Aus der Abteilung Gastroenterologie der Medizinischen Hochschule Hannover und der Abteilung Virologie des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen
Differenzielle Genexpression im akuten Leberversagen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der
Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von
Reiner M. Wäschle
aus
Frankfurt am Main
Hannover 2007
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am: 28.06.2007
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Präsident: Professor Dr. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer der Arbeit: Professor Dr. Michael Peter Manns
Referent: Prof. Dr. Michael Neipp
Korreferent: Prof. Dr. Thomas Buhr
Tag der mündlichen Prüfung: 28.06.2007
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Johann Karstens
Prof. Dr. Benno Ure
PD Dr. Hüseyin Bektas
„dañ die leber ist ein ursprung viler kranckheiten und ein edels glid das vilen glideren dienet uñ fast allen: so sie ist es nit ein kleine leiden,
sondern ein gros uñ mancherley“
Theophrastus Bombastus von Hohenheim, genannt PARACELSUS (1493-1541) Liber tertius paramiri, de morbis es Tartaro,
St. Gallen, 1531
Inhaltsverzeichnis:
1 Einleitung...1
1.1 Akutes Leberversagen (ALV) ... 1
1.1.1 Definition ... 1
1.1.2 Epidemiologie und Ätiologie ... 1
1.1.3 Klinik ... 11
1.1.4 Diagnostik ... 14
1.1.5 Therapie ... 15
1.1.6 Prognose... 16
1.2 Problemstellung... 18
2 Material und Methoden...19
2.1 RNA - Isolierung und First - Strand Synthese ... 19
2.1.1 Die verwendeten Lebergewebe... 19
2.1.2 RNA - Extraktion ... 19
2.1.3 mRNA - Isolierung... 20
2.1.4 Reverse Transkription/ ss cDNA - Synthese ... 21
2.2 DD - RAP PCR, Reamplifizierung und Klonierung der differentiell exprimierten Banden ... 21
2.2.1 Polymerase - Kettenreaktion – polymerase chain reaction (PCR) ... 21
2.2.2 DD - RAP PCR... 21
2.2.3 Polyacrylamid - Gelelektrophorese ... 22
2.2.4 Ausschneiden der Banden und Eluierung der DNA ... 23
2.2.5 Reamplifikation der aus dem Gel eluierten DNA ... 23
2.2.6 Ligation und Klonierung ... 23
2.2.7 Isolation und Aufreinigung der Plasmide... 25
2.2.8 Erstellen von Glycerin - Kulturen... 25
2.2.9 Klon - PCR zur Kontrolle der Klonierung ... 26
2.3 Sequenzierung der gefundenen Gene ... 26
2.3.1 Extraktion von PCR - Produkten mit nachfolgender Fällungsreaktion. 26 2.3.2 Sequenzierung ... 26
2.3.3 Sequenzierung durch SeqLab... 27
2.4 Herstellung der nicht - radioaktiven DIG - Sonden für die Northern - bzw.
Southern - Blot Hybridisierung ... 28
2.4.1 Erstellen DIG - gelabelter DNA - Sonden mittels PCR ... 28
2.4.2 In vitro Transkription zur Erstellung DIG - gelabelter RNA - Sonden... 28
2.5 Northern - Blot Hybridisierung mit den DIG - gelabelten Sonden und Detektion auf Röntgenfilm ... 30
2.5.1 Elektrophorese der RNA ... 30
2.5.2 Transfer der RNA auf eine Nylonmembran ... 31
2.5.3 Prähybridisierung und Hybridisierung mit den DIG - gelab. Sonden ... 32
2.5.4 Detektion der Sonde mit CSPD... 33
2.5.5 Strippen der Membran ... 33
2.6 Methoden zur Aufreinigung und Konzentrationsmessung von NS ... 34
2.6.1 Extraktion von PCR - Produkten mit nachfolgender Fällungsreaktion. 34 2.6.2 Fällungsreaktion von DNA - haltigen Lösungen ... 34
2.6.3 Aufreinigung und Gelextraktion von PCR - Produkten ... 34
2.6.4 Photometrische Messung der DNA/RNA - Konzentration ... 35
2.7 Verwendete „housekeeping“ Gene... 35
2.7.1
β- Actin PCR ... 35
2.7.2 GAPDH PCR... 36
3 Ergebnis...37
3.1 Gefundene differentiell exprimierte Gene beim akuten Leberversagen... 37
3.1.1 Übersicht ... 37
3.1.2 IL - 18 binding protein (IL - 18 bp) ... 38
3.1.3 HS - Thymosin beta - 10 ... 42
3.1.4 MHC II ... 44
3.1.5 HS - Serum Amyloid A 1 beta (HS - SAA 1 β)... 46
3.1.6 Qualitätskontrolle der extrahierten RNA ... 47
3.1.7 Northern - Blot mit dem „housekeeping“ Gene GAPDH ... 48
3.1.8 Übersicht der restl. in der DD - RAP PCR identifizierten Fragmente... 49
3.1.9 Übersicht der Fragmente, die kein Signal in den Northern - Blot Analysen zeigten... 49
3.1.10 Auflistung der gefundenen Nukleotidsequenzen ... 50
3.2 Modifikationen und Optimierung der verschiedenen Verfahren zur Detektion differentiell exprimierter Gene ... 50
3.2.1 Ermittlung der optimalen Nukleotid - Konzentrationen ... 50
3.2.2 Vergleich der Effizienz der ELONGASE™ und des Advantage
®cDNA
Polymerase Mixes in der DD - RAP PCR... 52
3.2.3 Vergleich der Effizienz verschiedener Thermocycler Programme für die DD - RAP PCR... 53
3.2.4 Vergleich Taq DNA Polymerase und Advantage
®cDNA Polymerase Mix ... 54
3.2.5 Vergleich der Transkriptionseffizienz abhängig von der Herstellung des DNA Templates... 55
4 Diskussion ...57
4.1 IL - 18 und sein physiologischer Antagonist, IL - 18 bindendes Protein ... 57
4.2 Thymosin beta - 10, ein Protein der Embryogenese mit zentraler Bedeutung bei apoptotischen Prozessen ... 60
4.3 Der MHC II - Komplex und seine Bedeutung in der Leber ... 61
4.4 Das Akut - Phase Protein HS - SAA 1 beta; Vorkommen und Funktion ... 62
4.5 Leber - Carboxylesterase und UDP - GalNAc Transferase als Zeichen der differenzierten Zellfunktion ... 63
4.6 Kritische Auseinandersetzung mit den gefundenen Genen... 63
4.7 Kritische Betrachtung der verwendeten Methoden... 65
5 Zusammenfassung ...67
6 Anhang...68
6.1 Selbstangesetzte Lösungen und Nährmedien:... 68
6.2 Grundlegende Informationen zu den verwendeten Komponenten und Verfahren ... 70
6.3 Verwendete Primer... 73
6.4 Verwendete PCR - Ansätze ... 74
6.5 Verwendete Thermocycler - Programme... 77
6.6 Zusätzliche Informationen ... 79
6.7 Darstellung der kompletten Sequenzen der gefundenen Gene... 79
7 Literaturverzeichnis...83
8 Tabellen - und Abbildungsverzeichnis ...99
9 Lebenslauf ...101
10 Danksagung ...105
Abkürzungen
A Adenin (Purinbase)/ Adenosin (Nukleosid)
Ag Antigen
AIH Autoimmunhepatitis
Ak Antikörper
ALT Alanin - Amino - Transferase / Glutamat - Pyruvat - Transaminase ALV akutes Leberversagen
APS Ammoniumpersulfat
AS Aminosäure(n)
ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare/ binding protein
C Cytosin (Pyrimidinbase)/ Cytidin (Nukleosid) cDNA complementary DNA
CRP C - reaktives Protein CT Computer Tomographie CTL cytotoxische T Lymphozyten
DD Differential Display/ Differentialdiagnose DEPC Diethylpyrocarbonat
d.F. der Fälle
DIG Digoxigenin/ Disseminierte intravasale Gerinnung DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleinacid/ Desoxyribonukleinsäure
ds double stranded
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EtBr Ethyliumbromid
EtOH Ethanol
F Abkürzung für die FHF - Proben bei der Beschriftung der Gelbilder FFP Fresh Frozen Plasma/ gefrorenes Frischplasma
FHF fulminant hepatic failure/ fulminantes Leberversagen 5 - FU 5 - Fluorouracil
G Guanin (Purinbase)/ Guanosin (Nukleosid)/
Abkürzung für die gesunden Proben bei der Beschriftung der Gelbilder
GalNAc N - Acetylgalaktosamin
GAPDH Glycerinaldehyd - 3 - Phosphatdehydrogenase
GI Gastrointestinal
h Stunde(n)
HAV Hepatitis A Virus HBV Hepatitis B Virus
HCV Hepatitis C Virus
HH hereditäre Hämochromatose HLA Humanes Lymphozytenantigen
HPLC high - pressure liquid chromatography (Hochleistungsflüssigkeits - Chromatografie)
HS Homo sapiens
ICE IL - 1β converting enzyme IFN γ Interferon gamma
IL Interleukin
kb Kilobasen
LB - Medium Luria - Bertani Medium LPS Lipopolysaccharid
i.S. im Serum
LTX Lebertransplantation
M Mol/l = Molar
MESA MOPS - EDTA - Sodium Acetate
min Minute(n)
MHC Major histocompatibility complex (Hauptimmunitätskomplex - HLA System)
MOF multi organ failure
MOPS - Puffer 3 - N - Morpholinopropansulfonsäure Puffer mRNA messenger Ribonukleinsäure (Boten - RNS)
N N/l = normal
NCBI National Center for Biotechnology Information Neg. Negativkontrolle
NK - Zellen Natürliche Killerzellen NTP Nukleosidtriphosphat dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
ddNTP Didesoxynukleotidtriphosphat OD optical density (Extinktion) PBC Primär biliäre Zirrhose
PBMC peripheral blood mononuclear cells
PCR Polymerase chain reaction/ Polymerase - Kettenreaktion
PG Prostaglandin
PR - 3 Proteinase - 3
RAP Random arbitrarily primed
RIA Radioimmunoassay
RNA ribonucleinacid (Ribonukleinsäure/ RNS) rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Raumtemperatur bzw. Reverse Transkriptase RT - PCR Reverse Transkription - Polymerase Kettenreaktion
SAA Serum Amyloid A
SDS Sodium dodecylsulphate (Natriumdodecylsulfat)
s Sekunde(n)
ss single stranded
SSC Sodium Chloride - Sodium Citrate (Natriumchlorid - Natriumcitrat) T Thymin (Pyrimidinbase)/ Thymidin (Nukleosid)
TAE Tris - HCl - Acetat - EDTA
Taq DNA Polymerase DNA - abhängige DNA - Polymerase der Bakterienspezies Thermophilus bzw. Thermus aquaticus YT1
TBE Tris - HCl - Borat - EDTA TE Tris - HCl - EDTA
TEMED N - N - N’ - N’ - Tetramethylethylendiamin TMAC Tetramethylammoniumchlorid TNFα, β, γ Tumornekrosefaktor α, β, γ
U Uracil (Pyrimidinbase)/ Uridin (Nukleosid) UDP - GalNAc UDP N - Acetylgalactosaminyltransferase
1 Einleitung
1.1 Akutes Leberversagen (ALV)
Die Leber spielt eine zentrale Rolle in unterschiedlichsten Prozessen des menschlichen Körpers. So finden sowohl Stoffwechselprozesse (Abbau von Ammoniak, allg. Entgiftung, etc.), als auch Syntheseleistungen (Gerinnungs - und Komplementfaktoren, Albumin, Cholinesterase, Akut - Phase - Proteine, etc.) in der Leber statt. Außerdem hat die Leber eine wichtige Funktion als lymphatisches Gewebe, das sowohl mit pathogenen Erregern als auch mit Toxinen in Kontakt kommt und eine Immunantwort initiierten kann. Aufgrund der Komplexität und der vielfältigen Funktionen dieses Organs besteht außer einer Transplantation keine Möglichkeit eines funktionellen Ersatzes. Daher stellt das akute Versagen der Leber ein großes therapeutisches Problem dar, da nur symptomatische Therapieansätze existieren. Das ist von besonderer Bedeutung, wenn das Zeitfenster von Diagnose bis zur Enzephalopathie und dem Versterben der Patienten nur wenige Tage bis Wochen beträgt, wie es beim ALV der Fall ist.
1.1.1 Definition
Das Versagen der Leber wird definiert als Ausfall der Leberfunktion bei Patienten, die vorher keine chronische Lebererkrankung hatten und der klinischen Trias: Ikterus, Gerinnungsstörungen und Bewusstseinsstörungen [1]. Das ALV wird in 3 Verlaufsformen unterteilt. Je nach dem Zeitintervall zwischen Ausfall der Leberfunktion und Beginn der
Enzephalopathie unterscheidet man: fulminant (< 7 Tage), akut oder subfulminant (8 – 28 Tage) und subakut bzw. protrahiert (> 4 Wochen) [2], [3]. Der Begriff „akutes Leberversagen“ wird in der Regel als Überbegriff für die zeitabhängigen Subformen verwendet.
1.1.2 Epidemiologie und Ätiologie
Dieses Krankheitsbild kommt in Deutschland mit 100 - 150 Fällen pro Jahr relativ selten vor, wobei zu beachten ist, dass therapeutisch, falls die Patienten sich nicht spontan erholen, langfristig nur eine Lebertransplantation in Frage kommt [3]. Die Ätiologie ist vielfältig und
zeigt die in Tabelle 1 dargestellte Verteilung, wobei medikamentenbedingte ALV (insbes. die Paracetamol - Intoxikation) mit 44 % die häufigste Ursache darstellen, gefolgt von viralen Hepatitiden mit 25 % und kryptogenen mit 19 %.
Tabelle 1: Häufigkeit der Ursachen für ein ALV (aus [1]) Ätiologie
Paracetamol - Intoxikation
Kryptogen* Hepatitis B Virus
Andere Ursachen
Andere Medikamente/Toxine
Hepatitis A Virus Insgesamt **
(n = 1783) 34 % 19 % 18 % 12 % 10 % 7 %
* Ätiologie unbekannt und seronegativ für akute Infektionen durch Hepatitis A und B Viren (Non - A, Non - B Hepatitis).
** Zusammenfassung verschiedener Studien aus unterschiedlichen Ländern [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]
Eine Studie aus den USA, die Daten aus 13 verschiedenen Kliniken (12 Transplantationszentren) zusammenfasst, zeigt, dass von 295 Patienten 25 % spontan überlebten, 41 % transplantiert werden mussten und 34 % verstarben (ohne Transplantation) [4]. So dass man davon ausgehen kann, dass ca. 75 % der Patienten mit ALV eine Lebertransplantation benötigen bzw. versterben. In den USA versterben jährlich ca. 2000 Patienten im Rahmen eines ALV [11].
Die Daten deuten darauf hin, dass der Anteil an spontanen Remissionen unter anderem von der ursächlichen Erkrankung abhängig ist. So war die höchste Rate an spontanen Remissionen bei ALV durch Paracetamol - Intoxikation (57 %) zu verzeichnen. Im Gegensatz dazu stand das M. Wilson - bedingte ALV, bei dem kein Patient spontan überlebte und 94 % (17 von 18 Patienten) transplantiert werden mussten. Dies ist die höchste Rate an Transplantationen. Prozentual am wenigsten Lebertransplantationen mussten im Zusammenhang mit einer Autoimmunhepatitis (29 %) und einer Paracetamol - Intoxikation (12 %) durchgeführt werden. Nach dieser Studie hatte das Alter der Erkrankten keinen Einfluss auf den Verlauf, wobei das auch im Zusammenhang mit der Selektion bei Überweisungen zu Transplantationszentren zu tun haben könnte [4].
Außer den oben erwähnten Ursachen, kommen noch weitere, seltenere in Betracht, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind.
Tabelle 2: Seltene Ursachen für ein ALV (aus [1]) M. Wilson (in der Initialen Phase)
Andere Infektionen (z.B.: Epstein - Barr - und Herpesviren, Tuberkulose)
Vaskulär (z.B. Budd Chiari - Syndrom, hepatische Venenverschlusskrankheit (hepatic veno - occlusive disease))
Toxine (z.B. Ingestion von Amanita phalloides (grüner Knollenblätterpilz), CCl4*) Akute Schwangerschaftsfettleber
Autoimmunhepatitis (in der initialen Phase)
Maligne Infiltrationen (z.B. im Rahmen von Lymphomen, Melanomen und Mamma - Ca) Ischämie (z.B.: Hypotension, Hitzschlag)
Reye - Syndrom
Primäre Funktionsuntüchtigkeit/ Funktionsunfähigkeit des Spenderorgans nach Lebertransplantation
* CCl4, Tetrachlorkohlenstoff
Der zeitliche Verlauf steht in Zusammenhang mit der Ätiologie und der Prognose. So ist eine Entwicklung bis zur hepatischen Enzephalopathie innerhalb einer Woche charakteristisch für eine hepatische Ischämie oder Paracetamolvergiftung. Im Gegensatz dazu wird ein Intervall von länger als 4 Wochen eher bei viralen Hepatitiden oder kryptogenen ALV beobachtet [12]. Patienten mit einer Zeitspanne von über 2 Wochen vor Entwicklung einer Enzephalopathie haben eine höhere Wahrscheinlichkeit, Symptome einer portalen Hypertension (Aszites, Nierenversagen) zu entwickeln [13], wohingegen Patienten mit weniger als 4 Wochen Krankheitsdauer eher dazu neigen, ein Hirnödem zu bekommen [14]. Besteht der Ikterus weniger als 1 Woche vor Einsetzen der Enzephalopathie, deutet das auf eine schlechte Prognose hin [15].
1.1.2.1 Medikamente
Unter den durch Medikamente verursachte ALV ist vor allem die Paracetamol - Intoxikation von Bedeutung, da Paracetamol nicht verschreibungspflichtig ist und somit relativ häufig in suizidaler Absicht eingenommen wird. Paracetamol ist direkt hepatotoxisch und kann bei Überdosierung (> 12 g) zu ausgedehnten Leberzellnekrosen und konsekutiv zu ALV führen.
Aber auch schon niedrigere, therapeutische Dosen (ab 4 g) können bei Begleitfaktoren wie z.B. Fasten, chronischer Alkoholabusus oder chronische Einnahme von Medikamenten, die die p450 - Cytochromoxidasen in der Leber induzieren, zu einem ALV führen [16], [17]. Es kommt zur Bildung eines toxischen instabilen Metaboliten, der über eine Erschöpfung des Gluthathion - Pools und Lipidperoxidation zu einer Zellschädigung führt [3]. Die Klinik entwickelt sich typischerweise etwas verzögert bis am 3. - 4. Tag nach Einnahme eine sich schnell verschlechternde Enzephalopathie eintritt. Häufig kommt es zu einer metabolischen
Azidose und zu einem frühen Nierenversagen, was jeweils mit einer Verschlechterung der Prognose assoziiert ist [3].
Außerdem kommen noch einige andere Medikamente in Frage, die ein ALV auslösen können. Dazu gehören unter anderem dosisunabhängig Halothan [18] als klassisches Beispiel für eine idiosynkratische Medikamentenreaktion, Isoniazid [19], [20], [21], [22]
, Sulfonamide [23], Phenytoin [24] und Glitazone [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. und ebenso wie Paracetamol dosisabhängig Valproinsäure [32], [33], [34]
.
1.1.2.2 Hepatotrope Viren
HAV und HBC sind unter den hepatotropen Viren relativ die häufigsten Verursacher eines ALV (siehe Tabelle 1).
Tabelle 3: Klinische Aspekte der verschiedenen Hepatitis - Infektionen (aus [31])
Feature HAV HBV HCV HDV HEV
Übertragung
Fäkal - oral Häufig Nicht
wahrscheinlich Nein Nein Häufig
Parenteral Selten Häufig Häufig Häufig Unbekannt
Sexuell Nein Häufig Ja, selten Ja, selten Nein Vertikal Nein Häufig Ja, selten Nein Ja, unbekannte
Häufigkeit Inkubationszeit
(in Tagen)
15 - 50
(∅ 25) 60 - 180 14–160 21–45 15–60 Klinische
Symptome bei Präsentation
5 % Kinder, 70 %–80 % Erwachsene
10 %–15 % 5 %–10 % 10 %, höher bei Superinfektion
70–80 % bei Erwachsenen
Ikterus Erw. 30 %
Kinder < 5 % 5 %–20 % 5 %–10 % Unbekannt Häufig Fulminant < 1 % ≤ 1 % Selten 2 %–7,5 % < 1 %, bis zu 30 %
bei Schwangeren Diagnostische
Tests
Akute Infektion IgM anti - HAV HBsAg, IgM anti - HBc
HCV RNA (anti -
HCV) IgM anti - HDV IgG anti - HEV (Serokonversion) Chronische
Infektion Entfällt HBsAg, IgG anti - HBc
Anti - HCV (EIA)
RIBA, HCV RNA IgG anti - HDV Entfällt Immunität IgG anti - HAV IgG anti - HBc,
anti - HBs Unbekannt Entfällt Entfällt
Feature HAV HBV HCV HDV HEV Sterberate 0,1 %–2,7 % 1 %–3 % 1 %–2 % < 1 %
Simultaninfektion 0,5 %–4 %
> 5 % Superinfektion
1,5 %–21 % bei Schwangeren Chronische
Infektion Keine < 5 % bei
Erwachsenen 80 %–90 % 80 %
Superinfektion Keine
> 90 % Neugeborene
≤ 5 % Simultaninfektionen
Hepatitis A Virus
Das Hepatitis A Virus (HAV) ist ein RNA - Virus, das zu den Hepatoviren der Picornaviridae Familie gerechnet wird [35] und erstmals 1973 im Elektronenmikroskop sichtbar gemacht wurde [36]. Die Inzidenz beträgt in Deutschland laut Daten des Robert - Koch - Instituts 4,7/100.000/Jahr [37], wobei ein Rückgang zu beobachten ist [38]. Die Seroprävalenz liegt im Durchschnitt bei 46,5 %, wobei sich eine ausgeprägte Altersabhängigkeit mit einem
kontinuierlicher Anstieg abzeichnet [39]. Während in den Altersklassen der 18 - bis 19 - Jährigen nur etwa 7 % HAV - Antikörper aufweisen, steigt die Prävalenz bei den 40 - bis
49 - Jährigen auf 40,9 % und bei den 70 - bis 79 - Jährigen schließlich auf 89,2 % an [39]. Die Inzidenz des ALV beträgt zwischen 0,1 % und 0,4 % der hospitalisierten Patienten [3]. Hierbei ist zu beachten, dass nur ein sehr kleiner Teil der Patienten hospitalisiert wird und somit die absolute Inzidenz weit niedriger liegen dürfte.
Die Übertragung erfolgt meist fäkal - oral und ist daher sehr eng mit dem Hygienestandard verbunden. Sie führt nach einer Inkubationszeit von 15 - 50 Tagen zu einem variablen, vom Alter und den hygienischen Bedingungen abhängigen Verlauf. Je besser der hygienische Standard, desto später erkranken die Menschen im Durchschnitt und desto höher ist die Wahrscheinlichkeit eines symptomatischen Verlaufs. So verlaufen 90 % der Infektionen bei Kindern unter 5 Jahren asymptomatisch (< 5 % Ikterus) und 70 - 80 % der Erwachsenen haben symptomatische Verläufe (30 % Ikterus) [40], [41]. Die schwersten klinischen Verläufe zeigen sich bei Patienten über 50 Jahren [31]. Aufgrund des durchschnittlich jungen Alters verlaufen die meisten HAV - Infektionen asymptomatisch [42] und hinterlassen eine lebenslange Immunität (Anti - HAV - IgG) [31]. Neben der bekannten direkten zellschädigenden Wirkung des Virus scheinen nach neueren Befunden ebenso wie bei anderen hepatotropen Viren (z.B. HBV und HCV) die Immunantwort des Patienten eine entscheidende Rolle zu spielen [3], [43].
Bei einer HAV - Infektion gibt es keine chronischen Verläufe und insgesamt führen nur < 1 % zu einem ALV, wobei die Zahlen abhängig sind vom Alter des Patienten und eventuell
vorliegenden Begleiterkrankungen. So kommt das ALV gehäuft bei Patienten über 40 Jahren und bei Kinder unter 11 Jahren vor [44], [45].
Bei zugrunde liegenden chronischen HBV - oder HCV - Infektionen kommt es gehäuft zu schweren Verläufen und der Entwicklung eines ALV, besonders bei Vorliegen einer chronischen Hepatitis oder einer Zirrhose [44], [46], [47], [48], [45]
.
Hepatitis B Virus
Der Hepatitis B Virus (HBV) ist ein DNA - Virus aus der Familie der Hepatnaviridae. Weltweit sind nach Schätzungen des Robert - Koch - Instituts ca. 350 Millionen Menschen mit dem Hepatitis B Virus infiziert, dies entspricht etwa 5 - 7 % der Weltbevölkerung. Die Inzidenz beträgt in der BRD 2,96/100.000/Jahr [49] mit rückläufiger Tendenz [50]. Der Altersgipfel befindet sich zwischen dem 20. und 29. Lebensjahr [49]. Die Infektion erfolgt parenteral, sexuell und vertikal, die Inkubationszeit dauert bis zu 180 Tage [31], [51]. Die akute Infektion heilt in rund 90 % d.F. aus und führt bei immunkompetenten Erwachsenen nur in 5 - 10 % d.F. zu einer chronischen Hepatitis [49], [52], [53], [54]. In diesem Zusammenhang ist das extrem hohe Risiko von immungeschwächten Patienten und Neugeborenen, die perinatal infiziert wurden, mit ungefähr 90 % chronischer Verläufe zu erwähnen [31], [49], [51], [54].
Auch wenn HBV - Infektionen die häufigste virale Ursache für ein ALV sind, kommt es insgesamt nur sehr selten zu einem fulminanten Verlauf (etwa 1 % der hospitalisierten Patienten) [3]. Zu beachten ist die gesteigerte Häufigkeit bei einer Simultan - bzw.
Superinfektion mit HDV (siehe unten). Außerdem kann bei einem chronischen Verlauf eine Superinfektion mit HAV zu einem ALV führen, insbesondere, wenn bereits eine Zirrhose vorlag [44], [46], [47], [48], [45].
Das Besondere an diesem Virus ist, dass er keine direkte pathogene Wirkung auf die Hepatozyten besitzt, sondern die Immunantwort des infizierten Wirts auf HBV - kodierte Antigene auf den Zielzellen zu der Zellzerstörung führt [55]. So kommt es bei Kindern mit einem angeborenen Immundefekt und gleichzeitiger HBV - Infektion zu chronischen Verläufen ohne nennenswerte Zellzerstörung. Bei fulminanten Verläufen ist im Gegensatz dazu eine massive Immunantwort zu beobachten [31], [56].
Hepatitis C Virus
Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein RNA - Virus, der zu der Familie der Flaviviren gehört [35], [57]. Es stellt die Hauptursache für chronische Hepatitiden, Leberzirrhose und das hepatozelluläre Karzinom dar und ist die Hauptindikation für Lebertransplantationen weltweit [31]. Schätzungsweise sind 2 - 3 % der Weltbevölkerung chronisch infiziert [58]. Der Altersgipfel liegt bei 30 - 49 Jahren [31]. Man kann davon ausgehen, dass die Prävalenz von HCV - Antikörpern in der BRD bei 0,5 - 0,7 % der Bevölkerung liegt [58] und ca. 80 % der
Infektionen ohne Therapie chronisch verlaufen [31], [58]. Die Übertragung erfolgt vor allem parenteral, seltener sexuell oder vertikal [59]. Das HCV - induzierte ALV kommt in den westlichen Ländern sehr selten vor und spielt eine untergeordnete Rolle [6], [60], [61], [62], [63], [64]. In Japan scheint HCV als Ursache für ein ALV häufiger vorzukommen, wobei die Ursache dafür bisher ungeklärt ist [65].
Interessanterweise scheint der progrediente Verlauf der Leberzellzerstörung auch bei der Infektion mit diesem Virus durch die Reaktionen des Immunsystems der Patienten vermittelt zu sein [66]. Andererseits wird generell die Gewebeschädigung bei Infektionen mit Flaviviren durch den direkten zytotoxischen Effekt des Virus verursacht und der Grad der Leberschädigung beim HCV - assoziierten ALV entspricht der Höhe der viralen Replikation [66], [67]. Diese Beobachtung führt zu der Vermutung, dass HCV sowohl direkt als auch indirekt zur Schädigung der Hepatozyten führt.
Hepatitis D Virus
Bei dem Hepatitis D Virus (HDV) handelt es sich um ein inkomplettes RNA - Virus (Viroid), das für sein Coating und die Freisetzung das Genom des HBV und dementsprechend eine gleichzeitige HBV - Infektion benötigt [31]. Die Replikation innerhalb der Hepatozyten erfolgt unabhängig von HBV [31]. Die Transmission erfolgt meist parenteral, kann aber auch sexuell sein und ist über eine Transfusion nahezu ausgeschlossen [68]. Über die Assoziation von Infektionsart (Simultan - oder Superinfektion) und klinischem Verlauf scheint noch keine Einigkeit zu bestehen. Nach Angaben des Robert - Koch - Instituts kommt es bei einer HDV - Superinfektion gehäuft zu ALV [69] und sie nimmt in 90 % d.F. einen chronischen Verlauf [68]. Im Gegensatz dazu beschreiben andere Veröffentlichungen, dass eine Simultaninfektion von HDV und HBV mit einem erhöhten Risiko für schwere und fulminante Verläufe einhergeht, aber keinen Einfluss auf die Entwicklung einer chronischen Hepatitis hat [70]. Allerdings besteht Einigkeit über die Tatsache, dass eine Superinfektion mit HDV mit einer höheren Wahrscheinlichkeit zu einem chronischen Verlauf führt [70].
Insgesamt kommt ein ALV bei einer HDV - Infektion in 2 - 7,5 % d.F. vor (abhängig vom Infektionsmodus) [31] und die Mortalitätsrate schwankt zwischen < 1 % bei einer Simultaninfektion und > 5 % bei einer Superinfektion [31].
Hepatitis E Virus
Bei dem Hepatitis E Virus handelt es sich um einen RNA - Virus, der bisher keiner Virenfamilie eindeutig zugeordnet werden konnte. Es werden entsprechend ihrer geographischen Verteilung 4 Genotypen unterschieden (siehe Tab. 4) [31].
Tabelle 4: Gegenüberstellung der verschiedenen Genotypen und deren geographischen Verteilung [31]
Genotyp 1 Asien Genotyp 2 Mexiko Genotyp 3 Nordamerika Genotyp 4 Teile von China und
Taiwan
Die Antikörperprävalenz für HEV liegt bei ca. 1 % der gesunden Bevölkerung in Deutschland [71]. Besondere Bedeutung hat das HE - Virus bei der Infektion von Schwangeren, wo es eine extrem hohe Rate an fulminanten Verläufen zeigt (30 % d.F., im Gegensatz zu < 1 % bei den anderen Patienten; siehe Tabelle 3) [31]. Die mütterliche Sterberate steigt mit dem Stadium der Schwangerschaft [72]. Sie beträgt während des ersten Trimenon 1,5 %, 8,5 % im zweiten Trimenon und steigt bis auf 21 % im letzten Trimenon [73]. Ebenso ist die fetale Sterberate in utero und direkt nach der Geburt gegenüber akuten viralen Hepatitiden anderer Ätiologie gesteigert [74], [75]. Die Übertragung erfolgt wie bei dem Hepatitis A Virus fäkal - oral.
Andere hepatotrope Viren
Auch andere Viren können in seltenen Fällen zu einem ALV führen. Dazu gehören die Herpes - simplex - Viren Typ 1 und 2, Herpesvirus Typ 6, Varizella - Zoster - Virus, Epstein Barr - und Zytomegalieviren. Auch nach Parainfluenza - Infektion sind vereinzelt fulminante Hepatitiden beschrieben worden [3]. Außerdem wurde 1997 ein neuer DNA - Virus mittels representational difference analysis (RDA) durch eine japanische Forschungsgruppe identifiziert, der entsprechend der Initialen des Patienten als „TT - Virus“ bezeichnet wurde (häufig auch als „transfusion - transmitted virus“ interpretiert) [76]. Zu beachten ist die außerordentlich hohe Prävalenz in der Normalbevölkerung weltweit [77]. So ist davon auszugehen, dass in Deutschland bei 20 - 40 % der Bevölkerung TTV - Sequenzen nachweisbar sind [77]. Auch dieser Virus ist in der Lage ein ALV hervorzurufen.
1.1.2.3 Kryptogenes ALV
Dabei handelt es sich um ein ALV, bei dem weder Marker der bisher bekannten Hepatitisvirus - Infektionen noch Alkoholmissbrauch oder andere Noxe nachweisbar sind (idiopathische = kryptogene Hepatitis). In 19 % d.F. findet sich keine Ursache für das ALV (siehe Tabelle 1), wobei die Inzidenz mit Werten von 15 % bis 44 % sehr unterschiedlich angegeben wird [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Ursprünglich war die Definition auf Non - A -, Non - B -
Hepatitiden bezogen und man erwartete mit der Einführung der PCR die Identifizierung der anderen Ursachen. Dies ist bis heute aber nur begrenzt gelungen.
Um einen eventuell beteiligten genetischen Aspekt in der Pathogenese des akuten Leberversagens bestimmen zu können, wurden bei den hier durchgeführten Experimenten sowohl Lebergewebe von kryptogenen ALV als auch von ätiologisch geklärten ALV den gesunden Proben gegenübergestellt, um ein möglichst differenziertes Bild zu erhalten. Diese Proben wurden Lebergeweben mit Zirrhosen bekannter Ätiologie gegenübergestellt, um den akuten von dem chronischen Verlauf abgrenzen zu können.
1.1.2.4 Andere Ursachen
Zu den anderen Ursachen, auf die hier noch kurz eingegangen werden soll, gehören: die Hämochromatose, der Morbus Wilson, das Budd - Chiari - Syndrom, die Knollenblätterpilz - vergiftung und die akute Schwangerschaftsfettleber.
Hämochromatose
Bei der Hämochromatose kommt es zu einer Eisenüberladung mit konsekutiver Parenchymschädigung. Am häufigsten kommt in Europa die hereditäre Hämochromatose (HH) vor, die autosomal - rezessiv vererbt wird [78]. Es ist dabei das HFE - Gen auf Chromosom 6 im Bereich der HLA - Region betroffen [79] und die zwei häufigsten Mutationen werden als C282Y (G → A bzw. Cystein → Thyrosin an Position 282 [78]) und H63D (C → G bzw. Histidin → Aspartat an Position 63 [78]) bezeichnet. Dadurch kommt es zu einer Störung der Interaktion mit dem Transferrinrezeptor (das HFE - Protein bildet einen Komplex mit dem Transferrinrezeptor [31]
)
und damit zu einer gesteigerten Eisenresorption im Dünndarm. Zu den Ursachen der sekundären Hämochromatose gehören eine ineffektive Erythropoese (z.B. Thalassämia major), gesteigerte orale Eisenaufnahme und die seltene kongenitale Atransferrinämie. Davon zu unterscheiden ist die parenterale Eisenüberladung, die immer iatrogen ist [31].Aufgrund dieses Überangebots von Eisen kommt es zuerst in der Leber als primärem Eisenspeicherorgan und nachfolgend auch in anderen Bereichen (Pankreas, Herz, Schilddrüse, Gonaden, Hypothalamus und Gelenken
)
zu ausgeprägten Zellzerstörungen mit Fibrosierung und nachfolgender Zirrhose [78]. Aufgrund der Fortschritte in der Therapie und der früheren Diagnose ist die Entwicklung einer Zirrhose nur noch in 5 - 10 % d.F. zu beobachten [80], [81], im Vergleich zu über 50 % in den 60er Jahren des vorherigen Jahrhunderts [82]. Ein ALV kommt vor, ist aber ausgesprochen selten [31]. Symptome treten durchschnittlich erst nach der 4. Lebensdekade auf. Die meisten Patienten befinden sichzum Zeitpunkt der Diagnosestellung zwischen dem 40. und 50. Lebensjahr [31], [80], [81], [82]. Es ist dabei zu beachten, dass bei Frauen die Symptome wenn überhaupt relativ später und in abgeschwächter Form auftreten. Dies dürfte mit dem physiologisch höheren Eisenbedarf der Frauen im Vergleich zu den Männern in Zusammenhang stehen [78]. Das Verhältnis Frauen : Männern beträgt je nach Studie zwischen 1 : 2 und 1 : 8 [80], [81], [82]
. Diagnostisch wegweisend sind das Serumeisen, die totale Eisenbindungskapazität, die errechnete Transferrinsättigung (Eisen/ totale Eisenbindungskapazität x 100 %) und das Serumferritin [31]. Außerdem kann man Mutationsanalysen bezüglich des HFE - Gens durchführen (→ C282Y und H63D). Therapeutisch gilt nach wie vor der Aderlass als Mittel der Wahl [31].
Morbus Wilson
Hierbei handelt es sich um eine seltene, autosomal - rezessiv vererbte Kupfer - stoffwechselerkrankung, die durch eine progressiv verlaufende Lebererkrankung und/oder neurologische Ausfallserscheinungen charakterisiert ist [83]. Die Prävalenz liegt in den USA bei 1 : 40.000. Die Ursache liegt in einer Mutation eines Gens auf Chromosom 13q14.3, dem Wilson - Gen (ATP7B), bei dem es sich um eine Kupfer - ATPase handelt [83]. Diese wird vor allem in der Leber, der Niere und in leicht veränderter Form im Gehirn produziert. Dadurch kommt es zu einer verminderten biliären Ausscheidung von Kupfer in den Darm (nur etwa 20 % des Normalwertes). Außerdem ist das Ceruloplasmin, ein Kupfer - Transportprotein, das über 80 % des Kupfers im Plasma transportiert, reduziert [83]. Es scheint der Einbau von Kupfer in das Ceruloplasmin gestört zu sein. Kupfer wirkt als Schwermetall zytotoxisch und führt zu massivem Zelluntergang und es kommt zu einer Fibrosierung und Degeneration der Leber bis hin zu einer meist mikronodulären Leberzirrhose [83]. Hierbei ist zu beachten, dass die Leberveränderungen erst nach 8 - 16 Jahren auftreten. Außerdem kommt es häufig zu Kupferablagerungen in der Kornea, dem sog. Kayser - Fleischer - Ring, und zu Ablagerungen in den Nierentubuli. Ein akutes Leberversagen kommt nur äußerst selten vor [83] und dann vor allem bei jungen Menschen in der 2. - 3. Lebensdekade [3]. Ausgelöst wird diese Dekompensation manchmal durch plötzliche körperliche Belastung, wobei die zugrunde liegenden Pathomechanismen noch nicht geklärt sind [3]. Typisch ist die klinische Trias mit ALV, Coombs - negativer hämolytischer Anämie und nur gering erhöhten Leberenzymwerten (bes. der alkalischen Phosphatase (AP)) [84]. Diagnostisch wegweisend sind die extrem erhöhte Urin - Kupfer - Ausscheidung und die fast immer erniedrigten Werte für Ceruloplasmin [3]. Auch deutet ein Verhältnis von Gesamtbilirubin zur AP i.S. > 2 bei Patienten mit einem ALV auf einen Morbus Wilson hin [85].
Budd - Chiari - Syndrom
Dieses seltenen Syndrom ist gekennzeichnet durch eine posthepatische Behinderung des venösen Blutflusses mit Stau und konsekutivem Leberversagen [86]. Die Ätiologie lässt sich meistens nicht eindeutig klären, am häufigsten werden hämatologische, tumoröse, infektiöse oder schwangerschaftsbedingte Ursachen gefunden [86]. Es wird eine fulminante, eine akute und eine chronische Form unterschieden, wobei nur die fulminante Variante, die meistens bei schwangeren Frauen zu beobachten ist, zu einem ALV führt [86].
Akute Schwangerschaftsfettleber
Die akute Schwangerschaftsfettleber ist eine Komplikation, die im letzten Trimenon auftritt und durch eine massive, mikrovesikuläre Verfettung der Leber gekennzeichnet ist [3]. Diagnostisch wichtig ist die Abgrenzung gegenüber anderen schwangerschaftsassoziierten Leberfunktionsstörungen aus der Gruppe der schweren Gestosen, wie z.B. das HELLP - Syndrom (Hypertension, Elevated Liver enzymes, Low Platelets) [87].
Knollenblätterpilzvergiftungen (Amanita phalloides)
Diese Vergiftungsform kommt vor allem im Sommer und Herbst in unseren Breiten vor und ist für ca. 90 % aller tödlicher Pilzvergiftungen verantwortlich [88]. Die zytotoxische Wirkung wird über die direkte Bindung des Amanita - Toxins an spezifische Rezeptoren der Hepatozyten vermittelt. Dabei handelt es sich um ein thermostabiles zyklisches Oktapeptids, das zu der Klasse der Hepatotoxine gehört [89], [90]. Ein Pilz enthält ca. 50 mg des Toxins, wobei die minimale letale Dosis für Erwachsene 0,1 mg/kg beträgt [3], [89], [90]. Es zeigt sich nach einer Latenzzeit von 6 - 12 Stunden ein typischer klinischer Verlauf. So kommt es zu schweren abdominellen Beschwerden mit Schmerzen, Übelkeit und – häufig blutigem – Erbrechen mit nachfolgendem Durchfall sowie Atembeschwerden. Danach folgt eine relativ symptomarme Phase mit einer Dauer von 1 - 3 Tagen, wobei es in dieser Zeit zu einem massiven Anstieg der Transaminasen und einem raschen Abfall der Gerinnungsfaktoren kommt. Nach 3 - 5 Tagen zeigt sich dann das Vollbild eines ALV mit Ikterus und Koma hepaticum, häufig gefolgt von einem Multiorganversagen (bes. mit Niereninsuffizienz). Der Tod tritt nach etwa 8 Tagen bei 10 - 15 % der Erwachsenen und 50 % der jüngeren Kinder ein. Der Nachweis des Toxins erfolgt über den Urin mittels RIA [3], [88].
1.1.3 Klinik
Das klinische Erscheinungsbild ist bestimmt durch die zugrunde liegende Ursache, das Alter des Patienten, den Verlust der hepatischen Funktion und die Auswirkungen auf andere Organe. Initial zeigen sich oft unspezifische Allgemeinsymptome, wie Übelkeit, Erbrechen,
Müdigkeit und Abgeschlagenheit. Aufgrund der verminderten Leberfunktion kommt es im Verlauf zu einer reduzierten Elimination von Bilirubin (→ Ikterus), einer Abnahme der Leber - abhängigen Gerinnungsfaktoren I, II, V, VII, IX und X (→ erhöhtes Risiko für GI - und intrakranielle Blutungen), einer verringerten Glukosesynthese (→ Hypoglykämie) und einem deutlichen Laktatanstieg i.S. bei verminderter hepatischer Aufnahme und gleichzeitig gesteigerter peripherer Produktion durch anaerobe Glykolyse im Rahmen der Hypoxämie.
Jedoch wird die Wirkung auf den pH - Wert durch die abnehmende Bikarbonat (HCO3 - ) Elimination und der daraus resultierenden Erhöhung des pH - Wertes im Normalfall mehr als ausgeglichen (→ metabolischen Alkalose; nur ca. 5 % entwickeln eine metabolische Azidose, die mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist [3]). Eine Ausnahme stellt in diesem Zusammenhang die Paracetamol - Intoxikation dar, bei der sich meistens eine metabolische Azidose manifestiert, die ebenfalls mit einer schlechten Prognose verbunden ist [3]. Außerdem kommt es zu einer verminderten Ausscheidung von Ammoniak (NH3)/
Ammoniumionen (NH4+), deren Beteiligung bei der Entstehung des Hirnödems und der damit verbundenen hepatischen Enzephalopathie/ Koma noch ungeklärt ist und die einen gesteigerten Atemantrieb bewirken (Hyperventilation). Man geht davon aus, dass es sich bei dem pathophysiologischen Mechanismus um ein multifaktorielles Geschehen handelt.
Im Folgenden sollen die wichtigsten Komplikationen kurz dargestellt werden. Zu ihnen gehören das Hirnödem mit der hepatischen Enzephalopathie, Infektionen, gastrointestinale Blutungen und das Multiorganversagen.
1.1.3.1 Hepatische Enzephalopathie und Hirnödem
Die hepatische Enzephalopathie ist ein Teil der Definition des akuten Leberversagens, die allgemein in 4 Stadien unterteilt wird. Die pathophysiologischen Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt und wahrscheinlich ebenfalls multifaktoriell. Eine Theorie geht davon aus, dass die Gammaaminobuttersäure (GABA), die im Serum von Patienten mit ALV erhöht ist, zu einer „endogenen Narkose“ führt. Auch die Bildung „falscher Neurotransmitter“ wird diskutiert. Nachgewiesen ist nur die Tatsache, dass die Aufnahme stickstoffhaltiger Substanzen aus dem Darm die Symptomatik verschlechtert [3]. Außerdem können Komplikationen wie Hypoglykämie, Sepsis, Hypoxämie, okkulte Krampfanfälle und Hirnödem auch zu neurologischen Symptomen bzw. deren Verstärkung führen.
Ein Hirnödem wird bei bis zu 80 % der Patienten gefunden und ist bei Patienten im Koma fast immer vorhanden [91]. Die Pathogenese des Hirnödems ist ebenso noch kaum erforscht.
Eine Theorie ist, dass Neurotoxine aus dem Darm aufgrund der eingeschränkten Leberfunktion in den systemischen Kreislauf gelangen und zu neurologischen Schäden mit Ödem führen [91], [92]. Eine aktuellere Hypothese, das Ammoniak/Glutamin - Model, vermutet
eine intrazelluläre Glutaminakkumulation durch Hyperammoniämie als Ursache [93], [94]. Zwei Mechanismen scheinen grundlegend beteiligt zu sein. Zum einen eine Schwellung der Zellen im Gehirn (im Sinne eines zytotoxischen Ödems) und zum anderen eine Störung der Blut - Hirn - Schranke (vaskuläres Ödem). Ein fortschreitendes Hirnödem kann zu einer Störung der Durchblutung mit irreversiblen Schäden bzw. zur zerebralen Herniation im Foramen magnum und zum Tode führen [31].
1.1.3.2 Infektionen
Als weitere Komplikation können bei etwa 80 % der Patienten mit ALV Infektionen auftreten, eine Bakteriämie ist in 20 - 25 % d.F. nachweisbar [95], [96]. Dafür sind in erster Linie 3 Faktoren verantwortlich. Erstens können Mikroorganismen aus dem Darm aufgrund des Untergangs von hepatischen Makrophagen (Kupffer’sche Sternzellen) über die Pfortader in den systemischen Kreislauf gelangen. Zweitens ist die Funktion der neutrophilen Granulozyten wegen der reduzierten Synthese von Akut - Phase - Proteinen in der Leber gestört. Und drittens werden bei ALV - Patienten gehäuft invasive Maßnahmen eingesetzt, die ihrerseits ein erhöhtes Risiko für Infektionen beinhalten. So kommt es, dass die häufigsten Eintrittstellen einer Infektion der Respirationstrakt und der Urogenitaltrakt sind [95]. Die häufigsten Erreger sind Staphylokokken, Streptokokken und gram - negative Stäbchen.
1/3 der Patienten zeigt im Verlauf einen Pilzbefall, meist mit Candida albicans [97]. Auch Aspergillusinfektionen scheinen hingegen früherer Annahmen häufiger vorzukommen und für bis zu 50 % der tödlich verlaufenden Pilzinfektionen nach Lebertransplantation verantwortlich zu sein [8], [98].
1.1.3.3 Gastrointestinale Blutungen
Aufgrund der verringerten Produktion von Gerinnungsfaktoren durch die Leber, einem gesteigerten peripheren Verbrauch, durch die qualitative und quantitative Störung der Thrombozyten und einem Antithrombin - III - Mangel besteht ein erhöhtes Risiko für GI - Blutungen, besonders aus Magen und oberem Dünndarm [3]. Außerdem zeigt sich bei diesen Intensivpatienten eine erhöhte Neigung zur Bildung von Stressulzera im Rahmen einer akuten Stauungsgastritis [99]. Im Gegensatz zum chronischen Leberversagen kommt es bei Patienten mit ALV nur ausgesprochen selten zu Blutungen aus Varizen [31].
1.1.3.4 Multiorganversagen
Als letzte Komplikation sei auf das Multiorganversagen eingegangen, das eine der Hauptkontraindikationen für eine Lebertransplantation darstellt. Klinisch manifestiert es sich in Form einer peripheren Vasodilatation mit Hypotension, eines Lungenödems, einer akuten
tubulären Nekrose und/ oder einer disseminierten intravasalen Gerinnung (DIG). Die zugrunde liegende Störung der Mikrozirkulation wird durch zwei Mechanismen gefördert.
Zum einen durch die Polymerisation von aus untergegangenen Hepatozyten freigesetztem Aktin innerhalb des Lumens der Kapillaren mit Aktivierung von Thrombozyten, die zu einer Zerstörung von Endothelien führen [100]. Zum anderen kommt es zu einer Ansammlung von vasoaktiven Stoffen im systemischen Kreislauf, da die Filterfunktion der Leber gestört ist [101]. Durch die Störung der Mikrozirkulation kommt es zu Gewebehypoxie mit sekundärer Schädigung extrahepatischer Organe, wie z.B. Darm, Niere, Lunge und ZNS. Das Ausmaß der Schädigung an diesen Organen ist prognoseentscheidend [3].
Respiratorische Probleme und die damit verbundenen intensivmedizinischen Schwierigkeiten spielen eine zentrale Rolle beim ALV. Unabhängig von der Ätiologie haben etwa 37 % der Patienten ein Lungenödem [102]. Bei Paracetamol - Intoxikation zeigte sich bei etwa 33 % der Patienten ein akutes Atemwegssyndrom (ARDS – acute respiratory distress syndrome) [103]. Ein akutes Nierenversagen kommt in über 1/3 d.F. vor und ist multifaktoriell bedingt [101].
1.1.4 Diagnostik
Die klinische Symptome wie das Auftreten eines Ikterus, die verringerten Lebergröße und das schnelle Auftreten einer hepatischen Enzephalopathie kombiniert mit den Abweichungen im Labor (Erhöhung von Transaminasen, Bilirubin und Ammoniak, Erniedrigung von Glukose und Zeichen einer Koagulopathie) ohne bekannte Vorgeschichte eines Leberleidens sind wegweisend. Bildgebende Verfahren wie Ultraschall und CT werden zur Beurteilung der Lebergröße und zur Klärung der Ätiologie verwendet (z.B. raumfordernde Prozesse, Gefäßverschlüsse, etc.). Eventuell können darüber hinaus auch Zeichen einer portalen Hypertension sichtbar gemacht werden, wobei diese eher bei chronischen Prozessen zu finden sind. Hinzukommen toxikologische Untersuchungen und unterschiedliche Serologien zur Differenzierung der Ursache.
Histopathologisch ist das ALV durch eine diffuse intrahepatische Infiltration von hauptsächlich aus T - Lymphozyten bestehenden Entzündungszellen mit massiven multilobulären Nekrosen charakterisiert [104], [105], wobei zu beachten ist, dass die Indikation zu einer Leberbiopsie bei ALV mit Vorsicht zu stellen ist. Auf der einen Seite kann die Histologie zwar manchmal entscheidende Hinweise erbringen (z.B. bei veno - okklusiver Ursache, bei Transplantatabstoßung), wobei in vielen Fällen nach einer Biopsie keine zuverlässigere Aussagen zu der Ätiologie oder der Spontanprognose getroffen werden kann [106]. Auf der anderen Seite besteht aufgrund der häufig gleichzeitig bestehenden Koagulopathie ein deutlich erhöhtes Blutungsrisiko bei der Leberpunktion, so dass darauf normalerweise verzichtet wird [3].
Zu den Differentialdiagnosen gehören eine akute Dekompensation einer chronischen Hepatitis, Sepsis und Präeklampsie/Eklampsie bei schwangeren Patientinnen.
1.1.5 Therapie
Nach wie vor sterben ungeachtet des Fortschritts in der Intensivmedizin die Mehrzahl der Patienten mit ALV (siehe nächster Abschnitt). Ein entscheidender Faktor in der Therapie des ALV ist die Identifizierung der Ursache, da bei bestimmten Ätiologien eine gezielte Therapie möglich ist und außerdem Aussagen über die Prognose getroffen werden können. So wirkt z.B. N - Acetylcystein (ACC) als Antidot bei einer Paracetamol - Intoxikation [107], [108] und die i.v. - Gabe von Aciclovir scheint bei Herpes - induzierten Fällen Wirkung zu zeigen [109]. Im Falle einer akuten Schwangerschaftsfettleber ist die sofortige Entbindung Therapie der Wahl.
Die Allgemeinmaßnahmen bestehen in erster Linie aus Substitution von Elektrolyten, parenteraler Ernährung und orale Eiweißkarenz kombiniert mit der Gabe von Laktulose [3], [110].
Die häufigsten Komplikationen sind die Magen - Darm - Blutung (> 50 %) und das Hirnödem (bis 80 % der Patienten mit Enzephalopathie Grad IV), das auch die häufigste Todesursache (70 %) darstellt [111]. Dementsprechend ist die suffiziente Therapie dieser Komplikationen von besonderer Wichtigkeit. Bei gestörter Gerinnung hat sich die Substitution von Antithrombin - III und von Gerinnungsfaktoren durch die Infusion von gefrorenem Frischplasma (FFP) etabliert, ebenso wie der Einsatz von H2 - Rezeptorantagonisten [112]
bzw. Protonenpumpenhemmer [113] zur Reduktion des Risikos für gastrointestinale Blutungen. Die wichtigste Therapieoption bei Entstehung eines Hirnödems ist die intravenöse Gabe von Mannitol [3]. Zur Aufrechterhaltung des arteriellen Mitteldrucks und damit des zerebralen Perfusionsdrucks bei hypotoner Kreislaufsituation sind Katecholamine Mittel der Wahl.
Unabhängig davon sind eine möglichst schnelle Identifizierung der Patienten, die eine Lebertransplantation benötigen (vergl King's College Kriterien, Kap. 1.1.6), und ein sofortiger Transfer in ein spezialisiertes Zentrum notwendig. Die Problematik besteht darin, Patienten, bei denen eine Spontanheilung eintritt, nicht unnötig zu transplantieren und trotzdem diejenigen, die eine Transplantation benötigen, frühzeitig einem entsprechenden Zentrum zuzuführen, da es gerade bei diesen Patienten häufig zu einer relativ plötzlichen, rapiden Verschlechterung des Allgemeinzustands kommen kann [31].
Das erste Labor sollte unter anderem auch folgende Untersuchungen zur Klärung der Ätiologie und um die Schwere der Erkrankung beurteilen zu können beinhalten: virale Serologie und toxikologisches Screening, Leber - und Nierenfunktionswerte und eine arterielle Blutgasanalyse [31].
In Fällen ohne Spontanheilung bleiben nur die Lebertransplantation und die supportive, intensivmedizinische Therapie bis ein geeigneter Spender gefunden ist. Ungefähr 7 % aller Lebertransplantationen werden aufgrund eines ALV durchgeführt [114].
Zusätzlich zu den Allgemeinmaßnahmen bestehen noch andere Möglichkeiten wie z.B.
operative Eingriffe, die das Blut an der Leber vorbeischleusen. Diese Maßnahmen sind jedoch nur geeignet, die Zeit bis zu einer Transplantation bzw. Spontanheilung zu überbrücken. Alternativ werden seit einiger Zeit auch andere Verfahren getestet, wobei auch diese die Gemeinsamkeit haben, dass sie nur als Überbrückung bis zu einer Lebertransplantation bzw. einer Spontanheilung zu sehen sind. Dazu gehören: die auxiliäre partielle orthotope Lebertransplantation [115], [116], die bioartificial liver devices, die Xenotransplantation [117] und die Transplantation von Hepatozyten [118], [119], [31].
Die Lebertransplantation nach AVL als einziges kuratives Verfahren [11] zeigt insgesamt nach einer Studie aus den USA, die den Zeitraum von 1987 - 1991 umfasst, eine Überlebensrate von 63 % [120]. Diese Rate steigt auf über 70 %, wenn man die Daten aus spezialisierten Zentren nimmt. Dabei schwanken die Werte zwischen 55 % [7] und 89 % [9], [121].
1.1.6 Prognose
Die Prognose ist stark abhängig von der auslösenden Ursache, dem Alter des Patienten und dem klinischen Verlauf. So ist bei einem fulminantem Verlauf die Prognose besser als bei langsameren Entwicklung [3]. Außerdem müssen die Patienten mit ALV allgemein in zwei Gruppen unterteilt werden. Zum einen die Gruppe mit den Patienten, bei denen es zu einer Spontanheilung kommt, und zum anderen die Patienten, die eine Lebertransplantation benötigen. Um die Patienten zu identifizieren, die eine Lebertransplantation wirklich benötigen, wurde im Rahmen einer großen Studie in England mit 588 Patienten mit ALV die relevanten Parameter (klinisch und biochemisch) bestimmt und nachfolgend bei weiteren 175 Patienten diese Parameter bestätigt. Diese Kriterien sind heute auch unter dem Namen
„King's College criteria“ bekannt [122]. In dieser Studie wurde eine deutliche Unterscheidung zwischen Patienten mit einer Paracetamol - Intoxikation und Patienten mit anderer Ätiologie gemacht. Die folgende Tabelle zeigt die Einflussgrößen, die mit einer schlechten Prognose assoziiert sind:
Tabelle 5: Mit einer schlechten Prognose assoziierte Einflussgrößen (Daten aus [3] und [122])
Schlechte Prognose
Ätiologie: Medikamente, Non A - C Hepatitiden
Alter: < 10 J., > 40 J.
Klinischer Verlauf: subakut
lang anhaltender Ikterus
deutliche Erhöhung des Bilirubins im Serum deutliche Verlängerung der Prothrombinzeit bei Paracetamol - Intoxikation: metabolische Azidose
erhöhtes Serum - Kreatinin als Zeichen für ein frühes Nierenversagen
Bei Patienten mit einem nicht durch Paracetamol verursachtem ALV war das Auftreten eines negativen prognostischen Faktors mit einer Mortalität von 80 % und beim gleichzeitigen Vorliegen von 3 Faktoren mit einer Mortalitätsrate von über 95 % verbunden [122]. Im Gegensatz dazu war bei Patienten mit Paracetamol - verursachtem ALV eine Steigerung der Sterblichkeit auf mindestens 55 % bei einem prognoseverschlechternden Faktor zu beobachten. Allerdings zeigt sich eine massiver Steigerung der Mortalität bei gleichzeitigem Vorliegen einer Azidose [122]. Die Ergebnisse dieser Studie wurden in einer weiteren Studie durch Anand et al. 1997 bestätigt [123]. Andere Parameter wie z.B. Faktor V - Level [124] und hepatische Volumenmessungen [125] zeigten keine Signifikanz bezüglich ihres prognostischen Wertes.
Auch wenn durch die Weiterentwicklung in der Intensivmedizin die Prognose verbessert wurde, gibt es bisher außer der Lebertransplantation keine kurative Therapie und die Überlebensrate nach Eintritt der Enzephalopathie liegt zwischen 30 % und 60 %, d.h. etwa jeder 2. Patient braucht eine Lebertransplantation [126]. Kommt es zur Heilung, bilden sich in der Regel alle Symptome vollständig zurück und nur selten bleiben Residuen [3].
1.2 Problemstellung
Beim ALV handelt es sich um eine akute, neu aufgetretene und lebensbedrohliche Einschränkung der Leberfunktion. Da außer einer Lebertransplantation keine kurativen Therapieoptionen bestehen, ist das Verständnis der molekularbiologischen Vorgänge von besonderer Bedeutung. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit durch Gegenüberstellung der Genexpression in verschiedenen Lebergeweben Hinweise auf die molekularen Abläufe bzw. eine eventuelle genetische Komponente beim ALV zu erlangen.
Um ein möglichst differenziertes Bild zu erhalten und die Bedeutung der gefundenen Gene beim ALV im Gegensatz zu anderweitig verursachten Lebererkrankungen nachvollziehen zu können, wurden bei den hier durchgeführten Experimenten sowohl Lebergewebe von ALV (mit bekannter und unbekannter Ätiologie) als auch von chronischen Verläufen (Zirrhosen) den gesunden Proben gegenübergestellt. So konnte durch Beurteilung unterschiedlicher Expressionslevel bei akuten und chronischen Verläufen eine genauere Interpretation der Bedeutung der gefundenen Gene stattfinden.
2 Material und Methoden
Die Bezugsquellen bzw. Rezepte für Reagenzien, Kits, Puffer und die verschiedenen PCR - Parameter (Primersequenzen, Reaktionsansätze, Thermocycler - Programme) finden sich im Anhang (Kap. 6).
2.1 RNA - Isolierung und First - Strand Synthese
2.1.1 Die verwendeten Lebergewebe
Die in dieser Arbeit verwendeten Lebergewebe stammen aus dem Bestand der Abteilung Gastroenterologie der Medizinischen Hochschule Hannover und beinhalteten vier gesunde Gewebe von Transplantationslebern, Gewebe von vier unterschiedlichen ALV und jeweils ein Gewebe von einer PBC - , einer AIH - , einer HBV - und einer HCV - bedingten Leberzirrhose. Die Gruppe der ALV - Proben besteht ihrerseits aus Geweben von zwei kryptogenen FHF, einem HBV - induziertem FHF (HBsAg negativ, Anti - HBc IgM positiv) und einem subfulminanten Verlauf einer AIH mit hohen LKM - Titern. Die Gegenüberstellung der Genexpression in gesunden Proben und in Proben mit sowohl chronischen als auch verschiedener akuten Verläufen sollte ein möglichst differenziertes Bild der molekularbiologischen Vorgänge beim ALV liefern.
Aufgrund der relativ niedrigen Inzidenz des ALV war die Anzahl der zur Verfügung stehenden Gewebeproben sehr begrenzt. Außerdem stellte die schlechte RNA - Qualität aufgrund der krankheitsbedingten deutlichen nekrotischen Veränderungen mit der damit verbundenen RNA - Degradation in den Gewebe bei Entnahme eine Herausforderung an die verwendeten molekularbiologischen Verfahren dar.
2.1.2 RNA - Extraktion
Die Extraktion von total RNA aus den Lebergeweben erfolgte nach dem Phenol - Chloroform - Prinzip, das seit den 60er Jahren des vorherigen Jahrhunderts verwendet wird und 1989 detailliert bei Sambrook et al beschrieben wurde [127]. Dabei wird die gesteigerte denaturierende Wirkung von zwei verschiedenen organischen Agens, Phenol und Chloroform, gleichzeitig genutzt. Diese Methode wurde 1987 durch Chomczynski und Sacchi
weiterentwickelt [128], indem Phenol mit Guanidinthiocyanat kombiniert wurde. Damit ist eine relativ hohe Ausbeute an RNA bei gleichzeitiger Verkürzung der Extraktionszeit zu erreichen [128]. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde in der vorliegenden Arbeit RNAzol B verwendet, das sowohl Phenol als auch Guanidinthiocyanat enthält.
Die Homogenisierung des Lebergewebes im Mörser erfolgte äußerst gründlich, um die Effizienz der späteren Denaturierung zu optimieren. Es wurde jeweils nur der Konus der 2 ml Tubes mit Gewebe gefüllt und unverzüglich 1200 µl RNAzol B und mind. 120 µl Chloroform (rein) dazugegeben. Anschließend wurde die Probe jeweils gut gemischt und 10 min. auf Eis gestellt, damit die Denaturierung der Proteine ablaufen konnte. Zur Trennung der verschiedenen Phasen folgte ein Zentrifugationsschritt 15 min. bei 4 °C. Es entstanden 2 Phasen mit Interphase. Die untere, blaue und die Interphase enthielten DNA und Proteine.
In der wässrigen Oberphase war die RNA lokalisiert. Die Oberphase wurde dann isoliert in ein frisches 1,5 ml E - Cup überführt und es folgte eine zweite RNA - Extraktion nach dem gleichen Protokoll. Die daraus resultierende Oberphase wurde erneut in ein frisches Tube überführt und es wurden 1000 µl reines Isopropanol dazugegeben. Die RNA wurde 20 min bei 4 °C präzipitiert und dann 15 min. bei 4 °C zentrifugiert, wobei ein gelb - weißliches Pellet am Boden des Tubes sichtbar wurde. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet mit 1000 µl 75 % Ethanol 10 min. bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand vorsichtig abpipettiert und das Pellet luftgetrocknet, um das restliche Ethanol zu entfernen.
Nun wurde das Pellet in 50 µl TE - Puffer bzw. DEPC - H2O resuspendiert. Um diesen Prozess zu unterstützen, wurden die Tubes 3 min im Thermomixer von Eppendorf bei 37 °C und 500 rpm geschüttelt. Dann wurden die Konzentration und die Reinheit der extrahierten RNA in einem Gene Quant Photometer gemessen (siehe Kap. 2.9.4). Alle Tubes wurden gepoolt und es wurden 5µl RNasin, ein RNase - Inhibitor von Promega, dazugegeben.
Abschließend wurde eine mRNA - Isolierung durchgeführt (siehe Kap. 2.1.3). Die Weiterverarbeitung aller mRNAs zur cDNA erfolgte gesammelt nach RNA - Extraktion aus allen Lebergeweben (siehe Kap. 2.3.4).
2.1.3 mRNA - Isolierung
Die Isolierung der mRNA wurde mit dem Oligotex mRNA Kit und entsprechend dem mitgelieferten Protokoll durchgeführt. Das Prinzip, nach dem dieses Kit arbeitet, ähnelt dem der Reversen Transkription mit oligo - dT Primern. An Stelle der Primer werden bei diesem Verfahren dC10T30 - Oligonukleotide, die an Polystyren - Latex Partikel gebunden sind und ihrerseits die poly A - Enden der mRNA binden, eingesetzt. Die Partikel und damit die mRNA werden abhängig von der Salzkonzentration durch die Membran in der Säule zurückgehalten bzw. durch den Elutionspuffer wieder freigegeben.
Die Elution erfolgte mit 60 µl des auf 70 °C vorgeheizten Tris - Puffers (Elutionspuffer) und Zentrifugation, wobei das erste Eluat erneut auf die Säule gegeben wurde und ein zweiter Zentrifugationsschritt durchgeführt wurde. Am Ende wurden jeweils die 60 µl eluierte mRNA auf 3 Cups verteilt und bei - 80 °C gelagert.
2.1.4 Reverse Transkription/ ss cDNA - Synthese
Die RT - Reaktion erfolgte nach dem Protokoll der Reversen Transkriptase Superscript II von GIBCO BRL. Das Prinzip der cDNA Synthese beruht auf der Tatsache, dass mRNA Stränge an ihrem 3’ - Ende mit einem poly A - Schwanz versehen sind [129]. Mit dem verwendeten poly T - Primer wird dieser Umstand genutzt. Außerdem wird die Fähigkeit einer RTase benötigt, um die RNA in DNA umzuschreiben. Zu diesem Zweck wurde die SuperScript II™ Reverse Transkriptase von GIBCO BRL verwendet.
2.2 DD - RAP PCR, Reamplifizierung und Klonierung der differentiell exprimierten Banden
2.2.1 Polymerase - Kettenreaktion – polymerase chain reaction (PCR)
Bei der PCR handelt es sich um ein zuerst 1986 durch Mullis et al. beschriebenes Verfahren, um DNA - Fragmente spezifisch um mehrere 10er Potenzen zu vervielfältigen [130]. Bei dieser Methode werden so genannte Primer, kurze DNA - Fragmente, dazu verwendet, das zu amplifizierende Stück auf der Erbinformation zu begrenzen und gleichzeitig als Startpunkt für die Polymerase zu dienen.
2.2.2 DD - RAP PCR
Um die differentiell exprimierten Gene zu identifizieren, wurde eine Kombination zweier Verfahren nach Diachenko et al. (1996) verwendet [131]: 1. DD - PCR (Differential Display - PCR) von Liang und Pardee (1992) [132] und 2. RAP - PCR (RNA arbitrarily primed - PCR) von Welsh et al. (1992) [133]. Eine Schwachstelle der Methode von Liang et al. war die niedrige Annealingtemperatur, die zwangsläufig zu einer relativ niedrigen Spezifität geführt hat, und folglich zu der Hauptursache für falsch - positive Ergebnisse wurde. Bei dem
Protokoll von Diachenko et al werden längere arbitrary Primer (25 mer) und oligo - dT - Primer (29 mer) mit zwei zusätzliche Nukleotide am 3’ Ende, die dafür sorgen, dass der Primer direkt upstream des Poly - A Schwanzes ansetzt, verwendet [134]. Durch die Länge der Primer konnte die Annealingtemperatur der PCR nach zwei initialen Zyklen mit 40 °C auf 60 °C und die NTP – Endkonzentration auf 50 µM erhöht werden. Zu beachten ist, dass die bei der DD - PCR verwendete, gezielt niedrig gehaltene NTP - Konzentration zu einer gesteigerten Spezifität, aber auch zu einer reduzierten Aktivität der Taq Polymerase führt [132]. Es wurde ein Mix aus zwei thermostabilen Polymerasen benutzt und es erfolgte die Umstellung auf eine PCR mit einer hohen Starttemperatur (Hot Start - PCR), um unspezifische Bindungen zu unterdrücken. Durch diese Veränderungen in dem Protokoll von Diachenko et al. sollen die Spezifität deutlich verbessert und die Wahrscheinlichkeit für falsch - positive Ergebnisse verringert werden.
Bei der Arbeit mit dieser Methode mussten weitere Modifikationen vorgenommen werden, um dieses Verfahren effizient und reproduzierbar zu machen. Die beiden wichtigsten Veränderungen betrafen die NTP - Konzentration und das PCR - Programm (siehe Kap. 3.2.1 – 3.2.3). Außerdem wurde der Advantage® cDNA Polymerase Mix, bestehend aus einer KlenTaq - 1 DNA Polymerase und einer Deep Vent™ Polymerase, verwendet. Die KlenTaq - 1 Polymerase ist dabei durch den TaqStart Antikörper blockiert, der bei Temperaturen über 65 °C denaturiert und somit Hot Start Bedingungen schafft [135], um eine höchstmögliche Stringenz zu erhalten.
2.2.3 Polyacrylamid - Gelelektrophorese
Zur Vorbereitung der Proben wurde das Volumen der PCR - Produkte aus der DD - /RAP - PCR mit einer Vakuum - Zentrifuge eingeengt und anschließend mit dem Sample - Puffer 1:1 gemischt, das Zielvolumen lag bei 6 µl, die dann auf das rehydrierte Polyacrylamidgel aufgetragen wurden. Die Außenbahnen wurden mit der 100 bp - Leiter von Pharmacia und den Negativkontrollen belegt.
Die nicht - denaturierenden Gele (CleanGel Long - 10) wurden entsprechend der Anleitung rehydriert und aufgelegt. Die Elektrophorese erfolgte nach dem Protokoll von ETC auf einer Horizontal - Elektrophorese Kammer von neoLab nach dem in Tabelle 6 zusammengefassten Spannungsprofil.
Tabelle 6: Verlauf der applizierten Spannung bei der Horizontal - Elektrophorese Spannung (V) Leistung (W) Zeit
150V 5W 30min
400V 12W 10min
500V 12W 45min
800V 13W 2h 20min
Zum abschließenden Anfärben der DNA - Banden wurde das DNA Silver Staining Kit entsprechend dem mitgelieferten Protokoll verwendet [136]. Die verschiedenen Schritte wurden auf einem Taumel - Wipptisch durchgeführt.
2.2.4 Ausschneiden der Banden und Eluierung der DNA
Die Banden, die den Eindruck machten, dass sie im Vergleich der Probengruppen untereinander differentiell bzw. über - oder unterexprimiert sind, wurden mit einem sterilen Einmal - Skalpell, ausgeschnitten und in sterile 0,5 ml Tubes überführt. Dann wurden 50 µl TE - Puffer hinzugefügt und es folgte eine 20 - minütige Inkubation in einem Thermocycler bei 95 °C. Dabei wurde der Heizdeckel des Thermocyclers auf 110 °C erhitzt, um die Verdunstung möglichst gering zu halten. Anschließend wurde eine Fällung mit Ammoniumacetat, 100 %EtOH und Glykogen als Carrier durchgeführt und dann die aufgereinigte DNA in 18,5 µl DEPC - H2O resuspendiert und in die folgend beschriebene Reaktion eingesetzt.
2.2.5 Reamplifikation der aus dem Gel eluierten DNA
Die Reamplifikation der eluierten DNA erfolgte mit der gleichen Primerkombination, wie sie in der entsprechenden, vorausgegangenen DD - RAP PCR verwendet wurde. Als Annealing - temperatur wurden 60 °C verwendet, um eine hohe Stringenz zu erhalten.
2.2.6 Ligation und Klonierung
Die Ligation erfolgte unter Verwendung des TOPO TA Cloning® Kit entsprechend dem beigefügten Protokoll. Die Besonderheit bei diesem Kit liegt in der Verwendung einer DNA Topoisomerase I an der Stelle, wo das DNA - Fragment inseriert wird, so dass eine Ligase nicht mehr verwendet werden muss und die Inkubation sich auf 5 min verkürzt [137]. Durch
