Aus dem Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Vergleichende Analyse des fibrotischen Lungenumbaues nach Lungen- und Stammzelltransplantation
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der
Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Berenice Rath aus Bremerhaven
Hannover Januar 2019
Angenommen vom Senat: 24.06.2019
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. Danny Jonigk 1. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Detlef Neumann
2. Referent: Prof. Dr. phil. Sabina-Marija Janciauskiene Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2019
Prüfungsausschuss
Vorsitz: Prof. Dr. med. Hans-Heinrich Kreipe 1. Prüfer: Prof. Dr. med. Reinhard Brunkhorst 2. Prüfer: Prof. Dr. med. Andreas Klos
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1
1.1 Nicht-neoplastische Lungenerkrankungen 1
1.2 Lungen- und Stammzelltransplantation, fibrotischer Lungenumbau nach Radiatio/Chemotherapie und bei
idiopathischer pleuroparenchymaler Fibroelastose 1 1.3 Diagnostischer Stellenwert der histopathologischen Untersuchung
humaner Lungenbiopsien 6
1.4 Fragestellungen 8
2. Material und Methoden 9
2.1 Patientenkollektive und Gewebeproben 9
2.2 Laser-Mikrodissektion 10
2.3 Genexpressionsanalyse von 45 fibrose-, umbau- und
abstoßungsassoziierten Genprodukten und drei Referenzgenen 11 2.4 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)–Bestimmung
der Herkunft von Makrophagen/(Myo-) Fibroblasten in der Lunge 11
2.5 Quantifizierung des Elastins 12
2.6 Datenanalyse und Statistik 12
3. Ergebnisse 13
3.1 Ergebnisse der konventionellen Histopathologie 13
3.2 CLAD-Unterformen und Auswertung 15
3.3 Vergleich der molekularpathologischen Ergebnisse der iPPFE mit
fibroelastotischen Veränderungen in rCLAD/RAS-Lungen 18
3.4 Ergebnisse der exemplarischen X/Y-FISH 18
3.5 Ergebnisse der ergänzenden Immunhistochemie 18
4. Diskussion 20 4.1 Molekulare Unterschiede zwischen Bronchiolitis obliterans,
idiopathischer pleuroparenchymaler Fibroelastose und
fibroelastotischen pulmonalen Veränderungen 20 4.2 Vorteile und Limitation der molekularpathologischen Analysemethode 27
4.3 Mögliche Therapiestrategien 28
4.4 Beantwortung der ursprünglichen Fragestellungen 30
5. Zusammenfassung 31
6. Literaturverzeichnis 33
7. Abkürzungsverzeichnis 39
8. Curriculum Vitae 41
9. Erklärung nach § 2 Absatz 2 Nummer 6 und 7 Promotionsordnung 45
10. Danksagung 46
11. Anhang - Originalpublikation 47
12. Anhang - Digitale Version 49
1 1. Einleitung
1.1 Nicht-neoplastische Lungenerkrankungen
Interstitielle Lungenerkrankungen (ILE) werden nach der aktuellen Konsensusklassifikation der „European Respiratory Society“ und der „American Thoracic Society“ (ERS/ATS) in vier Kategorien eingeteilt: 1. ILE mit bekannter Ursache, 2. Idiopathische Interstitielle Pneumonien (IIP), 3. Granulomatöse ILE und 4. Andere Formen der ILE, wobei die IIP die idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) und andere IIPs (wie z. B. die nicht-spezifische interstitielle Pneumonie (NSIP), die kryptogene organisierende Pneumonie (COP), die respiratorische Bronchiolitis mit ILE (RB-ILE), die desquamative interstitielle Pneumonie (DIP), die lymphoide interstitielle Pneumonie (LIP) und Akute interstitielle Pneumonie (AIP)) zählen (American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS), 2002). Die fibrotischen Umbauprozesse, welche die Mehrzahl dieser Erkrankungen charakterisieren, führen meist zu einer progressiven und irreversiblen Störung der Gasaustauschfunktion der Lunge, sodass für viele der Betroffenen als einzige kurative Therapie die allogene Lungentransplantation (LuTx) verbleibt.
1.2 Lungen- und Stammzelltransplantation, fibrotischer Lungenumbau nach Radiatio/Chemotherapie und bei idiopathischer pleuroparenchymaler Fibroelastose
Hardy et al. vollführten 1963 die erste klinische unilaterale Lungentransplantation bei einem Menschen (Margreiter R, 2016). Das Register der „International Society of Heart and Lung Transplantation“ (ISHLT) hat bis einschließlich Juni 2015 Daten zu 55.795 adulten Lungentransplantationen gesammelt (Yusen RD et al. 2016). Die überlebensbegrenzende Achillesferse bei der Lungentransplantation war initial die akute zelluläre Abstoßung, die in den folgenden Jahren allerdings mit der Entdeckung neuer Immunmodulatoren wie Cyclosporin immer besser zu beherrschen war. Aktuell ist jedoch die „chronische Abstoßung“, besser als chronische Allograftdysfunktion (CLAD) bezeichnet, der hauptsächliche limitierende Faktor für das Langzeitüberleben nach Transplantation (Gauthier JM et al., 2018).
CLAD ist ein Überbegriff für zahlreiche immunologische und nicht-immunologische
2 Schädigungen des Transplantats (Vos R et al., 2015, Verleden SE et al., 2015, Suwara MI et al., 2014). Das CLAD lässt sich in das bereits länger bekannte und bislang relativ gut beleuchtete funktionell obstruktive CLAD (oCLAD/BOS, synonym BOS = Bronchiolitis obliterans-Syndrom) und das erst in der letzten Zeit identifizierte funktionell restriktive CLAD (rCLAD/RAS, synonym RAS = restriktives Allograft- Syndrom) einteilen (Suhling H et al., 2016). Das bessere Verständnis der Pathogenese des CLAD soll helfen, bessere Behandlungen und Präventionsmöglichkeiten zu schaffen. Zunächst wird dargestellt, welche Indikationen zu einer Lungentransplantation führen: Nach dem 33. Erwachsenen Lungen- und Herz-Lungen-Transplantationsreport aus 2016 der ISHLT sind in absteigender Reihenfolge die häufigsten Indikationen genannt (Yusen RD et al.
2016):
1. Chronische obstruktive Lungenerkrankung / Emphysem (COPD) ohne alpha1 Antitrypsin-Mangel (31,3%); falls dieses kombiniert wird mit COPD mit alpha1-Antitrypsinmangel (5,1%), macht diese Erkrankung mehr als ein Drittel (36,4%) der Indikationen aus,
2. Interstitielle Lungenerkrankungen (ILE) oder Lungenfibrose (29,7%),
hauptsächlich bestehend aus idiopathischen interstitiellen Pneumonien (IIP, 24,5%) und non-IIP ILE (5,2%),
3. Bronchiektasien (18,5%) , insbesondere Mukoviszidose (CF, 15,8%)
4. Pulmonalarterielle Hypertonie (PAH) (4,4%), davon macht die idiopathische Variante 2,9% aus,
5. Seltene Entitäten (6,8%): Sarkoidose, Lymphangioleiomyomatose / tuberöse Sklerose, Bronchiolitis obliterans (0,9%), Bindegewebserkrankung, Tumorerkrankungen,
6. Retransplantation (4,1%).
Das Fünf-Jahres-Überleben nach Lungentransplantation beträgt weltweit betrachtet nur etwa 50 % (s. Abbildung 1), an spezialisierten Zentren wie der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) liegt es bei ca. 60%, zurückzuführen auf die Expertise in der Nachsorge der Organempfänger (transbronchiale Biopsien (TBB) werden zur Beurteilung einer Abstoßungsreaktion routinemäßig entnommen und ggf. eine angepasste Immunmodulation etc. eingeleitet).
4 Transplantatversagens sind fibroelastotische Veränderungen ähnlich einer idiopathischen pleuroparenchymalen Fibroelastose (iPPFE). Die CLAD-Unterformen können histologisch und klinisch diagnostiziert werden, jedoch ist eine Früherkennung von den obstruktiven bzw. restriktiven Ventilationsstörungen bislang schwierig.
BO-Läsionen und fibroelastotische Veränderungen bei Patienten mit restriktiven Veränderungen ähnlich einer iPPFE treten nicht nur nach Lungentransplantation auf, sondern z. B. auch nach hämatopoetischer Stammzeltransplantation (HSCT) im Sinne von fibrotischem Parenchymumbau bei einer „Graft versus Host“-Reaktion (GvHD).
Eine Radio-/Chemotherapie (RC) kann ebenfalls als Nebenwirkung zu BO-Läsionen und fibroelastotischen Veränderungen mit restriktiven Funktionsstörungen ähnlich einer iPPFE in der Lunge führen. Diese Patienten benötigen bei schwerer Manifestation einer respiratorischen Insuffizienz eine Lungentransplantation als einzige effiziente Therapie und können danach wiederum ebenfalls an lungentransplantationsassoziierter BO und fibroelastotischen Veränderungen ähnlich einer iPPFE der Lunge erkranken.
Die idiopathische pleuroparenchymale Fibroelastose (iPPFE) entsteht nach aktuellem Stand der Wissenschaft in Assoziation mit Autoimmunphänomenen und nach rezidivierenden Infektionen, selten mit familiärer Häufung (Bonifazi M et al., 2017). Diese ist ebenfalls Bestandteil der Untersuchungen.
Allgemein gesprochen gibt es aktuell keine effektive Therapie, die die fibrotischen Umbauprozesse im Rahmen von interstitiellen Lungenerkrankungen (ILE) rückgängig machen kann. Neue Therapieansätze für einzelne Erkrankungen, wie z. B. die IPF, beinhalten antifibrotische Medikamente wie Pirfenidon und Nintedanib, die jedoch nur für einen Teil der betroffenen Patienten geeignet sind und dabei auch nicht zuverlässig wirken (Lancaster et al., 2017, Richeldi L et al., 2014).
Zudem wird jeder transplantierte Patient mit einer Induktions- und Erhaltungstherapie im Rahmen einer Immunsuppression behandelt (s. auch Kapitel 4.3 Mögliche Therapiestrategien). Dieses geht allerdings mit unerwünschten Arzneimittelwirkungen einher.
5 Unabhängig ob sich ein oCLAD/BOS und/oder rCLAD/RAS nach Lungentransplantation, Stammzelltransplantation oder Radio-/Chemotherapie manifestieren, verbleibt aktuell die einzige definitive Therapieoption eine
Lungen-(-re-)transplantation.
Sekundäre Infektionen können die klinische Präsentation überlagern und damit auch die Diagnostik und eine Abgrenzung deutlich erschweren. Zur Routinediagnostik bei lungentransplantierten Patienten gehören Lungenfunktionstests, Computertomographie des Thorax und die Bronchoskopie. CLAD ist eine Ausschlussdiagnose, da z. B. infektiöse Veränderungen ähnliche Befunde aufweisen können. Radiologisch lassen sich typischerweise Bronchialwandverdickungen und Lufteinschlüsse im Sinne von Bronchiektasien und mitunter Schleimretentionen und Zeichen einer Pneumonie nachweisen (Vos R et al., 2015).
Die Frage wie viele Patienten ein BOS/RAS nach LuTx, HSCT bzw. Radio-/
Chemotherapie entwickeln ist Gegenstand aktueller Forschung. Hartert et al.
beschreiben, dass die BOS-Rate nach 1 Jahr nach LuTx bei 9,5% der Patienten liegt. Bei Langzeitüberlebenden liegt die BOS-Rate bei über 60% (Hartert M et al., 2014).
BOS nach einer allogenen HSCT kommt im Rahmen einer Lungenbeteiligung bei einer chronischen Graft-versus-Host-Erkrankung (cGvHD) zum Tragen. Hier liegt die Inzidenz eines BOS zwischen 1,7 bis 26%, wie Yoshihara et al. publizierten (Yoshihara S et al., 2007). Zu der Inzidenz von einem BOS nach Radiatio und/oder Chemotherapie liegen zum aktuellen Zeitpunkt keine gesicherten Studien vor.
In dieser Arbeit wird nicht nur die BO weiter beleuchtet, sondern auch die histologischen Veränderungen eines rCLAD/RAS weiter untersucht.
Die vorliegende Studie nutzt sowohl krankes als auch gesundes humanes Lungenmaterial (s. Kapitel 2: Material und Methoden). Somit können direkt am betroffenen Patientenmaterial Vergleiche gezogen werden. Man kann zudem auf noch unzureichend repräsentative Tiermodelle verzichten. Der aktuelle Stand der Tiermodelle für CLAD wurde von Lama et al. kürzlich prägnant zusammengefasst (Lama VN et al., 2017):
6
Heterotope Tracheatransplantmodelle (HTT)*
Vorteile: hoher Durchsatz, entwickelt okklusive Atemwegserkrankung mit möglicher aber ungewisser Entstehung von BO
Nachteile: ektopische Position ohne normale Atemluftumgebung, welche relevant ist für eine genuine BO-Entstehung
Orthotope Tracheatransplantmodelle (OTT)*
Vorteile: hoher Durchsatz in nativer Position mit normaler Luftbewegung sowie subepitheliale Fibrose der großen Atemwege
Nachteile: repräsentiert keine terminale Atemwegsobliteration im Sinne einer genuinen BO
Orthotope Lungentransplantmodelle*
Vorteile: kleine Atemwege mit Obliteration, ähnlich einer BO
Nachteile: BO-Läsionen mit variabler Penetranz abhängig von der Belastung und dem durchführenden Labor
Knochenmarktransplantationsmodelle*
Vorteile: hoher Durchsatz, BO im Rahmen einer GvHD wurde wiederholt beobachtet
Nachteile: BO mit sehr variabler Penetranz, Bronchusverengung eingeschränkt reproduzierbar
(*modifiziert nach Lama VN et al. 2017)
1.3 Diagnostischer Stellenwert der histopathologischen Untersuchung humaner Lungenbiopsien
Mittels Bronchoskopie können Biopsien zur weiteren diagnostischen Abklärung entnommen werden. Die subtotale oder totale obliterierende Fibrose der Bronchioli ist das typische histomorphologische Korrelat des BOS. Dabei ist nur ein Teil der distalen Bronchioli betroffen, während die großen Bronchien in den allermeisten Fällen nicht in die Umbauvorgänge einbezogen sind. Das Problem bei der Diagnostik ist daher, dass eine transbronchiale Biopsie, die ja via die großen Bronchien entnommen wird, häufig betroffene Bronchioli nicht miterfasst. Auch wenn klinisch ein BOS vorliegt, kann die Histologie deshalb ein falsch-negatives Ergebnis liefern bzw. es lassen sich keine fibrotischen Obliterationen in der Biopsie sichern, wobei diese aber in weiter peripher gelegenen Lungenabschnitten, diskontinuierlich verteilt,
7 vorhanden sind. Die BO-Areale zeigen eine Vermehrung von Histiozyten/Makrophagen, Lymphozyten und Fibroblasten/Myofibroblasten sowie eine Deposition von extrazellulärer Matrix. Reste des bedeckenden respiratorischen Epithels können noch darstellbar sein, aber bei einer vollständigen Obliteration sind diese oft nicht mehr sicher nachweisbar. Mittels Bindegewebsfärbungen, z. B. einer Elastika-van-Gieson-Färbung, kann das Fasergerüst des ehemals belüfteten Bronchiolus abgegrenzt werden. Die distalen Lungenabschnitte können sekundäre chronisch-entzündliche und/oder floride-entzündliche Veränderungen zeigen.
Die fibroelastotischen Veränderungen bei rCLAD/RAS ähnlich einer iPPFE unterscheiden sich von der BO im Wesentlichen darin, dass nicht primär die Bronchioli betroffen sind, sondern flächenhaft die Alveolen eine hyaline Verfaserung aufweisen. Bei typischen BO-Läsionen sind die angrenzenden Alveolen weitgehend intakt. Es handelt sich dabei allerdings nicht um vollkommen getrennte histopathologische Veränderungen, weil BO-Läsionen auch begleitend zu fibroelastotischen Veränderungen bei rCLAD/RAS ähnlich einer iPPFE vorkommen können. Zur Histopathologie beider Veränderungen siehe Anhang, Abbildung 1 in der angehängten Originalpublikation (Jonigk D*, Rath B* et al., Journal of Pathology (Clinical Research), 2016.
8 1.4 Fragestellungen
Ziel der vorliegenden Arbeit war eine vergleichende Analyse der molekularpathologischen Genexpressionsprofile von fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierten Genen innerhalb von oCLAD/BOS und rCLAD/RAS nach Lungen- und Stammzelltransplantation (HSCT) sowie nach Radio-/Chemotherapie und bei iPPFE.
Die Fragestellungen lauten im Einzelnen:
Sind die histomorphologisch ähnlichen Lungenveränderungen (BO-Läsionen) bei oCLAD/BOS, nach Radiatio/Chemotherapie und bei GvHD nach HSCT auch molekular identisch?
Sind die histomorphologisch ähnlichen fibroelastotischen
Lungenveränderungen bei rCLAD/RAS, iPPFE sowie nach HSCT auch molekular identisch?
Lassen sich von den molekularen Profilen Rückschlüsse auf die Genese des fibrotischen Lungenumbaus ziehen?
9 2. Material und Methoden
2.1 Patientenkollektive und Gewebeproben
Die in gepuffertem Formaldehyd fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben wurden aus dem Archiv des Institutes für Pathologie (Medizinische Hochschule Hannover/MHH) entnommen. Die retrospektive Analyse wurde von der Ethikkommission der MHH genehmigt (Ethikvotum E2050-2013).
Es wurden insgesamt 63 Lungenexplantate nach Lungen(-re-)transplantation von vier verschiedenen Patientengruppen sowie 19 Kontrollgewebe untersucht (s.
Tabelle 1):
Lungen im Endstadium, explantiert nach Retransplantation, mit manifestem CLAD und obstruktiven oder restriktiven funktionellen Veränderungen (n=22;
oCLAD/BOS=14, rCLAD/RAS=8)
o Klinisch BOS, mikroskopisch BO ohne fibroelastotische Veränderungen o Klinisch rCLAD/RAS, mikroskopisch BO und in der Umgebung fibroelastotische Veränderungen ähnlich einer PPFE mit intraalveolär kollagener Obliteration mit wenig oder keiner begleitenden zellulären Inflammation
Lungen im Endstadium mit prominentem fibrotischem Umbau und manifesten und irreversiblen obstruktiven und restriktiven funktionellen Veränderungen nach HSCT (n=29)
o In allen Fällen BO mit zusätzlichen fibroelastotischen Veränderungen.
Lungen im Endstadium mit prominentem fibrotischem Umbau nach Radio- und/oder Chemotherapie (n=6)
o In allen Fällen BO ohne fibroelastotische Veränderungen
idiopathische pleuroparenchymale Fibroelastose (iPPFE, n=6) o in allen Fällen mit fibroelastotischen Veränderungen
Kontrollen: „downsizing“-Präparate von Spenderlungen ohne fibrotischen Umbau, entnommen vor Lungentransplantation (n=19)
10 Gruppe
(n, ♀/♂)
Durchschnittsalter (Minimum-Maximum, Standardabweichung) bei LuTx in Jahren
Durchschnittsalter (Minimum-Maximum, Standard-
abweichung)
bei Re-LuTx in Jahren
Durchschnittliche Zeit (Minimum- Maximum,
Standard- abweichung)
zwischen LuTx und Re-LuTx in Tagen oCLAD/
BOS (14, 10/4)
35,9
(17-55; ±12,3)
38,7
(20-57; ±12,1)
921
(473-2183; ±472)
rCLAD/RAS (8, 6/2)
34,6
(17-56; ±15,4)
36,7
(22-57; ±13,9)
2109
(730-3170; 9±28) HSCT
(29, 11/18)
30,5
(8-57; ±13,5)
- -
RC (6, 3/3)
26,2
(17-39; ±9,0)
- -
iPPFE (6, 4/2)
50,3
(39-61; ±8,8)
- -
2.2 Laser-Mikrodissektion
FFPE-Proben wurden in Form 5 µm dicker Schnitte auf Molecular Machine Industries (MMI)-Membranobjekträger aufgezogen (MMI CellCut Plus System, Eching, Deutschland) und nachfolgend mit einer mit Xylol beginnenden absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert und nach einem Wasserbad mit gefiltertem Hämalaun gefärbt. Anschließend an die Trocknung der Schnitte folgte die kompartimentenspezifische Laser-assistierte Mikrodissektion (MMI CellCut Plus System, Eching, Deutschland). Das Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.
Tabelle 1: Charaktersitika des untersuchten Patientenkollektivs
Abkürzungen: Lungentransplantation (LuTx), obliterierende/restriktive chronische Lungentransplantdysfunktion (rCLAD/RAS; oCLAD/BOS), hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSCT), Radio-/Chemotherapie (RC; 1/6 Radiotherapie, 1/6 Chemotherapie, 4/6 kombinierte RC), idiopathische pleuroparenchymale Fibroelastose (iPPFE).
12 Untersuchungen durchgeführt. Hierbei wurden Proben eines männlichen Empfängers bei einer weiblichen Lungenspenderin ausgewählt.
Die FISH-Untersuchung ist eine molekularzytogenetische Untersuchung mit deren Hilfe Bereiche des Genoms farbig markiert werden können. Es kam eine X/Y- Chromosomen-FISH-Sonde (Zytomed Systems GmbH, Berlin, Deutschland) zum Einsatz. 5 µm dicke Gewebeschnitte wurden auf SUPERFROST® PLUS- Objektträgern (Menzel-Gläser, Thermo SCIENTIFIC) aufgezogen und entparaffiniert.
Anschließend folgte eine Vorbehandlung mit Citratpuffer und einer Pepsin-Lösung.
Die Objektträger wurden nach einer aufsteigenden Alkoholreihe mit Ethanol getrocknet und anschließend wurde die lichtempfindliche Sonde aufpipettiert und der Schnitt im StatSpin® ThermoBriteTM Modell S500 (ABBOT MOLECULAR) inkubiert.
Schließlich wurde das Präparat gewaschen und eingedeckelt.
2.5 Quantifizierung des Elastins
Die histopathologische Bewertung der Proben und die semiquantitative Abschätzung des Elastingehalts wurden entsprechend der von Kellner et al. beschriebenen Methode durch stereologisches „point counting“ durchgeführt (zu den Ergebnissen s.
Abbildung 4) (Kellner M et al., 2012).
2.6 Datenanalyse und Statistik
Die Genexpressionswerte wurden als relative Expression auf den Wert des endogenen Kontrollgens DNA‐directed RNA polymerase II subunit RPB1 (POLR2α) mittels der ΔCt-Methode als relative Expression normalisiert (Formel: ΔCt=CtZielgen- CtPOLR2α, relative Expression=2(-(CtZielgen-CtPolr2α))). Als statistischer Test zum Gruppenvergleich für die ungepaarten Werte wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Testergebnisse mit p<0,05 wurden als statistisch signifikant gewertet. Die paarweisen Gruppenvergleiche erfolgten unter explorativen Gesichtspunkten, es erfolgte keine Korrektur für multiples Testen. Die Datenaufbereitung erfolgte mittels Microsoft EXCEL (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) und die statistische Analysen wurden mittels Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) auf einem IBM-kompatiblen PC unter Windows 7 (Microsoft Corporation) durchgeführt.
13 3. Ergebnisse
3.1 Ergebnisse der konventionellen Histopathologie
Für die verschiedenen Patientengruppen wurden molekularpathologische und histopathologische Befunde verglichen. Diese werden in der Folge ausgeführt.
In BOS-Patienten wurden erwartungsgemäß prominente BO-Läsionen in Abwesenheit anderer Formen der parenchymalen Fibrose identifiziert.
In Lungenexplantaten von rCLAD/RAS-Patienten wurden drei unterschiedliche Bereiche identifiziert: Es fanden sich (i) Bereiche mit intraalveolärer kollagener Obliteration ohne oder mit geringer begleitender Entzündung. Weiterhin fanden sich vermehrt elastische Fasern in den ehemaligen Alveolarwänden, im Sinne von einem voll entwickelten Muster des fibroelastotischen Umbaus wie bei einer PPFE (FE- Muster) (s. Abbildung 3). Diese FE-Areale waren in den Lungen ungleich verteilt und betrafen - neben den (sub-) pleuralen - Bereichen, auch die paraseptalen und zentrolobulären Areale des Lungenparenchyms. Zusätzlich fanden sich in diesen Bereichen in jedem analysierten rCLAD/RAS-Patienten auch zahlreiche BO- Läsionen.
Neben diesen fanden wir in Form eines abrupten Übergangs von FE-Arealen (ii) Bereiche mit fibrinreichem Exsudat (Stadium "akuter Alveolarschaden").
Wiederum fanden sich in unmittelbarer Nähe von diesen zwei beschriebenen Arealen, (iii) Kompartimente mit dichten intraalveolären Makrophagenaggregaten, die die Alveolen in einem DIP-ähnlichen Muster“ (makrophagenreichen, „vergebliches Auflösungs"-Stadium) ausfüllten.
14
Abbildung 3: 1) Voll entwickeltes FE-Stadium mit intraalveolärer Obliteration mit spärlicher Inflammation und deepithelisalisierten Alveolarwänden sowie prominenter Elastose, 2) Voll entwickeltes FE-Muster (links) neben einer BO-Läsion (rechts) in einer rCLAD/RAS-Lunge, (Originalabbildungen).
In Lungen von Patienten nach HSCT konnten – im Gegensatz zu Patienten mit Zustand nach LuTx – in allen Fällen ein FE-Muster sowie Fibrin und ein makrophagenreiches Resorptionsstadium (MO-Stadium) und begleitende BO- Läsionen nachgewiesen werden.
Lungen mit Behandlung nach Radio- und/oder Chemotherapie) zeigten prominente BO-Läsionen ohne FE-Muster, während iPPFE-Lungen alle histologischen Merkmale im Zusammenhang mit der FE-Entwicklung, aber in Abwesenheit von BO-Läsionen, aufwiesen.
Zusätzlich fanden wir durch eine semiquantitative stereologische Auszählung (s.
Abbildung 4) in allen Formen der FE- Veränderungen stark erhöhte Elastinmengen, nicht nur in FE-typischen Stadien, wo sich erwartungsgemäß das meiste Elastin fand, sondern auch im Stadium "akuter Alveolarschaden" und in histiozytendominierten Arealen. Es sollte beachtet werden, dass keine Unterschiede bezüglich des Elastingehalts zwischen rCLAD/RAS, HSCT oder iPPFE beobachtet werden konnten.
Abbildung 5: Relative Elastinmenge in allen Formen der FE-Veränderungen
1 2
15 3.2 CLAD-Unterformen und Auswertung
Als nächstes wurden die Expressionsmuster fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierter Gene in verschiedenen histopathologischen Korrelaten von Lungenfunktionsstörungen, welche auf fibrotischen Umbau zurückzuführen sind, analysiert: BO in oCLAD/BOS-Lungen und BO und FE-Veränderungen in rCLAD/RAS-Lungen. Die Ergebnisse dieser Analysen wurden mit Patienten mit pulmonalen Komplikationen (oCLAD/BOS und rCLAD/RAS) nach HSCT, RC und mit iPPFE verglichen (s. Abbildung 5)
Weiterhin wurden die unterschiedlichen Stadien des FE-Musters (ein fibrinreiches Anfangsstadium (Fibrin), ein MO-Stadium und ein vollständig manifestiertes FE- Muster (s. Abbildung S2 in der Originalpublikation) auf molekularer Genexpressionsebene untersucht.
Die Analyse von BO-Läsionen in explantierten Lungen mit den Diagnosen oCLAD/BOS, Zustand nach HSCT bzw. RC, ergab nahezu identische Expressionsprofile von 26 fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierten Genen, mit der Ausnahme von Bone Morphogenetic Protein (BMP2), welches in der RC-Gruppe nicht signifikant hochreguliert war (vgl. Abbildung 5, Spalten 1, 4 und 7).
Im Gegensatz dazu, zeigten BO-Läsionen in rCLAD/RAS-Lungen ein gänzlich anderes Expressionsmuster, obwohl sie histomorphologisch nicht von denen in BOS- Patienten zu unterscheiden waren. Sie teilten die Aufregulation der Hälfte der Zielgene, aber zeigten keine vermehrte Expression des CC-Chemokins 5 (CCL5), CXC-Motiv-Chemokins 12 (CXCL12), Forkhead Box Proteins P3 (FOXP3), der Matrix Metalloproteinase 9 (MMP9), des Urokinase Plasminogen Aktivator Oberflächen Rezeptors (PLAUR) und des Plasminogen-Aktivator-Inhibitors 1 (SERPINE1).
Stattdessen fand sich eine reduzierte Genexpression vom knochenmorphogenetischen Protein 2 (BMP2), gewebsspezifischen Plasminogenaktivator (PLAT) und transformierenden Wachstumsfaktor‐beta Rezeptor Typ‐2 (TGFBR2) (vgl. Abbildungen 5). Interessanterweise ist dieses Profil dem Expressionsmuster der FE-Veränderungen in rCLAD/RAS-Lungen sehr ähnlich (vgl. Abbildung 5, Spalte 2 und 3). Des Weiteren wiesen fibrinreiche und histiozyten-dominierte Alveolen reduzierte Mengen exprimierter Gene auf im Vergleich zu FE-Bereichen (s. Abbildung S2 in der Originalpublikation).
16
Abbildung 5: Ergebnisse der analysierten fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierten Gene
Aufregulierte Gene sind in grün, nicht differentiell regulierte Gene in gelb und herunterregulierte Gene in rot im Vergleich zu gesunden Kontrolllungen dargestellt. Alle Genexpressionen wurden gegen die korrespondierenden gesunden Kontrolllungen ausgewertet. Angegeben sind die p-Werte des Mann-Whitney-U-Tests (Originalabbildung).
Gennamen:
Knochenmorphogenetisches Protein (BMP1, 2, 4), CC-Chemokin 5 (CCL5), Kollagene (COL1A2, COL3A1, COL4A1), CXC-Motiv-Chemokin 12 (CXCL12), CXC-Motiv- Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), Forkhead Box Protein P3 (FOXP3), Lysyloxidase (LOX), Matrix Metalloproteinasen (MMP1, MMP2, MMP9, MMP11, MMP14), Gewebsspezifischer Plasminogenaktivator (PLAT), Urokinase Plasminogen Aktivator Oberflächen Rezeptor (PLAUR), Prokollagen‐Lysine, 2‐Oxoglutarate 5‐Dioxygenase 2 (PLOD2), Plasminogen- Aktivator-Inhibitor 1 (SERPINE1), „Mothers against decapentaplegic homolog 1“ (SMAD family member 1) (SMAD1), Transformierender Wachstumsfaktor-beta‐1 (TGFB1), TGF‐ beta Rezeptor Typ‐2 (TGFBR2), Thrombospondin‐1 (THBS1), Metalloproteinase-Inhibitor (TIMP1, TIMP2)
17 In fibrinhaltigen Alveolen zeigte sich eine Aufregulation von Lysyloxidase (LOX), Matrix Metalloproteinase 2 (MMP2) und Metalloproteinase-Inhibitor 1 (TIMP1). In Alveolen angefüllt mit Makrophagen wurde eine CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4)-Aufregulation gefunden. Schließlich waren FE-Bereiche BO-Bereichen molekular ähnlich, gekennzeichnet durch Aufregulation von 12 Genen (vgl.
Abbildung 5, Spalte 2 und 3). Im Gegensatz zur BO zeigten die FE-Veränderungen jedoch keine Aufregulation vom knochenmorphogenetischen Protein 1 (BMP1) und keine transformierender Wachstumsfakor-beta‐1 (TGFB1)-Expression, aber stattdessen eine Aufregulation von FOXP3, SERPINE1 und „Mothers against decapentaplegic homolog 1“ (SMAD family member 1) (SMAD1), während Prokollagen‐Lysine, 2‐Oxoglutarate 5‐Dioxygenase 2 (PLOD2) herunterreguliert war (s. Abbildung 5 und Abbildung S2 in der angehängten Originalpublikation).
In Lungen von Patienten mit Zustand nach HSCT waren die Expressionsprofile von BO und FE-Arealen gering different im Vergleich zu CLAD-Lungen: HSCT- Lungen wurden entweder charakterisiert durch ein alleinig vorkommendes FE-Muster oder ein FE-Muster in Kombination mit BO-Läsionen. Interessanterweise kamen BO- Läsionen ohne gleichzeitige FE-Veränderungen nie in dem von uns analysierten Patientenkollektiv vor. Wir fanden, dass das Genexpressionsprofil von BO-Läsionen in HSCT-Lungen eher dem Expressionsmuster von oCLAD/BOS-Lungen statt dem rCLAD/RAS-Lungenmuster ähnelte (vgl. Abbildung 5, Spalte 1 und 4). Im Gegensatz dazu ähnelt das Genexpressionsprofil von FE-Veränderungen in HSCT- Lungen dem Genexpressionsprofil von FE-Veränderungen in rCLAD/RAS-Lungen (vgl. Abbildung 5, Spalte 3 und 5). In Bezug auf die initiale Phase des FE-Umbaus in Lungenexplantaten von Patienten mit Zustand nach HSCT wurde das Fibrin- Stadium durch eine Aufregulation von Kollagenen wie Collagen Alpha-2-Typ-I- Kollagen, Alpha-1-Typ-III-Kollagen und Alpha‐1-Typ-IV-Kollagen (COL1A2, COL3A1 und COL4A1), sowie Metalloproteinase-Inhibitor 2 (TIMP2) und eine verminderte Genexpression von PLOD2 charakterisiert (Abbildung S2 in der angehängten Originalpublikation).
18 3.3 Vergleich der molekularpathologischen Ergebnisse der iPPFE im
Vergleich zu fibroelastotischen Veränderungen in rCLAD/RAS-Lungen
Die molekulare Signatur der idiopathischen Form der PPFE stimmte ganz überwiegend mit dem molekularen Profil von FE-Veränderungen in rCLAD/RAS- Lungen überein; mit Ausnahme der Gene BMP1, CCL5, CXCL12 und FOXP3, welche in der iPPFE, nicht aber in anderen Formen von FE-Mustern aufreguliert waren.
3.4 Ergebnisse der exemplarischen X/Y-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
Es konnte mittels X/Y-FISH-Untersuchungen gezeigt werden, dass die intraalveolären Makrophagen sowie die vorhandenen (Myo-) Fibroblasten in der darstellbaren Fibrose im weit überwiegendem Teil rote (Y-Chromosom) und grüne (X-Chromosom) Signale aufwiesen, sodass zu schlussfolgern ist, dass der fibrotische Umbau im weiblichen Transplantat von Zellen des männlichen Empfängers dominiert wurde.
Abbildung 3: Visualisierung der FISH-Untersuchungsergebnisse 1) Lungentransplantat eines weiblichen Spenders und eines männlichen Empfängers mit fibroelastotischem Umbau; ortsständige Alveolarepithelzellen (Pfeile) zeigen zwei grüne FISH-Signale, korrespondierend zu zwei X- Chromosomen. Prominente Elastose der Alveolarwand (rechts im Bild) mit starker Autofluoreszenz des Elastins. 2) Dichte intraalveoläre Infiltrate der vom männlichen Empfänger stammenden Makrophagen (Y-Chromosomen in rot, X-Chromosomen in grün markiert). 3) Vom männlichen Empfänger stammende intra-alveoläre (Myo-) Fibroblasten, die von dichter extrazellulärer Matrix in Arealen vollausgebildeter AFE umgeben sind (Y-Chromosomen in rot, X-Chromosomen in grün markiert).
3.5 Ergebnisse der ergänzenden Immunhistochemie
Da die mRNA-Expression aufgrund der post-transkriptionellen Regulierung mit der tatsächlichen Proteinexpression nicht direkt gleichgesetzt werden kann, wurden die
1 2 3
19 PCR-Ergebnisse mittels ergänzender Immunhistochemie überprüft (s. Tabelle S2 in der angehängten Originalpublikation). Wir konnten starke immunhistochemische Positivität für MMP9 und PLAT in Makrophagen bei BO-Läsionen und schwache Positivität von Makrophagen in FE-Mustern darstellen, während Makrophagen, sowohl in BO-Läsionen als auch in den FE-Mustern, starke Positivität für MMP2 und Matrix Metalloproteinase 11 (MMP11) zeigten.
20 4. Diskussion
4.1 Molekulare Unterschiede zwischen Bronchiolitis obliterans, idiopathischer pleuroparenchymaler Fibroelastose und fibroelastotischen pulmonalen Veränderungen
In der vorliegenden Arbeit wurden die architektonischen Veränderungen und molekularen Muster von Patienten mit chronisch-fibrosierenden Läsionen untersucht.
Dabei wurde das Genexpressionsprofil von 45 fibrose, umbau- und abstoßungsassoziierten Genen pro Probe analysiert.
Fibroelastotischer Umbau der kleinen Atemwege und Alveolen wird schon seit einem Jahrhundert als ein eher unspezifisches Korrelat pulmonaler Verletzungen und Umbauvorgängen betrachtet (Langstein A, 2015, Ofek E et al., 2013, Sato M et al., 2012, Yu J, 2015, Uhlving HH et al., 2015, Shino MY et al., 2013, Takeuchi Y et al., 2015). Die tatsächliche Einstufung dieser Veränderungen und die Zuordnung von histopathologischen Mustern zu spezifischen Krankheitsbildern, insbesondere im Bereich der Transplantation, begannen jedoch erst kürzlich (Sato M et al., 2011) Während BO und das klinische Korrelat BOS seit einiger Zeit gut erforscht sind, wurden erst 2003 klinische Berichte über pulmonale Dysfunktion mit Anzeichen einer Lungenoberlappenfibrose von LuTx- (Konen E et al., 2003 und Pakhale SS et al., 2005) und HSCT-Patienten (Parish JM et al., 2003) veröffentlicht. Ungefähr zur selben Zeit wurden die iPPFE und deren FE-Muster von Frankel et al. als eine neue Form der idiopathischen Lungenfibrose identifiziert und definiert (Frankel SK et al., 2004), wobei jedoch ein Teil der Patienten eine Krankheitsgeschichte mit einer vorausgegangenen Chemotherapie aufwiesen. Es dauerte fast ein weiteres Jahrzehnt bis die histologischen Parallelen zwischen iPPFE-, rCLAD/RAS- und HSCT-Patienten - nämlich histologische Veränderungen in Form eines FE-Musters - erkannt wurden (Ofek E et al., 2013, von der Thüsen JH et al., 2011). Von uns werden hier die FE-Veränderung zum ersten Mal grundsätzlich als eine Reaktion auf Verletzungsmuster auf der morphologischen und molekularen Ebene in jeglichen der bisher dargestellten klinischen Rahmen beschrieben, und ein schrittweiser Übergang von einer akuten Verletzungsphase zu einem bindegewebigen Umbauvorgang demonstriert.
21 Aus dieser molekularen Vergleichsstudie entstanden drei Kernaussagen:
1.) Vereinfacht gesagt, „BO ist BO“. Trotz der verschiedenen klinischen
Hintergründe, erschienen die Genexpressionsmuster der BO-Läsionen in allen Gruppen identisch. Jedoch mit einer Ausnahme: Einige Patienten entwickelten nach Lungentransplantation nur BO-Läsionen versus BO-Läsionen in Kombination mit einem FE-Muster. Während die erste Gruppe ein identisches Expressionsmuster in BO-Läsionen wie in stammzelltransplantierten Patienten und Radio-/Chemotherapie-Patienten aufwies, zeigten die anderen (BO und voll entwickeltes FE-Muster) molekulare Veränderungen, die mehr den Expressionsmustern eines voll entwickelten FE-Musters nach Stammzelltransplantation und iPPFE-Patienten ähnelten.
2.) "AFE ist AFE". In Lungen von Patienten mit eingeschränkter
Lungenfunktionsstörung nach LuTx (rCLAD/RAS) oder HSCT und in Lungen mit iPPFE, zeigten fibroelastotisch veränderte Bereiche weitgehend identische Expressionsmuster (vgl. Abbildung 5), die sich von den Veränderungen, die man in BO-Fällen sieht, unterschieden. Aufgrund der alveolären Lokalisation und Ähnlichkeiten der Genexpression wurde dieses Schädigungsmuster daher in der Folge erstmalig als Alveoläre Fibroelastose (AFE) bezeichnet. Ein Begriff, der derzeit Akzeptanz in der Fachwelt findet.
3.) Wenn eine AFE nach LuTx vorliegt, ist die begleitende BO durch eine AFE ähnliche molekulare Mikroumgebung gekennzeichnet: In Lungen von Patienten mit restriktiven Veränderungen der Lungenphysiologie nach LuTx (rCLAD/RAS) werden BO und AFE üblicherweise gemeinsam vorgefunden.
Bei diesen Patienten zeigte die Genexpression von BO-Läsionen und AFE auffallende Ähnlichkeiten. Insbesondere Gene, die in der AFE nicht aufreguliert oder sogar herunterreguliert waren, verglichen mit der BO, bezogen auf frühe Ereignisse in der Entwicklung von CLAD, waren in den beiden Systemen vergleichbar, z. B. BMP2, CCL5, CXCL12, MMP9, PLAT und TGF‐beta Rezeptor Typ‐2 (TGFBR2). Darüber hinaus wurde die Matrix Metalloproteinase 1 (MMP1), die nach LuTx und iPPFE in AFE aufreguliert war, in rCLAD/RAS BO ebenfalls als aufreguliert gemessen im Unterschied zu einer BO, die nach HSCT oder RC entsteht (s. Abbildung 6 und Abbildung S2 in der Originalpublikation).
22 Somit weist das voll entwickelte AFE-Stadium Ähnlichkeiten mit BO-Läsionen in der Genexpression auf, insbesondere in Bezug auf die Gene, die am späten fibrotischen Reifungsprozess beteiligt sind, wie zum Beispiel dem knochenmorphogenetischen Protein 4 (BMP4). Dieses Mitglied der TGF-beta-Superfamilie wurde kürzlich von Jonigk et al. als verlässlicher Marker und Indikator für die BOS-Entwicklung in humanen Transbronchialen Biopsien (TBB) beschrieben (Jonigk D et al., 2015) und wird derzeit in einer prospektiven klinischen Studie zusammen mit dem TGF-beta- Aktivator Thrombospondin 1 (THBS1) als Marker für die Vorhersage von BOS getestet. BMP4 wirkt jedoch auf verschiedene Arten bei Lungenerkrankungen;
BMP4-induzierte und MMP-vermittelte Effekte auf die Homöostase des Weichgewebes, die Hemmung der Proliferation und Differenzierung von Epithelzellen sowie die Regulation des extrazelluläre Matrix-Remodelings (ECM-Remodeling) wurden beschrieben (Pegorier S et al., 2010, Molloy EL et al., 2008) und all diese hängen von der BMP4-Konzentration und dem Dimerisierungsstatus ab.
In Nieren wurde die Transformation von Fibroblasten zu aktiven Myofibroblasten in einem chronischen Allotransplantat-Nephropathie-Modell gezeigt und dargelegt, dass die konsekutive Ablagerung von extrazellulärer Matrix (ECM) über BMP4/7 in einem Aktivin-Rezeptor-ähnlichen Kinase 1 (ALK1)/„Mothers against decapentaplegic homolog 1/5“ (SMAD1/5)-abhängigen Weg gehemmt wird (Pegorier S et al., 2010, Molloy EL et al., 2008, Suzuki T et al., 2014, Muñoz-Felix JM et al., 2013). Wenn die Aufregulation von BMP2 und 4, nicht jedoch von BMP7 beobachtet wird, könnte dies bedeuten, dass die Inhibitionsaktivität von BMP4/7 verloren geht. Dieses geschieht vermutlich über den TGF-beta-Signalweg mit anschließender Phosphorylierung von SMADs, was durch BMP-Rezeptorkinasen zur ECM-Produktion und damit zu bindegewebigem Remodeling führt (Pegorier S et al., 2010). Ebenso ist die relative Reduktion von BMP7 im Vergleich zu BMP4 in Übereinstimmung mit dem vollständigen Verlust von Epithelstrukturen in voll entwickelter AFE, da BMP7 bekanntlich regenerative Wirkungen auf Epithelien ausübt und epithelial- mesenchymale Transition (EMT) inhibiert (Buijs JT et al., 2007, Zeisberg M et al., 2003). Darüber hinaus kann SMAD1, das in rCLAD/RAS, AFE und iPPFE aufreguliert ist, auch die Fibrogenese beeinflussen, indem es direkt an den TGF- beta-Rezeptor ALK1 bindet und anschließend profibrotische Gene aufreguliert.
23 Es gibt jedoch auch deutliche Unterschiede zwischen BO- und AFE- Genexpressionsmustern. Diese sind insbesondere auf der Ebene der ECM- Degradation offensichtlich: BO-Läsionen sind gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Aufregulation von Kollagenmatrix-abbauenden Enzymen, z.B. MMP2, 9, 11, 14 und BMP1 sowie fibrinabbauende Enzyme wie PLAT, MMP9 und PLAUR. Im Gegensatz dazu konnte im AFE-Muster unabhängig vom klinischen Hintergrund (rCLAD/RAS, HSCT, iPPFE) keine Expression von fibrinolyseassoziierten Genen nachgewiesen werden, während in rCLAD/RAS, AFE und iPPFE eine Aufregulation von Matrix Metalloproteinase 1 (MMP1) beobachtet wurde. Dies ist von Interesse, da die Herunterregulierung von MMP1 ein wichtiger Schritt in der Endphase der Wundheilung ist, während seine konstitutive Expression oder Aufregulation in anhaltenden Wunden und idiopathischer Lungenfibrose (IPF) gefunden wird. MMP1 ist über intrazelluläre Aktivität an Zellteilung, Migration, Differenzierung und Apoptose beteiligt. In unseren eigenen gewebebasierten molekularen Expressionsanalysen konnten wir im Gegensatz zu bronchoalveolären Lavage (BAL)-Analysen eine Aufregulation von MMP1 in TBB von oCLAD/BOS-Patienten nachweisen (Jonigk D et al., 2011a, Heijink IH et al., 2015, Taghavi S et al., 2005). Über Kompartimenten- spezifische molekulare Expressionsanalysen wurde MMP1 noch spezifischer in AFE- Bereichen nachgewiesen.
Als Folge der Morphologie und der molekularen Daten von explantiertem Lungengewebe wird hier und durch andere (Ofek E et al., 2013, Takeuchi Y et al., 2015, Hirota T et al., 2015) eine phasenweise Progression von AFE in rCLAD/RAS, HSCT und iPPFE nahegelegt (s. Abbildung 7) und drei verschiedene Phasen der AFE-Entwicklung vorgeschlagen:
1.) Das "Fibrin-Stadium": Hier sind die Alveolen mit fibrinreichem Exsudat gefüllt.
Exsudate dieser Art werden häufig bei einer Vielzahl von Lungenerkrankungen (wie dem diffusen Alveoläreschaden (DAD), der akuten fibrinösen organisierenden Pneumonie (AFOP) usw.) als Antwort auf Epithelschäden gefunden (Ofek E et al., 2013, Alici IO et al., 2015, Sato M et al., 2012, Pakhale SS et al., 2005). Idealerweise wird Fibrin schnell proteolysiert und anschließend von ortsständigen Makrophagen resorbiert, was zu einer vollständigen Remission führt. Trotz einer offensichtlichen makrophagenassoziierten Auflösung von fibrinösen Ablagerungen wurde keine
24 Aufregulation von fibrinolytischen Enzymen, z. B. PLOD2, PLAUR oder MMP9 gemessen, was einen alternativen Weg der Fibrinauflösung anzeigt.
Interessanterweise wurde dieses Fibrinstadium bei den untersuchten Patienten bereits von einer erhöhten Menge an elastischen Fasern in den Alveolarwänden begleitet (s. Abbildungen 7). In diesem Zusammenhang haben „Tissue- Engineering“-Experimente gezeigt, dass Fibrozyten oder embryonale glatte Muskelzellen einen starken Anstieg der Expression von elastischen Fasern zeigen, wenn sie Fibringelen (Long JL et al., 2003) ausgesetzt sind. Dies könnte darauf hinweisen, dass der Fibrinstatus in AFE nicht so kurz ist, wie erwartet und folglich der verlängerte Kontakt der deepithelisierten Alveolarzellen mit Fibrin zu einer erhöhten Synthese und Ablagerung von Elastin beiträgt. Darüber hinaus führt die beeinträchtigte Luft-Flüssigkeits Interphase höchstwahrscheinlich auch zu einer erhöhten Scherspannung, was wiederum bekanntlich eine erhöhte Elastin- Expression erleichtert. Die tatsächliche Ursache für die fehlerhafte Auflösung muss jedoch noch weitergehend bestimmt werden. Es ist allerdings bekannt, dass Polymorphismen in Genen von Proteinasen wie MMPs, die zu einer verminderten MMP-Expression oder Aktivität führen, Risikofaktoren für das Auftreten von fibrotischen Lungenerkrankungen wie CLAD, idiopathischer Lungenfibrose oder Pneumokoniose (Vos R et al., 2015, Ji X et al., 2015, Mashimo Y et al., 2016) sind.
2.) Das „histiozytische Stadium": Neben Bereichen des Fibrinstadiums und vollständig entwickelter AFE, fanden sich Areale des Alveolarparenchyms, die durch dichte intraalveoläre Aggregate von Makrophagen in einem diffusen interstitiellen Pneumonie (DIP)-ähnlichen Muster, gelegentlich mit einigen begleitenden Resten von Fibrin, auffielen. Die Mehrheit dieser Zellen wurde von dem Empfänger abgeleitet, was durch eine XY-Chromosomen-FISH-Analyse nachgewiesen wurde.
Diese Bereiche zeigten auch einen weiteren Anstieg der Elastinfasern in den Alveolarwänden, eine Aufregulation von CXCR4 und interessanterweise keine Anzeichen für eine relevante fibrinolytische Genexpression. Es ist bekannt, dass es alternative, nicht-proteolytische Mechanismen für die Verdauung von Fibrin (Miles LA et al., 2016) gibt. Es ist jedoch unklar, wie diese alternative Clearance das Phagozytenverhalten beeinflusst, insbesondere in Bezug auf die pro-fibrotische Signalgebung, da auch eine umschriebene Akkumulation von Fibroblasten naturgemäß eine Erhöhung der Kollagenexpression bedeutet.
3.) Die voll entwickelte AFE-Phase: Kennzeichen dieser Phase sind erhöhte Mengen an
25 ECM, die das Alveolarlumen ausfüllen, einige inkorporierte Myofibroblasten, die von dem Empfänger stammen (wie durch XY-Chromosomen-FISH gezeigt, s. o.), und eine abnehmende Anzahl von lokalen Entzündungszellen/Histiozyten. An diesem Punkt ist das Genexpressionsmuster durch Aufregulation und Überexpression in den Resten der vorbestehenden Alveolarwände von Kollagenen und Kollagen- Remodeling-Enzymen, wie MMP11 und 14, sowie regulierenden Faktoren wie TIMP1 charakterisiert.
Abbildung 7: Morphologische und molekulare Entwicklungsstadien der alveolären Fibroelastose.
Schematischer Überblick über die vorgeschlagenen Entwicklungsstadien des alveolären fibroelastotischen Remodelings von frühen bis späten Ereignissen und entsprechenden histopathologischen Bildern. Die grauen Kästchen zeigen die analysierten Gene in Verbindung mit ihren jeweiligen Funktionen im Zusammenhang mit der alveolären Fibroelastose an; Eine frühe Schädigung mit oder ohne Beteiligung von Allo- und/oder Autoimmuneffekten, gefolgt von fibrinreichen Exsudaten im Alveolarlumen (Fibrinstadium) führt zu einer atypischen Auflösung des Fibrins durch Makrophagen (Histiozytosestadium) und schließlich zu einer vollständig remodellierten alveolären Fibroelastose, Originalabbildung.
Gennamen und Abkürzungen zu Abbildung 7: Knochenmorphogenetisches Protein (BMP1, 2, 4), CC-Chemokin 5 (CCL5), Kollagene (COL1A2, COL3A1, COL4A1), CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), CXC-Motiv-Chemokin 12 (CXCL12), Forkhead Box Protein P3 (FOXP3), Lysyloxidase (LOX), Matrix Metalloproteinasen (MMP1, 2, 9, 11, 14), Metalloproteinase-Inhibitor (TIMP1, 2), Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (SERPINE1), Prokollagen-Lysin, 2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase (PLOD2), Thrombospondin 1 (THBS1), Gewebsspezifischer Plasminogenaktivator (PLAT), Transformierender Wachstumsfaktor-beta‐1 (TGFB1), TGF‐beta Rezeptor Typ‐2 (TGFBR2), Urokinase Plasminogen Aktivator Oberflächen Rezeptor (PLAUR), Epitheliale/Endotheliale zu Mesenchymale Transition (EMT), Extrazelluläre Matrix (ECM)
26 Basierend auf diesen Ergebnissen wird von uns ein dreistufiges Evolutionsmodell der AFE vorgeschlagen (Jonigk D, Rath B et al., 2016). Zunächst dominierte ein fibrindominantes primäres akutes Verletzungsmuster, das möglicherweise durch eine allo-/autoimmune Reaktion bei transplantierten Patienten ko-ausgelöst wurde. Bei einem fehlgeleiteten Auflösungsversuch ohne Aktivierung von fibrinolytischen Genen (z.B. PLAUR, PLOD2 und MMP9) schreitet der fehlerhafte Heilungsprozess zu einem zweiten, Histiozyten-dominierten Stadium voran. Möglicherweise ausgelöst durch Makrophagen-abgeleitete profibrotische Signalgebung über Rekrutierung und Aktivierung von (Myo-) Fibroblasten, wird das dritte Stadium erreicht, das von ECM- Produktion mit intraalveolärer obliterierender Kollagenablagerung, Verlust der Epithelschicht und Fibroelastose der Alveolarwand dominiert wird. Diese einzelnen Stadien des Remodelings sind durch entsprechende molekulare Profile gekennzeichnet und, wie wir und andere gezeigt haben, ist dieses gefolgt von einem kontinuierlichen Anstieg der Elastinablagerung (Kokosi MA et al., 2016).
Diese molekularen Daten zeigen, dass das bindegewebige Remodeling in der Lunge, ob als BO oder als AFE, eher unspezifische Verletzungsmuster darstellt, die durch verschiedene äußere Reize ausgelöst werden können. Die Kombination von Morphologie und molekularen Daten legt einen alternativen Mechanismus der Fibrineliminierung über Makrophagen nahe, in Abwesenheit von klassischen fibrinolytischen Enzymen nach lokaler Verletzung, welches ein möglicher Grund für die fehlgeschlagene Heilung nach einer akuten Lungenverletzung sein könnte. So kann eine profibrotische Kaskade mit bindegewebigem Remodeling bei einem abweichenden Reparaturversuch ausgelöst werden, was letztlich zu einer restriktiven Lungenfunktionsstörung und zum Tod des Patienten führt (Jonigk D, Rath B et al., 2016).
Diese Daten können als diagnostische Hilfsmittel dienen und dazu beitragen, den klinischen Verlauf der Atemfunktionsstörungen nach Lungen- und Stammzelltransplantation genauer vorherzusagen. Darüber hinaus könnte eine detailliertere Analyse des fehlgeleiteten Mechanismus der Fibrinolyse und der damit verbundenen Fibrogenese potentielle therapeutische Ziele aufzeigen, um den Verlauf der letztendlich tödlichen Lungenumgestaltung zu verändern.
27 4.2 Vorteile und Limitation der molekularpathologischen Analysemethode
Das bisher entwickelte Modell der AFE-Evolution basiert auf Beobachtungen in Endstadiumlungen und nicht auf Biopsien, welche im Laufe der Zeit entnommen wurden. Es ist jedoch seit längerem bekannt, dass bei fibrotischen Lungenerkrankungen verschiedene Stadien des Krankheitsentwicklung gleichzeitig auch in Endstadiumorganen (Kellner M et al., 2015) existieren.
Die beiden entscheidenden Vorteile der hier vorliegenden Analyse sind die Verwendung von humanem Patientengewebe und die kompartimentenspezifische Analyse.
Explantiertes menschliches Gewebe mit fibrotischen Läsionen hat bei lungentransplantierten Patienten, Patienten nach HSCT und Patienten nach RC offensichtlich einen chronisch-entzündlichen, systemischen Prozess durchgemacht.
Dies ermöglicht repräsentativere Aussagen, als es in Tierexperimenten möglich wäre. Insbesondere BO-Läsionen lassen sich bei Ratten und Mäusen nach orthotoper Lungentransplantation aufgrund der fehlenden Komplexität der Atemwege nicht adäquat darstellen bzw nicht adäquat reproduzieren (Lama et al., 2017).
Die Laser-Mikrodissektion hat den Vorteil, eine kompartimentenspezifische Entnahme des Gewebes im Bereich der jeweiligen fibrotischen Läsion durchzuführen, was insbesondere bei der BO relevant ist, weil sich die chronische Entzündung betont im Bereich der Bronchioli manifestiert. Die umliegenden und weiter entfernt gelegenen Alveolen und auch die nicht betroffenen größeren Atemwege zeigen keine so schwere Fibrose, wie in BO-Läsionen, mit der Ausnahme wenn ein AFE-Muster vorliegt. Eine Ganzschnittuntersuchung, ohne Laser- Mikrodissektion, würde somit auch die Genexpression von nicht-fibrotischen Lungenabschnitten mit abbilden. Somit ist das hier angewandte Verfahren sehr gut geeignet, den Krankheitsfokus molekularpathologisch zu untersuchen. Auch ermöglicht die cDNA-Präamplifikation und die Verwendung der „low-density array“- Analyseplattform die Untersuchung nicht nur von einem, sondern von insgesamt 45 Genprodukten gleichzeitig. Dadurch ist die Erstellung eines Expressionsprofils innerhalb der BO-Läsionen und AFE-Mustern möglich (Jonigk D, Rath B et al., 2016).
Eine wesentliche Limitation der Analyse ist, dass zwar kompartimentenspezifisch ein Genexpressionsprofil von 45 Faktoren erstellt werden konnte, aber dass das Verfahren keine direkte Aussage darüber erlaubt, welche Zellen innerhalb der Läsion
28 selbst welchen Faktor bilden. In einer vorherigen Analyse aus der Arbeitsgruppe Jonigk konnten aber mittels Immunhistochemie verschiedenen Zelltypen identifiziert werden, welche hauptverantwortlich für die Expression der fibroseassoziierten Faktoren sind. Dies sind insbesondere Histiozyten/Makrophagen und Fibroblasten/Myofibroblasten (Jongik D et al., 2015).
Ein weiterer Punkt ist, dass die hier durchgeführte Expressionsanalyse die lokal innerhalb der Läsion gebildeten Faktoren abbildet, aber nicht die systemisch zirkulierenden Entzündungsfaktoren, etwa aus Milz oder Leber. Korrespondierende Blutproben lagen zu den Zeitpunkten der Untersuchung nicht vor, würden aber in der Zukunft eine Möglichkeit bieten, potentielle fibrose-assoziierte Faktoren systemisch zu untersuchen.
4.3 Mögliche Therapiestrategien
Die Erkenntnisse über die Gemeinsamkeiten von BO und AFE könnten trotz unterschiedlicher Grunderkrankung in der Zukunft eine Grundlage für neue Therapiestrategien darstellen.
Die bisherigen Therapiestrategien werden im 33. ISHLT-Report wie folgt aufgezählt (Yusen RD et al., 2016):
Prednison nach der Transplantation.
Induktionstherapie bestehend in ca. 75 % der Fälle aus Interleukin-2 (IL-2) Antagonisten, in 15 % der Fälle aus polyklonalem Anti-Lymphozyten Globulin / Anti-Thymozyten Globulin, in 12 % der Fälle aus Alemtuzumab, wobei die Induktionstherapie bestehend aus IL-2-Antagonist in der letzten Zeit zunimmt.
Eine Erhaltungstherapie zur Immunsuppression wird allen Patienten
verordnet, die aus dem Krankenhaus entlassen wurden. Diese besteht meistens aus Tacrolimus und Mycophenolat mofetil.
Desweiteren wurden in der Übersichtsarbeit von Gauthier et al. Folgendes zusammengefasst (Gauthier JM et al., 2018):
Akute Abnahme der Lungenfunktion Steroid-Stoßtherapie, mit anschließendem langsamem Ausschleichen des Kortisonstoßes.
29
Anpassung/Änderung der Kalzineurintherapie und/oder des Antimetaboliten bei vorbestehender Therapie hiermit.
Bei einem Nichtansprechen darauf eignet sich eine zytolytische Therapie, z. B. mit Antithymozytenglobulin.
Bei Patienten, welche nur unzureichend auf eine medikamentöse Therapie ansprechen, kann eine extrakorporale Photopherese durchgeführt werden.
Extrakorporale Photopherese in Kombination mit einer etablierten Immunsuppression kann im Vergleich zur Standardtherapie die Lungenfunktion stabilisieren.
Totale Lymphbettbestrahlung zur breiten, unspezifischen Immunsuppression, (Nebenwirkungen: Panzytopenie und Infektionen).
Somit stellt sich die Frage, wie das Auslösen der Umbauvorgänge inhibiert werden kann. Eine allgemeine Immunsuppression dürfte dabei nicht helfen, was daran ersichtlich ist, dass sich bei Lungentransplantierten die oben ausgeführten Erkrankungen manifestieren. Deswegen ist es ggf. sinnvoller, gezielt eine der beteiligten zellulären Hauptkomponenten direkt zu beeinflussen. Dies sind insbesondere Makrophagen. In der vorliegenden Arbeit wurde einerseits morphologisch dargestellt, dass Alveolarmakrophagen eine relevante Rolle in der Entwicklung des fibrotischen Umbaus einnehmen und eine alternative Fibrinolyse ebenfalls zentral in der Evolution der AFE ist. Somit könnten Therapieansätze, welche den Kontakt zwischen Alveolarepithel und Fibrin beeinflussen, erfolgversprechend sein. Entsprechende Ansätze sind Gegenstand aktueller Untersuchungen.
30 4.4 Beantwortung der ursprünglichen Fragestellungen
BO ist BO, unabhängig welcher klinische Kontext mit der BO-Manifestation assoziiert ist. Trotz des unterschiedlichen klinischen Hintergrundes (LuTx, HSCT, RC) sind die Genexpressionsmuster der BO-Läsionen in allen Gruppen weitgehend identisch.
Nach Lungentransplantation entwickelte ein Teil der Patienten entweder eine BO oder BO in Kombination mit AFE: Letzte Gruppe stellt auch molekularpathologisch eine Besonderheit dar. Während die erste Gruppe ein identisches Genexpressionsmuster wie die HSCT und RC aufweisen, zeigt die BO-AFE-Gruppe ein eher dem AFE-Muster ähnelndes Genexpressionsmuster. Somit konnte hier erstmals gezeigt werden, dass überlappende pathologisch-anatomische Veränderungen auch überlappende Expressionsprofile von fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierten Faktoren aufweisen.
Rückschlüsse auf die Genese des fibrotischen Lungenumbaus:
Die molekularen Daten zeigen, dass das bindegewebige Remodeling in der Lunge, ob als BO oder als AFE, eher unspezifische Verletzungsmuster sind, die durch verschiedene äußere Reize ausgelöst werden können. Die Kombination von Morphologie und molekularen Daten legt einen alternativen Mechanismus der Fibrineliminierung über Makrophagen nahe, in Abwesenheit von klassischen fibrinolytischen Enzymen, welches ein möglicher Grund für die fehlgeschlagene Heilung nach einer akuten Lungenverletzung sein könnte.
So kann eine profibrotische Kaskade mit bindegewebigem Remodeling bei einem abweichenden Reparaturversuch ausgelöst werden, was letztlich zu einer restriktiven Lungenfunktionsstörung und zum Tod des betroffenen Patienten führt.
31 5. Zusammenfassung
Nicht-neoplastische Lungenerkrankungen, insbesondere ILE führen durch fibrotische Umbauprozesse bei einer Mehrzahl der Erkrankungen zu einer Störung der Gasaustauschfunktion der Lunge, sodass bei Abwesenheit von wirkungsvollen medikamentösen Behandlungsoptionen als einzige kurative Therapie die LuTx verbleibt. Selbst an Zentren, an denen Transplantationen zu Routineverfahren gehören, liegt das 5-Jahres-Überleben nach LuTx bei nur knapp über 60%. Ursache dafür ist ganz vornehmlich das CLAD.
Es werden funktionell obstruktive und restriktive Veränderungen CLAD-Varianten (oCLAD/BOS bzw. rCLAD/RAS) unterschieden. In dieser Arbeit wird insbesondere das rCLAD/RAS untersucht. BO und FE treten aber auch nach HSCT und RC auf.
Auch zeigt die iPPFE fibrotische Läsionen im Sinne einer FE-Veränderung.
In dieser Studie wurden daher 63 Lungenexplantate, die obstruktive und restriktive Veränderungen bei Patienten nach LuTx, HSCT, RC und bei iPPFE zeigten, kompartimentenspezifisch analysiert. Die morphologischen Korrelate wurden mittels Laser-Mikrodissektion isoliert und die Genexpression von 45 fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierten Genen analysiert. Zudem wurde die Herkunft der am Umbau beteiligten Zellen durch X/Y-FISH untersucht.
Zunächst wurde dabei festgestellt, dass sich BO-Läsionen der unterschiedlichen Kollektive morphologisch sehr stark ähneln. Die FE-Veränderungen bieten dahingehend ein komplexeres Bild mit verschiedenen, aber stets wiederkehrenden Mustern:
Ein fibrinreiches Stadium, abgelöst durch Kompartimente mit dichten intraalveolären Makrophagenaggregaten, seinerseits wiederum abgelöst durch ein voll entwickeltes FE-Muster mit hochgradigem Kollagengehalt.
Auf molekularer Ebene konnten wir nachgewiesen, dass BO-Läsionen grundsätzlich durch nahezu identische Expressionsmuster charakterisiert sind. Im Einzelnen waren dies 26 nahezu identisch regulierte fibrose-, umbau- und abstoßungsassoziierte Genprodukte, mit der Ausnahme von BMP2, das nicht signifikant hochreguliert wurde in der RC-Gruppe.
Bei den FE-Veränderungen war dieses vergleichbar.
32 Hierbei fiel auf, dass keine Expression von klassischen fibrinolytischen Enzymen zu beobachten war, was wiederum auf eine alternative Fibrinolyse hindeutet.
Des Weiteren konnte mittels X/Y-Chromosomen-FISH gezeigt werden, dass die an den Fibroseprozessen beteiligten Makrophagen/(Myo-) Fibroblasten dem Empfänger entstammten.
Zusammenfassend erschließen sich so aus der vorliegenden Arbeit drei Kernaussagen:
1. „BO ist BO“. Trotz der verschiedenen klinischen Hintergründe, entsprechen sich die Genexpressionsmuster der BO-Läsionen in allen untersuchten Gruppen.
2. „AFE ist AFE". In Lungen von Patienten mit rCLAD/RAS oder FE-Remodeling nach HSCT und in Lungen mit iPPFE, zeigten FE-Veränderungen weitgehend identische Expressionsmuster, welche sich von der Regulation in BO-Fällen unterscheiden. Aufgrund der grundsätzlichen Ähnlichkeiten der Genexpression wird dieses Schädigungsmuster daher hier erstmalig von uns als Alveoläre Fibroelastose (AFE) bezeichnet, eine Terminologie, welche aktuell in der Lungenforschung von anderen Gruppen übernommen wird.
3. Wenn eine AFE nach LuTx vorliegt, ist die begleitende BO durch eine AFE ähnliche molekulare Mikroumgebung charakterisiert.
Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit zeigen vielversprechende Ansätze für Therapien auf, insofern als dass die Beeinflussung der alternativen Fibrinolyse und somit der konsekutiven Umbauvorgänge einen bisher unbeachteten Mechanismus darstellt. Als weiterer wichtiger Punkt ist herauszustellen, dass mögliche zukünftige Therapieansätze nicht nur für AFE nach einer Form der Schädigung nutzbar wären, sondern potentiell bei allen untersuchten Varianten.
33 6. Literaturverzeichnis
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