Evaluation in vitro de l'activité de la population microbienne du rumen

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Station fédérale de recherches en production végétale

de Changins

Directeur: André Stéubli http://www.admin.ch/sar/rac

Evaluation in vitro de l'activité de la population microbienne du rumen

en présence d'extraits végétaux

J. SCEHOVIC, Statiori fédérale de i'eChei"CheS en p1'QdlfCtiOn l'egétale de Changins, CH-1260 Nvvn

E-mail: jan.scehovic@rac.admin.ch Tel. (+41) 22/36 34 444.

Introduction

A l'échelle de la planète, les ruminants domestiques tirent 90 à 95% de leur nourriture de l'appareil végétatif aérien des plantes herbacées, des plantes vi- vrières après leur récolte et des arbus- tes (JARRIGE et al., 1995). Ces fourrages sont d'une extraordinaire diversité bo- tanique, morphologique, anatomique et physico-chimique. Toutes ces caracté- ristiques agissent sur leur ingestibilité, leur dégradation dans le rumen et leur digestibilité. En Suisse, les prairies per- manentes représentent environ 60% de la surface agricole utile et assurent la part la plus importante de l'alimenta- tion des ruminants. Ces prairies sont des

associations végétales plus ou moins complexes, composées généralement de graminées, de légumineuses et d'au- tres dicotylédones. La présence parfois importante de certaines dicotylédones riches en métabolites secondaires peut entraîner, d'une part, une forte sélecti- vité de la part du bétail au paturage et, d'autre part, une diminution de la di- gestibilite et de l' ingestibilité du four- rage. Mis à part leur aptitude à inhiber l'activité des enzymes cellulolytiques (DAIBER, 1975; SWAIN, 1977; MUELLER- HARVEY, 1989; SCEHOVIC, 1995), cer- tains métabolites secondaires peuvent conduire, par leur action antibiotique, à une diminution de l'activité des micro- organismes du rumen (CHENG et al.,

1980; JUNG, 1985; BORNEMAN et al., 1986; LAMED et al., 1987; SCEHOVIC, 1997 et 1998).

Les cellules végétales sont constituées d'une paroi externe rigide et de deux compartiments spécifiques: les plastes et les vacuoles. Ces dernières occupent souvent plus de la moitié du volume des cellules. Elles accumulent de l'eau, des substances nutritives organiques et minérales, des enzymes, des produits de déchets, ainsi que des produits poten- tiellement nocifs (JARRIGE et al., 1995).

Depuis la fin du siècle dernier, on a cherché à extraire le contenu cellulaire pour isoler les parois considérées comme facteur déterminant la qualité des fourrages. L'action potentiellement antinutritionnelle de certaines substan- ces présentes dans le contenu cellulaire a ainsi été négligée.

Nous présentons dans cet article un procédé microbiologique permettant de quantifier les effets de l action conco- mitante, positive et négative, de l'ex- trait végétal sur l'activité de la popula- tion microbienne du jus de rumen.

Matériel et méthodes

Mise au point méthodologique Principe de la méthode (fig. 1) L'évolution du pH durant le processus de fermentation est un excellent indicateur de l'intensité de l'activité microbienne (RÉ- MOND et al., 1995; DACCORD et al., 1997).

Du gaz, issu des fermentations microbien- nes et de la décomposition des bicarbonates salivaires, est dissous dans la phase liquide du contenu ruminal. La diminution du pH du milieu est le résultat de l'élévation de la concentration des acides gras volatils pro- duits par la fermentation.

Résumé

Le contenu de la cellule végétale est composé, d'une part, de substan- ces nutritives indispensables a la croissance microbienne du rumen et, d'autre part, de substances dont la fonction, défensive dans l'organisme végétal, définit l'orientation plutôt antibiotique de leur action. Une métho- de in vitro a été développée pour évaluer l'action stimulante et inhibitrice de l'ensemble des substances du contenu cellulaire sur l'activité micro- bienne du rumen. L'extrait cellulaire obtenu par macération de la matière végétale dans de la salive artificielle est mélangé avec du jus de rumen et du glucose. L'incubation en conditions optimales (température, anoxie) du mélange ainsi obtenu entraîne la production de gaz dont la dissolu- tion dans le milieu de fermentation a pour résultat l'abaissement du pH initial. L'ampleur de cette évolution qui est une fonction linéaire de l'acti- vité microbienne, est mesurée et exprimée par rapport a un témoin d'une composition appropriée au niveau d'énergie et de minéraux mais exemp- te de stimulateurs et d'inhibiteurs de cette activité. Les résultats obtenus avec une centaine d'espèces végétales prélevées individuellement dans des prairies permanentes, révèlent des différences interspécifiques très importantes.

Pour une courte durée, le niveau de fermen- tation — et donc la production de gaz — est une fonction linéaire de la croissance de la population microbienne (KRISHNAMOORTHY et al., 1991). En situation non limitante d'approvisionnement en énergie des micro- organismes et des conditions du milieu (température, anoxie, osmolarité), 1 évolu- tion du pH traduit donc directement l'action simultanée de diverses substances présentes dans l'extrait végétal sur la prolifération microbienne.

Après 4 heures d'incubation d'un mélange de l'extrait végétal et du jus de rumen, l'évolution du pH est enregistrée et sa va- leur est exprimée par rapport à un témoin.

Matière végétale

Une centaine d'espèces végétales ont été prélevées séparément dans des prairies per- manentes. Deux à quatre échantillons de chaque espèce ont été prélevés à différents stades de développement et dans différents

lieux. La matière végétale a été séchée a 55 °C dans une étuve ventilée durant 24 heu- res, puis réduite en poudre (1 mm) et stockée à l'obscurité.

Extraction de la fraction soluble L'extraction de la fraction soluble est effec- tuée par macération de la matière végétale dans de la salive artificielle (MCDOUGALL, 1948; SCEHOVIC, 1997) à la température de 47 °C dans des conditions anaérobies (SCE- HOVIC, 1998). Pour imiter le mieux possible les conditions réelles de l'organisme animal et pour éviter la dilution dans la salive des substances potentiellement actives, nous avons adopté une proportion salive/substrat se rapprochant du rapport moyen des pha- ses liquide et solide dans le rumen (35 ml de salive pour 2,5 g de matière végétale).

Après 18 heures de macération, l'extrait est refroidi dans de la glace pilée et séparé du résidu végétal par filtration sous pression de N, à travers un verre fritté (porosité 1).

Jus de rumen

La collecte, le conditionnement, la congéla- tion, le stockage et la manipulation du jus de rumen ont été effectués selon SCEHOVIC (1998).

Mélange d'inoculation

Le mélange d'inoculation est un mélange de jus de rumen, de salive et de glucose qui est le substrat préférentiel de nombreuses espèces microbiennes (FONTY et al., 1995).

Le glucose est ajouté en excès (20 mg/ml de milieu fermentaire), afin d'assurer, du point de vue énergétique, des conditions optimales pour la croissance de la popula- tion microbienne.

Incubation — fermentation

Le mélange d'inoculation est ajouté à l'ex- trait végétal (dans les proportions volu- miques 1:2,5) et l'incubation est effectuée dans des tubes de 15 ml dont l'air a été chassé a l'aide d'un courant de CO,. Après avoir mesuré le pH du milieu fermentaire (valeur «avant fermentation»), les tubes sont hermétiquement fermés, bien agités et placés dans un incubateur préchauffé à 39 °C. Après 4 heures d'incubation, la fer- mentation est stoppée en plaçant les tubes dans un congélateur pour quelques minutes.

La mesure du pH du milieu fermentaire est alors effectuée pour obtenir la valeur «après fermentation».

Témoin

Chaque série d'échantillons est accompa- gnée d'un témoin où l'extrait végétal est remplacé par la salive artificielle. La com- position du témoin correspond a la situation d'alimentation optimale du point de vue minéral et énergétique en absence de stimu- lateurs ou d'inhibiteurs potentiels de la pro- lifération microbienne.

Calcul de l'indice d'activité fermentaire potentielle (IAFP) Pour effectuer les mesures du pH qui est l'unité de base de ce procédé, il est recom- mandé d'utiliser le pH-mètre le plus précis et le plus stable possible, de préférence avec un dispositif de compensation de la température incorporé. L'IAFP est calculé de la façon suivante:

D= 100x(A-B)/A

A = pH avant fermentation, B = pH après fermentation

IAFP = 100 x DE / DT

DE = valeur pour l'échantillon mesuré (ex- trait végétal), DT = valeur pour le témoin.

Repetabilite

Deux séries de tests ont été effectuées sur trois espèces végétales (Loliuïn perenne, Ti-ifoliurn pratense et Polygonum historta) pour déterminer la répétabilité (Sr: écart-type de répétabilité) du procédé décrit. Il s'agis- sait, d'une part, d'analyser les résultats ob- tenus en mesurant six fois le même extrait et, d'autre part, de comparer les résultats obtenus avec six extraits de la même espèce.

L'utilisation de trois espèces végétales a eu pour but de s'assurer de la bonne répétabili- té, à tous les niveaux, des valeurs obtenues.

Les résultats des tests montrent que la repe-

Macération (18h à 47 °C) CO2

Salive Salive artificielle artificielle

(35 ml) (pH = 6,9)

Matière végétale (2,5 g)

Filtration sous pression de N2 CO2 (verre fritté porosité 1)

Mélange d'inoculation -jus de rumen (2,6 ml)

C 1

Echantillon Témoin

10 ml N ~ 10 ml

CO21==>~ 4 ml ~ COz O2

1 1

pH avant fermentation

E Fermentation É

1 (4h à 39 °C)

> >

pH après fermentation Fig. 1. Schéma du procédé expérimental.

7.5 7.2

6.7

CL 6.

6.2

. _~â~ ['~~

>*_~

5.7

5. 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Durée de la fermentation (heures) 5

7

5 5

5 6

5 -f- Avec échappement du gaz

~- Sans échappement du gaz 5

Inhibition (IAFP < 100) Geranium sylvaticum

Silene vulgaris Silene alba Rumex obtusifolius Ranunculus friesianus Rumex acetosa Myosotis sylvatica Polygonum bistorta Bartsia alpina Hypericum maculatum Centaurea scabiosa Onobrychis viciifolia Sanguisorba minor Plantago alpina Veronica chamaedrys Ranunculus aconitifolius Geum montanum Alchemilla vulgaris Ranunculus bulbosus Heracleum sphondylium Stellaria media Artemisia annua Plantago lanceolata Ranunculus repens Plantago major Luzula multiflora Ranunculus acris Vicia sepium Chaerophyllum sp.

Plantago atrata Geranium molle Aster bellidiastrum

Stimulation (IAFP > 100) Vicia cracca

Dnonis spinosa rrifolium thalii

~lantago media

~oa alpina non vivip.

ohleum rhâticum

~lardus stricta Trifolium alpinum

~ledicago sativa Ligusticum mutellina 4çlrostis capillaris Trrfolium repens

Poa alpina vivipar 4nthoxantum alpinum Campanula barbata Festuca pratensis megalo.

Taraxacum officinale Festuca nigrescens Pimpinella major Dactylis glomerata Cynosorus cristatus Tragopogon orientalis Carum carvi

Crepis aurea Crepis biennis Lolium perenne Brachypodium pinnatum Ajuga reptans

Lotus alpinus Vicia sativa Lamium album Hippocreppis comosa Onobrycf~is sativa Leucanthemum vulgare Centaurea montana Centaurea jacea Bromus hordeaceus

Anthoxantum odoratum Anthriscus sylvestris Cirsium eriophorum Trifolium badium Knautia arvensis Scabiosa columbaria Rhinantus alectorolophus Achillea millefolium Lotus corniculatus Trifolium montanum Salvia pratensis Galium mollugo Carex curvula Cardamine pratensis Silene dioica Holcus lanatus Carex sempervirens Briza media Potentilla erecta Bromus erectus

Medicago lupulina Trifolium pratense Anthyllis vulneraria Leontodon helveticus Lathyrus pratensis Daucus carota Leontodon hispidus 200 1

Fig. 2. Exemple d'évolution du pH du mi- lieu fermentaire avec et sans échappement

du gaz. >

tabilite, très bonne pour différentes mesures du même extrait _(Sr = 2,02 avec IAFP moyen de 125,9), diminue légèrement avec six extraits d'une même espèce _(Sr = 2,79 avec IAFP moyen de 127,04).

Résultats et discussion

A l'origine, le procédé décrit est basé sur la mesure du volume de gaz produit par la fermentation microbienne en présence de l'extrait végétal (SCEHOVIC, 1998). Dans ce travail, nous avons constaté l'existence d'une relation si- gnificative entre la production de gaz et l'évolution du pH de la phase liquide du milieu. Selon RÉMOND et al. (1995), le gaz issu des fermentations micro- biennes est dissous dans la phase liqui- de du rumen et son excès s'accumule sous forme gazeuse. Cette observation nous a incités à effectuer une série de tests. Nous avons comparé l'évolution du pH du milieu fermentaire dans un dispositif permettant (par une soupape) ou non (par une fermeture hermétique) l'échappement du gaz. Les résultats des tests montrent que la diminution de pH avec le temps de fermentation est beaucoup moins importante dans le pre- mier cas que celle observée dans le mi- lieu hermétiquement fermé (fig. 2). Une plus grande variabilité de valeurs de pH obtenues avec «soupape» par rapport à celles obtenues dans le milieu herméti- quement fermé a été constatée. L'avan- tage de la mesure potentiométrique par rapport à la mesure de la production de gaz réside dans le fait que la mesure du pH permet de tenir compte du gaz qui reste dissous dans la phase liquide et dont le volume par conséquent n'est pas mesurable.

La détermination de FIAFP des diverses espèces végétales révèle des différences interspécifiques très importantes (tabl. 1;

fig. 3). De fortes différences intraspéci- fiques sont exceptionnelles (Leontodon hispides) et dues en majeure partie à Page ou au stade de développement des espèces analysées. La majorité des espè- ces analysées ont plutôt tendance à sti- muler l'activité de la population micro- bienne du jus de rumen (IAFP > 100).

Fig. 3. Indice d'action fermentaire potentiel- le (IAFP) de diverses espèces des prairies permanentes (moyenne de 2 a 4 échantillons par espèce); lorsque l'IAFP est inférieur à 100, les espèces ont une action inhibitrice et lorsque l'IAFP dépasse 100, les espèces ont une action stimulante. >

Tableau 1. Statistique descriptive de l'IAFP et des paramètres utilisés pour sa détermination.

Paramètres (n = 286) Moyenne Dév. std. Maximum Minimum

pH extrait 7,13 0,303 7,96 5,74

pH avant fermentation (A) 7,26 0,179 7,92 6,43

pH après fermentation (B) 6,42 0,398 7,14 5,46

Différence (A-B) 0,84 0,324 1,71 0,11

Proportion [100*(A-B) / A] 11,58 4,503 23,60 1,60

IAFP 12698 50982 26390 2396

Fig. 4. Relation entre les valeurs d'IAFP et d'IANP (SCEHOVIC, 1995) sur les 286 échan- tillons analysés (r = —0,47; P < 0,01).

175

~ ~ 0 150-,

75 E

~ ~

II

CD 125

~

~ ô

s 100

_ n -~- Geranium silvaticum + Lolium perenne 0 Geranium silvaticum + Trifolium repens

~ .... 75

~ -o- Heracleum s hondYlium + Lolium perenne Q -o- Trifolium repens + Lolium perenne

50 1 1 1 1 1

i

0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Proportion de dicotylédones (%)

Fig. 5. Evolution de l'IAFP d'associations végétales en relation avec leur composition bota- nique.

Mis à part quelques exceptions, les es- pèces de faible appetibilite exercent une action plus ou moins inhibitrice (IAFP < 100). Les graminées et les lé- gumineuses forment le groupe de tête des «stimulateurs», mais la position de certaines espèces dans le classement est surprenante. Effectivement, la posi- tion de Plantago media, Centaurea montana ^et Centaurea jacea (espèces riches en substances terpéniques) dans le groupe des «stimulateurs» est plutôt inattendue par rapport à Ti-ifolilim pra- terlse (fig. 3). A l'opposé, dans le groupe des «inhibiteurs», la position de Silene alba et Silene vulgaris est étonnante (fig. 3). Leur composition chimique, en apparence, ne permet pas de supposer une aussi forte action inhibitrice.

Chez les graminées et les légumineu- ses, l'évolution des valeurs d'IAFP en fonction de l' âge des plantes révèle que l'effet stimulant tend à diminuer. Chez la majorité des dicotylédones, il s'agi- rait plutôt d'une diminution de l'inhibi- tion (sans exclure la conjonction des deux actions). Chez quelques espèces analysées, on observe exceptionnelle- ment une stagnation ou même une aug- mentation, avec l'âge, de leur activité inhibitrice (Lotus alpinus, Ligusticum mutellina, Plantago atrata, Crepis aurea, Luzula multifloi-a).

La recherche des substances responsa- bles de l'action stimulante ou inhibitrice de l'activité de la population micro- bienne a l'aide d'une analyse statistique (IAFP versus composition chimique des 286 échantillons) révèle que seuls les phénols solubles et surtout l'IANP (in- dice d'action négative potentielle) (SCEHOVIC, 1995) expliquent partielle- ment les différences de l'IAFP entre les échantillons analysés (fig. 4). Vu l'ex- traordinaire complexité chimique de la matière végétale, les substances prises en considération ne représentent qu'une infime partie des principes potentielle- ment actifs au niveau de la microbiolo- gie du rumen. Les familles botaniques riches en substances phénoliques et par- ticulièrement en certains acides et poly- mères phénoliques (p. ex. les rosacées, les géraniacées) manifestent l'action in-

hibitrice la plus prononcée. La présence dans les végétaux d'acides organiques toxiques (p. ex. les polygonacées), d'alcaloïdes (p. ex. les renonculacées, les chénopodiacées), de mucilages et

de terpènes (p. ex. les plantaginacées, les astéracées, les apiacées) peut expli- quer la diminution de l'activité fermen- taire, cette énumération n'étant de loin pas exhaustive.

Du point de vue pratique, il est intéres- sant d'examiner l'influence sui- l'IAFP de mélanges, en différentes proportions, d'espèces végétales «stimulantes» et

«inhibitrices» de l'activité microbienne.

L'analyse des associations reconstituées au laboratoire révèle des différences importantes selon les espèces (fig. 5).

Apparemment, la présence de certai- nes espèces «inhibitrices» (Heracleum sphondyliunl) peut, jusqu'à une certaine proportion, augmenter la valeur d'IAFP de l'association. Certaines autres espe-

ces peuvent diminuer la valeur d'IAFP de l'association même si leur propor- tion est faible (Geraniun7 sy1vaticum) (fig. 5). Schématiquement, nous pou- vons en déduire que la valeur d'IAFP reflète la somme des effets positifs et négatifs sur l'activité de la population microbienne. Il est probable que l'ac- tion des différents composants chimi- ques présents dans la fraction soluble est directe, sans exclure des effets indi- rects liés aux interactions existant entre les différents composants chimiques.

Conclusions

❑ L'acquis majeur de cette étude est une nouvelle façon d'aborder le pro- blème de la qualité des fourrages.

❑ Le procédé expérimental et le milieu d'extraction ont été mis au point de façon à ce que les principes poten- tiellement actifs dans l'extrait de- meurent dans leur matrice naturelle et dans des concentrations compara- bles à celles que l'on trouve dans la salive et dans le liquide du rumen.

❑ L'intérêt de l'aspect «qualitatif»

(composition) de la fraction soluble de la matière végétale, sous-estimé par rapport à son aspect «quantita- tif» (teneur), est souligné.

❑ La détermination quantitative de l'effet de l'ensemble des substances solubles dans la salive artificielle sur la prolifération microbienne per- met d'éviter des conclusions aléatoi- res, issues de l'extrapolation basée uniquement sur la concentration, dans les végétaux, des substances chimiques supposées actives.

❑ La comparaison des espèces végéta- les à l'aide de la méthode décrite permet, d'une part, d'observer l'ac- tion potentielle dans l'appareil di- gestif des ruminants de substances dont on connaît la présence dans les végétaux et, d'autre part, d étudier l'effet de certaines espèces sur la qualité de l'association végétale dont elles font partie.

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Summary

1n vitro evaluation of rumen m crobial activity in the présence of plant extracts The plant cell content is conaposed both by nutrients available. for rurnen microbial growth, and by compounds -which have a defensive function in the plant organi sm and exhibit a rather antibrn 'tic action. An in vitro method was developed, vvhich enables the" evaluation of the stimulating and inhibiting action of Whole cell content compounds on rumen micrflbial activity. The cell extract, obtained by maceration 1 of plant mater al in McDougall's. artific al saliva, is mixed with rumen fluid and glucose.

The incubation in optimal conditions (anaerobic environnent, temperature) of the mixture engenders a production of gas, dissolving of which in the fermentation culture medium results in _a decrease of its initial pH value. The extent of the pH decrease is a linear function of the microbial activity, and is measured and expressed in relation to a reference. The reference is a culture medium with appropriate energetic and mineral content but free of both stimulators and inhibitors of this activity (e.g. without the plant extract), treated in the same way. The results obtained with about a hundred plant species, individually collected in natural grassland herbage, reveals very important interspecific differences.

Key words: artifiicial sauva, cell content, chemical compos Wo.., natural grassland, inhibition, stimulation, rumen micro-organisms, laboratory method.

Zusammenfassung

In-Ifitro-Schiftung

der

Der Inhalt von Pflanzenzeilen setzt sich einerseits aus N'âhrsubstanzen zusammen, die für das Wachstum der Pansenflora unentbehrlich _ sind, und anderseits aus Substanzen,

die eine Abwehrfunktion im Pflanzenorganismus haben. Eine .fn-Vitro-Methode wurde entwickelt, um die stimulierende und hern"mende wirkung :der gesamten Zellinhalts- stoffe auf die Aktivitâit der Pan enflora zu erfassen. Der durch Einweichung des Pflan- zenmaterials in künstlichen Speichel gewonnene Zellextrakt wurde mit Pansensaft und Stârkezucker genaischt. Die Inkubation der Mischung unter optimalen Bedingun- gen (Temperatur, Sauerstofflosigkeit) führt zur Bildung von Gas, dessen Auflôsung im Ganmilieu zur Senkung des pH-Wertes 'fûhrt. Das Ausmass dieses Vorgangs, welcher eine lineare Funktion der rnikrobiologischen Aktivitat ist, vvird gemessen und in Be- ziehung eines hinsichtlich Energie- und Mineralstoffgehalts angepassten Standards gesetzt. Letzterer hat weder eine stimulierende noch eine inhiliitorische Wirkung auf diese Aktivitat. Die erzi.elten Ergebnisse aus etwa hundert Pflanzenarten, welche in Naturwiesen gesammelt wurden, weisen sehr markante interspezifische Unterschiede

auf. '