Immunotoxikologische Untersuchung zur Biokompatibilität von abbaubaren Implantaten aus Magnesiumbasislegierungen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Klaas Feser Wilhelmshaven Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
1. Gutachter: Prof. Dr. M. Kietzmann
2. Gutachter: Prof. Dr. A. Meyer-Lindenberg
Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2009
Meiner lieben Familie
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 01
2. Literaturübersicht 03
2.1. Dendritische Zellen 03
2.1.1. Hämatopoese und Reifung der DC 03
2.1.2. Migration naiver DC und Antigen-Aufnahme 05 2.1.3. Migration reifender DC in lymphatische Organe 07 2.1.4. Antigenprozessierung und –präsentation durch DC 09
2.2. Rolle von Magnesium im Organismus 11
2.2.1. Magnesium: Resorption und Ausscheidung 12 2.2.2. Toxikologische Bedeutung von Magnesium 13
2.3. Magnesiumbasislegierung 14
2.3.1. Magnesium-Calcium-Legierungen 17
2.4. Capture-ELISA 19
2.5. FACS-Analyse 19
2.5.1. Annexin V-FITC und PI 20
2.6. XTT-Proliferationstest 21
2.7. MLR (Mixed Leukocyte Reaction) 21
3. Material und Methoden 22
3.1. Material 22
3.1.1. Geräte 22
3.1.2. Verbrauchsmaterial 23
3.1.3. Reagenzien 23
3.1.4. Magnesiumbasislegierungen 24
3.1.5. Puffer und Lösungen 25
3.1.6. Kits 26
3.1.7. Antikörper 27
3.1.8. Mäuse 27
3.1.9. Software 27
3.2. Methoden 28
3.2.1. Generierung von DC 28
3.2.2. Gewinnung muriner T-Zellen 29
3.2.3. Herstellung der Degradationsmedien 29 3.2.3.1. Bestimmung der Magnesium- und Calciumkonzentration
in den Degradationsmedien 30
3.2.4. In-vitro-Untersuchungen mit Magnesium-
und Calcium-Salzen 32
3.2.4.1. Inkubation der DC mit MgCl2 und CaCl2 33 3.2.5. In-vitro-Untersuchungen mit Magnesiumbasislegierungen 36 3.2.5.1 Kultivierung der DC in den Degradationsmedien der
Magnesiumbasislegierungen 37
3.2.6. Zytokinbestimmung 39
3.2.7. Migrationsassay 40
3.2.8. FACS-Analyse 41
3.2.8.1. Vitalitätstest (Annexin V-FITC und PI, XTT) 41 3.2.8.2. Untersuchung der Expression von CD11c und CD86 42 3.2.8.3. MLR (Mixed Leukocyte Reaction) 42
3.3. Statistische Auswertung 43
4. Ergebnisse 44
4.1. Magnesium und Calciumkonzentration in den Degradationsmedien 44 4.2. Vergleichende Darstellung der In-vitro-Ergebnisse zwischen MgCl2,
CaCl2 und den Magnesiumbasislegierungen 45 4.2.1. DC-Zellzahl und MØ-Zellzahl im Vergleich zwischen
MgCl2, CaCl2 und Degradationsmedien 45 4.2.2. Vitalität (Annexin V-FITC und PI, XTT) 52
4.2.3. Freisetzung von TNF-α 61
4.2.4. Migrationsassay 64
4.2.5. Expression der Oberflächenmoleküle CD11c und CD86 66 4.2.6. T-Zellproliferation in der MLR 71
5. Diskussion 76 5.1. Degradationsversuche der Magnesium-Calcium-Legierungen 76 5.2. DC-Zellzahl, MØ-Zellzahl und Vitalität der DC nach MgCl2- und CaCl2-
Inkubation bzw. nach Kultivierung in den Degradationsmedien 78 5.3. TNF-α-Sekretion der DC nach MgCl2- und CaCl2-
Inkubation bzw. nach Kultivierung in den Degradationsmedien 79 5.4. Auswanderungsverhalten von DC nach MgCl2- und CaCl2-Inkubation
bzw. nach Kultivierung in den Degradationsmedien 80
5.5. Expression von CD11c/CD86 auf DC nach MgCl2- und CaCl2- Inkubation bzw. nach Kultivierung in den Degradationsmedien 81 5.6. Mixed Leukocyte Reaction mit DC, nach Präinkubation mit MgCl2 und CaCl2 bzw. nach Kultivierung in den Degradationsmedien 82
6. Zusammenfassung 85
7. Summary 87
8. Literaturverzeichnis 88
9. Anhang 108
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
A. bidest Ag
APC BC BSA ca.
Ca2+
CLP CMP CCL CCR CD CFSE CTL DC
DC-SIGN DMEM d.h.
DMSO DNCB ELISA et al.
FACS FITC FKS FSC g
GM-CSF
Abbildung
Aqua bidestillat (zweifach destilliertes Wasser) Antigen
Antigenpräsentierende Zellen Boyden Chamber
Bovines Serum Albumin circa
Calcium
common lymphoid progenitor cells common myeloid progenitor cells Chemokin Ligand
Chemokin Rezeptor Cluster of Differentiation
carboxyfluorescein diacetate succinimidylester zytotoxische T-Zellen
Dendritic Cell(s), dendritische Zelle(n)
DC-specific intercellular adhesion molecule-grabbing nonintegrin Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium
das heißt
Dimethylsulfoxid
2,4-Dinitrochlorobenzol
enzyme-linked immunosorbent assay et alii (und andere)
Durchflusszytometer, fluorescensce-activated cell sorter Fluorescein-Isothiocyanat
foetales Kälberserum
Vorwärtsstreulicht, forwardscatter
Gramm oder Erdbeschleunigung: 9,81m/s2
granulozyte-macrophage colony-stimulating factor
h iDC IFN IL LAM LPS MØ MCP-1 mDC mg Mg2+
MHC min MIP-3β ml MLR mmol MMP MTT MW OD o.g.
NF-κB NK-Zellen PAMP PBS PE
Pen/Strep PGE PI
Stunde
unreife DC, immature DC Interferon
Interleukin
Lipoarabinomannan Lipopolysaccharid Makrophagen
monocyte chemoattractant protein-1 reife DC, mature DC
milli(10-3)gramm Magnesium
Haupthistokompatibilitätskomplex, major histcompatibility complex Minute
macrophage-inflammatory-Protein-3β milli(10-3)liter
mixed leukocyte reaction milli(10-3)molar
Matrix-Metalloproteinasen
Zytotoxizitäts-Test (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- Tetrazoliumbromid)
Molekulargewicht oder Mittelwert optische Dichte
oben genannten nuclear factor κB natürliche Killerzellen
Pathogen-assoziierte molekulare Muster Phosphat-gepufferte Saline
Phycoerythrin
Penicillin/Streptomycin Prostaglandin E
Propidium Iodid
pH PLA PRR PS PTH RDH RNA XTT RANTES RT S.D.
SE s.o.
SSC Tab.
TCR TH-Zelle TLR TNF TM u.a.
wt%
z.B.
%
®
°C µ
*
**
***
negativer dekadischer Logarithmus der Protonen-Konzentration Polylaktid
Mustererkennungs-Rezeptoren, pattern recognition receptors Phosphatidylserin
Parathormon
recommended daily allowance Ribonukleinsäure
Tetrazoliumsalz (Natrium3`-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4- tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)-benzolsulfonsäure-hydrat) regulation and activated normal T-cell expressed and secreted Raumtemperatur
Standartabweichung Seltene Erden
siehe oben (im selben Abschnitt) Seitwärtsstreulicht, sidescatter Tabelle
T-cell receptor T-Helfer-Zelle Toll-like receptor Tumornekrosefaktor Warenzeichen unter anderem
Gewichtsprozent, weight percent zum Beispiel
Prozent
eingetragenes Warenzeichen Grad Celsius
mikro, 10-6
schwach signifikant (Irrtumswahrscheinlichkeit 5 %) signifikant (Irrtumswahrscheinlichkeit 1 %)
hoch signifikant (Irrtumswahrscheinlichkeit 0,1 %)
1. Einleitung
Der Einsatz von abbaubaren Implantaten aus Magnesiumbasislegierungen in der Chirurgie setzt bei vollständiger Degradation im Körper eine uneingeschränkte Biokompatibilität voraus. Das Immunsystem spielt dabei eine wichtige Rolle.
Fremdstoffe, die in den Organismus gelangen, werden vom Immunsystem erkannt und bewertet. Als Reaktion des Immunsystems kann es zur Ausbildung einer Toleranz oder einer Immunität kommen (JANEWAY et al., 2002). Das Immunsystem besteht aus einer unspezifischen (angeborenen) Immunabwehr und einer spezifischen (erworbenen) Immunabwehr, denen verschiedene Funktionsweisen zugrunde liegen und die sich bei einer Immunantwort gegenseitig ergänzen.
Dendritische Zellen (DC) werden der unspezifischen Immunabwehr zugeordnet und spielen, als wichtige Gruppe der antigenpräsentierenden Zellen (APC), eine große Rolle für die Aktivierung und Einbeziehung der spezifischen Immunabwehr, da sie in der Lage sind Antigene aufzunehmen und diese den T-Lymphozyten der regionalen Lymphknoten zu präsentieren. Durch Stimulation der T-Lymphozyten kann somit eine Immunantwort initiiert werden (JANEWAY et al., 2002).
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über die Beeinflussung der Zellfunktionen von murinen DC durch abbaubare Magnesiumbasislegierungen zu gewinnen. In der Literatur gibt es lediglich Angaben zur Allergietestung von degradablen metallischen Magnesiumlegierungen (ABELN, 2009). Die Beeinflussung der Funktion von DC durch abbaubare Magnesiumbasislegierungen wurde bisher nicht untersucht. Zum Einsatz kommen reines Magnesium und Legierungen auf Magnesium-Calcium-Basis.
In vitro wird zuerst der Einfluss von Magnesium- und Calcium-Salzen auf die unterschiedlichen Phasen der DC-Maturation untersucht. Im Mittelpunkt stehen zum einen die Vitalität der DC und die Expression diverser Oberflächenmoleküle, sowie das Auswanderverhalten der DC in einem Migrationsassay. Die T-Zellstimulation durch DC in der Mixed Leukocyte Reaction (MLR) ist ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit.
Anschließend werden Degradationsmedien aus verschiedenen abbaubaren Magnesiumbasislegierungen hergestellt. Untersucht wird das Degradationsverhalten sowie die Magnesium- und Calciumkonzentration in den Degradationsmedien mit Hilfe photometrischer Messungen. Weiterhin wird der Einfluss der Degradationsmedien auf die unterschiedlichen Phasen der DC-Maturation hinsichtlich der Vitalität, der Expression diverser Oberflächenmoleküle, sowie des Auswanderverhaltens untersucht.
Außerdem wird die T-Zellstimulation durch DC in der Mixed Leukocyte Reaction (MLR) untersucht.
2. Literaturübersicht 2.1. Dendritische Zellen
Die dendritischen Zellen (DC) sind leukozytären Ursprungs und spielen eine wichtige Rolle in der Überwachung und Steuerung der Immunabwehr. Ihre hauptsächliche Funktion ist die Präsentation von Antigenen an T-Lymphozyten, um diese zu stimulieren. Daher bezeichnet man die DC als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC) (CAUX et al., 2000). DC sind für die Sensitivierung MHC-restringierender T-Zellen, die Entwicklung der T-Zell abhängigen Antikörperproduktion sowie für die Induktion der immunologischen Toleranz verantwortlich (STEINMAN, 1991; STINGL und BERGSTRESSER, 1995). Erstmals wurden die DC 1868 von LANGERHANS in der basalen Epidermis menschlicher Haut entdeckt. Aufgrund ihrer vielen Ausläufer (Dendriten) missdeutete er jedoch ihre Form und hielt sie für Nervenzellen (LANGERHANS, 1868). Erst in der Mitte der siebziger Jahre des letzten Jahrhunderts wurden die DC als solche von STEINMAN und COHN (1973) als neuer Zelltyp in peripheren lymphatischen Organen der Maus entdeckt und beschrieben. Aufgrund ihrer baumartig verzweigten Zytoplasma- ausläufer wurden sie als Dendritsche Zellen (dendron, griechisch = Baum) bezeichnet. In den folgenden Jahrzehnten wurden DC zusätzlich im Blut (VAN VOORHIS et al., 1982), im Knochenmark (EGNER et al., 1993) und in verschieden Organen beschrieben, wie zum Beispiel in der Leber (PRICKETT et al., 1988), in der Lunge (SERTL et al., 1986) und im Darm (PAVIL et al., 1996).
2.1.1. Hämatopoese und Reifung der DC
Die dendritischen Zellen entwickeln sich über Zwischenstufen der DC- Vorläuferzellen aus pluripotenten häematopoetischen CD34+-Stammzellen aus dem Knochenmark. Bei den DC-Vorläuferzellen können zwei Typen unterschieden werden: die myeloiden Vorläuferzellen (common myeloid progenitor cells, CMP) und die lymphoiden Vorläuferzellen (common lymphoid progenitor cells, CLP) (LIU, 2001). Die Stimulation von linienspezifischen Vorläuferzellen mit
macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) (PULENDRAN et al., 2001) und TNF-α führt zur Bildung von vier unterschiedlichen DC-Subtypen. Es entstehen epitheliale DC (Dermis), interstitielle DC (Herz, Niere, Darm, Lunge), myeloide DC und plasmazytoide DC (VERMAELEN und PAUWLS, 2005). Unterschieden werden die DC-Subpopulationen aufgrund ihrer Verteilung im Gewebe, ihrer Morphologie und ihrer Funktion (WU und DAKIC, 2004), wobei jedes Mitglied die Kontrolle über einen anderen Teil des Immunsystems besitzt. Für die Funktion als antigenpräsentierende Zellen durchlaufen myeloide DC verschiedene Stadien der Reifung (Maturation). Man unterscheidet immature, semi-maturierte und mature DC.
Am Anfang besiedeln immature gewebeständige DC die peripheren Organe. Diese sind unreife DC mit einer geringen Anzahl costimulatorischer Oberflächenmoleküle und einer Heraufregulation endozytotischer Rezeptoren. In den peripheren Organen verharren sie in einer Art Ruhestadium, um Antigene phagozytotisch und makropinozytotisch aus ihrer Umgebung aufzunehmen (JANEWAY et al., 2002).
Nachdem immature DC Antigene aufgenommen haben, werden sie durch inflammatorische Signale (wie z.B. TNF-α, IL-1β) aktiviert und wandern hauptsächlich durch das lymphatische System zu den sekundären Lymphorganen. Bei ihrer Wanderung kommt es zur Reifung maturer DC, die die Antigene (Ag) für die Ag- Präsentation aufbereiten. Mature DC sind reife DC. Sie unterscheiden sich von den unreifen DC in zwei wesentlichen Punkten: Zum einen können sie keine Antigene mehr aufnehmen, dafür besitzen sie jedoch eine starke costimulatorische Aktivität sowie eine hohe Expression von MHC-Klasse II-Strukturen (CAUX et al., 2000). Über die CD-Moleküle (cluster of differentiation) können immature und mature DC voneinander unterschieden werden (Tabelle 1). Charakteristisch für reife DC ist die Expression des Zelloberflächenproteins CD11c, welches in der Lage ist, eine Adhäsion zwischen Zellen bei der Immunantwort zu ermöglichen. Weiterhin wichtig für die DC-Entwicklung ist CD40. Durch Bindung des Liganden CD40L an aktivierte T-Zellen kommt es zur terminalen Reifung der DC durch Hochregulation von CD80, CD86 (LAMBRECHT, 2001). Diese Hochregulation sorgt zusätzlich für eine Aktivierung naiver T-Zellen (JANEWAY und TRAVERS, 1997). Von immaturen und maturen DC sind zusätzlich die semi-maturierten DC zu unterscheiden. Dieses sind
DC, die nicht vollständig gereift sind. Sie unterscheiden sich von maturierten DC durch eine geringe Expression von kostimulatorischen Molekülen. Außerdem fehlt den semi-maturierten DC die Fähigkeit, proinflammatorische Zytokine auszuschütten.
Aufgrund dieser Tatsache sind sie in der Lage, Selbstantigen und apoptotisches Zellmaterial zu den sekundären Lymphorganen zu transportieren und über dort ansässige T-Zellen eine Toleranz zu vermitteln (LUTZ und SCHULER, 2002;
STEINMAN et al., 2003a). Dies geschieht durch Reifung unreifer T-Zellen zu IL-10 produzierenden Supressor-Zellen (JONULEIT et al., 2000; DHODAPKAR et al., 2001). Sie spielen also eine wichtige Rolle in der Immuntoleranz.
Tabelle 1: Einteilung der DC nach den Cluster of Differentiation (CD) (JANEWAY und TRAVERS, 1997)
CD31/34 MHCII CD11b CD11c CD14 CD25 CD40 CD68 CD80/86
Stammzelle
+ - - - - - - - -
Unreife DC
- - + -/+ + - - + -
Reife DC
- + - + - + + - +
2.1.2. Migration naiver DC und Antigen-Aufnahme
Neu generierte DC migrieren aus dem Blut in die nicht lymphatischen Organe.
Sie orientieren sich bei ihrer Wanderung anhand von Oberflächenstrukturen auf ortständigen Zellen und Chemokinreizen an den Orten lokaler Infektionen, in die sie verstärkt einwandern. Je nach Reifungsgrad weisen die DC unterschiedliche Rezeptormuster auf und variieren dementsprechend unterschiedlich in ihrem Verhalten gegenüber Chemokinen. Für die Migration von unreifen DC spielen vor allem inflammatorische Chemokine wie z.B. CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP- 1β und CCL5/RANTES eine große Rolle (CAUX et al., 2000). Diese Chemokine werden u.a. von unreifen DC nach Antigenkontakt für die Rekrutierung immaturer DC und T-Zellen sezerniert. Zur Unterstützung der Migration sind unreife DC außerdem in der Lage, Matrix-Metalloproteinasen (MMP) zu synthetisieren, welche in den Geweben eine elastolytische Kapazität aufweisen (CAUX et al., 2000). Am Ort der
Entzündung stehen den DC verschieden Mechanismen zur Antigenaufnahme zur Verfügung: die rezeptorvermittelte Endozytose und Phagozytose und die rezeptorunabhängige Mikro- und Makropinozytose (SALLUSTO et al., 1995). Bei der rezeptorvermittelten Endozytose werden verschiedene Mustererkennungs- Rezeptoren (pattern recognition receptors, PRR) durch die Erkennung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) aktiviert (JANEWAY und MEDZHITOV, 2002). Zu den wichtigsten PRR gehören u.a. die C-Typ-Lektin-Rezeptoren (Mannoserezeptor) (ENGERING et al., 1997), DEC-205 und DC-SIGN (DC-specific intercellular adhesion molecule- grabbing nonintegrin) (MAHNKE et al., 2000; GEIJTENBEEK et al., 2000).
Außerdem können über Fc-y Rezeptor Typ 1 (CD64) und Typ 2 (CD32) und C3b Komplement-Rezeptor (CD11b) optionierte Partikel und Immunkomplexe aufgenommen werden (FANGER et al., 1996). Die Phagozytose dient der Inkorporation von apoptotischen und nekrotischen Zellfragmenten (CD36 und avβ3 oder avβ5 Integrinen) (ALBERT et al., 1998), Viren und Bakterien (INABA et al., 1993). Bei der rezeptorunabhängigen Makropinozytose wird von den DC permanent extrazelluläre Flüssigkeit mit eventuell vorhandenen Pathogen-Strukturen in Bläschen aufgenommen (JANEWAY et al., 2002). Durch Ausleiten der Flüssigkeit durch Wasserkanäle (Aquaporine) werden die in den Bläschen befindlichen Antigene konzentriert. Durch die Fähigkeit der DC, Antigene zu erkennen, wird schon bei der Initiierung einer Immunantwort die Wichtigkeit der aufgenommenen Strukturen erkannt und somit die DC mit der Information einer Erregerinvasion in Alarmzustand versetzt und aktiviert. Beispielsweise erkennen DC LPS (Lipopolysaccharid) aus Zellwänden gramnegativer Bakterien mit der Kombination der Toll-like receptors (TLRs) TLR2 und TLR4 und CD14 (RESCIGNO et al., 1999). Über die TLRs wird der Transkriptionsfaktor NF-KB (nuclear factor kB) aktiviert. Es kommt zur Reifung der DC und Regulierung verschiedener Effektorfunktionen, einschließlich der Expression des major histocompatibility complex (MHC) und der Zytokinausschüttung (WALLET et al., 2005). Aber auch andere Antigene, wie zum Beispiel bakterielle DNS (HACKER et al., 1998; AKBARI et al., 1999), Doppelstrang RNS aus Influenzaviren (CELLA et al., 1999) und LAM (Lipoarabinomannan) (KRUTZIG und MODLIN, 2004), können
eine Reaktion der DC in Form eines Reifungsschrittes bei Kontakt verursachen.
Neben den exogenen Faktoren, also von außen auf den Körper einwirkenden Faktoren, können auch endogene körpereigene immunologische Mechanismen in ruhenden DC einen Ausreifungsschritt induzieren. So kann z.B. eine lokale Produktion von TNF-α oder IL-1 (CUMBERBATCH und KIMBER, 1995), eine Änderung des Gleichgewichts zwischen pro- und inflammatorischen Signalen oder die Aufnahme von Immunkomplexen über Fc-Rezeptoren ruhende DC dazu veranlassen, einen Reifungsschritt in Richtung maturer DC durchzuführen. Die zahlreichen Möglichkeiten, DC zu aktivieren, dienen alle der Rekrutierung immunkompetenter Zellen in inflammatorische Gebiete und somit der Steigerung der angeborenen Immunität. Nach der Aktivierung der DC kommt es zu zahlreichen morphologischen Veränderungen auf Seiten der DC. Durch die Neuorganisation des Zytoskeletts, die Modifikation der Adhäsionsstrukturen, den Verlust der Endozytose- und Phagozytoserezeptoren und die Heraufregulation von MHC-Molekülen bereitet sich die DC auf ihre Funktion als antigenpräsentierende Zelle vor (WINZLER et al., 1997).
2.1.3. Migration reifender DC in lymphatische Organe
Nach der Aktivierung der DC kommt es zur Reifung und zur Migration der DC über die Lymphflüssigkeit zu den lymphatischen Organen. Bei der Reifung kommt es zu einer Desensibilisierung der DC gegenüber inflammatorischen Chemokinen (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β und CCL5/RANTES) durch Herunterregulierung der entsprechenden Rezeptoren (SALLUSTO et al., 1998; SOZZANI et al., 1999). Durch diese Herunterregulierung können sich maturierende DC den lokalen Gradienten der inflammatorischen Chemokine entziehen. Parallel wird der Chemokinrezeptor CCR7 hochreguliert. Dieser Rezeptor ist für die Wanderung der DC sehr wichtig, da er die von lymphatischen Organen ausgehenden Chemokine CCL19 und CCL21 erkennt (STEINMAN, 2003b). Somit können die DC das inflammatorische Gewebe über den Lymphstrom entlang eines chemotaktischen Gradienten in Richtung der lymphatischen Organe verlassen. Nach Ankunft in den T- und B-Zell-Zonen
sekundärer lymphoider Organe können die DC selbst CCL19 und CCL21 sezernieren um zusätzlich für eine Verstärkung der chemotaktischen Signale zu sorgen (DIEU et al., 1998, SALLUSTO et al., 1998). Darüber hinaus werden durch die Chemokine CCL19, CCL18 und CCL22 zusätzlich naive T-Zellen und T- Gedächtnis-Zellen von den maturierenden DC angelockt. Die Abbildung 2.1.3.-a zeigt eine schematische Darstellung des Zusammenhanges zwischen Chemokinen und der DC-Reifung in Anlehnung an MCCOLL (2002) und LEBRE et al. (2005).
Chemokine Chemokinrezeptoren Oberflächenmoleküle
Abb. 2.1.3.-a: Schematische Darstellung der Zusammenhänge zwischen Chemokinen und der DC-Reifung (MCCOLL, 2002; LEBRE et al., 2005). Immature DC gelangen über die Blutgefäße entlang des Chemokingradienten der inflammatorischen Chemokine CCL2/3/5 in die inflammatorischen Gewebe. Nach Ag-Aufnahme kommt es zur Expression des Chemokinrezeptors CCR7. Durch diesen Rezeptor ist es den nun reifenden (maturierenden) DC möglich, entlang des Chemokingradienten von CCL19 und CCL20 zu den sekundären Lymphorganen zu wandern. Dort kommt es zur Antigenpräsentation und zur Einleitung einer Immunantwort.
maturierende DC
naive T- Zellen
Immature DC
drainierendes Lymphgefäß
CCR7
CCR1/2/5/6 Ag
CCL19/21 CCL2 /3/5
sekundäres Lymphorgan (Lymphknoten/Milz etc.) Blutgefäß
Immunantwort (Immunität, Toleranz)
MHCII CD40 CD80/86 mDC
2.1.4. Antigenprozessierung und –präsentation durch DC
Die Migration der DC in die lymphatischen Organe dient der Präsentation der aufgenommenen Antigene an immunkompetente Zellen, um eine spezifische Immunantwort zu induzieren. In den lymphatischen Organen können die DC mit T- Zellen, B-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) interagieren. Für die T-Zell- Antigenpräsentation werden die von den DC aufgenommenen Pathogene durch intrazelluläre Enzyme in immunogene Peptide abgebaut und an MHC-Moleküle gebunden. Es existieren zwei verschiedene Sorten von MHC-Molekülen (MHC- Klasse I-Moleküle und MHC-Klasse II-Moleküle), die bei der Beladung mit Peptiden aus jeweils unterschiedlichen Zellkompartimenten (dem Zytosol und dem vesikulären System) bedient werden (PAMER und CRESSWELL, 1998). Peptide, die an MHC- Klasse I-Moleküle gebunden werden, interagieren mit dem T-cell receptor (TCR) von CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTL). Peptide aus dem vesikulären System werden von den DC an MHC-Klasse II-Molküle gebunden. Diese interagieren mit den TCR der CD4+ T-Helferzellen. Das alleinige Erkennen eines präsentierten Antigens durch einen TCR einer T-Zelle reicht jedoch noch nicht für eine adäquate Aktivierung der T- Zellen aus. Aus diesem Grund werden von reifen DC neben den MHC-Molekülen zusätzlich Korezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimiert. Für die Modulation einer T- Zell Antwort wichtige Korezeptoren sind CD80, CD83, CD86 und CD40 (LATCHUMANAN et al., 2002; FLORIDO et al., 2004). Erst durch die Kombination der Verbindungen MHC-Moleküle zu TCRs und der Korezeptoren CD80/CD86 zu CD28 (T-Zellen) kommt es zur Bildung immunologischer Synapsen (LAMBRECHT, 2001). Zusätzlich bewirkt die Bindung zwischen CD40 zu CD40L (aktivierte T-Zellen) eine Steigerung der Expression von stabilen MHC-Molekülen, eine Hochregulation von CD86 (LAMBRECHT, 2001) und eine vermehrte Produktion von IL-12, IL-6 und TNF-α (LUTZ und SCHULER, 2002; GAD et al., 2003) mit der Folge einer zusätzlichen Aktivierung weiterer T-Zellen. Aber nicht nur T-Zellen können von DC aktiviert werden. Sie sind außerdem in der Lage, die B-Zell-Proliferation und - Differenzierung zu beeinflussen (DUBOIS et al., 1999) sowie Zellen des angeborenen Immunsystems, wie zum Beispiel NK-Zellen (ZITVOGEL, 2002),
Eosinophile und Makrophagen über Chemokine, Zytokine oder direkten Kontakt zu aktivieren (PICCIOLI et al., 2002).
2.2. Rolle von Magnesium im Organismus
Magnesium ist ein essentielles Mineral im Organismus und ist an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen im Organismus beteiligt. Besonders für intrazelluläre, energieabhängige (metabolische) Reaktionen spielt Magnesium eine große Rolle, da es praktisch an allen ATP-abhängigen Reaktionen beteiligt ist (WOLF und CITTADINI, 2003). Wichtige Enzyme sind u.a. die Adenylatzyklase, ATPasen in Membranen (Substrat der Enzyme: ATP-Mg2+-Komplex) oder die alkalische Phosphatase, bei der Magnesium das Enzym bindet und aktiviert (WILLIAMS, 1993). Außerdem ist Magnesium beteiligt an der Aufrechterhaltung des elektrischen Potentials von Nervenzellen, der Muskelkontraktion (physiologischer Calcium-Antagonist) und der Regulation von Kalium- und Calciumkanälen (BIESALSKI et al., 1999). Schließlich ist Magnesium bei der Nukleinsäurebiosynthese wichtig, da es zum einen der Stabilisierung ihrer tertiären Struktur, und zum anderen als Co-Faktor im Metabolismus der Nukleinsäuren dient (WOLF und CITTADINI, 2003). Im Großen und Ganzen ist Magnesium an über 300 enzymatischen Reaktionen als Co-Faktor beteiligt, so dass eine ständige Regulation des Magnesiumspiegels im Organismus gewährleistet sein muss. Im Körper eines Erwachsenen befindet sich ca. 20-28 g Magnesium wobei 60-65 % im Knochen gespeichert sind. Dort ist Magnesium ein wichtiger Bestandteil und übt in Form des Hydroxylapatits in Knochen und Zähnen Stützfunktion aus. Der Rest befindet sich hauptsächlich in der Muskulatur (27 %) und in anderen Organen (6-7 %) (SHILS, 1997). Im Plasma befindet sich nur etwa 1 % Magnesium. Ein Großteil des intrazellulären Magnesiums ist im Endoplasmatischen Retikulum, gefolgt von den Mitochondrien und im Zellkern lokalisiert (HEATON, 1993). Dabei liegt etwa 90 % in gebundener Form vor, wobei es hauptsächlich an Nukleinsäuren, ATP (als Chelat- Komplex), negativ geladene Phospolipide und Proteine gebunden ist (WOLF und CITTADINI, 2003). Je höher die metabolische Aktivität einer Zelle desto höher ist
auch dessen intrazelluläre Magnesiumkonzentration, so dass gerade bei Skelett- und Herzmuskelzellen intrazelluläre Magnesiumkonzentrationen von 5 bis zu 20 mmol/l erreicht werden können (MCCARTHY und KUMAR, 1999).
2.2.1. Magnesium: Resorption und Ausscheidung
Die freie extrazelluläre Magnesiumkonzentration wird mit Hilfe eines komplexen Regelsystems konstant gehalten. Die Resorption von Magnesium erfolgt über den Dünndarm (Jejunum und Ileum) parazellulär durch passive Diffusion (SCHWEIGEL und MARTENS, 2000) als auch transzellulär durch einen carrier- vermittelten Prozess (TRPM6-Kanal) (FINE et al., 1991; QUAMME, 1997; WÄRING, 2008). Durch diesen aktiven Transport ist es möglich, Magnesium entgegen ungünstigen Membranspannungsverhältnissen und Magnesiumgradienten in den interstitiellen Raum zu transportieren (FINE et al., 1991; QUAMME, 1997). Unter normalen Bedingungen liegt die Resorptionsrate zwischen 30-50 % des durch die Nahrung aufgenommenen Magnesiums. Bei einer geringen Magnesiumaufnahme kann die Resorptionsrate allerdings über den aktiven Transporter bis zu 70 % gesteigert werden, um die extrazelluläre Magnesiumkonzentration konstant zu halten (BRANNAN et al., 1976; WÄRING, 2008). Außerdem werden bei einem geringen Magnesium-Serumspiegel u.a. Calcitriol (aktive Form von Vit. D) und Parathormon (PTH) freigesetzt, so dass die Magnesiumaufnahme aus dem Dünndarm und der Transport in den Extrazellularraum erhöht werden (BIESALSKI et al., 1999).
Die Ausscheidung von Magnesium erfolgt überwiegend über die Niere. Nach glomerulärer Filtration wird Magnesium jedoch zum größten Teil wieder rückresorbiert, so dass nur etwa 3-5 % der glomerulär filtrierten Magnesiummenge tatsächlich mit dem Endharn ausgeschieden werden (QUAMME, 1993;
SCHAAFSMA, 1997). Als Hauptregulationsorgan ist die Niere in der Lage, über spezielle Sensoren Veränderungen in der extrazellulären freien Magnesiumkonzentration wahrzunehmen. Bei einem geringen Magnesium- Serumspiegel kommt es im Organismus zu einer vermehrten Bildung von PTH und folglich zur Erhöhung von Calcitriol mit der Folge einer Erhöhung der tubulären
Magnesium-Rückresorption und einer Hemmung der renalen Magnesium- Ausscheidung (BIESALSKIE, 2002; FLEET et al., 2001). Bei einem Magnesium- Überschuss im Organismus wird vermehrt Calcitonin (Antagonist von PTH) synthetisiert, welches die renale Magnesium-Ausscheidung stimuliert und somit die extrazelluläre Magnesium-Konzentration senkt (QUAMME, 1993; SARIS et al., 2000;
FLEET und CASHMAN, 2001).
2.2.2. Toxikologische Bedeutung von Magnesium
Magnesium ist relativ untoxisch. Die empfohlene Recommended Daily Allowance (RDA) für Magnesium liegt bei Erwachsenen zwischen 310-420 mg (NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, 1999). Die physiologische Magnesium- Konzentration im Serum liegt zwischen 0,75-1 mmol/l (WEISINGER und BELLORIN- FONT, 1998). Da der Magnesiumhaushalt durch ein komplexes Regelsystem über Aufnahme und Abgabe konstant gehalten wird, ist bei gesunden Menschen eine Hypermagnesiämie in der Regel relativ selten, da zu viel aufgenommenes Magnesium über die Niere wieder ausgeschieden wird. Bei exzessiver Einnahme von Magnesiumsalzen oder magnesiumhaltiger Arzneimitteln (z.B. Antacida) kann es gerade bei Patienten mit einer gestörten Nierenfunktion zu Symptomen einer Hypermagnesiämie kommen. Leitsymptome sind vor allem zentralnervöse Störungen mit curareähnlichen Lähmungserscheinungen, Bradykardie, Hypotonus und Hypoventilation. Die ersten Symptome können ab einer Magnesium-Konzentration im Serum von 2,0 mmol/l auftreten. Lähmung, Herzstillstand und Koma treten bei Konzentrationen über 7 mmol/l auf (SWAMINATHAN, 2003).
Die Hypomagnesiämie, also eine Unterversorgung mit Magnesium, kommt im Vergleich zur Hypermagnesiämie häufiger vor. Ursachen können zum einen eine Umverteilung des Magnesiums von der Extrazellulärflüssigkeit in die Zellen oder Knochen sein oder mangelhafte nutritive Aufnahme (AL-GHAMDI et al., 1994;
FAWCETT et al., 1999). Weitere Ursachen sind u.a. gastro-intestinale (z.B.
chronische Diarrhoe), renale (z.B. erhöhte Diurese, Nephropathien), Alkoholismus und medikamentöse Ursachen (z.B. Diuretika, elektrolytfreie Infusionen)
(SWAMINATHAN, 2003). Eine Hypomagnesiämie tritt häufig in Kombination mit anderen Elektrolytstörungen auf. So kann zusätzlich eine Hypokaliämie (RYAN, 1993), Hypophosphatämie oder Hypocalcämie (FATEMI et al., 1991) vorliegen. An Symptomen treten Schwindel, Ataxie, vermehrte Erregbarkeit, Krämpfe, Tetanie und schwerwiegende Organstörungen wie Herzarrhythmien auf (SWAMINATHAN, 2003).
Außerdem wurde bei Patienten mit Osteoporose ein Magnesiummangel in den trabekulären Knochen festgestellt (SOJKA, 1995).
2.3. Magnesiumbasislegierungen
Der Einsatz von Magnesiumbasislegierungen als resorbierbares metallisches Osteosynthesematerial und in der Weichteilchirurgie zeigte sich in den letzten Jahren als sehr viel versprechend (MEYER-LINDENBERG et al., 2003; SWITZER, 2005;
WITTE et al., 2005). Gegenüber herkömmlich eingesetzten nichtresorbierbaren Implantaten aus Titan oder Stahl haben sie den Vorteil, dass sie sich mit der Zeit im Organismus auflösen. Dadurch kann eine zweite Operation zur Entfernung der Implantate und somit ein zweites Narkoserisiko umgangen werden (STAIGER et al., 2006). Auch im Vergleich zu anderen degradablen Implantatmaterialien wie zum Beispiel synthetische Polymere (resorbierbare Implantate an nicht tragenden Knochen) zeigen die Magnesiumbasislegierungen bei frei einstellbarer Resorptionszeit eine deutlich höhere Festigkeit (CLAES, 1992; SHIKINAMI und OKUNO, 1999; KAESE, 2002). Somit kombinieren Implantate aus Magnesiumbasislegierungen die guten mechanischen Eigenschaften der herkömmlichen Implantate mit den Vorteilen der resorbierbaren Materialien.
Der Gedanke, Implantate aus Magnesium in der Osteosynthese einzusetzen, ist jedoch nicht neu. Bereits 1907 setzte LAMBOTTE eine Magnesium-Platte ein, um eine Unterschenkelfraktur zu versorgen. Da das Implantatmaterial aus reinem Magnesium jedoch unter starker Gasbildung zu schnell korrodierte, schlug der Versuch fehl (LAMBOTTE, 1932). Daraufhin wurden in den folgenden Jahrzehnten Implantate aus verschiedenen Magnesiumlegierungen entwickelt, um die Korrosionsbeständigkeit sowie die In-vivo-Eigenschaften zu verbessern.
VERBRUGGE (1934) und MCBRIDE (1938) setzten in den 30er Jahren Implantate aus Magnesium-Aluminium-Legierung zur Versorgung verschiedener Frakturen beim Menschen erfolgreich ein. Vorteilhaft für die Magnesiumlegierungen war eine komplette Auflösung im Organismus ohne Irritationen und toxische Nebenwirkungen.
Allerdings stellte VERBRUGGE (1934) ebenfalls bei der Korrosion der Implantate eine Gasbildung fest, jedoch ohne Schädigung des Organismus. Die Vermutung von VERBRUGGE (1934), dass das entstandene Gas Wasserstoff sei, widerlegte MCBRIDE (1938) indem er die Gasblasen punktierte und analysierte. Er fand ein Gemisch aus 81 % Stickstoff, 7 % Wasserstoff, 6 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid.
TROITSKII und TSITRIN untersuchten 1944 die Auswirkung von Magnesium- Cadmium-Legierungen als Implantatmaterial für verschiedene Frakturen. Im Bereich des Implantats wurden keine Entzündungsreaktionen festgestellt. Auch trat kein Anstieg der Magnesiumkonzentration im Serum auf. Die Korrosionsbeständigkeit variierte bei den Versuchen zwischen fünf Wochen und 12 Monaten (TROITSKII und TSITRIN, 1944). 1972 wurden erstmals Multikomponenten-Legierungen als Implantatmaterial eingesetzt, die neben Calcium oder Aluminium zusätzlich 4 wt%
Seltene Erden (SE) und geringe Mengen an Silber, Mangan, Zirkonium oder Silizium enthielten (STROGANOV et al., 1972) mit dem Resultat einer verlangsamten Korrosion. Die Implantate in Form von Pins (Ø 3mm) konnten im Organismus bis zu fünf Monate nachgewiesen werden.
Der Gedanke, Magnesiumlegierungen mit geringen Anteilen an Seltenen Erden (SE) als Implantatmaterial zu verwenden, wurde in neueren Arbeiten weiter untersucht (SWITZER, 2005; WITTE et al., 2005; WITTE et al., 2006a; ABELN, 2006). Die Tabelle 2 soll einen Überblick über die eingesetzten Magnesiumlegierungen geben.
Tabelle 2: Übersicht der eingesetzten Magnesiumlegierungen (ABELN, 2006) Magnesium-Aluminium-Zink-Legierungen Magnesium-Seltene Erden-Legierungen AZ 31 (3 wt% Aluminium, 1 wt% Zink) LAE 442 (4 wt% Lithium, 4 wt%
Aluminium, 2 wt% Seltene Erden (SE) AZ 91 (9 wt% Aluminium, 1 wt% Zink) WE 43 (4 wt% Yttrium, 3 wt% SE)
SWITZER (2005) untersuchte die Implantationseigenschaften der o.g.
Magnesiumlegierungen im Vergleich zu herkömmlichen Implantatmaterialien wie PLA (Polylaktid) und Titan. Die Legierungen wurden als Magnesiumstifte intramedullär in die Femora von Meerschweinchen implantiert. Bei den Versuchen konnte gezeigt werden, dass bei der Korrosion der Implantate im Organismus ebenfalls Gas gebildet wurde, allerdings war die Gasbildung bei WE43 und LAE442 deutlich geringer als bei AZ31 und AZ91 (SWITZER, 2005). Wie auch bei MCBRIDE (1938) konnte bei der Untersuchung des gebildeten Gases kein Wasserstoff nachgewiesen werden (WITTE et al., 2005). Aus immunologischer Sicht untersuchten WITTE et al. (2006b), ob biodegradable Magnesiumlegierungen bei ihrer Degradation zu einer Aktivierung des Immunsystems führen. Hierfür wurden Zylinder der Magnesiumlegierung AZ91 in die rechten distalen Femurkondylen von Kaninchen implantiert. Als Kontrolle dienten autogene Knochenzylinder, die in die linken distalen Femurkondylen implantiert wurden. Drei bzw. sechs Monate nach Implantation konnte keine signifikant erhöhte Immunantwort festgestellt werden. Als Indikator für eine Immunantwort wurde die Anwesenheit von neutrophilen Granulozyten und CD3+ T-Zellen gemessen (WITTE et al., 2006b). ABELN (2006) führte prädiktive Allergietestungen mit den Legierungen AZ91, AZ31, WE43 und LAE442 (Tabelle 2) durch, um das allergene Potential der Magnesiumlegierungen zu ermitteln. Hierfür wurden die Testsubstanzen zunächst in gelöster Form und anschließend als Späne im Epikutantest bei Mäusen untersucht. Ein allergenes Potential konnte für die getesteten Legierungen nicht festgestellt werden. Als Kriterium für eine allergene Wirkung wurden Biopsien der Haut auf Spongiosis, Ödem, mononukleäres Infiltrat in der Dermis und Epidermis und perivaskuläres Infiltrat in der Dermis untersucht (ABELN, 2006). WITTE et al. (2006a) verglich das Korrosionsverhalten der Magnesiumlegierung AZ91 und LAE442 zwischen In-vitro- Korrosion und In-vivo-Korrosion. Er stellte fest, dass die Korrosionsraten der Legierungen im In-vivo-Tiermodell vier mal niedriger waren als die im In-vitro- Versuch. Außerdem zeigten LAE442 und AZ91 im Vergleich In-vitro- zu In-vivo- Untersuchungen gegensätzliche Korrosionsraten. Im In-vivo-Tiermodell erwies sich
die Legierung LAE442 als korrosionsresistenter als die Legierung AZ91. Im In-vitro- Versuch zeigte jedoch die Legierung AZ91 höhere Korrosionsresistenz als LAE442.
2.3.1. Magnesium-Calcium-Legierungen
Mit dem Hintergrund eine absolute Bioverträglichkeit der Magnesiumbasislegierungen zu garantieren, wurden in den letzten Jahren zusätzlich Untersuchungen mit Magnesium-Calcium-Legierungen durchgeführt (BACH et al., 2005; KRAUSE et al., 2005, 2006; MEYER-LINDENBERG et al., 2007; VON DER HÖH, 2008; LI et al., 2008). Trotz Allergietestung (ABELN, 2006) scheinen Aluminium und Seltene Erden, die in den Magnesiumbasislegierungen AZ31, AZ91 bzw. WE43 und LAE442 verwendet wurden, aus toxikologischer Sicht als bedenklich (LI et al., 2008). Aluminium ist bekannt als neurotoxisch bei parenteraler Gabe und wird in Verbindung gebracht mit Alzheimischer Krankheit (EL-RAHMAN, 2003).
Seltene Erden wie zum Beispiel Yttrium, Cer(ium) und Praseodymium haben bei parenteraler Gabe lebertoxische Wirkung (YUMIKO et al., 1997).
Dagegen erscheint Calcium zur Herstellung binärer Magnesiumlegierungen als resorbierbares Osteosynthesematerial vielversprechend, da Calcium wie auch Magnesium ein wichtiger Bestandteil im Knochengewebe ist (LI et al., 2008).
Außerdem erhofft man sich einen positiven Effekt für die Frakturheilung bei der Freisetzung von Mg2+ und Ca2+ während der Degradation, da Magnesium essentiell für die Aufnahme des Calciums in den Knochen ist (SERRE et al., 1998).
Erste In-vitro-Versuche mit Magnesium-Calcium-Legierungen zeigten ausreichende mechanische Eigenschaften für den Einsatz als Knochenimplantate (BACH et al., 2005). KRAUSE et al. (2005) und MEYER-LINDENBERG et al. (2007) untersuchten eine Calcium-haltige Magnesiumlegierung (MgCa0.8 mit 0,8 wt% Ca) und zwei Magnesiumlegierungen mit Beimengungen von Seltenen Erden (LAE442 und WE43) im Tiermodell. Dafür wurden Magnesiumstifte der drei Legierungen intramedullär in die Tibiamarkhöhle von Kaninchen implantiert. MgCa0.8 zeigte eine gute Biokompatibilität bei moderater Degradationsrate in den ersten drei Monaten nach
Implantation (KRAUSE et al., 2005). Im direkten Vergleich zu WE43 und LAE442 zeigte MgCa0.8 geringere Festigkeitswerte (KRAUSE et al., 2005).
In einer Pilotstudie untersuchte VON DER HÖH (2008) das Degradationsverhalten verschiedener Magnesium-Calcium-Legierungen im Kaninchenmodell. Für den Versuch wurden aus vier Magnesium-Calcium- Legierungen Implantate mit drei verschiedenen Oberflächen (glatt, rau und gestrahlt) hergestellt. Die Tabelle 3 soll einen Überblick über die verwendeten Magnesium- Calcium-Legierungen geben.
Tabelle 3: Übersicht verwendeter Magnesium-Calcium-Legierungen (VON DER HÖH, 2008)
Magnesium-Calcium-Legierung wt% Calcium
MgCa0.4 0,4
MgCa0.8 0,8
MgCa1.2 1,2
MgCa2.0 2,0
Zur Herstellung einer rauen Implantatoberfläche wurden die Implantate durch einen nachgelagerten Schleifprozess bearbeitet. Die gestrahlten Implantatoberflächen wurden durch Partikelbestrahlung von glatten Implantaten erzeugt (Partikeldurchmesser 300-400 µm, Strahlzeit 30 s). Anschließend wurden die Implantate für sechs Wochen in die medialen Femurkondylen beider Hintergliedmaßen eingesetzt. Unabhängig von den Calciumkonzentrationen in den Implantaten oder der Oberflächenstruktur zeigten die Implantate eine gute Verträglichkeit. Untersuchungen auf das Degradationsverhalten zeigten, dass Implantate mit glatter Oberfläche stabiler degradierten als Implantate mit rauer oder gestrahlter Oberfläche. Die Degradation in Bezug auf die Calciumkonzentration war bei MgCa1.2 am schwächsten, bei MgCa0.4 am stärksten (VON DER HÖH, 2008).
Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu In-vitro-Degradationsversuchen von DENKENA et al. (2005, 2006). Für den Degradationsversuch wurden die Magnesium-Calcium-Legierungen MgCa0.4, MgCa0.8 und MgCa2.0 für 72 Stunden
einer 5%igen NaCl2-Lösung ausgesetzt. Die Auswertung zeigte, dass bis zu einem Calciumanteil von 0,8 wt% Calcium die Legierungen gleichmäßig korrodierten. Bei den Legierungen mit höheren wt% Calcium verlief die Degradation stärker und inhomogener (DENKENA et al., 2005; DENKENA et al., 2006).
LI et al. (2008) führten Zellkulturversuche mit verschiedenen Magnesium- Calcium-Legierungen durch. Unter anderem untersuchten sie den Einfluss von MgCa1 (1 wt% Calcium) auf die Vitalität und Morphologie von murinen Fibroblasten (L929- Zellen). Dafür wurden die L929-Zellen in Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium (DMEM) kultiviert. Ab Tag 1 der Kultivierung wurden die L929-Zellen mit unterschiedlichen Verdünnungsstufen (0 %, 50 %, 90 %) des Degradationsmediums der Legierung MgCa1 inkubiert. Am Tag 2, 4 und 7 wurde die Vitalität der Zellen mittels MTT bestimmt. Die Auswertung zeigte, dass MgCa1 keinen zytotoxischen Effekt auf L929-Zellen hat. Darüber hinaus schien die Vitalität der in unverdünnten Degradationsmedium kultivierten L929-Zellen besser zu sein als die Vitalität von L929-Zellen in der Kontrolle (LI et al., 2008).
2.4. Capture-ELISA
Beim Capture-ELISA beschichtet man eine Mikrotiterplatte mit Antikörper gegen das nachzuweisende Antigen. Durch Zugabe der zu untersuchenden Probe wird das Antigen von den Antikörpern gebunden (Antigen-Antikörper-Komplex).
Durch Waschen kann anschließend nicht gebundenes Material entfernt werden.
Anschließend wird durch Zugabe eines zweiten Antikörpers, an dem ein Enzym gebunden ist, eine Farbreaktion ausgelöst. Die entstehende Farbreaktion kann mit Hilfe eines Photometers gemessen werden. Sie ist proportional zur Enzymaktivität und somit zu der vorhandenen Menge an Antigen (BROCK et al., 2001; LUTTMANN et al., 2006).
2.5. FACS-Analyse
Die FACS-Analyse (Fluorescence activated cell sorting) beruht auf dem Prinzip der
vorbei gesaugt. An den Zellen kommt es zu einer Lichtstreuung, die von einem Photodetektor gemessen wird. Für die Beurteilung der Lichtstreuung dienen zwei Parameter. Die Zellgröße wird durch die Streuung des Lichtes in Richtung des Laserstrahl bestimmt (Vorwärtsstreulicht, forwardscatter, FSC). Die Größe und Struktur des Zellkerns (Granularität) wird durch das in einem 90° Winkel an inneren Zellstrukturen reflektierte Licht bestimmt (Seitwärtsstreulicht, sidescatter, SSC).
Neben diesen Parametern können die Zellen zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert werden. Dabei kommt es beim Passieren des Lasers zur Anregung des Farbstoffes, der daraufhin Licht einer bestimmten Wellenlänge emittiert. Man unterscheidet bei der Markierung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoff zwischen der Oberflächenmarkierung und der intrazellulären Markierung. Außerdem wird zwischen einer direkten Markierung (Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoff) und einer indirekten Markierung (unmarkierter Primärantikörper und markierter Sekundärantikörper) unterschieden (JANEWAY et al., 2002; LUTTMANN et al., 2006).
2.5.1. Annexin V-FITC und PI
In apoptotischen Zellen wird das Membranphospholipid Phosphatidylserin (PS) durch Veränderung der Zytoplasmamembran nach außen gekehrt. Der markierte Antikörper Annexin V-Fluorescein-Isothiocyanat (Annexin V-FITC) bindet mit hoher Affinität an PS. Der Farbstoff Propidiumiodid (PI) dient der intrazellulären Markierung von Nukleinsäuren. In lebenden Zellen mit intakter Zytoplasmamembran kann PI nicht in das Zytoplasma gelangen. Aufgrund dieser Eigenschaften lassen sich die Zellen bezüglich ihrer Vitalität einteilen in vitale Zellen (Annexin V-FITC negativ; PI negativ), Zellen in frühem Apoptose-Stadium (Annexin V-FITC positiv, PI negativ) und sterbende oder tote Zellen (Annexin V-FITC positiv, PI positiv) (BD PharmingenTM Technical Data Sheet, Product Information).
2.6. XTT-Proliferationstest
Zum Nachweis zytotoxischer Effekte kann die metabolische Aktivität einer Zelle Aufschluss über ihre Vitalität geben. Mit Hilfe des XTT-Proliferationstest kann diese metabolische Aktivität vitaler Zelle gemessen werden. Unter Oxidation von NAD(P)H +H+ zu NAD(P)+ wird das schwach gefärbte Tetrazoliumsalz XTT (Natrium3`-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro)-
benzolsulfonsäure-hydrat) vorwiegend durch mitochondriale Dehydrogenasen intakter Zellen zu einem wasserlöslichen, stark gefärbten Formazan umgewandelt.
Diese Farbstoffbildung wird gemessen, wobei die entstehende Farbintensität mit der Zahl lebender Zellen korreliert (MOSMANN, 1983).
2.7. MLR (Mixed Leukocyte Reaction)
Mit Hilfe der heterologen MLR (Mixed Leukocyte Reaction) kann die Fähigkeit der unterschiedlich behandelten DC, T-Lymphozyten zur Proliferation anzuregen, untersucht werden. Dafür werden T-Lymphozyten einer NMRI-Maus mit DC einer BALB/c-Maus zusammen gebracht. Bei aktivierten DC werden die MHC-Moleküle der DC von den T-Lymphozyten als fremd erkannt. Dadurch kommt es zu einer Proliferation, also Zellteilung, der T-Lymphozyten. Die Proliferationsrate kann mit Hilfe des Farbstoffs CFSE (Carboxyfluorescein diacetate succinimidylester), mit dem die T-Lymphozyten markiert werden, sichtbar gemacht werden. Nach Diffusion in die Zelle wird die Acetatgruppe des CFSE von intrazellulären Esterasen gespalten, so dass ein fluoreszierender Farbstoff gebildet wird, der die Zytoplasmamembran nicht mehr passieren kann. Bei einer Zellteilung der T-Lymphozyten wird der Farbstoff zur Hälfte an die Tochterzelle weitergegeben und damit die Fluoreszensintensität auf die Hälfte reduziert. Mit Hilfe der FACS-Analyse kann die Fluoreszensintensität und somit die Proliferationsrate der T-Lymphozyten ausgewertet werden (Molecular Probes, Invitrogen Product Information).
3. Material und Methoden
3.1. Material 3.1.1. Geräte
Brutschrank HERAcell®150, Heraeus, Hanau, D Binder, Tuttlingen, D
Kühlzentrifuge Zentrifuge 5804 R, Eppendorf,
Hamburg, D
Zentrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg, D
Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Oberkochen, D
Neubauer-Zählkammer VWR, Hannover, D
Mikroplattenleser MRX Microplate Reader Dynatech, Denkendorf, D
Photometer Ultrospec®2000, Pharmacia Biotech,
Cambridge, UK
Sterilbank Heraeus Lamin Air®TL 2448, Heraeus,
Hanau, D
Pipettierhilfe Accu-jet®pro, Brand, Wertheim, D
Feinwaage ALS 120-4, Kern, Balingen, D
Vortexer Heidolph Reax top, Heidolph,
Schwabach, D
Janke & Kunkel, IKA®Labortechnik, Staufen, D
Wasserbad Büchi, Flawil, CH
GFL®, Burgwedel, D
Durchflusszytometer Coulter Epics XL, Beckman Coulter, FLA, USA
3.1.2. Verbrauchsmaterial
Polypropylen-Röhrchen (15 ml/50 ml) Greiner, Frickenhausen, D Reaktionsgefäße (1,5/ 2 ml) Eppendorf, Hamburg, D
Greiner, Frickenhausen, D Sarstedt, Nümbrecht, D
Petrischalen (100 mm x 20 mm) tissue culture dish cell+, Sarstedt, D 6-,12-,24,-96-well-plates Greiner, Frickenhausen, D
Pipetten Eppendorf, Hamburg, D
(2,5/ 20/ 100/ 200/ 1000/ 2500 µl) LABMATETM, Abimed, Langenfeld, D Pipettenspitzen Eppendorf Tips, Eppendorf, Hamburg, (0,1-10/ 2-200/ 500-1000/ 500-2500 µl) D
Pipettenspitzen (2-200/ 500-1000 µl) Greiner, Frickenhausen, D Plastikpipetten (10/ 25 ml) Greiner, Frickenhausen, D
Zellschaber (24 cm) TPP, Schweiz
Sterilfilter Minisart, Sartorius, Göttingen, D
96-well-plates, round-bottom Greiner, Frickenhausen, D 6-well-plates mit Einsätzen Greiner, Frickenhausen, D (8.0 µm Porengröße)
Einmalspritzen, 2/10 ml Omnifix, Braun, Melsungen, D Einmal-Injektions-Kanüle (Gr.18) Braun, Melsungen, D
Einmal-Injektions-Kanüle (19 G) Sterican®, Braun, Melsungen, D Einmal-Injektions-Kanüle, (Gr. 20) Omnifix, Braun, Melsungen, D Skalpellklinge (22) Bayha, Tuttlingen, D
3.1.3. Reagenzien
RPMI-1640-Medium Biochrom, Berlin, D
A. bidest Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Streptomycin Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D
Penicillin Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D
Fetales Kälberserum (FKS) PAA, Pasching, A
Rinderserum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Ethanol Roth, Karlsruhe, D
GM-CSF R&D-Systems, Wiesbaden, D
Polyvidon-Iod-Lösung Braunol, Braun, Melsungen, D Lipopolysaccharid (LPS, E. coli 0172:B8) Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Trypsin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Trypan-Blau Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Tween20 Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Schwefelsäure 2N Merck, Darmstadt, D
3,3`,5,5-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, D
Etoposide (VP-16) Merck, Darmstadt, D
Blei(II)chlorid (MW = 278,10) Merck, Darmstadt, D
Magnesium(II)chlorid Merck, Darmstadt, D
Calcium(II)chlorid Merck, Darmstadt, D
3.1.4. Magnesiumbasislegierungen
Mg(pur) (reines Magnesium) Institut für Werkstoffkunde, Garbsen, D MgCa0.6 (0,6 wt% Calcium) Institut für Werkstoffkunde, Garbsen, D MgCa0.8 (0,8 wt% Calcium) Institut für Werkstoffkunde, Garbsen, D MgCa1.0 (1,0 wt% Calcium) Institut für Werkstoffkunde, Garbsen, D MgCa1.2 (1,2 wt% Calcium) Institut für Werkstoffkunde, Garbsen, D
3.1.5. Puffer und Lösungen
Zellkultur:
DC-Medium:
FKS 10%
Penicillin/Streptomycin 1%
Β-Mercaptoethanol 50 µM
Das Medium wurde in RPMI-1640-Medium hergestellt.
PBS-Puffer
NaCl 137 nM
KCl 2,7 mM
Na2PO4 7,5 mM
KH2PO4 1,5 mM
Der Puffer wurde mit A. bidest. hergestellt; pH 7,4.
Hämolyse-Puffer
NH4Cl 0,15 M
Na2-EDTA 0,13 mM
Na HCO3 10 mM
Der Puffer wurde mit A. bidest. hergestellt; pH 7,3.
Erythrozyten-Lysepuffer
NH4Cl 0,15 M
EDTA 0,34 mM
KHCO3 10 mM
Der Puffer wurde mit A. bidest. hergestellt.
FACS-Analyse:
PBS/BSA-Waschpuffer
BSA 1%
Die Lösung wurde in PBS hergestellt; pH 7,4.
Binding-Puffer (Annexin V-FITC)
Herstellung des Puffers aus dem Annexin V-FITC Detection Kit I (BD Biosciences Pharmingen). Die Stammlösung wurde um den Faktor 10 mit PBS verdünnt.
Elisa:
Waschpuffer
Tween 20 0,05%
Die Lösung wurde in PBS hergestellt; pH 7,4.
10 x TBE
Tris-HCl (pH 8,0) 0,9 M Borsäure 0,9 M
EDTA (pH 8,0) 20 mM
Die Lösung wurde bei Bedarf um den Faktor 10 mit H2O verdünnt.
Reagent Diluent (ELISA)
BSA 1%
Die Lösung wurde in PBS hergestellt; pH 7,4.
3.1.6. Kits
DuoSet® Mouse TNF-α ELISA R&D Systems, Minneapolis, MN, USA Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences Pharmingen™,
Hamburg, D XTT Cell proliferation-kit Promega, USA
Testkit Nanocolor Härte 20 Machery-Nagel, Düren, D
3.1.7. Antikörper
FITC anti-mouse CD86 BD Biosciences Pharmingen™, Hamburg, D
PE anti-mouse CD 11c BD Biosciences Pharmingen™, Hamburg, D
Streptavidin-Peridin Chlorophyll-a Protein BD Biosciences Pharmingen™,
(SAv-Per CP) Conjugate Hamburg, D
CellTrace™ CFSE Invitrogen™, Oregon, USA
3.1.8. Mäuse
Für die DC-Gewinnung wurden weibliche Mäuse des Stammes BALB/c, sowie für die MLR (Mixed Leukocyte Reaktion) weibliche Mäuse des Stammes NMRI verwendet.
Die Tiere waren acht Wochen alt und wurden von Charles River (Sulzfeld, D) bezogen.
3.1.9. Software
Expo 32 ADC XL 4 Color Beckman Coulter, FLA, USA Expo 32 ADC Analysis Beckman Coulter, FLA, USA Microsoft® Office 2003-Edition Microsoft®, Washingten, WA, USA GraphPad Prism®5 GraphPad Software, CA, USA
3.2. Methoden
3.2.1. Generierung von DC
Für die Generierung von DC wurden nach LUTZ et al. (1999) aus dem Knochenmark von BALB/c-Mäusen DC-Vorläuferzellen gewonnen und im Brutschrank für 10 Tage bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Dazu wurde die BALB/c- Maus durch zervikale Dislokation getötet und der Femur herauspräpariert. Mit Hilfe einer Skalpellklinge wurde der Femur von umliegender Muskulatur befreit und anschließend in 70 %-igem Ethanol 2-5 Minuten desinfiziert und in sterilem PBS gewaschen. Für die Entnahme der Stammzellen aus der Markhöhle wurden die Femurenden mit der Skalpellklinge abgetrennt. Mit Hilfe von Kanüle und Spritze konnte anschließend das Knochenmark mit 5 ml sterilem PBS aus dem Femur herausgespült werden. Dabei wurde die Zellsuspension in einem Zentrifugenröhrchen aufgefangen und die Zellen durch Pipettieren vereinzelt.
Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (290 g, 4 °C, 10 Minuten).
Danach wurde der Überstand verworfen und das Zellpellett mit 5 ml RPMI-1640- Medium resuspendiert. Für die Bestimmung der gewonnenen Zellzahl wurden zu einem Aliquot der Zellsuspension Erythrozyten-Lysepuffer gegeben (Verdünnung 1:2). Nach ca. 5 Minuten Inkubation wurden die Zellen in Trypanblau (Verdünnung 1:3) in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt.
Für einen Ansatz wurden 2x106 Zellen benötigt. Diese wurden in 10 Wells einer 12- well-plate aufgeteilt, sodass sich pro Well 2x105 DC-Vorläuferzellen in 1 ml DC- Medium befanden. Anschließend wurden die Stammzellen mit 20 ng/ml granulozyte- macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) versetzt (INABA et al., 1992), um myeloide DC zu generieren. Nach LUTZ et al. (1999) entstehen dabei adhärente Makrophagen (MØ), nicht-adhärente reife DC (MHCIIhigh) und unreife DC (MHCIIlow).
Es folgte eine zweitägige Inkubation im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2. Am 3.
Tag der Kultivierung erfolgte eine Zugabe von 1 ml DC-Medium pro Well und 20 ng/ml GM-CSF. An den Tagen 6, 8 und 10 wurde jeweils 1 ml Medium pro Well entnommen, das Zellpellett durch Zentrifugation gewonnen und nach Resuspension mit frischem Medium und GM-CSF zur Kultur zurückgegeben.
3.2.2. Gewinnung muriner T-Zellen
Die Proliferationsrate der T-Zellen als Reaktion auf die behandelten DC wird mit Hilfe der Mixed Leukocyte Reaction (MLR) bestimmt. Hierbei handelt es sich um eine heterologe Reaktion, bei der T-Zellen einer NMRI-Maus mit DC einer BALB/c-Maus zusammengebracht werden.
Die benötigten T-Zellen wurden nach GUNZER et al. (2001) aus der Milz von NMRI- Mäusen gewonnen. Dazu wurde die NMRI-Maus durch zervikale Dislokation getötet und die Milz herauspräpariert. Anschließend wurden die beiden Enden der Milzkapsel eröffnet und mit Hilfe einer Kanüle und einer Spritze die Milzpulpa mit 10 ml sterilem PBS ausgespült. Die Zellsuspension wurde in einem Zentrifugenröhrchen aufgefangen und zentrifugiert (1000 g, 4 °C, 10 Minuten). Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit 5 ml Hämolysepuffer versetzt, um die vorhandenen Erythrozyten zu lysieren. Nach 5 Minuten wurde durch Zugabe von 45 ml sterilem PBS der Hämolysepuffer neutralisiert und somit der Vorgang gestoppt. Nach erneuter Zentrifugation (1000 g, 4 °C, 10 Minuten) wurde das Pellet in 10 ml RPMI- 1640-Medium (+ 10 % FKS + 1 % Penicillin/Streptomycin) resuspendiert.
Anschließend wurde die Zellsuspension in einer cell+-Petrischale im Brutschrank (37 °C, 5 % CO2) für 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nicht adhärenten Zellen vorsichtig mit einer Pipette gewonnen. Somit wurde eine T- Zellpopulation mit einer Reinheit von 60-70 % gewonnen. Anschließend wurden die T-Zellen nach erneuter Zentrifugation in 5 ml sterilem PBS resuspendiert und in Trypanblau, mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer, gezählt.
3.2.3. Herstellung der Degradationsmedien
Für die Herstellung der Degradationsmedien wurden zuerst die Legierungen im Autoklaven sterilisiert. Anschließend wurden für jede Legierung 10 ml DC-Medium in ein 50 ml Polypropylen-Röhrchen vorgelegt und ein Legierungsplättchen (Ø 8 mm, Höhe 2mm, Oberfläche 150,8 mm2) dazu gegeben. Für eine gleichmäßige
Bewegung mit den Legierungen inkubiert. Nach der 72-stündigen Inkubation wurden die einzelnen Degradationsmedien mit Hilfe von Spritze und Sterilfilter von ungelösten Bestandteilen befreit.
3.2.3.1. Bestimmung der Magnesium- und Calciumkonzentration in den Degradationsmedien
Die Magnesium- und Calciumkonzentration in den Degradationsmedien wurde mit Hilfe des Testkits Nanocolor Härte 20 (Machery-Nagel, Düren, D) mittels eines photometrischen Verfahrens bestimmt. Der Test beruht auf der Messung der Gesamthärte des Mediums, welche vor allem durch Magnesium- und Calcium-, aber auch geringfügig durch Barium- und Strontiumionen bestimmt wird. Dazu wird die Farbintensität von Phtaleinpurpur mittels Photometer gemessen, welche von der Gesamthärte des umgebenden Mediums abhängt. Anschließend werden die Calciumionen durch Zugabe eines speziellen Chelators maskiert, sodass bei wiederholter Messung die Härte nur noch vom Magnesiumgehalt abhängt. Der Calciumgehalt kann abschließend aus den Messwerten der Gesamthärte und des Magnesiumgehaltes errechnet werden.
Für die Bestimmung der Magnesium- und Calciumkonzentration wurden zunächst jeweils fünf Kalibrationsstandards mit den Konzentrationen 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 und 1,0 mmol/l angesetzt. Außerdem wurden zur Überprüfung von verschiedenen Magnesium/Calcium-Kombinationen 9 Kalibrationsstandards von Lösungen mit 0,5 bis 0,1 mmol/l Magnesium/Calcium angesetzt. Die Tabelle 4 soll einen Überblick über die Kalibrationsstandards geben.
Tabelle 4: Überblick Kalibrationsstandards im DC-Medium
MgCl2-Konz. [mmol/l] CaCl2-Konz. [mmol/l] MgCl2-/CaCl2-Konz.
[mmol/l]
0.2 0.2 0.5/0.5
0.4 0.4 0.4/0.4
0.6 0.6 0.3/0.3
0.8 0.8 0.2/0.2
1.0 1.0 0.1/0.1
0.5/0.4 0.4/0.5 0.3/0.2 0.2/0.3
Danach wurden die Proben der Degradationsmedien vorbereitet. Dafür wurden zum einen unverdünnte Aliquots der Degradationsmedien aus Mg(pur), MgCa0.6, MgCa0.8, MgCa1.0 und MgCa1.2 entnommen und zum anderen Aliquots mit einer Verdünnung 1:10 hergestellt. Anschließend wurde aus dem Testkit Nanocolor Härte 20 die Phtaleinpurpurlösung angesetzt und pro Probe 180 µl der Phtaleinpurpurlösung in die Wells einer 96-Well Platte vorgelegt. Danach wurden von jeder Probe 6 µl Lösung hinzu gegeben und gründlich durch auf und ab pipettieren gemischt. Anschließend wurde die Gesamthärte photometrisch (570 nm) gemessen.
Nach der Bestimmung der Gesamthärte wurde die 96-Well-Platte aus dem Photometer entnommen und in jedes Probenwell 6 µl des Calciumchelators aus dem Testkit zugegeben. Danach wurden die Proben erneut bei 570 nm gemessen. Die daraus resultierten optischen Dichten werden aufgrund der vorherigen Maskierung der Calciumionen hauptsächlich durch Magnesium bestimmt.
Für die Errechnung der Magnesiumkonzentration wurde aus den optischen Dichten der Standards eine Kalibrationsfunktion errechnet. Diese wurde anschließend zur Rückrechnung der an den Proben gemessenen Konzentrationen aus den gemessenen optischen Dichten benutzt.
y = 0,4259x + 1,3086 R2 = 0,9753 y = 0,461x + 1,296
R2 = 0,9666
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Abb. 3.2.2.2.-a: Errechnete Kalibrationsfunktion aus den an den Standards gemessenen optischen Dichten der Gesamthärtemessung und der Magnesiummessung. Y= optische Dichte,
X= Salzkonzentration, R2= Bestimmtheitsmaß (>0,95).
Für die Errechnung der Calciumkonzentration wurden für die Standards und jede Probe die bei der Magnesiummessung erfassten, optischen Dichten von den optischen Dichten der Gesamthärtemessung subtrahiert. Aus diesem Differenzwert der Standards konnte mittels linearer Regression eine Kalibrationsfunktion errechnet und mit dieser die Calciumkonzentration in den Proben errechnet werden. Die Magnesium- und Calciumkonzentrationsmessungen wurden jeweils achtmal durchgeführt.
3.2.4. In-vitro-Untersuchungen mit Magnesium- und Calcium-Salzen
Als Grundlage für die Versuche mit den Magnesium- und Calciumsalzen dienten Degradationsversuche mit Magnesiumbasislegierungen (Kapitel 3.2.3.), bei denen im Kulturmedium Magnesiumkonzentrationen zwischen 0,2 mmol/l und 10 mmol/l gemessen wurden. Durch die Zugabe von Magnesium- und Calciumsalzen in unterschiedlichen Konzentrationen zum Kulturmedium der DC sollte ein möglicher Einfluss auf die Zellfunktion von murinen DC untersucht werden. Zuerst wurde der Einfluss von Magnesium- und Calcium-Salzen auf die unterschiedlichen Phasen der DC-Maturation untersucht. Im Mittelpunkt standen zum einen die Vitalität der DC und die Expression diverser Oberflächenmoleküle untersucht in der Durchflusszytometrie,
Optische Dichte
Salzkonzentration
sowie das Auswanderverhalten der DC in einem Migrationsassay. Mit Hilfe der Mixed Leukocyte Reaction (MLR) konnte die Fähigkeit der DC, naive T-Zellen zur Proliferation anzuregen, untersucht werden. Versuche mit weiteren DC-Kulturen bestanden in der Gewinnung von Kulturüberständen zur Detektion des Zytokins TNF-α als Reaktion auf die Magnesium- und Calciumsalze.
3.2.4.1. Inkubation der DC mit MgCl
2und CaCl
2Für die Bestimmung der Vitalität, der TNF-α-Sekretion, der Migrationsbereitschaft, der Expression von CD11c/CD86 und der MLR wurden die DC pro Versuchsansatz ab dem 3. Tag der Kultivierung in jeweils fünf Gruppen für die Magnesiumchlorid- und Calciumchlorid-Behandlung unterteilt. Tabelle 5 gibt einen Überblick über die Kultivierung der DC-Vorläuferzellen und deren Behandlung.
