Research Collection
Doctoral Thesis
Lysine Acylation using Conjugating Enzymes for the Modification of Recombinant Proteins
Author(s):
Hofmann, Raphael Publication Date:
2021
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-b-000475966
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ETH Library
DISS. ETH No. 27288
Lysine Acylation using Conjugating Enzymes for the Modification of Recombinant Proteins
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich)
Presented by Raphael Hofmann
Master of Science in Biology, ETH Zurich Born on 15.07.1990
Citizen of Rapperswil-Jona and Eschenbach
Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Jeffrey W. Bode, examiner Prof. Dr. Donald Hilvert, co-examiner
2021
Abstract
ix
Abstract
Proteins and enzymes perform important functions of life. Further expanding and regulating their function, proteins are dynamically decorated with posttranslational modifications (PTMs).
Because of the large number of modifications and pathways involved, it is challenging to isolate a protein with a specific modification from natural sources. Besides native PTMs, artificial modifications can augment the properties and efficacy of proteins for their use in pharmaceutical applications and research. To determine the characteristics of natively existing modifications and to create modified protein products, efficient strategies for their preparation are required.
Protein modification in a controlled manner is a difficult task because of the richness of functional groups and chemical environments that the protein structure harbors. While chemical modification of proteins generally offers chemoselectivity for a specific functional group, enzymatic approaches frequently proceed with high site specificity and operate under mild reaction conditions. Such chemoenzymatic methods rely on pathways that operate on proteins, and substrate analogs that can be utilized by these enzymes. Many existing protocols, however, are restricted to modification at the protein termini, rely on non-peptidic metabolites, or require large recognition domains.
This dissertation describes the development and application of lysine acylation using conjugating enzymes (LACE), a chemoenzymatic strategy to site-specifically modify folded proteins at internal lysine residues. LACE relies on a minimal genetically encoded tag (four residues) recognized by the E2 small ubiquitin-like modifier-conjugating enzyme Ubc9 (Ube2I), and peptide or protein thioesters. Together, this approach obviates the need for E1 and E3 enzymes, enabling isopeptide formation with just Ubc9 in a programmable manner. Our studies demonstrate that LACE accepts a series of functionalized thioester probes, ranging from synthetic molecules to entire protein domains. The short tag size allowed the modification of diverse substrates, ranging from monomeric to multimeric proteins, and combination of the method with existing strategies for one-pot dual modifications. Importantly, LACE enabled the site-specific installation of native ubiquitin and ISG15 in a programmable manner from entirely recombinant sources in one step.
In a complementary approach, this dissertation describes the development of a workflow towards the identification of sequence-specific redox reactivity of cysteine residues. To this end, a solid-supported combinatorial peptide library was prepared, and a high-throughput screen combined with semi-automated peptide sequencing was established for the identification and characterization of library hits.
Zusammenfassung
xi
Zusammenfassung
Proteine und Enzyme erfüllen wichtige Funktionen des Lebens. Proteine werden dynamisch mit posttranslationalen Modifikationen (PTMs) dekoriert, was zur Erweiterung und Regulierung ihrer Funktion führt. Aufgrund der grossen Anzahl von Modifikationen und Pfaden ist es schwierig, ein Protein mit einer spezifischen Modifikation aus natürlichen Quellen zu isolieren.
Neben nativen PTMs können künstliche Modifikationen die Eigenschaften und Wirksamkeit von Proteinen für ihre Verwendung in pharmazeutischen Anwendungen und der Forschung verbessern. Um nativ vorkommende Modifikationen zu charakterisieren und um modifizierte Proteinprodukte herzustellen, sind effiziente Strategien für deren Herstellung erforderlich.
Kontrollierte Modifikation von Proteinen ist eine schwierige Aufgabe aufgrund der Reichhaltigkeit der Proteinstruktur an funktionellen Gruppen und chemischen Umgebungen.
Während chemische Proteinmodifikation im Allgemeinen Selektivität für eine bestimmte funktionelle Gruppe bietet, laufen enzymatische Ansätze häufig mit hoher Ortsspezifität und unter milden Reaktionsbedingungen ab. Solche chemoenzymatischen Verfahren beruhen auf Reaktionspfaden die auf Proteine wirken, und Substratanaloga, welche von diesen Enzymen verwendet werden können. Viele existierende Protokolle sind jedoch auf die Modifikation von Proteinenden beschränkt, greifen auf nicht-peptidische Metaboliten zurück, oder erfordern grosse Erkennungsdomänen.
Diese Dissertation beschreibt die Entwicklung und Anwendung der Lysin-Acylierung mittels konjugierender Enzyme (LACE), einer chemoenzymatischen Strategie zur ortsspezifischen Modifizierung gefalteter Proteine an internen Lysinresten. LACE beruht auf einem minimalen genetisch codierten Tag (vier Reste) der vom E2 SUMO-konjugierenden Enzym Ubc9 (Ube2I) erkannt wird, und Peptid- oder Proteinthioestern. Zusammengenommen macht dieser Ansatz E1- und E3-Enzyme überflüssig, und ermöglicht programmierbare Isopeptidbildung einfach mit Ubc9.
Unsere Studien zeigen, dass LACE eine breite Palette funktionalisierter Thioestersonden akzeptiert, die synthetische Moleküle bis hin zu ganzen Proteindomänen beinhalten können. Der kurze Tag ermöglichte es, verschiedene monomere und multimere Proteinsubstrate zu modifizieren, sowie die Methode mit bestehenden Strategien zu kombinieren um Eintopf- Doppelmodifikationen durchzuführen. Insbesondere ermöglichte LACE die ortsspezifische Installation von nativem Ubiquitin und ISG15 auf programmierbare Weise aus vollständig rekombinanten Quellen in einem Schritt.
In einem komplementären Ansatz beschreibt diese Dissertation die Entwicklung eines Ablaufs zur möglichen Identifizierung von sequenzspezifischer Redoxreaktivität von Cysteinresten. Zu diesem Zweck wurde eine Peptidbibliothek mittels kombinatorischer Festphasensynthese hergestellt. Zur Identifizierung und Charakterisierung von Bibliothekstreffern wurde ein Hochdurchsatz-Screen kombiniert mit halb-automatisierter Peptidsequenzierung etabliert.
