnahmen von EHEC-Erkrankungen zu nutzen.
2. Strategie zur Herstellung isogener Mutanten
Die Herstellung isogener Mutanten beruht auf homologer Rekombination, welche durch Suizidvektoren ermöglicht wird. Suizidvektoren besitzen ein origin of replication (oriR), welches zur Initiation der Replikation das π-Protein benötigt. Der den jeweiligen Suizidvektor tragende Laborstamm E. coli SM10λpir besitzt das π-Protein kodierende pir-Gen im Gegensatz zu den verwendeten EHEC-Wildtypen. Wird ein Suizidvektor in einen solchen EHEC-Wildstamm eingebracht, kann seine genetische Information nur fortbestehen, wenn die Vektor-DNA durch homologe Rekombination in das Wirtsgenom integriert wird.
Die Vektoren pMHH1 und pTUV6 gehen aus dem Suizidvektor pGP704 [Herrero et al., 1990] hervor. In pGP704 wurde das Levansucrase kodierende sacB-Gen kloniert [Lepesant et al., 1974], das bei der Herstellung unmarkierter Mutanten als positives Selektionssystem genutzt werden kann [Quandt and Hynes, 1993],. auf dem ein positives Selektionssystem basiert ist. Als Klonierungsvektor konstruiert, besitzen beide Vektoren eine Ampicillinresistenz, eine zur Mobilisation benötigte Mob-Site und eine Multiple Cloning Site.
Dieser Abschnitt erläutert im folgenden die Strategie zur Klonierung der Suizidvektoren und zur Gewinnung isogener Mutanten. Eine Übersicht über die vorgenommenen Schritte geben die Abbildungen 3-7.
2.1 Klonierung eines Teils der A-Untereinheit von stx2 in pUC19
Zunächst versuchten wir das gesamte Toxin-Gen in pUC19 zu klonieren. Dies gelang trotz wiederholter Versuche nicht. Wir vermuteten, daß sich die gesamte A-Untereinheit toxisch auf den Laborstamm auswirkte, woraufhin wir unsere Strategie änderten. Die Klonierung der fragmentierten A-Untereinheit verlief problemlos. Dazu wurde das entsprechende DNA- Fragment mittels PCR mit den Primern AG1/GK1a amplifiziert. Am 5´-Ende wurde durch überhängende Primer eine Schnittstelle für XbaI außerhalb des codierenden Bereichs eingeführt. Am 3´-Ende wurde eine natürliche Schnittstelle für PstI genutzt. Das PCR- Produkt wurde mit den Enzymen XbaI/PstI nachgespalten. Das durch Ligation entstandene Plasmid pAG1 wurde in E. coli DH5α transformiert.
2.2 Sequenzgerichtete Mutagenese
Die Mutagenese durch PCR ist eine Methode, um sequenzgerichtet Punktmutationen, den Austausch mehrerer Basen bis hin zur Insertion oder Deletion mehrerer Aminosäurecodons in ein Gen einzuführen. Dabei besitzen die zur PCR zugesetzten Primer die gewünschte Mutation. Die einzelnen Arbeitsschritte sind in Abschnitt 4.2 ausgeführt.
Nacheinander wurden mit Hilfe der dieser Methode die Aminosäurecodons von drei enzymatisch-funktionellen Kernregionen der A-Untereinheit im stx2-Gen mutagenisiert. Die Primer wurden so gewählt, daß die jeweilige einzuführende Aminosäure mit ihrem häufigsten Codon vertreten war. Eine Übersicht über die einzelnen Mutagenese-Schritte gibt Abbildung 2.
Zunächst wurde die wichtigste der drei Regionen mutagenisiert: Glutaminsäure 166 befindet sich im aktiven Zentrum. Ein Aminosäurenaustausch mit Glutamin führt zu enzymatischer Inaktivität [Jackson et al., 1990]. Durch diese Mutation entstand eine zusätzliche Schnittstelle für das Restriktionsenzym StuI. Die gewonnenen Plasmide wurden auf die Mutation durch einen Restriktionsverdau mit StuI getestet.
Nach dem gleichen Prinzip wurde das Codon für Glutaminsäure 166 zum Codon für Asparaginsäure umgewandelt, wodurch sich eine zusätzliche Schnittstelle für das Restriktionsenzym HgaI ergab. Mutagenisierte Klone wurden durch einen HgaI-Verdau bestätigt. Mit diesem Konstrukt wurde in dieser Arbeit nicht weitergearbeitet, da die die Mutation E166Q geeigneter für ein Vakzinierungskonstrukt erschien: Studien ließen darauf schließen, daß die Toxizität bei Ersatz von Glutaminsäure durch Glutamin stärker als durch Asparaginsäure gesenkt wird [Gordon et al.1992].
In einem zweiten Schritt wurde das Codon für Tyrosin an der Position 76 zum Codon für Serin mutiert. Als Ausgangsplasmid wurde pE166Q verwand. Eine neue Schnittstelle wurde mit einem BsaJI-Restriktionsverdau nachgewiesen. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pY76S.
In einem dritten Schritt wurden elf Aminosäurecodons von Position 200 bis 211 deletiert.
Mit dem Primerpaar AG6a/AG6b wurde pY76S in einer PCR amplifiziert. Das mit XbaI/PstI herausgeschnittene Insert war im Vergleich zur 917 bp langen Vorlage in der gelelektrophoretischen Auftrennung kürzer. Noch deutlicher war der Verlust der 36 bp im StuI-Verdau zu erkennen: Das kleine Fragment von 297 bp war im neu synthetisierten Plasmid p∆200 261 bp lang.
