• Keine Ergebnisse gefunden

KASUTATUD LÜHENDID

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Aktie "KASUTATUD LÜHENDID "

Copied!
58
0
0

Wird geladen.... (Jetzt Volltext ansehen)

Volltext

(1)

TARTU ÜLIKOOL

BIOLOOGIA-GEOGRAAFIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT

Nele Tamberg

Uudsete EGFP-d ekspresseerivate Semliki Forest viiruste iseloomustamine in vivo ja in vitro

Magistritöö

Juhendaja: Erakorraline Prof. Andres Merits, Ph.D

TARTU 2006

(2)

SISUKORD

SISUKORD ... 2

KASUTATUD LÜHENDID... 3

SISSEJUHATUS ... 5

I KIRJANDUSE ÜLEVAADE... 7

Alfaviirused... 7

SFV virion... 8

SFV genoom... 9

SFV elutsükkel ... 9

SFV mittestruktuursete valkude funktsioonid... 13

Alfaviirustel põhinevad vektorid ... 14

II EKSPERIMENTAALNE OSA... 18

Uurimistöö eesmärgid ... 18

MATERJAL JA METOODIKA ... 19

TÖÖ TULEMUSED... 28

ARUTELU ... 42

KOKKUVÕTE ... 51

SUMMARY... 53

KASUTATUD KIRJANDUS... 55

(3)

KASUTATUD LÜHENDID

ah – aminohape

ATP – adenosiintrifosfaat ATPaas – adenosiintrifosfataas

BHK – beebihamstri neerurakud (Baby Hamster Kidney) bp – aluspaar

BSA – veise seerumi albumiin cDNA – komplementaarne DNA DNA – desoksüribonukleiinhape DTT – ditiotreitool

EDTA – etüleendiamiintetraäädikhape

EGFP – roheliselt fluorestseeruv valk (Green Fluorescence Protein) GMEM – Glasgow Modified Eagle’s Medium

GMP – guanosiinmonofosfaat GT – guanülüültransferaas GTP –guanosiintrifosfaat

HEPES – hüdroksuetüülpiperasiinetaansulfaat icDNA – infektsiooniline komplementaarne DNA IgG – immuunoglobulin G

kb – kiloalus kDa – kilodalton

MOI – infektsiooni kordsus (Multiplicity of Infection) MT – metüültransferaas

NLS – tuuma lokalisatsiooni signaal (Nuclear Localization Signal) nsP – mittestruktuurne valk

nt - nukleotiid

NTP – nukleosiid trifosfaat NTPaas – nuklosiid trifosfataas

ORF – avatud lugemisraam (Open Reading Frame) PAGE – polüakrüülamiid geel-elektroforees

(4)

PBS – fosfaatpuhvriga sooladelahus

PFU – lüüsilaike moodustav ühik (Plaque Forming Unit) RdRp – RNA-st sõltuv RNA polümeraas

RNA – ribonukleiinhape rpm – pööret minutis

SDS – naatrium dodetsüülsulfaat SFV – Semliki Forest viirus SIN – Sindbis viirus

TAE – Tris/Atsetaat/EDTA puhver TE – Tris-EDTA puhver

Tris – trishüdroksümetüülaminometaan

VLP – viirus-laadne partikkel (Virus Like Particle) wt – metsikut tüüpi (Wilde Type)

(5)

SISSEJUHATUS

Alfaviirused on ülemaailmse levikuga selgroogsete patogeenid. Selle viirusperekonna liikmete, teiste seas ka Semliki Forest viiruse (SFV), uurimine on andnud suure panuse mõistmaks viiruslikku infektsiooniprotsessi, viiruse ja peremeesraku omavahelisi mõjutusi ning viiruste poolt põhjustatud patogeneesi. Kuna alfaviiruste genoom on suhteliselt kergesti manipuleeritav, on antud viirustel põhinevad vektorid ja replikon-süsteemid molekulaarbioloogias laialt kasutust leidnud ja arvatavasti leiavad tulevikus kasutust ka meditsiinis. Uurimistöödes on eriti kasulikuks osutunud markergeeni kandvad vektorid. Enamikus alfaviirustel põhinevatest vektoritest on markergeen paigutatud viiruse struktuursete geenide avatud lugemisraami asemele või duplitseeritud subgenoomse promooteri kontrolli alla. Kahjuks on sellised viirused geneetiliselt ebastabiilsed ja seega mitmetes rakubioloogilistes ja loomkatsetes piiratud kasutamisvõimalustega. Markergeeni ekspressioon on märksa stabiilsem, kui ta on osa viiruse loomulikust transkriptsiooniühikust, näiteks mittestruktuurseid valke kodeerivast alast.

Käesoleva töö eemärgiks oli analüüsida uudseid SFV tüvel SFV4 põhinevaid rekombinantseid viirusi SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4-EGFP, kus markergeen EGFP on kloneeritud viiruse mittestruktuursesse alasse ja seda ekspresseeritakse koos viiruse replikatsioonivalkudega. Kuna kaugemaks eesmärgiks oli kasutada antud viirusi erinevates rakubioloogilistes ja ka loomkatsetes, tahtsime esmalt veenduda, kuidas võõrgeeni sisestamine viiruse genoomi mittestruktuursesse alasse selle elutsüklit mõjutab.

Käesoleva töö teoreetiline osa annab lühida ülevaate alfaviirustest ning pikemalt peatutakse antud perekonda kuuluval SFV-l, selle ehitusel ja elutsüklil. Lisaks tutvustatakse alfaviirustel ja SFV-l põhinevate rekombinantsete vektorite loomise eesmärke ning erinevaid seni kasutust leidnud konstruktsioone.

Töö eksperimentaalses osas analüüsitakse detailselt mitmeid rekombinantsete viiruste SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4-EGFP omadusi ja võrreldakse neid SFV4-ga.

Analüüsitakse valguekspressiooni, RNA sünteesi, peremeesrakkude valgu translatsiooni

(6)

maha surumist. Lisaks uuritakse, milliseid rakutüüpe rekombinantsed viirused hiire ajus nakatavad.

Töö on valminud Tartu Ülikooli Molekulaar- ja Rakubioloogia Instituudis.

Loomkatsete osa on valminud Edinburghi Ülikoolis, John K. Fazakerley laboris.

Käesoleva töö praktilist osa finantseerisid EL projekt SFvectors, ETF 5055 ja Kristjan Jaagu stipendiumifond. Sooviksin tänada professoreid Andres Merits ja John K.

Fazakerley juhendamise ja kasulike nõuannete eest.

(7)

KIRJANDUSE ÜLEVAADE

Alfaviirused

Alfaviirused (sugukond Togaviridae) on levinud üle kogu maakera, neid leidub kõikidel kontinentidel peale Antarktika. Alfaviiruste levimine selgroogsetele peremeestele, sagedamini väikestele imetajatele ja lindudele, toimub verdimevate lülijalgsete vahendusel. Alfaviirused replitseeruvad nii putukvektorite kui ka selgroogsete rakkudes. Putukates on viiruse infektsiooni kulg apatogeenne ja püsiv. Selgroogsetes seevastu on alfaviiruste infektsioon enamasti kiire ning mitmed selle viirusperekonna liikmed on ohtlikud inimeste ja loomade patogeenid. Alfaviiruste nakkus võib mööduda ohutumate haigussümtomitega nagu lööve, palavik ja artriit. Samas näiteks Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) põhjustab eluohtlikku entsefaliiti (Schlesinger and Schlesinger, 2001). Ajaloost on teateid ka alfaviiruste poolt põhjustatud epideemiate kohta, hiljutiseks näiteks on selle aasta alguses puhkemud Chikungunya viiruse väga laiaulatuslik levik Réunioni saarel India ookeanis. Selle saare 770 000-st elanikust nakatusid koguni 110 000 palavikku, löövet ning lihas- ja liigesvalu põhjustava viirusega (Enserink, 2006).

Alfaviiruste perekonnas on 25 liiget ja nendest rohkem kui 10 genoom on osaliselt või täielikult sekveneeritud (Strauss and Strauss, 1994; Schlesinger and Schlesinger, 2001). Alfaviiruste genoomid on väga sarnase ülesehitusega, struktuurseid valke kodeerivate alade järjestused on 45% ja mittestruktuurseid valke kodeerivate alade järjestused 60% sarnased (Strauss and Strauss, 1994). Seega võib oletada, et ka antud viiruste genoomide replikatsioon ja infektsiooniprotsess peremehes on üldjoontes sarnased. Alfaviiruste uurimisel on oluliseks tööriistaks viirusgenoomil põhinevad infektsioonilised cDNA (icDNA) kloonid, mis hõlbustavad tunduvalt viiruste uurimist laboratoorsetes tingimustes. icDNA-s on viiruse genoomi järjestus pandud RNA polümeraasi (enamasti T7 või SP6) promooteri kontrolli alla, sellelt in vitro transkribeeritud RNA transfekteeritakse rakkudesse. Selline sünteetiline RNA on, identselt looduslikule viiruse genoomile, võimeline peremeesrakkudes replitseeruma ja

(8)

põhjustama nakatamisvõimeliste virionide teket. icDNA kloonid on olemas mitmetele alfaviirustele, sealhulgas SFV-le, Sindbis viirusele-le (SIN), VEE-le, Ross river virus’ele (RRV) ja South African arbovirus 86-le (Strauss and Strauss, 1994).

Molekulaarsel tasandil on alfaviiruste perekonna kõige paremini uuritud liikmed SFV ja SIN (Strauss and Strauss, 1994). Mõlema viiruse põhjal on loodud arvukalt võõrgeeni ekspresseerivaid vektoreid, mida kasutatakse viiruste elutsükli ja viirus- peremees interaktsioonide uurimiseks (Frolov et al., 1996). Kuigi mõlema viiruse laboratoorsed tüved on inimesele avirulentsed, põhjustavad nad hiirtes surmavat entsefaliiti ja on seega heaks mudelsüsteemiks viiruselise neuropatogeneesi uurimisel (Fazakerley et al., 1993).

SFV virion

SFV virion (läbimõõt 60-70 nm) koosneb üheahelalisest positiivse polaarsusega RNA molekulist ja seda ümbritsevatest nukleokapsiidist ning peremeesraku plasmamembraanist pärit lipiidsest ümbrisest (Joonis 1). Ikosaeedrilise kujuga nukleokapsiidil on T=4 sümmeetria ja see koosneb 240-st kapsiidivalgu monomeerist (umbes 30 kDa). Nukleokapsiidi ümbritseb lipiidne kaksikkiht, mis on tihedalt läbistatud viiruse struktuursete valkude E1 ja E2 heterodimeeridega (kumbki monomeer umbes 50 kDa). E1-E2 heterodimeerid on omakorda kolme kaupa organiseeritud membraanist väljaulatuvateks piigisarnasteks struktuurideks (Joonis 1). Iga piik on membraani ankurdatud kolme paari transmembraanse domeeniga ja iga piigis olev E1-E2 heterodimeer seondub membraani siseküljel asuva nukleokapsiidiga. Lisaks sisaldab ümbris ka perifeerset E3 valku (umbes 10 kDa) (Strauss and Strauss, 1994; Schlesinger and Schlesinger, 2001).

Joonis 1. SFV virion. Viiruse RNA genoom (punane) on pakitud nukleokapsiidi (kapsiidivalgud oraanžid), mis on omakorda ümbritsetud lipiidse kaksikkihiga (roheline) ja sinna sukeldunud E1 ning E2 valkudega (sinised) (Pilt saadud http://www-ggc.ucdavis.edu/ggc/bmb/images/cheng.gif).

(9)

SFV genoom

SFV genoomiks on positiivse polaarsusega üheahelaline lineaarne RNA molekul (42S RNA) täispikkusega umbes 11,500 nukleotiidi jääki (nt). Genoomse RNA 5’ otsas on 7-metüülguanosiinist cap-struktuur ja 3’ otsas umbes 100 nt pikkune polü(A) saba (Joonis 2). Viiruse genoomne RNA kodeerib kahte pikka polüproteiini, mis on mittestruktuursete replikatsioonivalkude ja struktuursete virioni moodustavate valkude eellasteks. Mittestruktuurseid valke nsP1, nsP2, nsP3 ja nsP4 kodeerib 5’ otsa poolne kaks-kolmandikku genoomist (42S RNA). Struktuurseid valke C, E3, E2, 6K ja E1 kodeerib üks-kolmandik genoomi 3’ otsast, täpsemalt viiruse RNA replikatsiooni käigus toodetav subgenoomne 26S RNA (Joonis 2). Sarnaselt genoomsele 42S RNA-le on 26S RNA 5’ cap-struktuuriga ja 3’ otsast polüadenüleeritud (Strauss and Strauss, 1994;

Schlesinger and Schlesinger, 2001).

SFV elutsükkel

Sisenemine rakku. Alfaviiruste peremeestering on laia nad replitseeruvad erinevat liiki organismides ja organismiseseselt ka erinevat tüüpi rakkudes. Arvatakse, et SFV kasutab raku pinnale seondumiseks rohkem kui ühte seni identifitseerimata retseptorit ja et kasutatav retseptor sõltub peremeesraku tüübist. Ka SIN-i puhul on leitud lisaks peamisele imetajarakkude retseprorile (laminiini retseptor) teisi raku pinnale seondumise vahendajaid (Schlesinger and Schlesinger, 2001). Viiruse glükoproteiin E2 on valk, mis interakteerub raku pinna retseptoritega.

SFV rakku sisenemine toimub retseptor-vahendatud endotsütoosi teel (Joonis 3).

Endosoomide madal pH põhjustab ümberkorraldusi virioni ümbrises, E1-E2 heterodimeer laguneb ja moodustub fusogeensete omadustega E1 trimeer. E1 trimeeri osalusel toimub viiruse lipiidse ümbrise ja endosoomi membraani kokkusulamine, mille järel viiruse nukleokapsiid vabaneb tsütoplasmasse. Arvatakse, et edasine nukleokapsiidi seondumine ribosoomidega põhjustab nukleokapsiid lagunemise ja viiruse RNA vabanemise (Strauss and Strauss, 1994; Schlesinger and Schlesinger, 2001).

(10)

Joonis 2. SFV genoomi organisatsioon. Genoomselt RNA-lt transleeritakse mittestruktuursete valkude prekursormolekul (P1234), mis protsessitakse viiruse proteaasi nsP2 poolt in cis ja in trans lõikamistega nsP1-4 valkudeks. Mittestruktuursed valgud moodustavad RNA replikatsioonikompleksi, sünteesides sõltuvalt protsessituse astmest negatiivse või positiivse polaarsusega RNA ahelaid. Esmalt sünteesitakse SFV genoomse RNA alusel komplementaarne miinusahelaline RNA, mis omakorda on matriitsiks uute genoomsete 42S RNA-de ja subgenoomsete 26S RNA-de sünteesil. Subgenoomselt RNA-lt lähtub viiruse struktuursete valkude eellasmolekuli (p130) süntees. Struktuurne polüproteiin protsessitakse kapsiidivalgu ja rakuliste proteaaside poolt. Noolega on tähistatud subgenoomne promooter. Joonise aluseks Strauss and Strauss 1994.

Mittestruktuursete valkude tootmine ja RNA replikatsioon. Vabanenud genoomne RNA on mRNA-ks viiruse mittestruktuurse polüproteiini P1234 translatioonil ja ka matriitsiks komplementaarse negatiivse polaarsusega ahela sünteesil. Negatiivsed RNA ahelad on omakorda matriitsiks positiivse polaarsusega ahelate sünteesil: nii uute genoomsete 42S RNA-de kui ka subgenoomsete 26S RNA-de tootmisel. Kogu SFV RNA

(11)

replikatsioon ja transkriptsioon toimub tsütoplasmas ja on seotud rakumembraanidega (Barton et al., 1991; Salonen et al., 2003).

Mittestruktuurne polüproteiin P1234 protsessitakse viiruse nsP2 proteaasi poolt (Ding and Schlesinger, 1989; Hardy and Strauss, 1989; Merits et al., 2001; Vasiljeva et al., 2001), see protsess on väga täpselt reguleeritud ja reguleerib omakorda viiruse replikatsioonitsüklit (Lemm et al., 1994; Shirako and Strauss, 1994; Lemm et al., 1998;

Kim et al., 2004). P1234 protsessingut alustatakse kas koheselt peale translatsiooni või tõenäolisemalt juba selle käigus. Esmalt toimub nsP4 vabanemine polüproteiinist ning tekkinud P123 ja nsP4 moodustavad varajase replikatsioonikompleksi (Shirako and Strauss, 1994; Kim et al., 2004), kus nsP4 täidab RNA-st sõltuva RNA polümeraasi (RdRp) rolli (Gorbalenya et al., 1991). See kompleks vastutab negatiivse polaarsusega RNA ahelate sünteesi eest (Joonis 2). Edasise replikatsioonitsükli käigus toimub esmalt nsP1 vabanemine ja seejärel ka järelejäänud P23 protsessing. Lõplikult protsessitud nsP1, nsP2, nsP3 ja nsP4 moodustavad hilise replikatsioonikompleksi ja vastutavad positiivse polaarsusega genoomsete ja subgenoomsete RNA-de sünteesi eest (Joonis 2) (Lemm et al., 1994; Lemm et al., 1998; Kim et al., 2004). Sellised muutused replikatsioonikompleksis viivad negatiivsete ahelate sünteesi mahasurumiseni.

Replikatsioonitükli hilisemas faasis sünteesitakse väga kõrgel tasemel struktuurseid valke ja toimub peremeesraku transkriptsiooni ja mRNAde translatsiooni mahasurumine (shut- down) ning apoptoosi indutseerimine (Frolov and Schlesinger, 1994; Gorchakov et al., 2004; Gorchakov et al., 2005; McInerney et al., 2005).

Struktuursete valkude tootmine. SFV 26S RNA moodustumine ja sellelt transleeritava struktuursete valkude eellasvalgu p130 süntees algab juba üsna varajases infektsiooni staadiumis (2-3 h peale nakatamist), maksimaalse aktiivsuse saavutab p130 translatsioon aga hilises infektsioonis (4-8 h peale nakatamist). Struktuurse polüproteiini protsessing algab juba translatsiooni ajal toimuva kapsiidivalgu autokatalüütilise vabanemisega. Sünteesitavas polüproteiinis paljastub seejärel signaaljärjestus, mis suunab transleeritava valgu karedapinnalisele tsütoplasmavõrgustikule. Seal toimub ka polüproteiini glükosüleerimine ja lõplik protsessing rakuliste signalaaspeptidaaside poolt.

Vabanevad p62 (E2 ja E3 eellasvalk), E1 ja 6K, liikudes esialgsest sünteesikohast sekretoorsete vesiikulite abil läbi Golgi kompleksi plasmamembraanile. P62 protsessing

(12)

toimub transpordi ajal trans-Golgis, vabanevad E2 ja E3 (Strauss and Strauss, 1994;

Schlesinger and Schlesinger, 2001).

Virionide moodustumine. SFV nukleokapsiidi moodustumine algab kapsiidivalgu oligomeriseerumisega. Signaaljärjestus, mis suunab nukleokapsiidi vaid viiruse genoomse RNA, asub nsP2 kodeerivas alas (Frolova, Frolov, 1997). Selle tunneb ära kapsiidivalgu sama segment, mis seondub ribosomaalse RNA-ga infektsiooniprotsessi alguses. Viiruse infektsiooni viimases staadiumis toimub nukleokapsiidi interakteerumine peremeesraku plasmamembraaniga kohtades, kus asuvad sinna juba varem transporditud viiruse transmembraansed glükoproteiinid E1 ja E2. See seondumine põhjustab plasmamembraani paindumist ümber nukleokapsiidi kuni viimane on ümbritsetud täielikult lipiidse kaksikkihiga ning virion vabaneb (Joonis 3) (Strauss and Strauss, 1994;

Schlesinger and Schlesinger, 2001).

Joonis 3. Skemaatiline joonis SFV elutsüklist (selgitus tekstis).

ns-valgud 42S RNA endosoom

tuum

SFV

26S RNA

kapsiidi- valk

membraani- valgud kaetud ER

vesiikul

Golgi kompleks ++

++ +

_ + +

(13)

SFV mittestruktuursete valkude funktsioonid

nsP1 (537 ah, 60 kDa) on multifunktsionaalne valk. nsP1 vastutab cap-struktuuri lisamise eest viiruse genoomsetele ja subgenoomsetele RNA-dele, omades guaniin-7- metüültransferaasset ja guanülüültransferaasset aktiivsus (Laakkonen et al., 1994; Ahola and Kaariainen, 1995). Lisaks osaleb antud valk ka miinusahelaliste RNA-de sünteesi initsiatsioonil. nsP1 on seotud rakumembraanidega ja vahendab kogu SFV replikatsioonikompleksi seondumist rakumembraanidele (Ahola et al., 1999). Nakatunud rakkudes põhjustab nsP1 ekspressioon tsütopaatilist effekti, filopoodiasarnaste struktuuride teket rakumembraanidel ja aktiini stress-fiibrite lõhkumist (Laakkonen et al., 1994).

Ka nsP2 (799ah, 89 kDa) on sarnaselt nsP1-le multifunktsionaalne valk. nsP2 C- terminaalne domeen omab proteaasset aktiivsust ja on vastutav kogu mittestruktuurse polüproteiini protsessingu eest (Hardy and Strauss, 1989; Vasiljeva et al., 2001). Valgu N-terminaalne osa omab RNA helikaasset aktiivsust (Gomez de Cedron et al., 1999) ning ka ATPaasi ja GTPaasi aktiivsust (Rikkonen et al., 1994). Lisaks osaleb nsP2 viiruse RNA cap-struktuuri lisamise reaktsiooni esimeses etapis, omades RNA trifosfataasset aktiivsust (Vasiljeva et al., 2000). On andmeid ka nsP2 osaluse kohta subgenoomsete RNA-de sünteesil, 26S promooterilt transkriptsiooni initsieerimisel (Suopanki et al., 1998).

nsP3 (482 ah, 61 kDa) täpne funktsioon pole teada. On näidatud, et ta on vajalik viiruse RNA replikatsiooniks (Hahn et al., 1992). nsP3 koosneb kolmest domeenist: N- terminaalne 1/3 on konserveerunud, sarnaseid järjestusi on leitud arhedest, bakteritest ja ka eukarüootidest; valgu keskmine osa on konserveerunud alfaviiruste seas; C- terminaalne 1/3 on hüpervarieeruv, erinedes tunduvalt ka SIN-i ja SFV vahel. nsP3 C- terminaalset osa fosforüeeritakse rakuliste kinaaside poolt (Vihinen and Saarinen, 2000).

Antud modifikatsioonide bioloogiline tähtsus pole teada, kuid on näidatud, et mitmed nsP3 fosforüleerimisdefektsed mutandid omavad madalamat tütotoksilisust võrreldes metsikut tüüpi viirusega (Vihinen et al., 2001). P123 koosseisus osaleb nsP3 ka viiruse replikatsioonikomplekside moodustamises (Salonen et al., 2003).

(14)

nsP4 (614 ah, 68 kDa) on viiruse RNA polümeraasi katalüütiline subühik (Gorbalenya et al., 1991). nsP4 on ebastabiilne valk ja SFV poolt nakatatud rakkudes degradeeritakse suur osa sünteesitud nsP4-st (umbes 80%) väga ruttu ubikvitinüleerimisraja kaudu proteasoomides. Tänu interaktsioonidele teiste replikatsioonikompleksi valkude ja/või struktuuridega on replikatsioonikompleksis olev nsP4 fraktsioon märksa stabiilsem (de Groot et al., 1991).

Alfaviirustel põhinevad vektorid

Alfaviirustel põhinevaid vektoreid luuakse peamiselt kahel eemärgil: selleks, et hõlbustada viiruse enda uurimist või selleks, et kasutada neid vektoreid tööriistadena muudes valdkondades. Näiteks on kergesti visualiseeritavat ja/või kvantifitseeritavat markergeeni ekspresseerivaid rekombinantseid viirusi tunduvalt mugavam kasutada, kui metsikut tüüpi viirusi. Teistest valdkondadest, kus SFV-l põhinevad vektorid kasutust leiavad, võiks tuua esile geeniteraapiavektorite ja rekombinantsete vaktsiinide arendamise.

Enamikes alfaviirustel põhinevates vektorites on võõrgeen pandud subgenoomse 26S promooteri kontrolli alla, asendades sellisel viisil viiruse struktuurseid valke kodeeriva ala võõrgeeni järgestusega (Joonis 4B) (Frolov et al., 1996). Selliseid vektoreid nimetatakse replikonideks, nad on võimelised rakkudes efektiivselt replitseeruma, kuid struktuursete valkude puudumise tõttu nad virione ei moodusta. Kasutades replikon RNA kotransfektsiooni helper-RNA-dega, mis kodeerivad ainult struktuurseid valke, on võimalik viiruslaadsete partiklite (VLP-de) moodustumine (Joonis 4B). VLP-desse helper-RNA-sid ei pakita, sest pakkimissignaal sisaldub ainult viiruse mittestruktuurses alas. VLP-d on võimelised üheks replikatsioonitükliks: nakatama rakke ja seal replitseeruma ning võõrgeeni ekspresseerima, kuid virione struktuursete valkude puudumisel ei moodustata. Replikonvektoreid on kasutatud infektsiooni protsessi uurimiseks koekultuuri tingimustes, kuid loomkatsetes, kus viiruse levik on sageli vajalik, on nende kasutamine piiratud (Frolov et al., 1996). Samas võivad nad kasutust leida meditsiinis, kus võõrgeeni lokaalne ekspressioon võib vajalik olla. Alternatiivne võimalus on kasutada võõrgeeni ekspressiooniks duplitseeritud subgenoomset 26S

(15)

promooterit 42S RNA 3’ mittetransleerivas alas või struktuurseid ja mittestruktuurseid valke kodeerivate piirkondade vahel (Joonis 4A) (Raju and Huang, 1991; Hahn et al., 1992; Vaha-Koskela et al., 2003). Topelt 26S promooteriga vektorid on leidnud laialt kasutust nii koekultuuri tingimustes kui ka loomuuringutes (Frolov et al., 1996; Levine et al., 1996; Cook and Griffin, 2003).

Kahjuks on viirused, mis ekspresseerivad võõrgeeni 26S promooteri kaudu, geneetiliselt ebastabiilsed (Pugachev et al., 1995; Pugachev et al., 2000; Thomas et al., 2003). Arvatavasti on selle põhjuseks asjaolu, et selliselt paigututatud võõrgeen on iseseisev transkriptsiooniühik ja sellel pole viiruse jaoks mingit selektsioonilist väärtust.

oonis 4. Alfaviirustel põhinevate vektorite skeem. (A) Võõrgeeni võib ekspresseerida duplitsee

õõrgeeni on võimalik ekspresseerida ka osana viiruse loomulikust geeniek

J

ritud subgenoomse promooter kontrolli alt viiruse genoomi mittetransleerivas 3’ alas või struktuursete ja mittestruktuursete piirkondade vahel. (B) Replikonvektorites on struktuurseid valke kodeeriv ala asendatud võõrgeeniga, mille ekspressiooni kontrollib subgenoomne promooter. Replikon RNA pakkimiseks VLP-desse on vajalik struktuursete valkude ekspressioon in trans helper-RNA abil.

Nooltega on tähistatud subgenoomsete promooterite asukohad

V

spressiooniühikust. Näiteks SIN viiruse puhul sisestati markergeen EGFP edukalt viiruse struktuurseid valke kodeerivasse polüproteiini (Thomas et al., 2003). Antud viirused ekspresseerisid EGFP-d kõrgel tasemel ja olid geneetiliselt suhteliselt stabiilsed, samas sõltus nendes võõrgeeni ekspressioon subgenoomsest promooterist ja leidis seega aset suhteliselt hilises infektsioonistaadiumis (Thomas et al., 2003). On kirjeldatud ka kahte SIN-i genoomil põhinevat vektorit, kus markergeen oli sisestatud viiruse mittestruktuurseid valke kodeerivasse alasse. Need viirused ekspresseerisid võõrgeeni liitvalguna nsP3-ga: nsP3-lutsiferaasi või nsP3-EGFP-d (Bick et al., 2003; Frolova et al., 2006). Mõlemad need viirused on väga heaks näiteks, kuidas markergeeni ekspresseerivaid rekombinantseid vektoreid edukalt kasutada: nsP3-EGFP-d

(16)

ekspresseerivaid viirusi kasutati infektsiooni käigus nsP3 lokalisatsiooni dünaamika uurimiseks ja võimalike viiruse replikatsioonikompleksiga assotsieeruvate rakuliste valkude leidmisel (Frolova et al., 2006); nsP3-lutsiferaasi tootvate viiruste puhul analüüsiti kergesti kvantifitseeritava markergeeni abil muutusi viiruse replikatsioonitasemes vastusena erinevatele inhibiitoritele (Bick et al., 2003). Võõrgeeni ekspresseerimist liitvalguna viiruse mittestruktuursete valkudega on kasutatud ka teiste viiruste sugukondade liikmete uurimisel. Näiteks hepatiit C viiruse puhul sisestati markegeen EGFP mittestruktuurset NS5A valku kodeerivasse järjestusse (Moradpour et al., 2004). Sarnast lähenemist on kasutatud ka hobusetaoliste arteriidi viiruse uurimisel (van den Born et al., 2005).

Alfaviirustel põhinevad vektoreid loodetakse kasutada ka geeniteraapias ja vaktsiin

ad vektorid kasutust leidnud ka moleku

struktuursete uuringute tarvis (Lundstrom, 2000).

ide välja töötamisel (Frolov et al., 1996; Lundstrom, 2000; Hay, 2004;

Yamanaka, 2004). Nendes valdkondades on alfaviiruste eeliseks väga lai peremeestering ja võime nakatada paljusid rakutüüpe, samas on huvi pakkunud ka antud viiruste neurotropism ja võime nakatada postmitootilisi närvirakke. On loodud näiteks gripiviiruse, HIV-i ja tavaohatise viiruse antigeene ekspresseerivad rekombinantsed vektorid, mis kutsusid esile tugeva spetsiifilise immuunvastuse (Lundstrom, 2000). On kasutatud ka lähenemist, kus viiruse struktuursetesse valkudesse on sisestatud heteroloogilisi aminohappe järjestusi ja immunogeenina käitub virioni pinnal ekspresseeritud epitoop. Lisaks on avaldatud mitmeid artikleid selle kohta, et SIN nakatab spetsiifiliselt vähkkasvaja rakke, andes seega lootust alfaviirustel põhinevate vähiteraapia vektorite väljatöötamiseks (Hay, 2004). Samuti on loodud alfaviirustel põhinevaid DNA vektoreid, kus viiruse rekombinantset RNA-d kodeeriv järjestus on paigutatud eukarüootse RNA polümeraas II promooteri kontrolli all. Sellise disainiga vektorid on näidanud palju efektiivsemat antigeeeni-spetsiifilist imuunvastuse tekitamist, kui tavalised DNA vaktsiinid (Hariharan et al., 1998).

Lisaks meditsiinile on alfaviirustel põhinev

laarbioloogias. Näiteks võiks tuua nende abil G-valkude retseptorite ekspresseerimise ligandi sidumise ja muudeks funktsionaalseteks uuringuteks, samuti ka suspensioonina kasvavates koekultuurirakkudes suurel hulgal erinevate valkude tootmise

(17)

Käesoleva töö aluseks oli idee sisestada markergeen SFV mittestruktuurseid valke kodeerivasse alasse, kus võõrgeeni ekspressioon toimuks koos viiruse enda mittestruktuursete valkudega juba varastes infektsiooni etappides. Erinevalt varem kirjeldatud SIN vektoritest (Bick et al., 2003; Frolova et al., 2006) ei ekspresseerita võõrgeeni liitvalguna mõne viiruse valguga, vaid individuaalse valguna. See on võimalik tänu markervalgu täielikule lahtilõikamisele viiruse mittestruktuurse polüproteiini küljest viiruse enda nsP2 proteaasi poolt. Eeldasime, et sellised viirused võiksid olla geneetiliselt küllaltki stabiilsed ja ekspresseerida markergeeni varajases infektsiooni staadiumis, olles seetõttu eriti headeks tööriistadeks viiruse elutsükli uurimisel nii koekultuuri tingimustes kui ka katseloom-mudelis.

(18)

EKSPERIMENTAALNE OSA

Uurimistöö eesmärgid

Käesoleva uurimistöö eemärgiks oli analüüsida Semliki Forest viirusel põhinevate rekombinantsete vektorite SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)4-EGFP infektsiooniprotsessi koekultuuri tingimustes ja hiire ajus ning võrrelda neid SFV4 infektsiooni protsessidega.

Uurimistöös keskenduti järgmistele viiruste omadustele:

1. Analüüsida koekultuuri tingimustes markergeeni lisamisest tulenevaid muutusi viiruse elujõulisuses, valguekspressioonis, RNA replikatsioonis ning tsütotoksilisuses.

2. Analüüsida rekombinantsete viiruste geneetilist stabiilsust nii koekultuuri tingimustes kui ka in vivo.

3. Analüüsida rekombinantsete viiruste in vivo fenotüüpi.

(19)

MATERJAL JA METOODIKA

Rakuliinid ja nende kasvatamine

Katsete läbiviimiseks ja viiruste tootmiseks kasutatud hamstri neerurakuliini BHK-21 (Baby Hamster Kidney cells) kasvatati GMEM (Glasgow’s modified Eagle’s medium, GibcoTM) söötmes, mis sisaldas 200 mM HEPES-t (pH 7.2), 2% TPB-d (Tryptose Phosphate Brot’, BactoTM), 7.5% veise loote seerumit, penitsilliini 100 U/ml ja streptomütsiini 100 ng/ml. Rakke kasvatati temperatuuril 37ºC ja 5% CO2 sisalduse juures.

Rekombinantsete viiruste konstruktsioon

Eksperimentaalse osa katsetes kasutatud EGFP-d (Green Fluorescence Protein) ekspresseerivad Semliki Forest viirusel põhinevad rekombinantsed viirused SFV(3L)4- EGFP ja SFV(3H)4-EGFP on disainitud järgmiselt. EGFP-d kodeeriv järjestus on kloneeritud mittestruktuurseid valke kodeerivasse alasse, nsP3 ja nsP4 kodeerivate järjestuste vahele nii, et polüproteiini lugemisraam säiliks. Selleks, et mittestruktuurse polüproteiini sünteesi käigus toimuks selle korrektne protsessing ja EGFP vabanemine, on kummalegi poole markervalgust disainitud nsP2 proteaasi lõikamisjärjestused (Joonis 5, lk 29). nsP3 ja EGFP vahele on disainitud kaks erinevat proteaasi äratundmisjärjestust L (Low) ja H (High), mille disain põhineb SFV4 polüproteiinist pärineval nsP3/4 lõikamisjärjestusel. Nende mõlema puhul on nsP2 lõikamiskohast ülesvoolu jäävaks järjestuseks natiivne nsP3 C-teminus (Joonis 5, ah järjestus GRAGA). Lõikamiskohast allavoolu jääv esimene aminohape (P1’ positsioon) on muudetud türosiinist (Y) glütsiiniks (G), sest nsP2 proteaas eelistab antud positsioonis glütsiini türosiinile (Lulla et al., 2006). Lisaks on G stabiliseeriv aminohape, samal ajal kui Y on destabiliseeriv (Varshavsky, 1996). L ja H lõikamissaidi erinevus on järgmine: L puhul järgneb P1’

positsioonis olevale G-le proliini jääk (P) ja siis EGFP järjestus, selline järjestus on nsP2 proteaasi mitteoptimaalne äratundmis-sait (seega nimetatud low, eesti keeles madal) (Lulla et al., 2006); H puhul järgnevad P1’ positsioonis olevale G-le nsP4 aminohapped

(20)

positsioonidest 2.-7. (IFSSDT) ja alles siis GP järjestus, sellega tekitati natiivne nsP3/4 lõikamissait asendusega Y→P positsioonis P1’. Antud järjestus on nsP2 proteaasi optimiseeritud lõikamissait ja nimetati seega H (high, eesti keeles kõrge). EGFP ja nsP4 vaheline proteaasi äratundmisjärjestus vastab natiivsele nsP3/4 saidile, selleks on EGFP C-terminusele lisatud nsP3 viimased 30 aa (Joonis 5).

In vitro transkriptsioon

Plasmiide pSFV(3L)4-EGFP, pSFV(3H)-EGFP ja pSFV4 (reaktsiooni kohta 3 µg DNAd) lineariseeriti ensüümiga BcuI (Fermentas). Lineariseeritud DNA puhastati JetQuick PCR Purification Spin Kit-iga (Genomed Gmbh) ja elueeriti 30 µl vees. Jääl segati kokku in vitro transkriptsiooni segu: rNTP segu (1 mM ATP, CTP, UTP ning 0.5 mM GTP; Promega), 5 mM DTT, 1 mM Ribo m7G Cap Analog (“Promega”), 1x SP6 puhver (80 mM Hepes-KOH, pH 7.4, 12 mM MgOAc, 4 mM spermidiin-HCl) ning 0.1%

dietüül pürokarbonaadiga (DEPC) töödeldud veega viidi ruumala 50 µl-ni. Enne lineariseeritud DNA (1.6 µg) lisamist lasti segul soojeneda toatemperatuurini, et vältida DNA sadenemist. Seejärel lisati 50 ühikut rekombinantset ribonukleaasi inhibiitorit (RNasinR, Promega) ja 30 ühikut SP6 RNA polümeraasi (Promega). Süntees viidi läbi 37οC juures 90 min jooksul. Saadud RNA saagist ja kvaliteeti hinnati agaroosgeel- elektroforeesil.

Viiruste tootmine

RNA (in vitro transkriptsiooni produkt) transfekteeriti BHK-21 rakkudesse elektroporatsiooni meetodil. Ühe transfektsiooni jaoks kasutati ~4x106 rakku (50-70%

konfluentne tass Ø 100 mm). Rakkudelt aspireeriti sööde, rakke pesti kaks korda steriilse PBS-iga, trüpsiniseeriti, suspendeeriti ning koguti 50 ml-sse koekultuuri tuubi, kuhu oli eelnevalt lisatud 8 ml GMEM söödet. Rakud sadestati tsentrifuugimisel (5 min., 1000 rpm Eppendorf Centrifuge 5810 R). Rakusademelt aspireeriti supernatant ja rakud resuspendeeriti vajalikus koguses PBS-is. Rakususpensioon (800 µl) ning RNA (50 µl)

(21)

segati õrnalt omavahel. Elektroporatsiooniks kasutati eelnevalt jääl jahutatud 0.4 cm küvetti (BioRad) ning tehti kaks pulssi 850 V ning 25 µF juures (BioRad Gene Pulser II).

Küvetist kanti elektroporeeritud rakud üle tassidele (Ø 100mm), kuhu oli eelnevalt lisatud 10 ml GMEM söödet. 24 tundi peale poratsiooni koguti koekultuuri tassidelt viirust sisaldav sööde (primaarne ehk P1 viirus-stokk), mida filtreeriti läbi 0.2 µm filtri ning säilitati -70ºC. Viiruse tiiter määrati lüüsilaikudega tiitrimise abil.

Rakkude nakatamine viirusega ja lüüsilaikudega tiitrimine

90% konfluentsetelt rakkudelt eemaldati sööde, pesti PBS-iga, mille järel lisati viirus (kogus sõltus konkreetsest katsest) 200 µl seerumvabas GMEM söötmes. Viirus- stokkide paljundamiseks kasutati MOI-d (Multiplicity Of Infection) 0.1. Rakke nakatati 60 min 37οC juures tassi vahepeal liigutades. Seejärel lisati rakkudele vajalik kogus GMEM söödet ning inkubeeriti 37οC ja 5% CO2 sisalduse juures. Viirus-stokkide paljundamisel koguti 24 h peale P1 stokiga nakatamist rakkudelt uusi virione sisaldav sööde, mida puhastati läbi 0.2 µm filtri ja kasutati sekundaarse ehk P2 stokina.

Kõikide viirus-stokkide tiitrid määrati lüüsilaikudega tiitrimisega. 100%

konfluentseid 35 mm koekultuuritassidel kasvavaid BHK-21 rakke nakatati viirus-stoki erinevate lahjendustega (10-2, 10-3, 10-4 jne) sarnaselt eelnevalt kirjeldatule, kusjuures igat viiruse lahjendust analüüsiti kahel paralleelsel tassil. Peale nakatamist lisati rakkudele 2%

karboksümetüültselluloosi ja 2% seerumit sisaldava GMEM söötme segu, suhtes vastavalt 2:3. 48 h hiljem segu eemaldati ja rakud värviti kristallviolett- fikseerimislahusega (0.25% kristallviolett (Merck), 1.85% formaldehüüd, 10% etanool, 35 mM Tris, 0.5% CaCl2) 15-30 min jooksul, pesti jooksva sooja veega ja kuivatati õhu käes. Viiruse tekitatud lüüsilaigud loendati ja arvutati viiruse tiiter.

Viiruste kasvukõverad

Viiruste SFV4, SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4-EGFP paljunemist kirjeldavad kõverad määrati BHK-21 rakkudes. 90% konfluentseid 100 mm koekultuuritassidel kasvavaid rakke nakatati MOI 20-ga, peale nakatamist koguti ühetunniste intervallide

(22)

järel nakatatud rakkudelt 100 µl söödet. Kogutud proovides määrati viiruse tiiter, kasutades eelpool kirjeldatud lüüsilaikudega tiitrimist, ning viiruste kasvu analüüsiti Microsoft Excel andmetöötlus-programmi abil.

Immuunofluorestsents analüüs

30% konfluentseid katteklaasidel kasvavaid BHK-21 rakke nakatati viirustega SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)4-EGFP MOI 1 tingimustes. Viis tundi peale nakatamist fikseeriti rakud 4% paraformaldehüüdis toatemperatuuril 15 min ja seejärel permeabiliseeriti membraanid külma metanooliga 10 min -20°C. Järgnevalt pesti preparaate kolm korda PBS-ga ning blokeeriti 3% BSA/Dulbeccos (0.8 mM CaCl2 ja 0.5 mM MgCl2 PBS-is) toatemperatuuril 30 min. Järgnevalt inkubeeriti preparaati 3%

BSA/Dulbeccos lahjendatud nsP3-vastase primaarse antikehaga (lahjendus 1:300) 1 tunni jooksul. Seejäral pesti preparaati kolm korda PBS-ga ja inkubeeriti Texas Red-ga konjugeeritud küüliku IgG vastase kitse antikehaga (100x lahjendus, 1µg/µl 3%BSA /Dulbeccos lahuses) 1 tunni jooksul. Preparaati pesti PBS-ga, loputati destilleeritud vees ning kuivatati õhu käes. Alusklaasi ja katteklaasi vahele lisati 5 µl sulundusvedelikku (Mowiol 4-88, 2.5 % DABCO). Katteklaasid asetati alusklaasidele nii, et rakud jääksid klaaside vahele. Preparaadid mikroskopeeriti OLYMPUS U-RFL-TX mikroskoobi abil ja tulemused pildistati, kasutades CD kaamerat (Olympus) ja vastavat tarkvara.

Valkude ekspressiooni detekteerimine Western blot meetodil

100 mm koekultuuritassidel kasvavad viirusega nakatatud või viiruse RNA-ga transfekteeritud rakud pesti PBS-ga ja lüüsiti 300 µl-s Laemmli puhvris (100 mM TrisHCl, pH 6.8, 200 mM DTT, 4% SDS, 0.2% broomfenoolsinine, 20% glütserool).

Rakulüsaati kuumutati 100°C 5 min ning umbes 100 000 rakule vastav materjal lahutati geelelektroforeesil 10% SDS-polüakrüülamiidgeelis 1xSDS puhvris (0.125 M Tris, 0.9 M glütsiin, 0.5% SDS). Ülekanne toimus 20 min poolkuivas ülekandepuhvris (48 mM Tris, 39 mM glütsiin, 0.037% SDS, 20% etanool) firma Amersham Biosciences nitrotselluloosfiltrile pingega 10 V, kasutades BioRad Instruments aparaati. Filter

(23)

blokeeriti 1 tunni jooksul ruumitemperatuuril 5% lõssipulbri lahuses (0.1% Tween20 PBS-s). Järgnevalt inkubeeriti filtrit vastavalt katsele küülikus toodetud nsP1 (10000x lahjendus), nsP2 (6000x lahjendus), nsP3 (10,000x lahjendus), nsP4 (4000x lahjendus) või EGFP (50,000 x lahjendus) vastase polüklonaalse antikehaga 1 tund 2% lõssipulbri lahuses (0.1% Tween20 PBS-s) ja pesti siis 3x10 min pesulahuses (50 mM TrisHCl pH7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20). Sekundaarse antikehaga, milleks oli peroksüdaasiga konjugeeritud küüliku IgG vastane kitse antikeha (lahjendusega 1:10000), inkubeeriti filtrit 1h 2% lõssipulbri lahuses (0.1% Tween20 PBS-s) ja seejärel pesti 15 min ja 2x10 min pesulahusega. Signaal detekteeriti kasutades ECL™ Kit´i (Amersham Pharmacia Biotech) ja röntgenfilmi.

Sünteesitavate valkude märgistamine in vivo

35mm koekultuuritassidel kasvavaid 90% konfluentsed BHK-21 rakke nakatati SFV(3L)4-EGFP, SFV(3H)-EGFP või SFV4-ga MOI 20 tingimustes. Peale nakatamist inkubeeriti rakke kindlatel ajapunktidel esmalt 30 min metioniini ja tsüsteiini vabas GMEM söötmes (Sigma) ja seejärel lisati rakkudele 50 µCi [35S]-metioniini ja [35S]- tsüsteiini segu (Amersham Biosciences, Reductive PRO-MIX) ning inkubeeriti 30 min.

Peale märgistamist rakud pesti PBS-ga, lüüsiti 100 µl-s Laemmli puhvris ja umbes 100 000 rakule vastav materjal lahutati geelelektroforeesil 10% SDS- polüakrüülamiidgeelis. Signaali võimendamiseks loksutades geeli 30min 1M Na- salitsülaadilahuses, seejärel geel kuivatati ning eksponeeriti röntgenfilmile.

Northern blot analüüs

35mm koekultuuritassidel kasvavaid 90% konfluentsed BHK-21 rakke nakatati SFV(3L)4-EGFP, SFV(3H)-EGFP või SFV4-ga MOI 20 tingimustes. Peale nakatamist puhastati kindlatel ajapunktidel rakkudest totaalne RNA, kasutades Trizol reagenti (Invitrogen). Umbes 150,000 rakule vastav materjal denatureeriti 1 x formamiid- formaldehüüd puhvris (5x puhver: 4mM EDTA pH 8, 0.9 M formaldehüüd, 20%

glütserool, 31% formamiid, 4 X MOPS puhver; 10 x MOPS puhver: 0.2 M MOPS pH

(24)

7.0, 20 mM NaAc, 10 mM EDTA), kuhu oli lisatud etiidium bromiidi lõppkontsentratsioonini 13 µg/ml, 10 min 65ºC juures ja lahutati koheselt agaroosgeel- elektroforeesil (0.2M formaldehüüdi sisaldav 1.5% agaroosgeel). RNA kanti geelilt Hybond–N+ filtrile (Amersham Biosciences) ja fikseeriti UV krosslinkimisega.

SFV4 positiivsele RNA ahelale ja subgenoomsele RNA-le komplementaarne RNA proov sünteesiti in vitro transkriptsiooni käigus, kasutades matriitsina T7 promooteri kontrolli alla kloneeritud fragmenti pSFV4-st (nukleotiidid 10465-11074) ja märgisena 50 µCi [α32 P]rUTP (Amersham Biosciences). Filtreid prehübridiseeriti 1.5 h 65ºC juures järgmises lahuses: 6xSSC (1xSSC on 0.15M NaCl 0.015 M Na tsitraadiga), 5X Denhardti lahus, 0.5% SDS ja 100 µg carrier DNA-d 1 ml kohta. Radioaktiivne proov lisati prehübridisatsiooni segule ja lasti hübridiseeruda filtrile 12 h 65ºC juures.

Siis filtrit pesti 65ºC juures 2 x 30 min 0.1% SDS-i sisaldavas 2xSSC-s, 2 x 30 min 0.1%

SDS-i sisaldavas 1xSSC-s ja 2 x 30 min 0.1% SDS-i sisaldavas 0.1xSSC-s. Seejärel filter kuivatati õhu käes ja eksponeeriti röntgenfilmile.

Viirus-spetsiifilise totaalse RNA märgistamine

35mm koekultuuritassidel kasvavaid 90% konfluentseid BHK-21 rakke nakatati SFV4, SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)-EGFP-ga MOI 20 tingimustes. Kõiki nakatamist tehti kahes paralleelis. 1 h peale nakatamist lisati rakkudele rakulist transkriptsiooni maha suruv aktinomütsiin D (AcD) lõppkontsentratsiooniga 2 µg/ml GMEM söötmes. 2h peale nakatamisi lisati rakkudele [5-3H]-uridiini sisaldav sööde (GMEM, kuhu oli lisatud AcD 2 µg/ml ja [5-3H]-uridiini (Amersham Biosciences) 20µCi iga koekultuuritassi kohta).

Seejärel, erinevatel ajahetkedel peale nakatamise algust (3, 4, 5, 6, 7, 8 h), rakud esmalt pesti 2 x külma PBS-ga, koguti trüpsiniseerimisega, pesti veel kord külma PBS-ga ja lüüsiti 1% SDS-s 5 min 65°C juures. Järgnevalt lisati 100 µl-le proovist (~2x105 rakku) 1 ml 10% trikloroäädikhappet (TCA) ning proovi inkubeeriti jääl 1 h. TCA-ga sadestatud rakuline materjal kanti 10% TCA-ga eelnevalt märjaks tehtud 25 mm klaasfiiber filtritele (Whatman), kasutades Manifold vaakumkuivatit (MILLIPORE). Seejärel filtreid pesti vaakumkuivati abil 1 ml külma 5% TCA ja 1 ml 96% etanooliga ning kuivatati õhu käes.

Kuivatatud filtrid asetati 3 ml-sse sintillatisoooni lahusesse ja seondunud radioaktiivsuse

(25)

hulka (CPM ehk counts per minute) analüüsiti sintillatsiooni lugejaga (1414 Liquid Scintillation Counter, WALLAC). Saadud tulemuste põhjal arvutati filtrile seondunud märgistunud RNA hulk.

Rekombinantsete viiruste genoomide geneetilise stabiilsuse analüüs

RT-PCR-l põhinev kvantitatiivne analüüs. 35mm koekultuuritassidel kasvavaid 90% konfluentseid BHK-21 rakke nakatati SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)-EGFP-ga MOI 0.1 tingimustes. 24 h peale nakatamist koguti rakkudelt viiruse P3 põlvkonda sisaldav sööde ja rakkudest eraldati totaalne RNA (Qiagen Rneasy kit, Quigen), mida kasutati matriitsiks järgneval cDNA sünteesil (Superscript II First Strand cDNA synthesis system, Invitrogen). Saadud cDNA-d olid matriitsiks PCR reaktsioonis, kus praimeritena kasutati nsP3 (nukleotiidid 4973-4999 SFV4-s) ja nsP4 (nukleotiidid 5646-5621 SFV4-s) konserveerunud järjestustele vastavaid praimereid. Järgnevalt määrati kogutud P3 viirusstokis sisalduv viiruse tiiter (kirjeldatud eelpool) ja seda kasutati jällegi BHK-21 rakkude nakatamiseks. Sellele järgnes P4 viirusstoki kogumine ning totaalse RNA eraldamine ja analüüs. Viiruste paljundamist ja totaalse RNA analüüsimist jätkati, lõpetades P5 stokiga nakatatud rakkudest RNA eraldamise, cDNA sünteesi ning PCR reaktsiooniga. Kõikides katsetes saadud PCR-i produkte analüüsiti agaroosgeel- elektroforeesil (meetodit kitjeldav joonis lk 36). Stabiilsuse hindamisel võrreldi täispikka EGFP geeni sisaldava PCR-i produkti (umbes 1.5 kb) kogust lühemate (deletsiooni sisaldavate) produktide kogusega.

RT-PCR meetodil saadud intaktsele nsP3-EGFP-nsP4 piirkonnale vastavast PCR produktist väiksemate produktide järjestuste analüüsiks nakatati BHK-21 rakke P4 stokiga ning viidi läbi RT-PCR analüüs. Saadud deletsiooni sisaldavad PCR produktid puhastati geelist (Gel Purification Kit, Eppendorf GmbH), kloneeriti pGEM®-T Easy vektorisse (Promega), järgides tootja juhiseid, ning sekveneeriti. Sekveneerimise tulemusi analüüsiti programmiga BioEdit.

Kvalitatiivseks analüüsiks kasutati viiruse puhastamist lüüsilaikudest. 35 mm koekultuuritassidel kasvavaid 100% konfluentseid BHK-21 rakke nakatati viirustega

(26)

SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)-EGFP (vaata eestpoolt). Seejärel kaeti rakud agaroos- GMEM seguga (1.8% agaroos ja 7.5% seerumit sisaldav 2xGMEM suhtes 1:1) ning inkubeeriti 37ºC ja 5% CO2 sisalduse juures 48 h. Lüüsilaikude tuvastamiseks värviti rakke üleöö 37ºC juures mitte-toksilist neutraalpunast sisaldava agaroos-GMEM seguga (0.02% neutraalpunast sisaldav 1.8% agaroos ja 7.5% seerumit sisaldav 2xGMEM suhtes 1:1). Igast tassidel moodustunud lüüsilaigust võeti steriilse plasikotsikuga agaroosi tükk ja iga tükk suspendeeriti ühes 24-augulise koekultuuriplaadi augus kasvavate rakkude kohal olevas söötmes. 24-72 h jooksul vaadeldi EGFP fluorestsentsi tekkimist/mitte tekkimist igast lüüsilaigust puhastatud viirusega nakatatud rakkudes.

Loomkatsed

Emased Balb/c hiired saadi Harlanist, UK ja neid kasvatati Edinburghi Ülikooli Infektsiooniliste Haiguste Keskuses (Centre for Infectious Diseases) patogeeni vabas keskkonnas, 12 h valge/pime tsüklis, toidu ja veega varustamine ad libitum. Kõik katsed olid Edinburghi Ülikooli eetikakomisjoni poolt heaks kiidetud. Kõikide loomkatsete puhul süstiti 5-6 nädala vanuseid hiiri ajusiseselt SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)4-EGFP- ga, kasutades üheks inokulatsiooniks 1000 PFU-d (Plaque Forming Unit) 20 µl PBSA-s (0.75% veise seerumi albumiini (BSA) sisaldav PBS). Seejärel kontrolliti hiiritel 2 korda päevas entsefaliidi kliiniliste sümptomite teket. Hiired, kellel ilmnesid haiguse lõppfaasile viitavad sümptomid, eutaniseeriti CO2-ga ja ajud eemaldati. Ajud poolitati sagitaalse läbilõikega mööda keskjoont. Poolitatud ajud fikseeriti 4% paraformaldehüüdis histoloogilisteks eksperimentideks, säilitati RNAlater lahuses (Ambion) järgneva RNA eraldamise jaoks või külmutati koheselt kuival jääl viiruse tiitri määramiseks ajus.

Immuunofluorestsents. Histoloogiliste katsete puhul fikseeriti aju 16h 4%

paraformaldehüüdis. Seejärel töödeldi aju sahharoosi gradiendis, inkubeerides kude 5%- s, seejärel 10%-s ja lõpuks 25%-s sahharoosi lahuses. Seejärel külmutati OCD lahuses (OCT Embedding Matrix, CellPath) olev aju isopentaanis ja lõigati järgnevalt krüomikrotoomiga 12 µm paksusteks lõikudeks, mis pandi alusklaasidele (Polysine Micro Adhesion Slides, VWR international). Koelõikudega alusklaase säilitati -70ºC juures.

(27)

Immuunofluorestsents analüüsiks lasti koelõikudega alusklaasidel soojeneda toatemperatuurini ja kuivada. Seejärel toimus koe permeabiliseerimine (0.3% TritonX- 100 PBS-s) 10 min ning pesu 2 x 15 min PBS-ga. Kude blokeeriti CAS blokeerimislahusega (Invitrogen) 10 min ning lisati primaarne antikeha lahjendatult CAS-is. Primaarsete antikehadena kasutati: neuronite visualiseerimiseks antikeha neuN (Chemicon); oligodendrotsüütide puhul antikeha anti-CNPaas (Witstar Laboratories);

astrotsüütide puhul antikeha anti-GFAP (Glial fibrillary acidic protein). Peale inkubeerimist 16 h toatemperatuuril pesti alusklaase 3 x 15 min PBS-ga. Sellele järgnes inkubeerimine sekundaarse biotiiniga konjugeeritud hiire IgG vastase roti antikehaga või biotiiniga konjugeeritud küüliku IgG vastase kitse antikehaga (lahjendused CAS blokeerimislahuses) 3 h toatemperatuuril. Järgnes 3 x 15 min pesu PBS-ga ning inkubatsioon streptavidiiniga konjugeeritud Alexa Flour 594-ga (Cambridge Biolabs) 45 min toatemperatuuril ja pimedas. Seejärel pesti alusklaase 2 x 15 min PBS-ga ja kaeti katteklaasidega, lisades klaaside vahele sulundusvedelikku (Vector Laboratories).

Preparaate pildistati Zeiss Axioscop konfokaalmikroskoobiga.

Viiruse tiitri määramine nakatatud hiire ajus. Kuival jääl külmutatud ajud homogeniseeriti PBSA-s (1/2 aju 1.35 ml-s). Viiruse tiiter ajus määrati vastavalt eelpool kirjeldatud lüüsilaikudega tiitrimisele.

Viiruse geneetilise stabiilsuse analüüs. Esmaseks hiirte süstimiseks (nagu eelpool kirjeldatud) kasutati BHK-21 rakkudes toodetud SFV(3H)-EGFP P2 põlvkonda.

½ nakatatud hiirest eemaldatud ajust säilitati RNAlater lahuses ja kasutades Rneasy lipid tissue kit’i (Qiagen) eraldati sellest totaalne RNA. Eraldatud RNA-l viidi läbi eelpool kirjeldatud RT-PCR-l põhinev analüüs. Ülejäänud ½ ajust homogeniseeriti ja saadud homogenisaati käsitleti in vivo P1 viirusstokina. Järgnevalt määrati homogenisaadis sisalduva viiruse tiiter (kirjeldatud eelpool) ning kasutades 1000 PFU-d süstiti sellega järgmist hiirt, mille ajust eraldati totaalne RNA ja ning valmistati in vivo P2 viirusstokk.

Viiruse paljundamist hiirte ajus ja totaalse RNA analüüsimist jätkati, lõpetades RNA eraldamisega in vivo P5 viirusstokiga nakatatud hiire ajust ning selle analüüsimisega.

(28)

TÖÖ TULEMUSED

Soovides luua geneetiliselt stabiilset ja varajase võõrgeeni ekspressiooniga rekombinantset SFV genoomi, uurisime kõigepealt markergeeni sisestamise võimalust viiruse mittestuktuursesse alasse, nii et see oleks osa viiruse transkriptsiooniühikust ja oleks transleeritud varases infektsiooni staadiumis. Sellise viiruse genoomi konstruktsioon põhines meie varasematel teadmistel SFV polüproteiini protsessingu ja replikaasikompleksi formeerumise kohta (Salonen et al., 2003; Vasiljeva et al., 2003).

Arvestati ka asjaolu, et varem konstrueeritud viirus, mille genoomis markergeen EGFP oli sisestatud mittestruktuurset valku nsP3 kodeerivasse alasse (aa 452 ja 453 vahele), oli infektsiooniline, kuid äärmiselt ebastabiilne (A. Merits, avaldamata andmed). Selle põhjuseks võiks olla defektsete replikatsioonikomplekside moodustumine, kus nsP3- EGFP liitvalk ei suuda individuaalse nsP3 funktsioone täielikult täita. Kuna sellise viiruse kasutamise võimalused on piiratud, kavandati uus lähenemine, mis võimaldaks taastada nsP3 natiivsel kujul. Selle saavutamiseks sisestati EGFP nsP3 ja nsP4 kodeerivate alade vahele, eraldades EGFP viiruse mittestruktuursetest valkudest proteaasi nsP2 lõikamissaitidega (Joonis 5). Sellises viiruses peaks EGFP-d transleeritama osana viiruse mittestruktuursest polüproteiinist, kuid peale nsP2 poolt teostatavat protsessingut vabanevad intaktne nsP3 ja EGFP.

Mittestruktuurse polüproteiini korrektne protsessing on absoluutselt vajalik SFV funktsionaalsete replikatsioonikomplekside moodustumiseks. Seejuures on oluline silmas pidada, et SFV varajase replikatsioonikompleksi moodustumiseks on vajalikud nii nsP4 kui ka P123. Kuna markergeeni ja täiendava nsP2 proteaasi äratundmis-saidi paigutamine P123 ja nsP4 vahele võib mõjutada protsessingut, siis disainisime nsP3 ja EGFP vahele kaks erinevat nsP2 lõikamisjärjestust, millest üks on madalama (Low ehk L) ja teine kõrgema efektiivsusega protsessitav (High ahk H) (Joonis 5). Sellest lähtuvalt oodati H lõikamissaidiga viirustes protsessingu tulemusel esmalt P123 + EGFP-nsP4 moodustumist ja L lõikamissaidiga viirustes P123-EGFP + nsP4 moodustumist. Ehkki meil puudusid andmed selliste komplekside funktsionaalsuse kohta, eeldasime, et vähemalt üks neist viirustest on infektsiooniline. EGFP ja nsP4 vahele disainiti SFV4 nsP3/4 saidile identne nsP2 proteaasi lõikamissait, liites nsP3 30 viimast aminohapet

(29)

EGFP C-terminusele (Joonis 5). See on vajalik tagamaks nsP4 kiiret protsessingut EGFP küljest ja korrektse N-terminaalse osaga nsP4 vabanemist. Need mõlemad tingimused on alfaviiruste replikatsiooniks absoluutselt vajalikud.

Joonis 5. Skeem rekombinatsete EGFP-d ekspresseerivate SFV genoomide ehituse kohta. EGFP geen sisestati valke nsP3 ja nsP4 kodeeritate alade vahele. Üleval on toodud SFV4 genoom ja sellest allpool on kujutatud SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4- EGFP genoomide konstruktsiooni ja oletatavat mitte-stuktuursete polüproteiinide protsessingut. Näidatud on nsP2 proteaasi lõikamissaitide L, H ja natiivse nsP3/4 saidi aminohappeline järjestus; EGFP C- terminusele lisatud 30 ah järjestus valgu nsP3 lõpust (ah 453-482). Viiruse proteaasi nsP2 lõikamiskohad on tähistatud nooltega. Numbrid tähistavad aminohapete positsioone nsP3-s. Aminohapped on tähistatud ühetäheliselt; (6) tähistab järjestust IFSSDT (pärineb nsP4 N-terminusest) proteaasi lõikamissaidis H.

Rekombinantsete viiruste kasv

Rekombinantsete viiruste replikatsioonitsükli kirjeldamist alustasime nende kasvukõverate analüüsimisega koekultuuri tingimustes. Selleks nakatasime BHK-21 rakke SFV4, SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)4-EGFP P2 stokkidega ja analüüsisime virionide vabanemist nakatunud rakkudest söötmesse (Joonis 6). Analüüs näitas, et virionide tootmise kineetika oli kahe rekombinantse viiruse SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4-EGFP vahel identne, viidates sellele, et erinevused nsP2 lõikamissaitides nsP3 ja EGFP vahel ei mõjuta viiruse kasvu. Võrreldes SFV4-ga, oli rekombinantsete viiruste akumuleerumine hilinenenud umbes ühe tunni võrra ja ka nende maksimaalne tiiter oli umbes 1 log10 võrra madalam. Kuid kuna mõlemad rekombinantsed viirused olid võimelised paljunema tiitrini 109 pfu/ml 10 h jooksul, järeldasime, et protsessitava EGFP

(30)

sisestamine mittestruktuursesse alasse omas viiruste replikatsioonitsüklile ainult kerget effekti.

1,0E+03 1,0E+04 1,0E+05 1,0E+06 1,0E+07 1,0E+08 1,0E+09 1,0E+10 1,0E+11

1 3 5 7 9 11 13

Aeg peale nakatamist (h)

Tiiter (pfu/ml)

SFV4

SFV(3H)4-EGFP SFV(3L)4-EGFP

Joonis 6. SFV4, SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)4-EGFP kasv viiruste P2 stokkidega nakatatud BHK-21 rakkudes. Söötmesse vabanenud viirused koguti ja nende tiiter määrati lüüsilaikudega tiitrimisel.

EGFP ekspressioon

Et kindlaks teha, kas rekombinantsed viirused SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4- EGFP ekspresseerivad funktsionaalset EGFP-d, nakatati nende viirustega BHK-21 rakke ja uuriti markervalgu ekspressiooni fluorestsentsmikroskoopi kasutades. Ehkki detekteeritud EGFP fluorestsents oli nakatatud rakkudes üsna nõrk, tõendas see siiski funktsionaalse EGFP ekspressiooni. Järgnevalt analüüsisime EGFP lokalisatsioon nakatatud rakus ja selle võimalikku kolokalisatsiooni SFV replikatsioonikompleksides paikneva nsP3-ga. SFV-ga nakatatud rakkudes seondub nsP3 modifitseeritud endosoomides ja lüsosoomides paiknevate replikatsioonikompleksidega (Froshauer 1988), vaba EGFP paikneb rakkudes seevastu aga tüüpiliselt difuusselt nii tsütoplasmas kui ka tuumas. Analüüsi tulemused näitasid, et SFV(3H)4-EGFP-ga nakatatud BHK-21 rakkudes oli nsP3 oodatult lokaliseerunud granulaarselt tsütoplasmas, EGFP seevastu difuusselt peamiselt tuumas (Joonis 7); identsed tulemused saime ka SFV(3L)4-EGFP kohta (andmed pole näidatud). nsP3 ja EGFP üksteisest sõltumatu asetsemine nakatatud rakkudes kinnitas, et mittestruktuurse polüproteiini lõikamine oli toimunud efektiivselt

(31)

ning protsessingu tulemusel vabanenud EGFP ei assotsieerunud SFV replikatsioonikompleksidega.

Joonis 7. EGFP ja nsP3 lokalisatsioon SFV(3H)4-EGFP-ga nakatatud BHK-21 rakkudes. Nakatatud rakud (MOI=1) fikseeriti 5 h peale infektsiooni. EGFP visualiseeriti valgu oma fluorestsentsi abil. nsP3 visualiseeriti nsP3-vastase primaarse antikeha ja sekundaarse Texas Red-ga konjugeeritud küüliku IgG vastase kitse antikeha abil.

Mittestruktuursete valkude ekspressioon ja protsessing

Mittestruktuursete valkude ekspressiooni rekombinantsete viiruste P2 stokiga nakatatud BHK-21 rakkudes analüüsiti Western blot meetodil. See analüüs näitas, et kõik viiruse mittestruktuursed valgud ja markervalk EGFP olid rakus peamiselt individuaalsete valkude kujul (Joonis 8, mustad nooled). Ainsa erandina detekteerisid nii anti-nsP4 kui ka anti-EGFP antikeha lisaks individuaalsetele valkudele ka suurema molekulmassiga valgu olemasolu (Joonis 8, seest tühjad nooled), mis tõenäoliselt kujutab endast protsessimata EGFP-nsP4 liitvalku. Protsessimata nsP3-EGFP liitvalku Western blot ei detekteerinud, viidates sellele, et nii H kui L nsP2 proteaasi lõikamissait protsessitakse nakatunud rakus väga kiiresti ja seetõttu on erinevused nende kahe järjestuse lõikamise vahel minimaalsed. Identsed tulemused valguekspressiooni kohta saadi ka infektsioonilise RNA-ga transfekteeritud ja P1 viirusstokiga nakatatud rakkudes.

(32)

Joonis 8. Western blot analüüs rekombinantsete viiruste P2 stokkidega nakatatud rakkudest. Nakatamata ja SFV(3H)4-EGFP või SFV(3L)4-EGFP-ga nakatatud rakkude lüsaadid on märgitud vastavalt “-”, H või L.

Iga paneeli kohale on märgitud kasutatud antikeha. Mustade nooltega on märgitud nsP1, nsP2, nsP3, nsP4 ja EGFP spetsiifilised signalid, EGFP-nsp4 liitvalgule vastav signal on märgitud seest tühja noolega.

Vasakul pool joonisest on märgitud molekulmassi standardid kDa-tes.

Viiruse RNA replikatsioon

SFV4, SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)4-EGFP RNA-de sünteesi nakatatud rakkudes võrreldi omavahel nii Northern blot meetodil kui ka märgistades totaalset viiruste poolt sünteesitud RNA-d [5-3H]-uridiiniga. Northern blot meetodi puhul kasutati viiruse positiivse polaarsusega genoomsetele (42S) ja subgenoomsetele (26S) RNA-dele komplementaarset märgistatud RNA proovi. Saadud tulemused näitasid, et nii SFV4-ga kui ka rekombinantsete viirustega nakatatud BHK-21 rakkudes sünteesiti mõlemaid viirus-spetsiifilisi RNA-sid (Joonis 9), kusjuures 42S ja 26S RNA-de süntees SFV(3H)4- EGFP ja SFV(3L)4-EGFP poolt oli sarnane SFV4-le, ehkki rekombinantsete viiruste puhul oli märgata väikest hilinemist RNA-de akumuleerumisel. Kõige selgemini oli antud hilinemist näha 3-4 h peale nakatamist (Joonis 9). Need andmed näitavad, et SFV- ga võrreldes algas positiivse polaarsusega RNA-de süntees rekombinantsete viiruste puhul väikese (umbes 1 h) hilinemisega. Olulisi erinevusi SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)4- EGFP 42S ja 26S RNA-de sünteesil Northern blot analüüs ei detekteerinud.

(33)

Joonis 9. SFV4 ja rekombinantsete viiruste positiivse polaarsusega RNA-de süntees. SFV4 või rekombinantsete viiruste P2 stokiga nakatatud BHK-21 rakkudest eraldati erinevatel ajahetkedel pärast infektsiooni (2, 3, 4, 5, 6 või 8 h) totaalne RNA ning viidi läbi Northern blot analüüs, kasutades 32P-ga märgistatud SFV4 genoomsele alale 10465-11074 nt komplementaarset RNA proovi. Subgenoomsele ja genoomsele RNA-le vastav signaal on märgitud vastavalt 26S ja 42S. Nakatamata kontrollproov on tähistatud “-”.

Võrdlesime ka totaalse viirus-spetsiifilise RNA sünteesi SFV4 ja rekombinantsete viiruste vahel. SFV(3L)4-EGFP, SFV(3H)4-EGFP ja SFV4 poolt nakatatud rakkudes inhibeeriti aktinomütsiin D lisamisega rakulise RNA süntees ning totaalse viirus- spetsiifilise RNA märgistamiseks kasutati [5-3H]-uridiini. Erinevatel ajahetkedel pärast nakatamist (3, 4, 5, 6, 7 ja 8 h) rakkudest eraldatud RNA analüüs näitas, et üldiselt oli totaalse RNA sünteesi dünaamika rekombinantsete viiruste ja SFV4 puhul sarnane (Joonis 10). Sarnaselt Northern blotil saadud tulemustele näitasid ka metaboolse märgistamisega saadud andmed, et RNA süntees toimub rekombinantsete viiruste puhul väikese hilinemisega: 3 h peale nakatamist oli sünteesitud totaalse RNA hulk SFV(3H)4- EGFP puhul umbes kaks ja SFV(3L)4-EGFP puhul isegi rohkem kordi madalam kui SFV4 puhul (Joonis 10). Samas ajapikku see vahe vähenes ja erinevate viiruste poolt sünteesitud RNA hulgad ühtlustusid (Joonis 10). Üllatav oli selles katses nähtud väike erinevus SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4-EGFP RNA sünteesi vahel. Kuna antud katset on tehtud korduvalt ja alati vähemalt kahe paralleeliga, siis on joonisel 10 näidatud tulemused usaldusväärsed ja väike erinevus rekombinantsete viiruste RNA sünteesi vahel tõepoolest eksisteerib.

(34)

Kokkuvõtvalt võib öelda, et Northern blot ja viirus-spetsiifilise RNA märgistamise analüüsid näitasid, et drastilisi erinevusi SFV4 ja rekombinantsete viiruste RNA sünteesis ei ole.

0,0E+00 5,0E+05 1,0E+06 1,5E+06 2,0E+06 2,5E+06 3,0E+06 3,5E+06

3 4 5 6 7 8

Aeg peale nakatamist (h)

CPM-d tassi kohta

SFV(3L)4-EGFP SFV(3H)4-EGFP SFV4

Joonis 10. SFV4 ja rekombinantsete viiruste totaalse RNA süntees nakatatud rakkudes. SFV4 või rekombinantsete viirustega nakatatud BHK-21 rakkudes inhibeeriti rakuspetsiifilise RNA süntees aktinomütsiin D-ga. [5-3H]-uridiini lisamisega 2 h peale infektsiooni algust märgistati sünteesitav viirus- spetsiifiline RNA. Erinevatel ajahetkedel peale nakatamise algust eraldati rakkudest totaalne RNA, sadestati see TCA-ga, kanti klaasfiiberfiltrile ning erinevates proovides sisalduva radioaktiivselt märgistunud RNA hulka anlüüsiti sintillatsiooni lugejaga.

Struktuursete valkude ekspressioon ja rakulise translatsiooni mahasurumine

On teada, et nakatatud rakkudes suruvad alfaviirused peremeesraku transkriptsiooni ja translatsooni maha (Frolov and Schlesinger, 1994; Gorchakov et al., 2004). Seetõttu oli oluline analüüsida, kas võime peremehe valgusünteesi inhibeerida on säilinud ka konstrueeritud rekombinantsetel viirustel. Lisaks huvitas meid, kuidas mõjutas markergeeni lisamine viiruse genoomi SFV struktuursete valkude ekspressiooni.

(35)

Translatsiooni uurimiseks märgistati metaboolselt SFV4, SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)4-EGFP-ga nakatatud rakkudes erinevatel ajahetkedel kõik sünteesitavad valgud (Materjal ja metoodika). Saadud tulemused näitasid, et sarnaselt SFV4-le surusid ka rekombinantsed viirused peremeesraku translatsiooni efektiivselt maha; samuti oli struktuursete valkude sünteesi dünaamika kõigi kolme viiruse puhul ühesugune (Joonis 11). Samas, sarnaselt viiruse kasvule (Joonis 6) ja viirus-spetsiifilise RNA sünteesile (Joonis 9 ja 10), oli näha, et rekombinantsete viiruste puhul eksisteerib ka struktuursete valkude sünteesi ning peremeesraku translatsiooni mahasurumise alguses väike hilinemine (Joonis 11). Näiteks SFV4-ga nakatatud rakkudes hakkas raku aktiini sünteesimine vähenema 3 h peale nakatamist, sama sündmus oli nähtav rekombinantsete viirustega nakatatud rakkudes 4 h peale infektsiooni algust (Joonis 11). Sarnaselt algas SFV4-ga nakatatud rakkudes viiruse struktuursete valkude C, E1 ja p62 detekteeritaval tasemel tootmine umbes 3 h peale infektsiooni algust; samade valkude ekspressioon rekombinantsete viiruste infektsiooni puhul oli aga täheldatav umbes 1 tund hiljem (Joonis 11).

Joonis 11. Rakulise translatsiooni mahasurumine SFV4 ja rekombinantsete viiruste poolt. SFV4, SFV(3H)4-EGFP või SFV(3L)4-EGFP-ga nakatatud BHK-21 rakkudes märgistati kõik sünteesitavad valgud erinevatel ajahetkedel peale infektsiooni (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 h) [35S]metioniini ja [35S]tsüsteiiniga, rakud lüüsiti ja analüüsiti SDS-polüakrüülamiidgeelis. Nakatamata rakulüsaat on tähistatud “-”

Molekulmassi standardid kDa-tes on märgitud vasakule poole.

(36)

Rekombinantsete viiruste geneetiline stabiilsus

Üheks oluliseks eesmärgiks SFV(3L)4-EGFP ja SFV(3H)4-EGFP loomisel oli disainida geneetiliselt stabiilsed rekombinantsed viirused. Selle omaduse analüüsimiseks kasutasime kahte iseseisvat meetodit: kvalitatiivset RT-PCR-l põhinevat lähenemist (Joonis12) ja kvantitatiivset viiruse lüüsilaikudest puhastamisel põhinevat meetodit. RT-

PCR analüüsi abil uurisime nii rekombinantsete viirustega nakatatud BHK-21 rakkudest pärit kui ka viirusega inokuleeritud hiire ajust pärit materjali.

Joonis 12. RT-PCR-l põhineva meetodi skemaatiline kujutamine. Punaste nooltega on tähistatud kohad, kuhu PCR reaktsioonis kasutatud praimerid seondusid.

RT-PCR meetodiga (Joonis 12) uurisime kõigepealt BHK-21 rakkudest, mis olid nakatatud SFV(3L)4-EGFP või SFV(3H)4-EGFP põlvkondadega P1, P2, P3, P4 ja P5, eraldatud totaalset RNA-d. Rekombinantsete viiruste P2 stokiga nakatatud rakkudest puhastatud RNA nsP3-EGFP-nsP4 piirkonna RT-PCR analüüsi tulemusteks olid intaktsele nsP3-EGFP-nsP4 alale vastava suurusega PCR produktid (Joonis 13A). Väga vähesel määral oli näha ka väiksemaid produkte, mis olid tõenäoliselt pärit EGFP või sellega külgnevate alade deletsioone sisaldavatest genoomidest (Joonis 13A). Järgnevate põlvkondadega nakatatud rakkudest puhastatud RNA analüüs näitas aga intaktsele nsP3- EGFP-nsP4 alale vastavatest PCR produktidest väiksemate produktide järk-järgulist akumuleerumist (Joonis 13A). Huvitaval kombel oli väiksemate produktide osakaal võrreldes korrektse suurusega produktiga SFV(3L)4-EGFP korral tunduvalt suurem kui SFV(3H)4-EGFP puhul.

Sarnase RT-PCR-l põhineva analüüsi viisime läbi ka SFV(3H)4-EGFP-ga otse ajju inokuleeritud hiirte ajudest eraldatud materjalis. Balb/c hiirte esmaseks inokuleerimiseks kasutasime BHK-21 rakkudes toodetud viiruse SFV(3H)4-EGFP P2 stokki, nakatatud ajukoe homogeniseerimisel saime in vivo P1 viiruse stoki, mida

(37)

paljundasime hiire ajus põlvkonnani P5. Saadud tulemused näitasid, et erinevalt in vitro tingimustele (Joonis 13A), on viirus SFV(3H)4-EGFP in vivo tingimustes tunduvalt stabiilsem (Joonis13B), kuna analüüsitud viies põlvkonnas saime RT-PCR analüüsil vaid intaktsele nsP3-EGFP-nsP4 alale vastava suurusega PCR produkte. Ühegi väiksema produkti olemasolu antud analüüs ei detekteerinud.

Joonis 13. SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)-EGFP geneetilise stabiilsuse kvalitatiivne analüüs. (A) RT-PCR analüüs rekombinantsete viiruste P2, P3, P4 ja P5 stokkidega nakatatud BHK-21 rakkudest. (B) RT-PCR analüüs in vitro P2 (0) või in vivo P1, P2, P3, P4 stokkidega inokuleeritud hiire ajumaterjalist. M tähistab DNA suurusmarkerit; H või L vastavalt SFV(3H)4-EGFP või SFV(3L)4-EGFP-ga nakatatud rakkude kasutamist analüüsil. Nooltega on märgitud intaktsele nsP3-EGFP-nsP4 alale vastava PCR produkti signaal; kolmnurkadega on näidatud deletsioonidega aladele vastavad PCR produktid, mida analüüsiti sekveneerimisega.

Meid huvitas ka, millised mutatsioonid viiruste paljundamisel BHK-21 rakkudes rekombinantsetes genoomides tekkisid. Selleks nakatasime BHK-21 rakke SFV(3H)4- EGFP P4 stokiga, viisime läbi RT-PCR analüüsi ja puhastasime geelist kõik joonisel 13 nii noolega kui ka kolmnurkadega näidatud PCR produktid. Antud PCR-i produktide sekveneerimine ja järgnev analüüs näitas, et noolega tähistatud signaal vastas tõepoolest intaktsele nsP3-EGFP-nsP4 alale. Kõik väiksemad produktid vastasid deletsioonidega genoomidele, kus deletsioon oli toimunud alati mittestruktuursete valkude lugemisraami säilitades. Kõige väiksem analüüsitud RCR-i produktidest vastas peaaegu täielikult SFV4 nsP3-nsP4 alale, välja arvatud nsP2 proteaasi nsP3/4 lõikamisjärjestus, mis oli asendunud, arvatavasti rekombinatsiooni teel, H lõikamisjärjestusega (Joonis 5; GRAGA- YIFSSDTG asemel GRAGA-GIFSSDTGP). See tõi sisuliselt kaasa vaid nsP4 esimese

(38)

aminohappe muutuse (Y→G). Ülejäänud 2 sekveneeritud PCR produkti vastasid EGFP geeni siseste deletsioonidega genoomidele.

SFV(3H)4-EGFP ja SFV(3L)4-EGFP geneetilise stabiilsuse kvalitatiivseks analüüsiks kasutasime viiruse puhastamist lüüsilaikudest. Selleks nakatasime BHK-21 rakke rekombinantsete viiruste P2, P3, P4 ja P5 stokkidega ning puhastasime nakatatud rakkudest kummagi viiruse iga põlvkonna kohta 96-st individuaalsest lüüsilaigust viiruse.

Järgnevalt analüüsisime puhastatud viiruste säilinud/kaotatud võimet EGFP-d ekspresseerida. See analüüs näitas, et kõik P2 stoki lüüsilaikudest puhastatud viirused ekspresseerisid funktsionaalset võõrgeeni, kuid hilisemates põlvkondades EGFP positiivsete viiruste osakaal langes (Joonis 14). P5 stokis oli SFV(3H)4-EGFP puhul 94% ja SFV(3L)4-EGFP puhul 50% EGFP positiivseid viiruseid (Joonis 14). Seega olid viiruste lüüsilaikudest puhastamisel saadud tulemused kooskõlas RT-PCR analüüsiga:

SFV(3L)4-EGFP viirus oli ka selles katses märgatavalt ebastabiilsem kui SFV(3H)4- EGFP.

Kõiki geneetilise stabiilsuse analüüsil saadud tulemusi kokku võttes võib öelda, et mõlema rekombinantse viiruse puhul deletsioonid ja/või muud mutatsioonid markergeeni piirkonnas toimuvad. Samas on deletsioonide toimumise sagedus madal ja sõltub viiruste kasvukeskkonnast ning tingimustest.

0 20 40 60 80 100

2 3 4 5

Viiruste põlvkonnad

GFP positiivseid viiruseid (%)

SFV(3H)4-EGFP SFV(3L)4-EGFP

Joonis 14. Rekombinantsete viiruste geneetilise stabiilsuse kvantitatiivne analüüs. BHK-21 rakke nakatati rekombinantsete viiruste põlvkondadega P2, P3, P4 ja P5. Kummagi viiruse iga põlvkonna kohta puhastati nakatatud rakkudest 96 lüüsilaiku, milles sisalduvate viiruste võimet EGFP ekspresseerida koekultuuri tingimustes analüüsiti.

Referenzen

ÄHNLICHE DOKUMENTE

Suuremaid erinevusi wt konstruktist võib RRD ning ∆RR mutatsiooniga konstruktidel märgata in trans paiknevate RNA-de akumuleerumises (joonis 11B). Jooniselt 11A ja 11B

Leidmaks seoseid vere rakulise koostise ja suitsetamisharjumuste vahel otsustati läbi viia rakukultuuri katsed ning uurida sigareti suitsu kondensaadi ja e-sigareti

Käesoleva töö eesmärgiks oli uurida TDtest meetodi (Gefen et al., 2017) sobivust nanofiibermattide testimisel ning erineva kiirusega antibiootikumi

Need faktorid (nt. kemikaalid, kiirgus) kahjustavad DNA struktuuri. DNA kahjustuste korral replikatsioon peatub ning juhul, kui kahjustust ei parandata õigeaegselt, võib

Bakalaureusetöö eesmärk on koolieelsete lasteasutuste õpetajate arvamuste põhjal välja selgitada mürgiste taimede, viljade ja seemnete käsitlemise vajadust ja olulisust

Kuna uurija tegi ka tegevuse lastega läbi, siis leidis, et näidis-tegevuskonspekt on siiski kõnearendust vajavatele lastele sobiv, kuna nad said sellega hästi hakkama ning

Lisaks on Kask jt., 2015 viidanud, et nendel 20% Ric8 CKO loomadel esinevad kraniofastsikulaarsed häired (alaarenenud üla/alalõua piirkond), mis annab alust arvata, et ka

Eelnevast lähtudes võib A549 ja HeLa rakkude puhul MMP-de ekspressioonimustri muutuse võimalikuks põhjuseks olla see, et ECM-i koguneb populatsiooni kasvamise