Untersuchung des Einflusses umweltrelevanter Schadstoffe auf die Glutathion‐S‐Transferase in der humanen Lungenkarzinom‐ Zelllinie A549

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Untersuchung des Einflusses

umweltrelevanter Schadstoffe auf die Glutathion‐S‐Transferase in der

humanen Lungenkarzinom‐ Zelllinie A549

Abschlussarbeit

Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz der Universität Leipzig

Dr. Susanne Rudzok Leipzig, 05.03.2012

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Kurz-Zusammenfassung

Die Lunge bietet die primäre Kontaktfläche bei der Inhalation von umweltrelevanten Schadstoffen. Die löslichen Glutathion-S-Tranferasen (GSTs) stellen eines der wichtigsten Detoxifizierungssysteme der Lunge dar. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss von vierzehn Pestiziden auf die Glutathion-S-Tranferase in der humanen Lungenkarzinom-Zelllinie A549 zu bewerten. Neben der Zellvitalität wurde die Veränderung der GST-Aktivität, sowie die Transkription der beiden Isoenzyme GSTP1 und GSTZ1 untersucht. Unabhängig von ihrer chemischen Struktur konnten sieben der ausgewählten Pestizide die GST-Aktivität signifikant erhöhen, und nahezu alle Pestizide waren in der Lage die Transkription zu beeinflussen. Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal, den Einfluss von Pestiziden auf die GST-Aktivität und Transkription in einem humanen Lungenzellmodell.

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Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG 5

1.1 HINTERGRUND 5

1.2 LUNGENTOXIKOLOGIE 5

1.3 GLUTATHION-S-TRANSFERASEN 6

1.4 A549ZELLLINIE 7

1.5 ZIELSTELLUNG 8

2 MATERIAL UND METHODEN 11

2.1 ZELLKULTUR 11

2.2 EXPOSITION 11

2.3 GLUTATHION-S-TRANSFERASE AKTIVITÄTSTEST (GST-TEST) 11

2.4 PROTEINBESTIMMUNG 12

2.5 MTT-TEST 12

2.6 NRU-TEST 13

2.7 ALAMARBLUE-TEST 13

2.8 RNA-EXTRAKTION 13

2.9 CDNA-SYNTHESE 14

2.10 QUANTITATIVE POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (QPCR) 14

2.11 STATISTIK 14

3 ERGEBNISSE 16

3.1 ZELLVITALITÄT 16

3.2 GST-AKTIVITÄT 19

3.3 GST-TRANSKRIPTION 22

3.4 VERGLEICH GENEXPRESSION UND ENZYMAKTIVITÄT 23

3.5 LÖSUNGSMITTELKONTROLLE 24

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4 DISKUSSION 26

5 ZUSAMMENFASSUNG 30

LITERATURVERZEICHNIS 31

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 34

ABBILDUNGSVERZEICHNIS 35

TABELLENVERZEICHNIS 35

ANHANG 36

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1 Einleitung

1.1 Hintergrund

In der industrialisierten Welt sind schätzungsweise 25 – 33 Prozent aller durch Krankheiten verursachte Kosten auf Umweltfaktoren zurück zuführen (Smith et al., 1999). Der Mensch ist täglich direkt oder indirekt zahlreichen Schadstoffen und Schadstoffgemischen aus anthropogenen Quellen ausgesetzt. Rückstände dieser Stoffe in Essen, Trinkwasser und Luft stellen nicht nur für die Umwelt sondern auch für die menschliche Gesundheit eine ernste Gefahr dar. Eine große Gruppe Chemikalien, die absichtlich täglich durch den Menschen in die Umwelt ausgebracht wird, sind Pestizide. Diese sogenannten Pflanzenschutzmittel werden nach ihrer Wirkung in Herbizide, Insektizide, Fungizide und Biozide unterteilt. Solche Stoffe unterliegen einem strengen Zulassungsverfahren, wobei sie hinsichtlich ihrer akuten, chronischen und subchronischen Toxizität, ihrer Toxikokinetik und ihrem Metabolismus bewertet werden. Die erlaubte Tagesdosis (englisch: Acceptable Daily Intake, ADI) beruht in der Regel auf Fütterungsstudien an Mäusen und Ratten. Als Hauptaufnahmeweg für den Menschen wird die Nahrung identifiziert. Dennoch stellt für einige Personengruppen auch die Aufnahme über die Luft einen wichtigen Expositionsweg dar, da diese Stoffe per Sprühverfahren auf Felder oder Wege aufgebracht werden. Im Allgemeinen ist die Personengruppe die in Deutschland oder Europa davon betroffen ist, zum Beispiel Landarbeiter, eher klein. In der dritten Welt werden die Stoffe jedoch großflächig per Flugzeug ausgebracht ohne Schutzmaßnahmen für die Bevölkerung zu treffen, wie beispielsweise in Indien. Da Pestizide keine Luftschadstoffe im eigentlichen Sinne darstellen, gibt es nur wenige Daten zu Arbeitsplatzgrenzwerten. Daher sind toxikologische Untersuchungen zu diesen Stoffe in einem Lungenzellmodel von großer Bedeutung um die komplexen Beziehungen von Umwelt und Erkrankungen aufzuschlüsseln.

1.2 Lungentoxikologie

Die Lunge hat eine große Oberfläche von über 100 m², und verfügt dabei über eine komplexe Struktur. Die Barriere zur Außenwelt ist an den Orten des Gasaustausches, den Alveolen kleiner

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Abschlussarbeit Postgradualstudium für Toxikologie und Umweltschutz Einleitung

0,5 µm. Schadstoffe können an Partikel gebunden oder über Aerosole in den Inhalationstrakt durch Einatmen aufgenommen werden. Sie können schnell absorbiert werden und unterliegen nicht dem First-Pass Metabolismus, oder Efflux-Transportern. Die Schadstoffe können in verschiedenen Abschnitten des Respirationstraktes bis hin zu den Alveolen deponiert werden.

Am Depositionsort kann es zur akuten Schädigung des Lungenepithels kommen, zum Beispiel bewirkt Chlor ein Lungenödem. Darüber hinaus können auch chronische Schädigungen wie eine Fibrose, oder Emphysem (Quarz, Rauchen), Luftwegsobstruktionen wie Bronchitis, oder Asthma (organische Stäube, Isocyanate) sowie Lungenkrebs (polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, kurz PAK) auftreten.

Die Ausscheidung solcher Schadstoffe hängt stark von ihren physico- chemischen Eigenschaften ab. Gasförmige Stoffe können abgeatmet werden. Partikel, oder an Partikel gebunden Schadstoffe werden über den mucoziliären Transport aus der Lunge oder Phagozytose eliminiert.

Sind die Schadstoffe aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften in die Zellen gelangt, bedürfen sie einer metabolischen Transformation. Dieser Fremdstoffmetabolismus beinhaltet die chemische Modifikation einer unpolaren Verbindung in eine polare, die biliär oder renal ausgeschieden werden kann. Diese Erhöhung der Wasserlöslichkeit der Substanzen verläuft in zwei Phasen. In Phase I unterliegt der Fremdstoff einer Funktionalisierung, wobei beispielsweise durch Cytochrom P450-Enzyme aktive Gruppen in die chemische Verbindung eingefügt werden. In Phase II erfolgt die Konjugation, der in Phase I enstandenen Metabolite mit einem hydrophilen endogenen Baustein, zum Beispiel Glucuronsäure, Glutathion, Sulfat oder Acetat. Generell resultiert diese Biotransformation in eine Inaktivierung beziehungsweise Detoxifizierung von endogenen und exogenen Stoffen. Dennoch können sich im Laufe des Metabolismus auch reaktivere, toxischere Verbindungen entstehen, die ein größeres Risiko für den Menschen darstellen. (Gonzales und Gelboin, 1994).

1.3 Glutathion-S-Transferasen

Eines der wichtigsten Detoxifizierungssysteme der Lunge sind die löslichen Glutathion-S- Tranferasen (GST, EC 2.5.1.18). Diese Enzyme gehören zum Phase II Metabolismus und vermitteln durch Konjugation mit dem Tripeptid Glutathion (γ-Glutamyl-Cysteinyl-Glycin) die Neutralisation einer Vielzahl von großen exogenen toxischen Verbindungen, sowie endogenen Produkten der Lipid-, oder DNA- Oxidation. (Falany 1997, Glatt 2000). Durch diese

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7 Konjugation inaktivieren sie elektrophile zytotoxische und genotoxische Substanzen (Mannervik und Danielson 1988).

GST beschreibt eine Gensuperfamilie, für die acht Familien bekannt sind: die alpha (GSTA), mu (GSTM), pi (GSTP), theta (GSTT), sigma (GSTS), kappa (GSTK), zeta (GSTZ) und omega (GSTO) (Hayes et al. 2005). Pro Familie sind bis zu fünf Isoenzyme bekannt. Im menschlichen Organismus kommen sie nahezu in allen Zellen vor. Sie zeichnen sich durch einen breiten Bereich an Substratspezifität aus und sind somit an einer Vielzahl von biologischen Prozessen beteiligt. Zur Untersuchung des GST Enzymaktivität kann das Breitspektrumsubstrat 1-Chlor- 2,4-Dinitrobenzol verwendet werden, was von den meisten GST gut umgesetzt wird, ausgenommen der GSTT- Familie.

Die zytosolischen GSTs kommen entweder als Homo- oder Heterodimer vor. Jede etwa 25 kDalton große Untereinheit hat ein komplettes, unabhängiges aktives Zentrum, bestehend aus einer Bindungsstelle für das Glutathion (G-site), einer benachbarten Bindungsstelle für das elektrophile Substrat (H-site) und einer Ligandenbindungstelle (L-site) (Wilce und Parker, 1994). GSTs werden im Zusammenhang mit der Resistenzbildung gegenüber Arzneimitteln und Pestiziden diskutiert (Tew 1994, Edwards et al. 2000). Darüber hinaus wurde eine Überexpression von GSTs in Tumoren nachgewiesen (Salinas und Wong, 1999).

1.4 A549 Zelllinie

Für die Untersuchung des Einflusses von umweltrelevanten Schadstoffen auf die GSTs wurde die alveolar Epithelzelllinie A459 (ATCC Cl-185), die einem Adenokarzinom entstammt, gewählt. Es gibt eine Auswahl an verschiedenen Zellmodellen humanen pulmonaren Ursprungs, um die Effekte von Fremdstoffen auf die menschliche Lunge zu untersuchen (Yu et al. 2001).

Unter Ihnen, entspricht die A549- Zelllinie in ihrer Morphologie und Zellfunktionen den Typ II pulmonalen Epithelzellen in vivo (Balis et al., 1984; Foster et al. 1998). Diese Zelllinie ist gut charakterisiert und wurde schon für viele biopharmazeutischen oder zytotoxischen Studien verwendet (Adissu and Schuller 2004; Forbes und Ehrhardt 2005). Castell et al. (2005) zeigten, dass die A549 ein vergleichbares Maß an Phase II- Enzymen im Allgemeinen und GST- Aktivität im Speziellen zu humanem Lungengewebe hat. Das GST Isoenzym Expressionsmuster ähnelt ebenfalls dem von humanem Lungengewebe. Es werden die Isoenzyme GSTP1 zu 80 %, GSTZ1 zu 20 %, sowie GSTA und GSTM3 zu einem sehr geringen Prozentsatz exprimiert

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(Bauer et al. 2006). Somit stellt die A549-Zellline ein geeignetes Model zur Untersuchung der GSTs dar.

1.5 Zielstellung

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss von vierzehn Pestiziden auf die Glutathion-S- Tranferase in der humanen A549 Zelllinie zu bewerten. Die ausgewählten Pestizide sind in Tabelle 1 mit ihren Strukturformeln, der chemischen Klassifizierung, biologischen Wirkung und physikalischen Eigenschaften angegeben. Parallel zur Ermittlung der Zytotoxizität wird der Einfluss der Pestizide auf die GST-Aktivität und die GST-Transkription untersucht. Die Zytotoxizität wird mittels drei verschiedener Zellvitalitäts-Tests bestimmt, der 3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl tetrazolium Bromid-Reduktion (MTT), der Neutral-Rot- Aufnahme (NRU), sowie der Resazurin Reduktion (AlamarBlue). Die GST-Aktivität wird durch eine spektrophotometrische Methode, die auf der GST katalysierten Umsetzung des 1-Chlor-2,4- Dinitrobenzol (CDNB) beruht, bestimmt. Mit Hilfe quantitativer RT-PCR mit spezifischen Primern für GSTP1 und GSTZ1 wird die Ebene der Transkription untersucht.

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9

Tabelle 1: Strukturformeln, Chemische und Biologische Chakterisierung sowie Physikalische Eigenschaften der untersuchten Pestizide (AGW- Arbeitsplatzgrenzwert, BCF - Biokonzentrationsfaktor, k.A. - keine Angabe)

Pestizid Formel Chemische Klasse, Wirkung, Grenzwerte Physikalische Eigenschaften

Insektizide

Chlorpyrifos (CHP)

 Organophosphat

 Azetylcholinesterase-Inhibitor

 Einsatz als Berührungs-, Fraß- und Atemgift

 AGW: 0,2 mg/m³

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

4,70 0,478 8151 1374

Diazinon (DIA)

 Organophosphat

 Einsatz gegen beißende und saugende Insekten in zahlreichen Kulturen

 AGW:0,1 mg/m³ (einatembare Fraktion)

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

3,69 6,09*10^-2 643 500

Dimethoat (DM)

 Organophosphat

 Einsatz gegen beißende Insekten, Nematoden

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

0,70 4,1*10^-08 k.A.

k.A.

Imidacloprid (IMI)

 Neonicotinoid

 Nicotinischer Azetycholin- Rezeptor Agonist

 Saatgutbeizung

 AGW: 960 mg/m³

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

0,57 1,7*10^-10 225 0,61

Permethrin (PERM)

 Pyrethroid

 Na⁺-Kanal Modulator in Nervenzellen

 Einsatz als Kontakt- und Fraßgift auch beim Menschen, breites Wirkungsspektrum

 Orientierungswert: 1 mg/kg Hausstaub (Bundesgesundheitsamt)

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

6,1 7.8*10^-05 100000 300

Piperonyl- butoxid (PBO)

 Zyklischer Aromat

 Blockiert Fremdstoffmetabolismus, P450-abhängiger Monooxygenase- Inhibitor

 Beistoff, Synergist für insektizide Wirkung

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

4,75 1,6*10^-04 89125 260

Thiachloprid (THIA)

 Neonicotinoid

 Nicotinischer Azetycholin- Rezeptor Agonist

 Einsatz gegen Acker- und Obstschädlingen

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

1,26 1,7*10^-13 k.A.

k.A.

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Herbizide

3,4 Dichloranilin (3,4D)

 Phenylharnstoff- Derivat

 Zwischenprodukte zur Herstellung von Arzneistoffen, Farbstoffen und Pestiziden

 Metabolit von Diuron

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

2,7 2,28 30 k.A.

Diuron (DUI)

 Phenylharnstoff- Derivat

 Inhibiert die Photosynthese

 Breitbandherbizid, „Roadside Control“

 AGW: 5 mg/m³

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

2,87 2,1*10^-08 813 k.A.

Fungizide

Azoxystrobin (AZ)

 Strobilurin

 Hemmt Elektronentransport in der Zellatmung

 Breitbandfungizid, protektiver und abstoppen- der Einsatz in landwirtschaftlichen Kulturen

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

2,5 2,7*10^-12 589 k.A.

Carbendazim (CARB)

 Benzimidazol

 Inhibierung der Mitose und Zellteilung

 Blatt- und Bodenfungizid in zahlreichen Kulturen, Nacherntebehandlungsmittel

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

1,48 8.8*10^-07 k.A.

25

Prochloraz (PRO)

 Imidazol

 Blockiert Membran Funktionen

 hemmt Ergosterolbiosynthese und damit den Aufbau der Pilzzellmembranen (Breitband)

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

4,1 1,64*10^-3 500 371

Biozide

Irgasan (IRG)

 polychloriertes Phenoxyphenol

 Bakterienhemmer, inhibiert Fettsäuresynthese

 Desinfektionsmittel, Konservierungsstoff

 AGW: k.A.

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

4,76 1,5*10⁷ 9200 2,7 - 90

Tributylzinnoxid (TBTO)

 Organozinnverbindung

 Allgemeines Stoffwechsel- und Zellgift

 Unterwasser Schutzanstrich bei Schiffen, Pilzgift in Holzschutzmitteln

 AGW:0,05 mg/m³

Log KOW

Henry Konstante KOC

BCF

3,19 2*10⁵ 1030

> 1000

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2 Material und Methoden

2.1 Zellkultur

Die humane Lungenkarzinom-Zelllinie A549 wurde in RPMI 1640 (PAN™ Biotech GmbH, Aidenbach, Deutschland), mit 10% FKS (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) unter Standardbedingungen (5% CO2, 95% Luftfeuchte, 37°C) kultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig für drei Tage in Zellkulturflaschen mit einer Wachstumsfläche von 75 cm² bis zur Konfluenz gezogen und dann mit einer Lösung aus 0,25% Trypsin / 0,02% EDTA (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) geerntet. Für die GST-Aktivität- sowie Zellvitalitätstests (NTU, MTT, AlamarBlue) wurden 20 000 Zellen je Kavität in eine 96 well Mikrotiterplatte ausgesät- Für die RNA- Isolation wurden 500 000 Zellen je Kavität in eine 6 well Mikrotiterplatte ausgesät. Die Zellen verblieben für 24 Stunden unter Standardbedingungen zum Adhärieren.

2.2 Exposition

Die Zellen wurden für 24 Stunden mit den Xenobiotika exponiert. Die Stocklösungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma, Steinheim, Deutschland) hergestellt. Die Exposition erfolgte im Zellkulturmedium mit einer Konzentration von 0,05% DMSO. Alle verwendetet Xenobiotika (Sigma, Steinheim, Deutschland) sind mit ihrer Strukturformel und physikalischen Parametern in Tabelle 1 dargestellt.

2.3 Glutathion-S-Transferase Aktivitätstest (GST-Test)

Nach Ablauf der Exposition wurde der Überstand abgenommen und die Zellen einmal mit 200 µl 0,1 M KH2PO4- Puffer (pH 6,5; Applichem, Darmstadt, Deutschland) je Kavität gewaschen. Anschließend wurden 70 µl 0,1 M KH2PO4 · 1 mM EDTA (Applichem, Darmstadt, Deutschland) auf die Zellen gegeben und es erfolgten drei Tau-Frier-Zyklen

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Abschlussarbeit Postgradualstudium für Toxikologie und Umweltschutz Material und Methoden

(-80°C / 4°C). Nach einer Zentrifugation (5 Minuten bei 1250rpm) wurden 20 µl für den GST- Test und 20 µl für die Proteinbestimmung verwendet.

Der GST- Test wurde in 96well Mikrotiterplatten durchgeführt. Zu den 20 µl Zelllysat wurden 180 µl Reaktionslösung gegeben. GST- Reaktionslösung [0,1 M KH2PO4, 1 mM EDTA, 20 mM Glutathion(GSH; Sigma, Steinheim, Deutschland), 20 mM 1-Chlor-2,4-Dinitrobenzol (CDNB; Sigma, Steinheim, Deutschland)]. Die Umwandlung des CNDB wurde spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm über insgesamt 15 min im Abstand von 1 Minute bei Raumtemperatur gemessen. Die Änderung der Extinktion über die Zeit

(∆E/min) entspricht der GST- Aktivität in einen Volumen von 20 µl (= GST- Volumenaktivität, U/ml). Die spezifische GST- Aktivität entspricht der GST-

Aktivität je mg Protein (U/mg). Es wurde immer auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05%

DMSO) normiert.

2.4 Proteinbestimmung

Die Proteinkonzentration wurde mit dem BC Assay (Uptima, Montlucon Cedex, Frankreich) entsprechend dem Herstellerprotokoll im 96well- Format durchgeführt. Zu 20 µl Zelllysat wurden 200 µl Reaktionslösung (49 Teile Lösung A + 1 Teil Lösung B) gegeben und es erfolgte eine Inkubation von 30 Minuten bei 37°C. Anschließend wurde der Proteingehalt spektrophotometrisch mittels einer Standardkurve (15,6 µg/ml – 2000 µg/ml Protein) bei einer Wellenlänge von 562 nm bestimmt.

2.5 MTT-Test

Der MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-Diphenyl- Tetrazoliumbromid) Test wurde analog dem Protokoll von Mosmann (1983) durchgeführt. Am Ende der Exposition wurde der Überstand abgenommen, so dass noch 50 µl je Kavität verblieben. Es folgte eine Zugabe von 10 µl MTT- Stammlösung (5 mg/ml; Applichem, Darmstadt, Deutschland) und einer Inkubation von 4 Stunden unter Standardbedingungen. Anschließend wurde die Reaktion mit 100 µl SDS/DMF- Lösung (40 g SDS/ 200 ml 50% DMF; Applichem, Darmstadt, Deutschland) abgestoppt und über Nacht inkubiert. Die Formazan- Bildung aus dem MTT wurde als Parameter für die metabolische Aktivität spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge 570 nm gemessen.

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13 2.6 NRU- Test

Der Neutral- Rot- Aufnahme Test basiert auf dem Protokoll, das erstmals von Borenfreund und Puerner (1985) beschrieben wurde. Am Ende der Exposition wurde der Überstand abgenommen und es erfolgte einen Zugabe von 100 µl NRU Reaktionslösung je Kavität (1:66 Verdünnung der NRU Stammlösung (3,3 mg/ml) in Zellkulturmedium; Sigma, Steinheim, Deutschland) und eine Inkubation für 3 Stunden unter Standardbedingungen. Anschließend wurde die NRU- Reaktionslösung verworfen, die Zellen mit 100 µl 0,5% v/v Formaldehyd · 1% w/v CaCl2 in ddH2O je Kavität für 1 Minute fixiert, einmal mit PBS gewaschen und der Farbstoff mit 100 µl Extraktionslösung (1% v/v Essigsäure · 50% Ethanol in ddH2O) aus den Zellen gelöst. Die Mikrotiterplatten wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Neutral- Rot- Aufnahme wurde als Parameter für die Membranstabilität bei einer Wellenlänge von 540 nm gemessen.

Essigsäure, Ethanol, Calciumchlorid wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.

2.7 AlamarBlue- Test

Am Ende der Expositionszeit wurde der Überstand abgenommen und es erfolgte eine Zugabe von 100 µl AlamarBlue- Reaktionslösung (5% AlamarBlue Stocklösung (Biosource, Solingen, Germany) in Zellkulturmedium ohne FKS) je Kavität und eine Inkubation von 30 Minuten unter Standardbedingungen. Die Umwandlung des Alamarblue- Farbstoffes in das fluoreszierende Resazurin wurde als Parameter für die metabolische Aktivität der Zellen mit einer Anregung von 530-560 nm und einer Emission von 590 nm gemessen.

2.8 RNA-Extraktion

Die zelluläre RNA wurde mit dem pepGold RNAPure^TM Isolationssystem (Peqlab, Erlangen, Deutschland) entsprechend dem Herstellerprotokoll gewonnen. Je Kavität einer 6 well Mikrotiterplatte wurde 1 ml peqGold RNAPureTM- Lösung verwendet und das Gemisch in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Dieses wurde entweder sofort weiter verarbeitet, oder bis zur Isolation bei -80°C gelagert. Die isolierte RNA wurde in DEPC- Wasser aufgenommen, ihre Konzentration spektrophotometrisch bestimmt und bei -80°C gelagert.

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2.9 cDNA- Synthese

Nach einem DNAse- Verdau (Roche, Mannheim, Deutschland) für 30 Minuten, wurden 5 µg Total-RNA mittels RevertAid H Minus First strand cDNA Synthesis Kits (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Deutschland) in cDNA umgeschrieben.

2.10 Quantitative Polymerase- Ketten- Reaktion (qPCR)

Für die GSTP1/GSTZ1 qPCR im LightCycler 480II (Roche, Mannheim, Deutschland) wurden spezifische Primer-Paare verwendet: h-qGSTP1_for/rev (5’-AGTCCAATACCATCCTGCGT CAC-3’, 3’-GGTCTTGCCTCCCTGGTTCTG-5’) und h-qGSTZ1_for/rev (5’-TGCCGG CAGCCAGATACAC-3’, 3’- TGCCCCGTCACATAGATAACAGT-5’). Das PCR-Protokoll umfasste einen Denaturierungschritt für 10 min bei 95°C, gefolgt von 45 Zyklen mit 10 Sekunden bei 95°C, 20 Sekunden bei 58°C und 20 Sekunden bei 72°C. Hierbei wird das Touchdown- PCR- Prinzip angewendet, wobei die Spezifität der Primer-Bindung durch eine zyklusweise Annäherung der Annealing-Temperatur von 68°C auf 58°C mit 1°C je Zyklus erhöht wird. Die PCR- Reaktionsmischung enthielt: 2,5 mM MgCl2, je 200 µM dNTP, jeweils 0,38 µM Primer, 0,31 U BIOTAQ™ DNA Polymerase (Bioline, Luckenwalde, Deutschland) und 1:26000 SYBRgreen I nucleic acid gel stain (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland).

Spezifische PCR-Produkte wurden anhand ihrer Schmelzkurven detektiert und mittels Standardkurven quantifiziert. Die Standardkurven wurden durch serielle Verdünnungen einer unbehandelten Probe gewonnen, wobei die geringste Verdünnung, die noch eine Schmelzkurve aufwies, mit einer Kopienanzahl von eins gleichgesetzt wurde. Um die veränderte Genexpression semi-quantitativ zu detektieren wurde als Referenzgen GUSB_for/rev (5’-CGCCCTGCCTATCTGTATTC-3’, 3’-TCCCACAGGGAGTGTGTAG- 5’) verwendet.

2.11 Statistik

Die Bestimmung der GST- Aktivität und des Proteingehaltes erfolgte mit Triplikaten in drei unabhängigen Experimenten aus der gleichen Kavität einer Mikrotiterplatte. Die Berechnung der GST-Aktivität (Volumenaktivität) erfolgt nach dem Lambert-Beerschen Gesetz (Gleichung 1).

Gleichung 1:

d V k

5 V ΔE/min ml ]

[Unit GST

P G



 

(15)

15

E/min Extinktionsänderung pro Minute VG Volumen total (0,2 ml)

5 Konvertierungsfaktor (0,2 ml zu 1 ml) k Extinktionskoeffizient für CDNB (9,6) VP Volumen der Probe (0,02 ml)

d Durchtrittslänge (0,621 cm)

Die spezifische GST- Aktivität wird in U/mg angegeben und entspricht der Volumenaktivität geteilt durch die Proteinkonzentration. Die Enzymaktivitäten wurden auf die mitgeführte Negativkontrolle (0,05% DMSO) normiert. Die Signifikanzanalyse erfolgte mittels ANOVA nach Ranks und anschließender Post-Hoc-Analyse nach Dunn’s Methode (Software Paket SigmaPlot, V11.0, Systat Software GmbH, Erkrath, Deutschland).

Die konzentrationsabhängige Veränderung der Genexpression und der Zellvitalität wurden parallel in einem Experiment untersucht. Die Zellvitalität und die Proteinbestimmung wurden mittels der mathematischen logistischen Regression (Gleichung 2) analysiert. (Software Paket SigmaPlot, V11.0, Systat Software GmbH, Erkrath, Deutschland). Diese Funktion ähnelt der Hill-Funktion, bei der das Minimum Null ist. Die Parameter: Maximum, EC50 sowie der Anstieg werden mit Standardabweichung und p-Wert bestimmt.

Gleichung 2: f(x) = Max/(1 + (x/EC50)^Anstieg)

Auf Basis dieser Regression wurde die Konzentration mit 1 Prozent negativer Effekt (EC1) nach Gleichung 3 berechnet.

Gleichung 3: EC1 = (((Max/(0,99*Max)) - 1)* EC50 (Anstieg))(1/ Anstieg)

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3 Ergebnisse

3.1 Zellvitalität

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von 14 umweltrelevanten Pestiziden auf die Lungenkarzinomzelllinie A549 untersucht. Die Zellvitalität wurde mit drei verschiedenen Testmethoden ermittelt: MTT-, NRU- und AlamarBlue- Test. Für Prochloraz sind die Konzentrations- Wirkungs- Beziehungen (Mittelwert mit Standardabweichung) in Abbildung 1 dargstellt. Die Konzentrationen sind logarithmisch skaliert. Mit Hilfe einer Logistischen Regression (f(x) = Max/(1 + (x/EC50)^Anstieg); SigmaPlot 11.0) wurde die effektive Konzentration (EC50) sowie der Anstieg der Kurven bestimmt. Mit allen drei Zellvitalitätstests wurden für Prochloraz ähnliche vollständige Konzentrations- Wirkungs- Verläufe und EC50- Werte ermittelt. Dieser Idealfall wurde ebenfalls für Azoxystrobin, Carbendazim und Diuron gemessen.

MTT

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 NRU

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 AlamarBlue

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

EC₅₀= 110 µM p < 0,001 Anstieg = 2,3 p = 0,007

EC₅₀= 70 µM p < 0,001 Anstieg = 2,0 p = 0,002 EC₅₀= 88 µM

p < 0,001 Anstieg = 2,5 p < 0,001 MTT

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 NRU

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 AlamarBlue

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

EC₅₀= 110 µM p < 0,001 Anstieg = 2,3 p = 0,007

EC₅₀= 70 µM p < 0,001 Anstieg = 2,0 p = 0,002 EC₅₀= 88 µM

p < 0,001 Anstieg = 2,5 p < 0,001

Abbildung 1: Dosis-Wirkungs-Kurven für Prochloraz nach 24 Stunden Exposition in A549 -Zellen. Die Konzentrationen sind logarithmisch aufgetragen; dargestellt sind die Mittelwerte mit Standardabweichung sowie die logistischen Regression mit dem ermittelten Konzentration des halbmaximalen Effekts (EC50)- Werte und dem Anstieg für den MTT-, den NRU- und den AlamarBlue- Test. Alle Werte sind auf die Lösungsmittelkontrolle normalisiert.

Die ermittelten Konzentrations-Wirkungs-Kurven für alle 14 Pestizide sind in Abbildung 2 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass die drei Zellvitalitätstests für den Großteil der Stoffe nicht mit der gleichen Sensitivität den Einfluss der Pestizide auf die A549 Zellen ermitteln. Für PBO und Permethrin unterschieden sich die EC50-Werte (Tab. 2) zum Beispiel erheblich. Es

(17)

Abschlussarbeit für Postgradualstudium Toxikologie und Umweltschutz Ergebnisse

17 kann auch keine generelle Aussage über die Sensitivität der Zellvitalitätstest gemacht werden.

Für beispielsweise 3,4-Dichloranilin ist der NRU-Test, für Carbendazim der MTT-Test und für Chlorpyrifos ist der AlamarBlue- Test die sensitivste Methode.

PRO

c [µM]

0,1 1 10 100

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

PERM 1,2

c [µM]

1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 PBO

c [µM]

0,1 1 10 100 1000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

IRG

c [µM]

0,1 1 10 100 1000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 IMI

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

DIU 1,2

c [µM]

0,1 1 10 100 1000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

DM

c [µM]

1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

DIA 1,2

c [µM]

0,1 1 10 100 1000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

CHP 1,2

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

CARB

c [µM]

0,1 1 10 100

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

AZ 1,2

c [µM]

0,1 1 10 100 1000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

1,2 3,4-D

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

THIA

c [µM]

0,1 1 10 100 1000

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

TBTO 1,2

c [µM]

0,1 1 10 100

Zellvitalität

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

NRU-Test

AlamarBue (AB)- Test MTT-Test

Abbildung 2: Logistische Regressionen der Dosis-Wirkungs-Beziehung für 14 Pestizide nach 24 Stunden Exposition in A549 -Zellen. Die Konzentrationen sind logarithmisch aufgetragen; dargestellt sind der MTT- (gestrichelte Linie), der AlamarBlue (gepunktete Linie) und der NRU-Test (durchgezogene Linie). Alle Werte sind auf die Lösungsmittelkontrolle normalisiert.

(18)

Für zwei Stoffe konnte kein signifikanter Einfluss auf die Zellvitalität mit den drei Testmethoden ermittelt werden: für PBO und Thiacloprid.

In dieser Arbeit wurde mit einem nicht-linaren Verfahren, die Konzentration mit 1 Prozent negativer Effekt (EC1) als Schwellenwert für den Einfluss auf die Zytotoxizität nach Gleichung 3 berechnet. Die Ergebnisse für die EC50 und die EC1 Werte, sowie der untersuchte Konzentrationsbereich sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: Ermittelten Konzentration des halbmaximalen Effekts (EC50)- Werte mittels Logistischer Regression, sowie die darauf basierten berechneten Schwellenwerte (EC1)-Werte. Die Werte und der untersuchte Konzentrationsbereich sind jeweils in µM angegeben; kursiv in Klammern sind Werte mit p ≤ 0,1.

Pestizid Konzentrations- bereich [µM]

EC₅₀ [µM] (Regression) EC₁ [µM] (Regression-basiert) MTT NRU AB MTT NRU AB Insektizide

Chlorpyrifos 2,5 - 5000 4587 534 1035 237 20 2,6

Diazinon 0,5 - 1000 887 180 196 23 20 7

Dimethoat 10 – 20000 53070 27090 (43460) 1727 2516 (1766)

Imidacloprid 2 - 4000 - (6000) 6600 - (1430) 1560

Thiacloprid 1 - 2000 - - - - - -

Permethrin 6 - 12000 - 2115 - - 1 -

Piperonylbutoxid 1,5 - 3000 - (250) - - (0,01) -

Herbizide

3,4-Dichloranilin 5 - 10000 4224 1781 1942 933 165 134

Diuron 1 – 2000 2014 1324 - 31 1 -

Fungizide

Azoxystrobin 0,5 - 1000 532 106 - 0,13 0,26 -

Carbendazim 0,2 - 25 40 (76) (22) 0,004 (0,188) (0,016)

Prochloraz 0,25 - 500 110 88 70 15 14,5 7

Biozide

Irgasan 1,8 - 250 42 33 22 0,6 3,5 0,9

TBTO 0,7 – 90 12 3,7 4,5 2,80 0,35 0,15

Es wird deutlich, dass die Aussage über die Sensitivität der Zellvitalitätstest, und somit über die Zytotoxizität der Stoffe stark vom untersuchten zytotoxischen Endpunkt abhängt. Während die EC50-Werte für Chlorpyrifos sich maximal um eine Zehnerpotenz unterscheiden, variiert der Schwellwert um den Faktor Hundert. Daraus lässt sich ableiten, dass die Dosis-

(19)

19 Wirkungsbeziehungen unterschiedliche Steilheiten aufweisen. Im Gegensatz dazu sind die Verhältnisse zwischen den EC50 und den EC1 Werten für 3,4-Dichloranilin ähnlich.

3.2 GST-Aktivität

Die Glutathion-S-Transferase Enzymaktivitätsbestimmung (GST-Test) wurde auf ein 96- Well Mikrotiterformat adaptiert. Am Ende der Exposition mit den Schadstoffen wurden für jede Kavität die Enzymaktivität der GST, sowie die Proteinkonzentration für ein definiertes Volumen (20 µl) gemessen und daraus die spezifische GST- Aktivität berechnet. In Abbildung 3 sind die Ergebnisse für Chlorpyrifos dargestellt. Für die Darstellung der Enzymaktivitäten wurde der Box-Whisker-Plot (Box: Median, 25% - 75% Quartil) und für die Proteinkonzentration wurde analog zur Zellvitalität die logistische Regression gewählt.

CHP

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

spezifische GST - Aktivität

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

* *

*

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

GST - Volumenaktivität [Boxplot]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Proteingehalt [Regressionskurve]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1,4 CHP

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

spezifische GST - Aktivität 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

* *

*

c [µM]

0,1 1 10 100 1000 10000

GST - Volumenaktivität [Boxplot]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Proteingehalt [Regressionskurve]

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Abbildung 3: GST-Aktivität für Chloryprifos in der A549-Zelllinie nach 24h Exposition. Die Volumenaktivität (a) und die spezifische GST-Aktivität (b) sind als Box-Whisker-Plot (Median, 25%- 75%

Quartil) dargestellt; für die Proteinkonzentration ist die logistische Regression gegeben. Sternchen indizieren einen signifikanten Unterschied zur Lösungsmittelkontrolle (0,05%DMSO). Alle Werte sind auf die Lösungsmittelkontrolle normalisiert.

Es ist auffällig, dass die Daten einer hohen Streuungsbreite und keiner Normalverteilung unterliegen. Mittels ANOVA nach Ranks und Post-Hoc-Test (Dunn) wurden die Konzentrationen identifiziert, deren spezifische GST- Aktivität sich signifikant von der Lösungsmittelkontrolle unterscheidet. Eine signifikante Erhöhung der spezifischen GST- Aktivität um etwa 20 % konnte für eine Exposition mit 31.25, 62.5, 125 und 500 µM Chlorpyrifos ermittelt werden (Abb. 3b).

a b

(20)

Für die vierzehn Pestizide wurden sehr unterschiedliche spezifische GST- Aktivitätsprofile ermittelt. In Abbildung 4 sind zwei weitere Beispiele für eine signifikante Enzymaktivitäts- induktion dargestellt.

Piperonylbutoxid induziert ab einem Schwellenwert von 46 µM für einen Konzentrations- bereich von einer log- Stufe eine konstant um etwa 30 Prozent erhöhte Enzymaktivität in den A459-Zellen (Abb. 4a). Im Gegensatz dazu weist TBTO eine konzentrationsabhängige Induktion der spezifischen GST- Aktivität um fast 50% auf, die Höchste die bei den untersuchten Pestiziden ermittelt wurde (Abb. 4b).

Piperonyl-butoxid

c [µM]

1 10 100 1000

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

* * * * *

Tributyl-tinoxid

c [µM]

0,01 0,1 1 10

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

* * * *

Abbildung 4: Induktion der spezifischen GST-Aktivität in A459-Zellen durch PBO (links) und TBTO (rechts). Die spezifische GST-Aktivität ist als Box-Whisker-Plot (Median, 25%- 75% Quartil) dargestellt. Alle Werte sind auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05%DMSO) normalisiert. Sternchen indizieren einen signifikanten Unterschied zur Lösungsmittelkontrolle.

Zwei Stoffe ohne signifikant erhöhte GST-Aktivität sind in Abbildung 5 dargstellt:

Azoxystrobin und Permethrin. Während Permethrin (Abb. 5a) über den gesamten Konzentrationsbereich konstant bei einer spezifischen GST- Aktivität von 1 liegt, weist die Exposition mit Azoxystrobin eine hohe Streuung auf. Diese Streuungsbreite lässt einen Einfluss auf die GST- Aktivität vermuten, der jedoch nicht statistisch signifikant ist.

Die Exposition der A549-Zellen mit keinem der untersuchten Schadstoffe führte zu keiner signifikanten Supprimierung der GST- Aktivität. In Tabelle 3 sind für alle 14 Pestizide die Konzentration und der Median mit Quartilen des Box-Whisker-Plots der maximalen Induktionen für die spezifischen GST- Aktivität in absteigender Reihenfolge gegeben.

a b

TBTO

(21)

21 Permethrin

c [µM]

10 100 1000 10000

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Azoxystrobin

c [µM]

1 10 100 1000

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Abbildung 5: Induktion der spezifischen GST-Aktivität in A459-Zellen durch Permethrin (a) und Azoxystrobin (b). Die spezifische GST-Aktivität ist als Box-Whisker-Plot (Median, 25%- 75% Quartil) dargestellt. Normiert wurde auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05% DMSO). Alle Werte sind auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05%DMSO) normalisiert.

Tabelle 3: Maximale signifikante Induktion der spezifischen GST- Aktivität (GSTmax) der 14 Pestizide.

Gegeben sind der untersuchte Konzentrationsbereich, die Konzentration ab welcher ein signifikanter Unterschied in der spezifischen GST- Aktivität ermittelt wurde, die ermittelte GSTmax mit Median und 25% - 75% Quartil, und die Relation der c(GSTmax) zur Zytotoxizität. Normiert wurde auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05%

DMSO).

Pestizid Konzentrations- bereich [µM]

c (GSTmax) [µM]

GSTmax

Median [25% - 75%]

Relation Zytotoxizität TBTO 0,02 - 5 > 0,16 1,47 [1,22 – 1,51] EC₁< GST_max Irgasan 0,2 - 50 > 1,6 1,29 [1,22 – 1,49] EC₁< GST_max PBO 6 - 1500 > 46 1,29 [1,10 – 1,45] (EC1< GSTmax) Diazinon 2 - 500 > 125 1,21 [1,15 – 1,34] GSTmax ~ EC50

Chlorpyrifos 7 - 2000 > 31,25 1,18 [1,07 – 1,27] EC1< GSTmax

3,4-Dichloranilin 7 - 2000 > 250 1,15 [1,11 – 1,37] EC₁< GST_max Prochloraz 0,7 - 100 > 12,5 1,10 [1,05 – 1,15] EC₁< GST_max Azoxystrobin 2 - 500 keine Angabe

Carbendazim 0,2 - 50 keine Angabe Dimethoat 20 - 5000 keine Angabe

Diuron 2 - 500 keine Angabe

Imidacloprid 7 - 2000 keine Angabe Thiacloprid 7 - 2000 keine Angabe Permethrin 20 - 6000 keine Angabe

a b

(22)

Eine signifikante Induktion der spezifischen GST- Aktivität kann erst für Konzentrationen verzeichnet werden, die auch Einfluss auf die Zellvitalität hatten. Die Konzentration für die maximale Induktion der GST-Aktivität ist in der Regel etwas höher als der Schwellenwert für die Zellvitalität. Ausnahme ist Diazinon, mit einer signifikanten Induktion der spezifischen GST- Aktivität beim EC50-Wert.

3.3 GST-Transkription

In A549-Zellen werden zwei GST- Isoenzym-Transkripte exprimiert, GSTP1 (80%) und GSTZ1 (20%) (Bauer et al. 2006). Es wurde der Einfluss der Pestizide auf diese beiden GST- Isoenzym-Transkripte untersucht. Die GST- spezifische mRNA wurde anhand einer Konzentrationsreihe nach 24 Stunden bestimmt.

1,00

18,90

7,89 5,50

2,20 1,91 1,88 1,87 1,65 1,22

0,69 0,49

0,19 0,08

0,00 0,01 0,10 1,00 10,00 100,00

Konzentrationsabhängige maximale Änderung der GSTP1- mRNA (x-fach) Lösungsmittelkontrolle Chlorpyrifos 150µM PBO 8µM Imidacloprid 5000µM TBTO 0,11µM Azoxystrobin 10µM Dimethoate 80µM Diazinon 50µM Prochloraz 0,4µM Carbendazim 12,5µM Thiacloprid 1µM 3,4Dichloranilin 200µM Diuron 1000µM Permethrin 300µM

1,00

18,90

7,89 5,50

2,20 1,91 1,88 1,87 1,65 1,22

0,69 0,49

0,19 0,08

0,00 0,01 0,10 1,00 10,00 100,00

Konzentrationsabhängige maximale Änderung der GSTP1- mRNA (x-fach) Lösungsmittelkontrolle Chlorpyrifos 150µM PBO 8µM Imidacloprid 5000µM TBTO 0,11µM Azoxystrobin 10µM Dimethoate 80µM Diazinon 50µM Prochloraz 0,4µM Carbendazim 12,5µM Thiacloprid 1µM 3,4Dichloranilin 200µM Diuron 1000µM Permethrin 300µM

Abbildung 6: Konzentrationsabhängige maximale Änderung der GSTP1- mRNA (x-fach) bezogen auf das Referenzgen GUSB nach 24h Exposition in A549-Zellen normiert auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05%

DMSO).

In Abbildung 6 sind die konzentrationsabhängigen maximalen Änderungen der GSTP1 mRNA für die einzelnen Schadstoffe im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle (0,05% DMSO) dargestellt. Die meisten Pestizide hatten einen Einfluss auf die GSTP1 mRNA Transkription.

Chlorpyrifos (19-fach), PBO (8-fach) und Imidacloprid (5,5-fach) stellen starke Induktoren

(23)

23 dar. Im Gegensatz dazu wird die Transkription nach Exposition mit Diuron und Permethrin nahezu vollständig inhibiert.

Für das zweite GST- Isoenzym Transkript GSTZ1 zeichnet sich für die mRNA Induktion ein anderes Bild ab (Abb. 7). Der stärkste Induktor ist Azoxystrobin mit einer dreifachen Erhöhung der GSTZ1- mRNA Transkription, gefolgt von Chlorpyrifos. Für Diuron und TBTO wurde eine Supprimierung der Transkription ermittelt. Der Großteil der Pestizide weißt mit einer Änderungsrate zwischen 0,7- und 2-fach nur einen schwachen bis keinen Einfluss auf die Transkription auf.

Für Irgasan wurde keine Genexpression ermittelt.

1,00

3,07 2,43

1,86 1,84 1,66 1,49 1,40 1,39

0,95 0,85 0,73

0,28 0,26

0,0 0,1 1,0 10,0

Konzentrationsabhängige maximale Änderung der GSTZ1- mRNA (x-fach) Lösungsmittelkontrolle Azoxystrobin 10µM Chlorpyrifos 1,2µM PBO 8µM Dimethoate 80µM Imidacloprid 8µM Thiacloprid 1µM Prochloraz 2µM Diazinon 50µM 3,4Dichloranilin 200µM Permethrin 300µM Carbendazim 12,5µM Diuron 1000µM TBTO 9µM

Abbildung 7: GSTZ1 Konzentrationsabhängige maximale Änderung der GSTZ1- mRNA (x-fach) bezogen auf das Referenzgen GUSB nach 24h Exposition in A549-Zellen normalisiert auf die Lösungsmittelkontrolle (0,05% DMSO).

3.4 Vergleich Genexpression und Enzymaktivität

Es ist auffällig, dass sich die Aussage über die GST Induktion stark unterscheidet, je nachdem ob man die Enzymaktivität oder die mRNA- Transkription betrachtet. In Abbildung 8 sind vier verschiedene GST- Aktivitätsprofile dargestellt. Diazinon induziert sowohl die spezifische GST- Aktivität als auch die Transkription beider Isoenzyme, auch wenn die Genexpression beider für GSTP1 und GSTZ1 mit zunehmender Konzentration wieder auf das Basislevel