Aus dem
Lübecker Institut für Experimentelle Dermatologie
Direktor: Prof. Dr. Dr. Enno Schmidt
Pharmakologische Inhibition des Komplement-5a-Rezeptors bei Antikörpertransfer-induzierter Epidermolysis bullosa acquisita
Inauguraldissertation zur
Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck
- Aus der Sektion Medizin - vorgelegt von
Martti Klockemann aus Kiel
Lübeck 2018
1. Berichterstatterin: Prof. Dr. med. vet. Jennifer Hundt 2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Marc Ehlers Tag der mündlichen Prüfung: 15.01.2020 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 15.01.2020 Promotionskommission der Sektion Medizin
I say: Neutrophils are not to blame. They do their job. - Tamás Laskay GRK 1727, Jour Fixe, 12.01.16
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung... 7
Liste der im Text verwendeten Abkürzungen: ... 8
1 Einleitung und Fragestellung ... 11
1.1 Aufbau und Funktion humaner Haut ... 11
1.2 Blasenbildende Autoimmundermatosen ... 12
1.3 Epidermolysis bullosa acquisita ... 14
1.3.1 Pathogenese ... 15
1.3.2 Therapie ... 17
1.4 Das Anaphylatoxin C5a als wichtige Komponente des Komplementsystems... 18
1.4.1 Inhibition des Komplementsystems – ein vielversprechender Therapieansatz ... 21
1.4.2 W-54011, ein spezifischer Antagonist des Komplement-5a-Rezeptors 1 ... 22
1.4.3 A8Δ71-73 als Antagonist der Komplement-5a-Rezeptoren 1 und 2 ... 22
1.5 Zwei-Photonen-Mikroskopie ... 23
1.6 Ziele der Arbeit ... 25
2 Methoden ... 27
2.1 Tierversuche ... 27
2.2 Antikörpertransfer-induziertes Mausmodell für Epidermolysis bullosa acquisita ... 27
2.2.1 Isolierung von Immunglobulin G aus Kaninchenseren ... 29
2.2.2 Affinitätsaufreinigung spezifischer Antikörper gegen murines Kollagen Typ VIIc ... 30
2.2.3 Fluoreszenzmarkierung des aufgereinigten Antikörpers ... 31
2.2.4 Testung der Bindekapazität des spezifischen, fluoreszenzmarkierten Antikörpers 32 2.3 Visualisierung der Neutrophilenextravasation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ... 32
2.4 Isolation muriner neutrophiler Granulozyten ... 34
2.5 Quantifizierung der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies aus murinen neutrophilen Granulozyten ... 35
2.6 Histologische Analysen ... 36
2.6.1 Histochemische Färbung von Gewebeschnitten und mikroskopische Analyse ... 36
2.6.2 Immunfluoreszenzfärbungen von Gewebeschnitten und mikroskopische Analyse 37 2.7 Quantifizierung der betroffenen Körperoberfläche und statistische Analysen ... 38
3 Ergebnisse ... 39
3.1 Der aufgereinigte Antikörper bindet an der dermo-epidermalen Junktionszone ... 39
3.2 Passiver Antikörpertransfer verursacht Symptome der Epidermolysis bullosa acquisita bei Mäusen ... 40
3.2.1 An Gewebeschnitten von Ohren sind Symptome der Epidermolysis bullosa
acquisita nachweisbar ... 41
3.2.2 An Gewebeschnitten betroffener Ohren lagert sich die Komplementkomponente 3 an der dermo-epidermalen Junktionszone ab ... 43
3.3 Die pharmakologische Blockade des Komplement-5a-Rezeptors 1 verbessert das Krankheitsbild nicht ... 44
3.4 Kombinierte pharmakologische Blockade der Komplement-5a-Rezeptoren 1 und 2 verbessert das Krankheitsbild nicht ... 45
3.5 Die kombinierte Blockade der Komplement-5a-Rezeptoren 1 und 2 reduziert für einen kurzen Zeitraum die Extravasation neutrophiler Granulozyten ... 48
3.6 Nur A8Δ71-73 zeigt in vitro Effekte, C5a-vermittelte Signale zu inhibieren ... 51
4 Diskussion ... 56
4.1 Zusammenfassung der Ergebnisse ... 56
4.2 Potentielle strukturelle Fehlerquellen ... 56
4.2.1 Wirksamkeit der verwendeten Pharmaka ... 56
4.2.2 Frühere Versuchsergebnisse – Artefakte eines fehlerhaften Mausmodells? ... 58
4.2.3 Differenzen in den verwendeten Mausstämmen ... 60
4.3 Limitationen ... 61
4.4 Pathogenesemodell unter Berücksichtigung der Versuchsergebnisse ... 62
4.4.1 Die Expression von Fcɣ-Rezeptoren auf neutrophilen Granulozyten ist notwendig, um das Krankheitsbild der Epidermolysis bullosa acquisita auszulösen ... 62
4.4.2 Es bestehen Interaktionen zwischen Komplementsystem und Fcɣ-Rezeptor vermittelten Signalen ... 63
4.4.3 Komplement-5a-Wirkungen sind nur in der Frühphase Immunkomplex-vermittelter Entzündungsreaktionen relevant ... 64
4.4.4 Hypothetischer Ablauf der dermalen Entzündungsreaktion bei experimenteller Epidermolysis bullosa acquisita ... 65
4.4.5 Interleukin-1β ist für die Aufrechterhaltung der dermalen Entzündungsreaktion verantwortlich ... 66
4.4.6 Das Anaphylatoxin C5a als Kickoff-Molekül für einen chronisch-inflammatorischen Teufelskreis ... 67
4.4.7 Potentielle Zielmoleküle zur Behandlung der Epidermolysis bullosa acquisita ... 69
4.5 Ausblick ... 70
5 Literaturverzeichnis ... 72
6 Anhänge ... 79
6.1 Abbildungsverzeichnis ... 79
6.2 Verwendete Materialien ... 80
6.2.1 Geräte ... 80
6.2.2 Verbrauchsmaterialien ... 81
6.2.3 Reagenzien ... 81
6.2.4 Pharmazeutika und Narkotika ... 82
6.2.5 Software ... 83
6.2.6 Puffer und Lösungen ... 83
6.2.6.1 Puffer zur Isolation der anti-mCOL7c-IgG ... 83
6.2.6.2 Puffer für ROS Release Assay ... 84
6.2.6.3 Anästhesien ... 84
6.2.7 Belegungspläne der 96-Well-Platten für ROS Release Assay ... 85
6.2.7.1 Vergleiche der Neutrophilen von C57Bl/6- und LysM-eGFP-Mäusen ... 85
6.2.7.2 C5a-Testung sowie Einfluss der Pharmaka auf C5a-Freisetzung ... 86
7 Danksagungen ... 87
8 Eigenständigkeitserklärung ... 89
9 Lebenslauf ... 90
7
Zusammenfassung
Die Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) ist eine Autoimmunerkrankung der Haut, die durch das Vorliegen von Antikörpern gegen Kollagen Typ VII gekennzeichnet ist. Betroffene entwickeln Blasen und Erosionen an der Haut. Unbehandelt nimmt die Krankheit einen schweren Verlauf und kann tödlich enden. Die standardmäßige Behandlung erfolgt zurzeit mit unspezifischen Immunsuppressiva. Oft werden systemische Kortikosteroide eingesetzt. Diese Therapie ist jedoch nicht immer wirksam und außerdem von starken Nebenwirkungen behaftet, weshalb die Entwicklung spezifischerer Therapieformen dringend notwendig ist.
In den letzten Jahren konnten mittels verschiedener Mausmodelle zahlreiche für das Entstehen der Krankheit wichtige Zellen und Moleküle identifiziert werden. Unter anderem fielen neutrophile Granulozyten und die Komplementkomponente C5a ins Auge. Da letztgenannte ein starker Signalgeber für neutrophile Granulozyten ist, wurde vermutet, dass C5a für die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Haut verantwortlich sei. Die pharmakologische Blockade der C5a- vermittelten Signale sollte daher vor Ausprägung der Krankheit schützen.
In dieser Arbeit wird der Nachweis erbracht, dass die pharmakologische Blockade des C5a- Rezeptors keinen effektiven Schutz vor der Krankheitsausprägung der EBA darstellt. Mittels aufwendiger Visualisierungsexperimente wird festgestellt, dass diese Blockade nur in den ersten Stunden nach Krankheitsinduktion einen Effekt hat. Anhand der Ergebnisse wird, eingebettet in aktuelle Forschungsarbeiten, ein Modell der Pathogenese entwickelt, welches C5a nur zu Beginn der dermalen Entzündungsreaktion eine wesentliche Rolle zuweist.
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Liste der im Text verwendeten Abkürzungen:
°C Grad Celsius
A8Δ71-73 Peptidischer C5aR- und C5L2-Antagonist
aHUS Atypisches hämolytisch-urämisches Syndrom
ANCA Anti-neutrophile zytoplasmatische Antikörper
Betr. Betroffene
BP180 Bullöses Pemphigoid-Antigen II
BP230 Bullöses Pemphigoid-Antigen I
BSA Bovines Serum-Albumin
C1q Komplementkomponente 1q
C3 Komplementkomponente 3
C5 Komplementkomponente 5
C5a Komplementkomponente 5a
C5aR Komplement-5a-Rezeptor 1 (identisch mit CD88)
C5b Komplementkomponente 5b
C5L2 Komplement-5a-Rezeptor 2
CD18 Cluster of differentiation 18
CD19 Cluster of differentiation 19
CD3e Cluster of differentiation 3e
CD88 Cluster of differentiation 88 (identisch mit C5aR)
CL-Medium Chlorid-Medium
CXCL1 Chemokin-Ligand 1
CXCL2 Chemokin-Ligand 2
DAPI 4',6-Diamidin-2-Phenylindol
DEJ Dermo-epidermale Junktionszone
DMSO Dimethylsulfoxid
EBA Epidermolysis bullosa acquisita
eGFP Enhanced green fluorescent protein
Fab-Teil "Fragment antigen binding", eine Antikörperregion
FBS Fetales bovines Serum
Fcɣ-Rezeptor Rezeptor, der den Fc-Teil von IgG bindet
Fc-Teil "Fragment crystallisable", eine weitere Antikörperregion
g Gramm
GM-CSF Granulozyten-Monozyten-Kolonie stimulierender Faktor
G-Protein Guaninnukleotidbindendes Protein
h Stunden
HBSS Hank's balanced salt solution
HE Hämatoxilin-Eosin
HLA-D2 Haupt-Histokompatibilitätskomplex Klasse II Haplotyp DR2
Hz Hertz
ICAM-1 Intercellular adhesion molecule 1
i.p. Intraperitoneal
i.v. Intravenös
IgA Immunglobulin Klasse A
9
IgG Immunglobulin Klasse G
IL-1 Interleukin-1
IL-1α Interleukin-1α
IL-1β Interleukin-1β
IL-6 Interleukin-6
IVIG Intravenöses Immunglobulin G
kDA Kilodalton
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
l Liter
LTB4 Leukotrien B4
LysM-Promoter Lysozym-M-Promoter
m2 Quadratmeter
M Molar
MAC Membrane attack complex
MACS Magnetic activated cell sorting
mCol7c Murines Kollagen Typ VII, Fragment C
mg Milligramm
min Minuten
Mio Millionen
ml Milliliter
mM Millimolar
N Neutrophile Granulozyten
NaCl Natriumchlorid
NADPH-Oxidase Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Oxidase
NaOH Natriumhydroxid
NC16A Nicht-Kollagene Domäne 16A
NC1-Domäne Nicht-Kollagene Domäne 1
NC2-Domäne Nicht-Kollagene Domäne 2
ng Nanogramm
nm Nanometer
ns nicht signifikant
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (Phosphate buffered saline)
PE Phycoerythin
PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
PMT Photomultiplier
PNH Paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie
RLU Relative Lumineszenzeinheiten
ROS Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)
s Sekunden
SHG-Signal Second harmonic generation-Signal
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1
W-54011 Niedermolekularer C5aR-Antagonist
µg Mikrogramm
10
μl Mikroliter
μm Mikrometer
11
1 Einleitung und Fragestellung
1.1 Aufbau und Funktion humaner Haut
Die Haut ist das flächenmäßig größte Organ des menschlichen Körpers. Mit einer Oberfläche von 1,4–2 m2 und einem Gewicht von 10-20 kg (Reißig und Salvetter, 2014) bedeckt sie den gesamten Körper und schließt diesen nach außen ab. Ihr fallen zahlreiche lebensnotwendige Funktionen zu, sodass großflächige Störungen der Integrität der Haut zu lebensbedrohlichen Zuständen führen können.
Die wohl offensichtlichste Funktion der Haut ist ihre Barrierefunktion gegenüber der Umwelt – der kompakte Aufbau der Epidermis bietet einen Schutz vor Fremdkörpern, durch die Sekretion antimikrobieller Peptide werden potentielle Pathogene schon außerhalb des Körpers wirksam bekämpft. Die mechanische Stabilität der Haut schützt bei Stößen, Kratzern und Schnitten.
Verschiedenste Sensoren der Haut sind für die Aufnahme von Reizen verantwortlich, auch zu diesem Zweck ist die Haut fast überall von feinen Haaren bedeckt. Das Aufrechterhalten des inneren Milieus stellt eine weitere wichtige Funktion der Haut dar. Man darf also ohne Zweifel behaupten, dass die Haut ein komplexes, für den Körper lebensnotwendiges Organ ist. Um die einzelnen Funktionen der Haut verstehen und nachvollziehen zu können, ist ein kurzer Einblick in den Aufbau ebendieser vonnöten.
Humane Haut besteht aus drei Schichten: der Oberhaut (Epidermis), der Lederhaut (Dermis) und der Unterhaut (Subkutis). Einen Überblick über den Aufbau vermittelt Abbildung 1.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Haut. Man erkennt deutlich die Anordnung von Ober-, Leder- und Unterhaut.
Zwischen Ober- und Lederhaut ist als rote Linie die Basalmembran dargestellt. (©bilderzwerg. Fotolia.com, 14.06.2016)
12 Nach außen hin bildet die Epidermis als mehrschichtig verhorntes Plattenepithel die äußerste Barriere gegenüber auf den Körper einwirkender Umwelteinflüsse. In einem Zyklus ständiger Erneuerung werden in der Tiefe der Epidermis, an der Basalmembran, neue Zellen gebildet, die aufgrund ihres hohen Gehalts an Keratin als Keratinozyten bezeichnet werden. Diese Zellen werden im Laufe ihres Lebens von in der Tiefe neu gebildeten Zellen immer weiter nach außen gedrängt.
Auf ihrem Weg differenzieren sie sich und verlieren Wasser, der Zellkern zersetzt sich. Am Ende sterben die Zellen ab. Die äußersten, je nach Hautregion 25-100 Zelllagen (Lüllmann-Rauch und Asan, 2015) bilden das Stratum corneum – eine kompakte Schicht abgestorbener Keratinozyten, die eine solide, nicht schmerzempfindliche Barriere zur Umwelt bildet. Unter der Epidermis liegt die Basalmembran, eine Schicht verschiedener Faser- und Verbindungsproteine, an denen die Basalzellen der Epidermis über Hemidesmosomen verankert sind. Von unten sind die Kollagenfasern der Dermis über Ankerfibrillen, hauptsächlich Kollagen Typ VII, mit der Basalmembran verbunden. Sie bildet so eine solide Basis für die Epidermis und stellt außerdem sicher, dass auf die Epidermis einwirkende Scherkräfte an die Kollagenfasern der darunterliegenden Dermis übertragen werden.
Unter der Basalmembran liegt die Dermis, welche sich wiederum in zwei Schichten einteilen lässt.
Der direkt an die Basalmembran anschließende Teil wird als Stratum papillare bezeichnet und besteht hauptsächlich aus locker gepacktem Kollagen Typ I und III, darüber hinaus finden sich hier zahlreiche elastische Fasern. Die tiefere Schicht der Dermis, welche auch den Übergang zur Subkutis bildet, wird als Stratum reticulare bezeichnet und besteht zum Großteil aus Kollagen Typ I, welches enger gepackt ist als im Stratum papillare. Die gesamte Dermis ist von Blutgefäßen und Nervenfasern durchsetzt.
Das Stratum reticulare geht schließlich in die Subkutis über, einer regional sehr unterschiedlich stark ausgeprägten Schicht von Adipozyten, die je nach Körperregion verschiedene Aufgaben erfüllen können. An einigen Regionen auftretendes braunes Fettgewebe dient der Thermogenese.
Auch unter der Fußsohle ist das subkutane Fettgewebe hochspezialisiert, strukturiert als kleine Druckpolster dient es hier der Stoßdämpfung beim Auftreten.
1.2 Blasenbildende Autoimmundermatosen
Der Körper beherbergt mit dem Immunsystem einen hocheffektiven Mechanismus zur Erkennung und Bekämpfung von Fremdkörpern. Auf eine genaue Beschreibung dieser Mechanismen muss hier verzichtet werden, es sei lediglich erwähnt, dass in seltenen Fällen auch körpereigene Strukturen von diesen Mechanismen als fremd erkannt und in der Folge bekämpft werden. Dieser Vorgang wird als Toleranzverlust bezeichnet. Wenn dies passiert, entstehen chronische, oft schwerwiegende
13 Krankheitsbilder, die als Autoimmunkrankheiten bezeichnet werden und danach klassifiziert werden, welche Strukturen vom Immunsystem angegriffen werden. Die Gründe, warum der Körper eigene Strukturen als fremd erkennt, sind noch nicht hinlänglich bekannt. Man vermutet jedoch, dass sowohl genetische als auch Umweltfaktoren eine Rolle spielen (Takai, 2002).
Zur Gruppe der Autoimmunkrankheiten gehören auch die blasenbildenden Autoimmundermatosen, eine Gruppe schwerwiegender Erkrankungen der Haut, die gemeinsam haben, dass im Rahmen einer Autoimmunreaktion Antikörper gegen bestimmte Strukturproteine der Haut gebildet werden. Nach ihrer Bildung binden diese Antikörper an ihre Zielproteine, sodass diese ihre Funktion nicht mehr erfüllen können. Im Falle der blasenbildenden Autoimmundermatosen werden solche Proteine attackiert, die für den Zusammenhalt der einzelnen Hautkomponenten verantwortlich sind. Können diese ihre Funktion nicht mehr erfüllen, lösen sich die unterschiedlichen Hautschichten voneinander, makroskopisch kommt es zur Blasenbildung.
Die Gruppe der blasenbildenden Autoimmundermatosen lässt sich weiter in Pemphigus- und Pemphigoid-Erkrankungen unterteilen. Bei Ersteren kommt es zu Blasenbildung innerhalb der Epidermis. Die häufigsten Varianten sind hier der Pemphigus vulgaris und der Pemphigus foliaceus (Chams-Davatchi et al., 2005). Bei den Pemphigoid-Erkrankungen findet die Spaltbildung an der dermo-epidermalen Junktionszone (DEJ) zwischen Dermis und Epidermis statt. Mit Abstand häufigstes Krankheitsbild ist hier das bullöse Pemphigoid (Bertram et al., 2009), seltenere Varianten sind die lineare IgA-Dermatose und die Epidermolysis bullosa acquisita. Eine Übersicht über verschiedene Ziel-Antigene bei blasenbildenden Autoimmundermatosen und deren Funktion an der DEJ bietet Abbildung 2.
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Abbildung 2: Antigene bei blasenbildenden Autoimmundermatosen. Man erkennt deutlich die Ankerfunktion von Kollagen Typ VII, dem Antigen bei Epidermolysis bullosa acquisita. Antikörper gegen BP 230 oder die NC16A-Domäne von BP180 lösen das bullöse Pemphigoid aus. Laminin ɣ1 ist das Antigen beim Anti-p200/Laminin ɣ1-Pemphigoid, beim Schleimhautpemphigoid ist das Antigen meist Laminin 332 (modifiziert nach Schmidt und Zillikens, 2013).
1.3 Epidermolysis bullosa acquisita
Nach obenstehender Klassifikation gehört die Epidermolysis bullosa acquisita (EBA) zu den Pemphigoid-Erkrankungen. Mit einer Inzidenz von 0,2 - 0,5 Neuerkrankungen pro 1 Millionen (Mio.) Einwohner pro Jahr (Bernard et al., 1995; Bertram et al., 2009) nimmt sie hier numerisch im Vergleich zum bullösen Pemhigoid [Inzidenz: 13,4 pro 1 Mio. Einwohner pro Jahr (Bertram et al., 2009)] eine untergeordnete Rolle ein. Da es sich um eine chronische Krankheit handelt, wird die Prävalenz höher geschätzt, hierzu sind jedoch keine Daten verfügbar. Im Durchschnitt setzt die Krankheit im Alter von 47 Lebensjahren ein (Ludwig, 2013), es sind jedoch auch Fälle bei Kindern und Jugendlichen beschrieben worden (Baican et al., 2013; Liszewski et al., 2015). Das Vorliegen des Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Klasse II-Haplotyps DR2 (HLA-DR2) erhöht das Risiko, zu erkranken (Gammon et al., 1988). Man vermutet jedoch, dass es auch außerhalb dieses Genlokus Gene gibt, die die Erkrankungswahrscheinlichkeit erhöhen. So waren in einer großen
15 Patientenkohorte von EBA-Patienten schwarzhäutige Menschen afrikanischen Ursprungs deutlich überrepräsentiert, diese waren bei Erkrankungsbeginn darüber hinaus jünger als Vergleichspatienten aus den Niederlanden und Korea (Zumelzu et al., 2011; Ludwig, 2013).
Klinisch lassen sich zwei Formen der EBA voneinander differenzieren. Etwa ein Drittel aller Patienten entwickelt die noninflammatorische, oft auch als mechanobullös oder klassisch bezeichnete Variante des Krankheitsbildes. Hier kommt es zu Hautläsionen und Bildung von straffen Blasen, ohne dass dieser Vorgang von einer kutanen Entzündung begleitet wird. Oft ist auch die orale Mukosa betroffen. Bei den anderen zwei Dritteln aller Patienten manifestiert sich die Krankheit als inflammatorische Variante, bei der die Hautläsionen von einer kutanen Entzündungsreaktion begleitet werden. Hier kommt es neben der Bildung straffer Blasen, die teilweise einreißen, zu Hautrötungen und Juckreiz der betroffenen Regionen (Kim et al., 2011;
Ludwig, 2013).
1.3.1 Pathogenese
Die Pathogenese der EBA ist noch nicht vollständig verstanden – auch diese Arbeit beschäftigt sich mit einem Teilaspekt dieses Prozesses. Nach der ersten Fallbeschreibung eines EBA-Patienten (Elliott, 1895) dauerte es mehr als 75 Jahre, bis erste diagnostische Kriterien festgelegt wurden (Roenigk, 1971). Das Antigen war zu diesem Zeitpunkt noch unbekannt, die Diagnose beruhte auf einer negativen Familienanamnese und dem Ausschluss anderer blasenbildender Autoimmundermatosen. Nach heutigem Forschungsstand beginnt der Krankheitsverlauf mit dem Toleranzverlust des Immunsystems für Kollagen Typ VII, welches an der DEJ als molekulare Brücke zwischen dermalen und epidermalen Strukturen fungiert. In der Folge werden vom Körper Antikörper, vorwiegend Immunglobulin G (IgG), gebildet. Diese richten sich insbesondere gegen die nicht-kollagene Domäne 1 (NC1) des Kollagens Typ VII, seltener werden auch Epitope innerhalb der nicht-kollagenen Domäne 2 (NC2) oder der tripelhelikalen kollagenen Domäne in der Mitte des Proteins erkannt (Ishii et al., 2004; Ishii et al., 2009).
Nach Bindung der Antikörper an das Kollagen Typ VII entsteht an der DEJ unter anderem durch Aktivierung des Komplementsystems ein proinflammatorisches Milieu, in der Folge werden neutrophile Granulozyten aus den dermalen Blutgefäßen rekrutiert. Sowohl die komplette Depletion neutrophiler Granulozyten als auch die Depletion von Cluster of differentiation 18 (CD18), einem Adhäsionsfaktor, der für die Extravasation neutrophiler Granulozyten aus den Blutgefäßen ins Gewebe notwendig ist, verhindern das Entstehen von Blasenbildung bei Versuchstieren komplett (Chiriac et al., 2007). Wichtig ist hier zu erwähnen, dass die Rekrutierung der neutrophilen Granulozyten wohl über das „fragment crystallisable“ (Fc-Teil) der Antikörper
16 moduliert wird, da die Injektion von Antigen-bindenden Antikörperfragmenten (Fab-Teil) im Tierversuch nicht ausreicht, um Blasenbildung auszulösen (Sitaru et al., 2005). Es wird vermutet, dass für diesen Rekrutierungsprozess maßgeblich aktive Komponenten des Komplementsystems verantwortlich sind – dieses System kann über die gewebegebundenen Antikörper aktiviert werden. In Gewebeschnitten erkrankter Mäuse ist die Komplementkomponente 5 (C5) an der DEJ nachweisbar, darüber hinaus sind C5-Knockout-Mäuse vor der Ausprägung der Krankheit geschützt (Sitaru et al., 2005). In einem weitergehenden Versuch konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass es ausreicht, den alternativen Weg der Komplementaktivierung zu blockieren, um Mäuse vor dem Krankheitsbefall zu schützen. Die Blockade des klassischen Weges der Komplementaktivierung führt zwar zu einem im Verlauf signifikant weniger ausgeprägtem Phänotyp, kann die Entstehung der Krankheit aber nicht komplett verhindern (Mihai et al., 2007). Im Gewebe setzen die aktivierten neutrophilen Granulozyten dann verschiedene Stoffe frei, die die Integrität der Haut stören und so für die Blasenbildung verantwortlich zu sein scheinen. Neben der Nicotinamidadenindinucleotidphosphat-Oxidase (NADPH-Oxidase), die für die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) verantwortlich ist, konnte nachgewiesen werden, dass auch Gelatinase B und Elastase notwendig sind, um Blasenbildung auszulösen (Shimanovich et al., 2004; Chiriac et al., 2007).
Neben den oben beschriebenen Mechanismen sind noch zahlreiche weitere Moleküle und Zellen in die Pathogenese involviert, deren Einordnung sich auf zeitlicher und räumlicher Ebene jedoch als äußerst schwierig erweist. So konnte zum Beispiel nachgewiesen werden, dass auch die Zytokine Interleukin-1 (IL-1) und IL-6, der Granulozyten-Monozyten-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) und die Chemokin-Liganden 1 und 2 (CXCl1; CXCL2) eine Rolle in der EBA-Pathogenese spielen (Ludwig, 2013).
Nach heutigem Kenntnisstand kommt es also nach Toleranzverlust gegenüber Kollagen Typ VII zur Antikörperbildung gegen dieses Molekül. Die Bindung der Antikörper an der DEJ führt zur, vermutlich Komplement-vermittelten, Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Haut. Die Freisetzung von ROS und verschiedenen Proteasen aus diesen Zellen ist dann für die Blasenbildung und Gewebeschädigung verantwortlich. Abbildung 3 gibt einen Überblick über dieses Modell der Pathogenese.
17
Abbildung 3: Pathogenese der Gewebeschädigung bei experimenteller Epidermolysis bullosa acquisita (EBA).
Antikörperbindung an die dermo-epidermale Junktionszone (DEJ) (a) führt zur lokalen Aktivierung des Komplementsystems (b). Spaltprodukte des Komplementsystems, darunter C5a, vermitteln die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten aus den Blutgefäßen in das Gewebe der Dermis. Noch nicht näher definierte Zellen setzen in der Folge Zytokine frei, die teils pro-, teils antiinflammatorische Effekte haben (c). Die eigentliche Blasenbildung wird hauptsächlich durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und Matrix-Metalloproteinasen (MMP) vermittelt, welche von Neutrophilen freigesetzt werden (d). Für das Abklingen der Entzündungsreaktion scheint unter anderem Flightless-1 (Flii) von Bedeutung zu sein (e) (modifiziert nach Ludwig, 2013).
1.3.2 Therapie
Die Therapie der EBA gestaltet sich, wie bei vielen Autoimmunkrankheiten, ausgesprochen schwierig. Aufgrund der Seltenheit der Erkrankung sind keine kontrolliert-randomisierten Studien verfügbar. Die meisten Patienten werden mit einem oralen Kortikosteroid (0,5-1,5 Milligramm (mg) / Kilogramm (kg) pro Tag) behandelt (Ishii et al., 2010), zur Dosisreduktion wird oft ein Immunsuppressivum (meist Azathioprin oder Methotrexat) parallel verabreicht. Einen vielversprechenden Therapieansatz stellt darüber hinaus Kolchizin dar (Megahed und Scharffetter- Kochanek, 1994), welches auch in Monotherapie eine gute Wirksamkeit zeigte. Allen diesen klassischen Therapiemethoden ist gemein, dass durch die sehr unspezifischen Wirkungen der Medikamente teils starke Nebenwirkungen auftreten. Deren negative Folgen überlagern im Empfinden der Patienten oft die durch den Therapieerfolg erzielten Erfolge.
18 In den letzten Jahren gab es vielfache Ansätze, spezifischere und von weniger Nebenwirkungen behaftete Therapiemethoden zu entwickeln. Getestet wurden diese zu Großteilen an therapierefraktären EBA-Patienten. Besonders vielversprechend erscheint hier die kontinuierliche intravenöse Applikation hoher Dosen Immunglobulin G (IVIG), die in einer kleinen Kohorte therapierefraktärer EBA-Patienten zur deutlichen Besserung des Krankheitsbildes bei nur geringen Nebenwirkungen führte (Ahmed und Gürcan, 2012). Auch Dapson wird häufig in Kombinationstherapie angewendet (Kim et al., 2011). Sein Nutzen als Monotherapie ist jedoch nur für einen einzelnen Fall publiziert (Hughes und Callen, 2001). Weiterhin rückte Rituximab in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus, da es bei anderen blasenbildenden Autoimmundermatosen erfolgreich eingesetzt wurde (Joly et al., 2007). Auch bei der EBA scheint dieses Medikament eine Therapiealternative darzustellen, die kleine Fallzahl und die Tatsache, dass es meist in Kombination mit anderen Arzneien verwendet wurde, erlaubt aber keine finale Aussage über seine Wirksamkeit.
Selbiges gilt auch für den Ansatz, zirkulierende Autoantikörper mittels Immunoadsorption aus dem Serum zu entfernen (Ludwig, 2013).
1.4 Das Anaphylatoxin C5a als wichtige Komponente des Komplementsystems
Das Komplementsystem ist als Teil des angeborenen Immunsystems zu verstehen, dessen Aufgabe es ist, den Körper durch verschiedene Funktionen bei der Fremdkörperabwehr zu unterstützen.
Molekular handelt es sich um eine Enzymkaskade, die durch verschiedene Stimuli (Aktivierungswege) aktiviert wird und dessen Spaltprodukte vielfältige Abwehrfunktionen wahrnehmen. Gängigerweise unterscheidet man zwischen dem klassischen, dem alternativen und dem Lektinweg der Komplementaktivierung. Alle drei Arten der Aktivierung führen letztlich dazu, dass das System seine drei Hauptfunktionen erfüllen kann – die Opsonisierung von Fremdkörpern, deren Bekämpfung durch Bildung des Membran attac complex (MAC) und die Rekrutierung von Entzündungszellen über die Freisetzung von Anaphylatoxinen (Murphy et al., 2014).
Auf eine genaue Darstellung der verschiedenen Aktivierungswege muss hier verzichtet werden.
Letztlich münden alle in einer gemeinsamen Endstrecke, in der die Komplementkomponente 5 (C5) in ihre Spaltprodukte C5a und C5b gespalten wird. Während der Faktor C5b im weiteren Verlauf wichtig für die Bildung des MAC ist und so der Lyse von Bakterien dient, ist C5a als Anaphylatoxin für die Rekrutierung von Entzündungszellen von extremer Wichtigkeit. Einen Überblick über Aktivierungs- und Effektormechanismen des Komplementsystems bietet Abbildung 4.
19
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Komplementsystems. Beim klassischen und beim Lektinweg induziert die Aktivierung von Serinproteasen [C1qrs bzw. Mannose-assoziierte Serinproteasen (MASPS)] die Spaltung von C2 in C2a und C2b und von C4 in C4a und C4b (nicht dargestellt). C2a und C4b bilden einen Komplex (C4b2a) der in der Lage ist, C3 in C3a und C3b zu spalten. C3a fungiert als Anaphylatoxin, während sich C3b an den Komplex anlagert und so zur Bildung von C4b2a3b, der C5-Konvertase des klassischen und des Lektinweges, führt. Der alternative Weg beginnt mit der spontanen Hydrolyse von C3. C3b induziert die Spaltung von frei im Serum vorkommenden Faktor B in Ba und Bb, C3b und Bb bilden einen Komplex, der weitere C3-Moleküle spalten kann. Lagert sich an diesen Komplex ein weiteres C3b-Fragment an, entsteht die C5-Konvertase des alternativen Weges (C3bBb3b). Die C5-Konvertasen spalten dann C5 in C5a und C5b.
Während sich C5b an Zellmembranen anlagert und durch Rekrutierung weiterer Komplementfaktoren (C6-C9) zur Bildung des Membrane attac complex (MAC) führt, ist C5a ein stark wirksames Anaphylatoxin (modifiziert nach Lappegård et al., 2015).
C5a ist ein 74 Aminosäuren langes Glykoprotein, das durch die C5-Konvertase (die wiederum aus anderen Komplementproteinen zusammengesetzt ist) aus dem 1676 Aminosäuren langem C5- Peptid abgespalten wird (Carney et al., 1991). Analog werden auch aus den Komplementfaktoren
20 C3 und C4 die Peptide C3a und C4a abgespalten, diese haben als Anaphylatoxine jedoch eine deutlich schwächere Potenz als C5a (Murphy et al., 2014). Im Plasma wird C5a durch die Carboxypeptidase B schnell am C-Terminus desarginiert, wodurch es einen großen Teil seiner Potenz verliert. Insbesondere die Fähigkeit, an den Komplement-5-a-Rezeptor 1 (C5aR) zu binden, wird stark eingeschränkt (Higginbottom et al., 2005).
Die biologischen Funktionen von C5a sind äußerst vielfältig und noch nicht zur Gänze verstanden.
Besonders auf neutrophile Granulozyten, in geringerem Umfang auch auf Makrophagen und Monozyten, wirkt es stark chemotaktisch (Marder et al., 1985). Bei neutrophilen Granulozyten kann es die Freisetzung granulärer Enzyme hervorrufen. Darüber hinaus verstärkt es die Phagozytoseaktivität und den Sauerstoffverbrauch dieser Zellen. Auf diese Art triggert es den
„oxidativen Burst“, welcher zur Freisetzung von ROS führt (Guo and Ward, 2005). Weiter sind vasodilatatorische Wirkungen bekannt (Schumacher et al., 1991). Darüber hinaus kann es die Expression bestimmter Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche neutrophiler Granulozyten verstärken (Guo et al., 2002). Der Nachweis, dass C5a auf neutrophile Granulozyten eine antiapoptotische Wirkung entfaltet (Perianayagam et al., 2002), bestätigt noch einmal, dass es sich um ein Molekül mit stark proinflammatorischen Wirkungen handelt.
C5a entfaltet den Großteil seiner Wirkungen über Bindung an einen heptahelikalen, G-Protein- gekoppelten Rezeptor (C5aR; CD88) (Gerard und Gerard, 1991). Schon früh wurde die Expression dieses Rezeptors auf Zellen der myeloiden Linie (Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten) nachgewiesen (Chenoweth and Hugli, 1978; Gerard et al., 1989; Werfel et al., 1992). Später wurde der Rezeptor auch auf nichtmyeloiden Zellen der Lunge und Leber entdeckt (Haviland et al., 1995).
Neben C5aR fungiert noch ein weiteres Molekül als Rezeptor für C5a: C5L2, ein nicht-G-Protein- gekoppelter Rezeptor (Okinaga et al., 2003), dessen Funktion noch unklar und Bestandteil heftiger Diskussionen ist. Während einige Gruppen ihn als regulatorischen Rezeptor für die über C5aR vermittelten Effekte betrachten, postulieren andere auch für C5L2 proinflammatorische Funktionen (Li et al., 2013).
Betrachtet man die einzelnen Funktionen des Anaphylatoxins C5a gesammelt, entsteht das Bild eines Moleküls, das eine zentrale Rolle in der Genese und Aufrechterhaltung von Entzündungsreaktionen einnimmt. Die Inhibition der Wirkungen dieses Moleküls ist demzufolge ein vielversprechender Ansatz, die Symptome verschiedenster Erkrankungen zu verbessern – darunter auch die inflammatorische Variante der EBA.
21
1.4.1 Inhibition des Komplementsystems – ein vielversprechender Therapieansatz
Aufgrund der in Kapitel 1.4 beschriebenen vielfältigen Wirkungen des Komplementsystems ist es nur logisch, dass die pharmazeutische Forschung sich der Fragestellung angenommen hat, auf welchem Wege man diese Wirkmechanismen unterbinden kann. Bisher ist mit dem humanisierten monoklonalen Antikörper Eculizumab jedoch nur ein Wirkstoff zugelassen, der in das Komplementsystem eingreift. Dessen Zulassung ist auf zwei seltene Erkrankungen beschränkt: der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie (PNH) und des atypischen hämolytisch-urämischen Syndroms (aHUS) (Lappegård et al., 2015). Zahlreiche Berichte, in denen Eculizumab in anderen Kontexten erfolgreich angewendet wurde (Johnson und Leca, 2015; Misawa, 2015; Salvadori, 2015), legen jedoch nahe, dass die Inhibition des Komplementsystems weit mehr Potential birgt.
Ruft man sich den kaskadenartigen Ablauf der Komplementaktivierung in Erinnerung, wird schnell klar, dass sich zur Komplementinhibition viele Zielmoleküle anbieten. Wie bei jeder pharmakologischen Therapie sollte jedoch eine möglichst spezifische, jeweils auf die krankheitsauslösenden Faktoren beschränkte Therapie angestrebt werden, um Nebenwirkungen zu vermeiden. Eculizumab entfaltet seine Wirkung durch Bindung an C5 – somit wird die Spaltung dieses Moleküls verhindert, weder C5a noch C5b entstehen. Da C5b essentieller Teil des MAC ist, kann dieser in der Folge nicht gebildet werden. Besonders wichtig scheint der MAC zur Bekämpfung von Neisserien zu sein – Patienten, die mit Eculizumab behandelt werden, haben ein erhöhtes Risiko für Neisserieninfektionen und müssen daher vor Beginn der Behandlung geimpft werden (McKeage, 2011).
In der Pathogenese der EBA ist die Rolle des Komplementsystems bereits recht gut eingegrenzt: Die Tatsache, dass C5-Knockout Mäuse keine Krankheitszeichen entwickeln (Sitaru et al., 2005) wies erstmals darauf hin, dass die Aktivierung terminaler Komplementkomponenten zur Krankheitsentwicklung nötig ist. Neonatale Mäuse entwickeln nur dann Blasen, wenn Ihnen zusätzlich zum pathogenen Antikörper IL-8 und C5a injiziert werden (Sitaru et al., 2005). Darüber hinaus konnte der wichtige Nachweis erbracht werden, dass C6-defiziente Mäuse nicht vor der Krankheit geschützt sind und demzufolge die Bildung des MAC (und damit höchstwahrscheinlich auch C5b) für die Pathogenese irrelevant zu sein scheinen (Mihai et al., nicht publizierte Daten).
Diese Erkenntnis rückte erstmals C5a als entscheidendes Molekül des Komplementsystems in den Fokus der Forschung. Inzwischen konnte diese Vermutung dadurch untermauert werden, dass C5aR-Knockout-Mäuse ein stark reduziertes Krankheitsbild entwickeln (Karsten et al., 2012).
Verschiedene natürlich vorkommende Peptidasen (z.B. die C5a-Peptidase von A-Streptokokken oder eine Cystein-Protease von Entamoeba histolytica) bieten die Möglichkeit, C5a direkt zu
22 inhibieren (Reed et al., 1995; Kagawa et al., 2009). In der aktuellen Forschung nehmen Moleküle, die an C5aR binden und so C5a-vermittelte Wirkungen blockieren sollen, jedoch eine weit prominentere Rolle ein. So wurde zum Beispiel der C5aR-Antagonist CCX168 bereits bei Patienten mit Anti-neutrophile zytoplasmatische Antikörper (ANCA) -assoziierter renaler Vaskulitis klinisch getestet (Jayne et al., 2014). Der peptidische C5aR-Antagonist PMX-53 wurde, wenn auch erfolglos, bei Patienten mit rheumatoider Arthritis eingesetzt (Vergunst et al., 2007). Zwei andere in dieser Arbeit verwendete C5aR-Antagonisten werden im Folgenden kurz vorgestellt.
1.4.2 W-54011, ein spezifischer Antagonist des Komplement-5a-Rezeptors 1
Der kleine, nichtpeptidische Antagonist W-54011 wurde 2002 durch Screening einer großen Molekülbibliothek als solcher identifiziert (Sumichika et al., 2002). Durch anschließende chemische Modifikation konnte die inhibitorische Potenz erhöht werden. Schon in der Erstpublikation wurde die Fähigkeit, durch rekombinantes humanes C5a induzierten Kalziumeinstrom bei humanen neutrophilen Granulozyten inhibieren zu können, belegt. An murinen neutrophilen Granulozyten konnte dieser Effekt nicht nachgewiesen werden, was 2005 über speziesabhängige Unterschiede im molekularen Aufbau der C5a-Rezeptoren erklärt werden konnte (Waters et al., 2005). Trotz dieses Nachweises war W-54011 jedoch in der Lage, in einem in vitro Assay die intrinsische Aktivität des C5aR-Rezeptors auf murinen dendritischen Zellen zu inhibieren (Peng et al., 2009), weshalb er auch in einem Review weiter als Kandidat für die Nutzung an Mausmodellen gehandelt wurde (Woodruff et al., 2011). Inzwischen wurde er erfolgreich bei einem murinen Pankreatitismodell eingesetzt und erwies sich dort sogar im Vergleich zu einem peptidischen Antagonisten als effektiver (Sendler et al., 2015).
1.4.3 A8
Δ71-73als Antagonist der Komplement-5a-Rezeptoren 1 und 2
Im Gegensatz zu W-54011 ist A8Δ71-73 ein peptidischer Antagonist. Die Entwicklung dieses Moleküls beruht auf der Erkenntnis, dass für die Signaltransduktion am Rezeptor das C-terminale Oktapeptid von C5a von besonderer Relevanz ist (Kawai et al., 1991). Mittels Phagen-Display wurde aufbauend auf diesem Befund ein Peptid mit einem mutierten C-Terminus identifiziert, das an C5aR bindet, die Signaltransduktion jedoch auf Höhe des G-Proteins unterbindet. In in-vitro-Versuchen wurde für dieses Peptid (A8Δ71-73) nachgewiesen, dass es C5a-vermittelten Kalziumeinstrom bei murinen Makrophagen unterbinden kann. Interessanterweise konnte sogar in vivo nachgewiesen werden, dass A8Δ71-73 in der Lage ist, die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Bauchhöhle nach dort ausgelöster Entzündungsreaktion signifikant zu reduzieren. Wichtig ist hier die Feststellung, dass der Inhibitor dafür intravenös (i.v.) injiziert werden musste (Heller et al., 1999a). Als einziger aller bekannten C5aR-Antagonisten ist für A8Δ71-73 nachgewiesen, dass er auch an C5L2 bindet (Otto et al., 2004). Seit Entwicklung wurde der Inhibitor in verschiedenen Krankheitsmodellen an Mäusen
23 erfolgreich eingesetzt, unter anderem im Kontext des allergischen Asthmas (Karp et al., 2000) oder Nierentransplantationen (Lewis et al., 2008). Abbildung 5 stellt schematisch die Effekte der Rezeptorblockade mittels A8Δ71-73 dar.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der C5aR-Blockade. Physiologische Bindung von C5a an C5aR mit folgender Signaltransduktion (links). Der peptidische Antagonist A8Δ71-73 bindet an C5aR, blockiert die Signaltransduktion aber auf Höhe des gekoppelten G-Proteins. Proinflammatorische Effektorfunktionen werden so nicht vermittelt (Mitte). Welche Funktionen über den zweiten bekannten C5a-Rezeptor, C5L2, vermittelt werden, ist Bestandteil kontroverser wissenschaftlicher Diskussionen. A8Δ71-73 bindet jedoch auch an diesen Rezeptor (rechts). GP: G-Protein, PKC: Proteinkinase C, MAPK: Mitogen-activated-Protein-Kinase
1.5 Zwei-Photonen-Mikroskopie
Die 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie ist ein bildgebendes Verfahren, was erstmals 1990 beschrieben (Denk et al., 1990) und seitdem in zahlreichen Arbeiten zum Einsatz gekommen ist.
Wie bei der normalen Fluoreszenzmikroskopie werden Fluorophore der zu untersuchenden Probe mittels Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt, woraufhin diese von einem Grundzustand in einen Zustand höherer Erregung übergehen (Abbildung 6). Durch das Zurückfallen in den Grundzustand werden Photonen freigesetzt, die dann detektiert werden können. Bei der Zwei- Photonen-Mikroskopie wird die Energie der Anregungsphotonen so gewählt, dass das Treffen eines
24 Photons auf den Fluorophor nicht ausreicht, um diesen anzuregen – eine Anregung findet erst statt, wenn zwei Photonen zur selben Zeit auf denselben Fluorophor treffen.
Abbildung 6: Jablonski-Diagramm zur Veranschaulichung von Ein- (a) und Zwei- (b) Photonen-Anregung. In beiden Fällen werden Fluorophore aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand versetzt, der auch als erster Elektronenanregungszustand bezeichnet wird. Nach vibrierender Relaxation fallen die Fluorophore auf ihr ursprüngliches Energielevel zurück und setzen hierbei ein Photon frei. Nach erneuter Vibrationsrelaxation erreichen sie wieder ihren Grundzustand (modifiziert nach So, 2002).
Dies bietet zahlreiche Vorteile: Da zur Anregung Licht geringerer Energie ausreicht, kann die Wellenlänge erhöht werden, was ein tieferes Eindringen (bis 1 mm) in Gewebeproben erlaubt (Theer et al., 2003). Die geringere Energie der eingesetzten Lichtstrahlen hat den weiteren Vorteil, dass es im Vergleich zur konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie zu wesentlich geringeren laserinduzierten Gewebeschäden bei der Probe kommt. Ein dritter Vorteil besteht in der hohen dreidimensionalen Auflösung der erhaltenen Bilder, da nur dort ein Fluoreszenzsignal entstehen kann, wo zwei Photonen gleichzeitig auf einen Fluorophor treffen – also im sehr eng begrenzbaren Fokus der Lichtstrahlen (Xu et al., 1996). Zur Mikroskopie der Haut ist diese Methode darüber hinaus besonders geeignet, da dermales Kollagen durch seine Struktur bedingt nach Anregung ein second harmonic generation-Signal (SHG) emittiert (Zipfel et al., 2003). Es kann so ohne vorherige Fluoreszenzmarkierung gut dargestellt werden, was eine klare Abgrenzung zwischen Epidermis, Dermis und Subkutis erlaubt (Kabashima und Egawa, 2014).
Für die Visualisierungsversuche in dieser Arbeit wurden Lysozym-M - enhanced green fluorescent protein (LysM-eGFP) Mäuse verwendet. Dieser im Jahr 2000 erstmalig beschriebene, transgene
25 Mausstamm exprimiert unter dem Lysozym-M-Promoter der myeloiden Zelllinie das enhanced green fluorescent protein (eGFP). Besonders stark wird das Protein bei diesen Mäusen in neutrophilen Granulozyten, zu einem geringerem Grad auch in Makrophagen exprimiert (Faust et al., 2000). Da diese Mäuse nun selektiv in den genannten Zellen starke grüne Fluorophore beherbergen, lassen sich mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie Wanderungsbewegungen dieser Zellen gut darstellen.
Um darüber hinaus die Lokalisierung und Bindungskapazität des injizierten anti-murines Kollagen Typ VIIc-(anti-mCOL7c) Antikörpers darstellen zu können, wurde dieser vorher mit einem roten Fluorophor markiert. Insgesamt konnten also mittels drei verschiedener Detektionskanäle das dermale Kollagen, neutrophile Granulozyten sowie der injizierte Antikörper visualisiert werden.
Anschließend wurden die erhaltenen Informationen in dreidimensionale Bilder übersetzt.
1.6 Ziele der Arbeit
Diese Arbeit hat zum Ziel, die Rolle des Anaphylatoxins C5a in der Pathogenese der EBA auf zeitlicher und räumlicher Ebene genauer einzuordnen. Die bereits recht sichere Erkenntnis, dass C5a in der Pathogenese der EBA eine tragende Rolle spielt, soll durch Untersuchungen zum genauen Zeitpunkt und Ort dieser Wirkungen präzisiert werden. Darüber hinaus wird getestet, ob durch pharmakologische Blockade von C5a-Rezeptoren das Krankheitsbild verbessert bzw. die Krankheitsausprägung verhindert werden kann. Die erfolgreichen Versuche an genetisch veränderten Tieren legen nahe, dass dieses Molekül im Verlaufe der Pathogenese eine zentrale Rolle einnimmt. Der Versuch, die Wirkungen von C5a pharmakologisch zu unterbinden, stellt daher den logischen nächsten Schritt dar, um langfristig zu prüfen, ob eine solche Therapie auch am Menschen zur Behandlung der EBA und anderer blasenbildender Autoimmundermatosen eine geeignete Therapieform sein kann. Vermutet wird, dass durch pharmakologische Blockade des C5a- Rezeptors die Krankheitsausprägung im EBA-Mausmodell verbessert werden kann und dieser Effekt dadurch erreicht wird, dass weniger neutrophile Granulozyten in die Dermis rekrutiert werden (Abbildung 7).
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Abbildung 7: Schematische Darstellung der Wirkungsweise der Komplement-5a-Rezeptor-1 (C5aR)- Blockade. Durch die Bindung von Antikörpern (anti-mCOL7c IgG) an Kollagen Typ VII wird das Komplementsystem aktiviert, auch die Komplementkomponente 5a (C5a) wird freigesetzt. Durch Bindung an C5aR, der vorwiegend von neutrophilen Granulozyten exprimiert wird, werden diese Zellen aus den Blutgefäßen ins Gewebe rekrutiert, wo sie dann die eigentlichen Krankheitssymptome hervorrufen. Die pharmakologische Blockade unterbindet diesen Rekrutierungsmechanismus, sodass die zur Krankheitsentstehung notwendigen Neutrophilen (grün dargestellt) im Gewebe der Dermis nicht mehr in nennenswerter Anzahl vorliegen.
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2 Methoden
2.1 Tierversuche
Alle Tierexperimente wurden vom Ministerium für Natur und Umwelt des Landes Schleswig- Holstein genehmigt (Auftragsnummer 5|2 – 1|11). Die Erlaubnis zur Durchführung tierexperimenteller Arbeiten wurde durch Absolvierung eines Tierschutzkurses der Universität zu Lübeck erlangt. Alle Mäuse wurden in der gemeinsamen Tierhaltung der Universität zu Lübeck gezüchtet. C57Bl/6-Mäuse wurden ursprünglich von Jackson Laboratories (Bar Harbor, USA) erworben, LysM-eGFP – Mäuse wurden ursprünglich von Dr. Graf (Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg), Hamburg, zur Verfügung gestellt. Die verwendeten Mäuse wurden in pathogenfreier Umgebung bei einem 12-Stunden Licht-Dunkel-Zyklus in der gemeinsamen Tierhaltung der Universität zu Lübeck gehalten. Es bestand stets unbeschränkter Zugang zu Wasser und Standardfutter.
2.2 Antikörpertransfer-induziertes Mausmodell für Epidermolysis bullosa acquisita Bei diesem Krankheitsmodell werden Mäusen Antikörper injiziert, die sich spezifisch gegen die NC1-Domäne von Kollagen Typ VII richten. Die Antikörper werden durch Immunisierung von Kaninchen mit dem Proteinfragment mCOL7c gewonnen. Aus den Seren immunisierter Kaninchen werden in einem ersten Schritt alle IgG isoliert. Anschließend werden aus diesem IgG-Cocktail nur solche IgG, die sich spezifisch gegen mCOL7c richten, isoliert. In dieser Arbeit wurden die aufgereinigten Antikörper darüber hinaus fluoreszenzmarkiert, um die Bindung ebendieser mit verschiedenen mikroskopischen Techniken nachweisen zu können. Nach dieser Affinitätsaufreinigung und Markierung werden die IgG Mäusen injiziert, die daraufhin das Krankheitsbild der EBA entwickeln. Einen Überblick über den Arbeitsablauf des Antikörpertransfer- induzierten Mausmodells für EBA bietet Abbildung 8.
Abbildung 8: Antikörpertransfer-induziertes Epidermolysis bullosa acquisita-Mausmodell. Nach Immunisierung von Kaninchen mit einem Fragment des murinen Kollagen Typ VII (mCOL7c), werden die Seren dieser Kaninchen gewonnen (Firma Eurogentec GmbH, Belgien). Nach einem zweistufigen Aufreinigungsverfahren wird der gewonnene anti-mCol7c- Antikörper mit einem roten Fluorophor (DyLight 594) markiert. Anschließend erfolgt die Injektion in Mäuse.
28 Insgesamt wurden 2 Tierexperimente durchgeführt. In einem ersten Versuch wurden bei Mäusen wie oben beschrieben das Krankheitsbild der EBA ausgelöst, mittels täglicher intraperitonealer (i.p.) Injektion von W-54011, eines Antagonisten des C5aR, wurde der Einfluss der über diesen Rezeptor vermittelten Signalwege evaluiert (Abbildung 9). Als Dosis wurden 10 Mikrogramm (µg) / Injektion [entspricht bei einem Mausgewicht von 20 Gramm (g) 500 µg /Kilogramm (kg) Körpergewicht (KG)]
gewählt. Der Kontrollgruppe wurden 100 Mikroliter (µl) 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespritzt, was dem Lösungsmittel des Rezeptorblockers entspricht. Um sicherzustellen, dass auch in der Frühphase der Entzündungsreaktion ausreichend hohe Wirkkonzentrationen vorliegen, wurde die Behandlung bereits 2 Tage vor Krankheitsinduktion begonnen. An Tag 0 und 2 des Versuches wurden jeweils 250 µg der anti-mCOL7c-IgG injiziert, deren Produktion in 2.2.1 – 2.2.4 beschrieben wird. An Tag 4, 8 und 12 wurde, wie in 2.8 beschrieben, die Krankheitsausprägung statistisch erfasst. Anschließend wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation unter Narkose getötet und Gewebeproben der Ohren entnommen.
Abbildung 9: Struktur des Experimentes W-54011. Bereits zwei Tage vor Krankheitsinduktion beginnt die Behandlung mit dem C5aR-Antagonisten W-54011 in einer Dosierung von ca. 500 µg/kg KG. An Tag 0 und 2 werden 250 µg anti-mCol7c- IgG injiziert, der C5a-Antagonist wird weiter täglich injiziert. An Tag 4, 8 und 12 wird die Krankheitsausprägung beurteilt, an Tag 12 werden die Mäuse getötet und Gewebeproben entnommen.
In einem zweiten Versuch wurde der Einfluss von C5aR und C5L2 untersucht. Da in diesem Versuch die Extravasation neutrophiler Granulozyten visualisiert wurde, wurde der Versuch an hierfür geeigneten LysM-eGFP-Mäusen vorgenommen (siehe Absatz 1.5). Das Krankheitsbild der EBA wurde wie oben beschrieben ausgelöst. Gleichzeitig mit der Krankheitsinduktion begann die Behandlung mit A8Δ71-73. Dieser Antagonist wurde alle 12 Stunden in die Schwanzvene der Mäuse injiziert. Anders als im Versuch mit W-54011 wurde auf eine Vorbehandlung mit A8Δ71-73 verzichtet.
Dieses Vorgehen hatte zwei Gründe: Erstens sollte zur Erhebung eines Basiswertes der Anzahl
29 neutrophiler Granulozyten eine Visualisierung an gesunden, nicht vorbehandelten Tieren möglichst kurz vor Versuchsbeginn erfolgen. Darüber hinaus betrachteten wir aufgrund der kurzen Halbwertszeit des Antagonisten eine Behandlung mehrere Tage oder Stunden vor Beginn der Krankheitsinduktion als nicht zielführend. Kontrolltieren wurde PBS injiziert, was dem Lösungsmittel des Antagonisten entspricht. Diese Behandlung wurde für 4 Tage fortgeführt. Bereits zwei Tage vor Versuchsbeginn wurden die Ohren der Mäuse ein erstes Mal visualisiert, wie in 2.3 beschrieben wird. An Tag 1 und 3 des Versuches folgten dann erneute Visualisierungen. An Tag 4, 8 und 12 wurde die Krankheitsausprägung statistisch erfasst, bevor die Tiere an Tag 12 durch zervikale Dislokation unter Narkose getötet wurden. Auch in diesem Versuch wurden Gewebeproben der Ohren entnommen. Abbildung 10 zeigt schematisch den Ablauf des Experimentes.
Abbildung 10: Struktur des Experimentes A8Δ71-73. Zwei Tage vor Krankheitsinduktion wird die Extravasation neutrophiler Granulozyten im gesunden Mausohr mittels 2-Photonen-Mikroskopie beurteilt. Parallel zur Krankheitsinduktion wird mit der Behandlung mit dem C5aR-Antagonisten A8Δ71-73 begonnen. An Tag 1 und 3 wird die Extravasation erneut beurteilt.
Die Behandlung mit A8Δ71-73 wird bis einschließlich Tag 4 alle 12 Stunden vorgenommen. An Tag 4, 8 und 12 wird die Krankheitsausprägung erfasst, an Tag 12 werden die Mäuse getötet und Gewebeproben entnommen (Tag 5-12 nicht dargestellt).
2.2.1 Isolierung von Immunglobulin G aus Kaninchenseren
Aus den Seren immunisierter Kaninchen wurden durch Protein G-Chromatographie alle IgG isoliert.
Nach dem Auftauen der Seren bei 4 Grad Celsius (°C) wurden diese auf eine Protein-G - Chromatographiesäule gegeben und über Nacht bei 4 °C auf dem Schüttler inkubiert. Am Folgetag wurde der Durchfluss verworfen und die Säule mit PBS gewaschen, bis der Durchfluss bei 280 Nanometer (nm) eine Extinktion von < 0,05 aufwies. Dann wurde das an die Matrix gebundene IgG mit Glycinpuffer eluiert, bis die gemessene Extinktion des Durchflusses < 0,01 war. Um die IgG nur
30 möglichst kurze Zeit einem sauren pH-Wert auszusetzen, wurden in die Sammelgefäße je 4 Tropfen 1 Molar (M) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS)-Base vorgelegt. Nach Abschluss des Eluierens wurde der pH-Wert der Lösungen mit 1 M TRIS-Base auf 7,2 eingestellt. Die Säule wurde anschließend mit PBS gewaschen, bis die Extinktion des Durchflusses < 0,00 war. Durch Waschen mit 50 ml 1 M Natriumchlorid (NaCl) und 50 ml PBS wurde die Säule regeneriert. Zur Vermeidung von Kontaminationen wurde ein letzter Waschschritt mit 75 ml 20 % Ethanol durchgeführt. Die zu einem Drittel mit Ethanol gefüllte Säule wurde dann bei 4 °C gelagert.
Die erhaltene IgG-Lösung wurde in Amicon® Ultra-15 Zentrifugierfiltereinheiten [30 Kilodalton (kDA)] überführt und 35 Minuten (min) bei 4000 Umdrehungen pro Minute (rpm) und 4 °C zentrifugiert. Zu der im Filter verbliebenen Lösung wurde wieder IgG-Lösung hinzugefügt und erneut zentrifugiert. Dies wurde solange wiederholt, bis die gesamte IgG-Lösung aufgebraucht war.
Anschließend wurden die Filtereinheiten je zweimal mit PBS aufgefüllt und bei denselben Parametern zentrifugiert. Nach diesem Pufferwechsel von Glycin zu PBS wurde photometrisch die Konzentration der IgG-Lösung bestimmt. Die Lösung wurde steril filtriert und bei 4 °C gelagert, bis mit der spezifischen Aufreinigung fortgefahren wurde.
2.2.2 Affinitätsaufreinigung spezifischer Antikörper gegen murines Kollagen Typ VIIc
Zur Affinitätsaufreinigung der IgG-Lösung wurde eine Chromatographiesäule verwendet, deren Matrix mit mCOL7c, also dem Antigen der zu gewinnenden Antikörper, beschichtet war. Diese Säule wurde mit 20 ml PBS gewaschen, bevor die wie in 2.2.1 beschrieben erhaltene IgG-Lösung auf die Säule gegeben wurde. Nach Inkubation auf dem Schüttler über Nacht bei 4 °C wurde am Folgetag der Durchfluss gesammelt. Anschließend wurde die Säule mit 20 ml Tritonpuffer und anschließend mit PBS gewaschen, bis die Extinktion des Durchflusses bei 280 nm < 0,01 war. In ein 50 ml Falconröhrchen wurden nun 3 Tropfen 1 M TRIS-Base vorgelegt. Anschließend wurde die Säule mit auf 4 °C temperierten Glycinpuffer befüllt und so die Ziel-Antikörper eluiert. Dieser Vorgang wurde so lange fortgesetzt, bis die Extinktion des Durchflusses < 0,05 war. Der Durchfluss wurde in dem zuvor mit TRIS-Base vorbereitetem Falconröhrchen gesammelt, um den sauren pH-Wert des Glycinpuffers schnell zu neutralisieren und so ein schonenderes Milieu für die Antikörper zu kreieren. Nach Abschluss des Eluierens wurde der pH-Wert der erhaltenen Antikörperlösung mit 1 M TRIS-Base auf 7,2 eingestellt und das Röhrchen bei 4 °C gelagert. Die Säule wurde anschließend mit Glycinpuffer gewaschen, bis die Extinktion des Durchflusses < 0,01 war. Durch Waschschritte mit je 20 ml 20 Millimolar (mM) TRIS Puffer, 20 mM TRIS + 0,5 M NaCl Puffer, 20 mM TRIS Puffer und schließlich PBS wurde die Säule regeneriert.31 Anders als bei der unspezifischen IgG-Aufreinigung wurde der Durchfluss der IgG-Lösung wie oben beschrieben nicht nach der ersten Inkubation auf der Säule verworfen, sondern erneut gesammelt.
Diese Lösung wurde nach Abschluss des ersten Aufreinigungszyklus erneut auf die Säule gegeben und für 30 min bei 4 °C auf dem Schüttler inkubiert. In der Folge wurde ein zweiter Aufreinigungszyklus vorgenommen, der methodisch dem zuvor beschriebenen Ersten gleich war.
Die IgG-Lösung wurde erneut gesammelt, sodass nach dem zweiten ein dritter Aufreinigungszyklus vorgenommen werden konnte, der methodisch dem Zweiten gleich war. Erst nach diesem Zyklus wurde die nun noch übrig gebliebene Lösung verworfen. Auf diese Weise wurde versucht, aus der isolierten unspezifischen IgG-Lösung möglichst alle spezifischen Antikörper zu extrahieren. Nach dem letzten Aufreinigungszyklus wurde die Säule mit 30 ml 20 % Ethanol gewaschen. Die zu einem Drittel mit Ethanol gefüllte Säule wurde dann bei 4 °C gelagert.
Die durch die Aufreinigung erhaltene IgG-Lösung wurde in Amicon® Ultra-15 Zentrifugierfiltereinheiten (30 kDA) überführt und 10 min bei 4000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Zu der im Filter verbliebenen Lösung wurde wieder IgG-Lösung hinzugefügt und erneut zentrifugiert.
Dies wurde solange wiederholt, bis die gesamte IgG-Lösung aufgebraucht war. Anschließend wurden die Filtereinheiten, die nun bereits jeweils aufkonzentrierte IgG-Lösung enthielten, mit PBS aufgefüllt und 10 min bei denselben Parametern zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde noch einmal mit PBS aufgefüllt, nun aber 15 min zentrifugiert. Nach diesem Pufferwechsel von Glycin zu PBS wurde der Inhalt aller Filtereinheiten in eine Einheit überführt und diese solange zentrifugiert, bis 1,5 ml Lösung im Filter verblieben. Von dieser Lösung wurde nun photometrisch die Konzentration gemessen. Je nach Bedarf wurde nun durch weiteres Zentrifugieren bzw. Verdünnen mit PBS die Konzentration der Lösung auf 2 mg/ml eingestellt. Die Lösung wurde steril filtriert und bei 4 °C gelagert, bis mit der Fluoreszenzmarkierung der Antikörper fortgefahren wurde.
2.2.3 Fluoreszenzmarkierung des aufgereinigten Antikörpers
Die aus 2.2.2 erhaltene spezifische IgG-Lösung wurde in einen Zellulose-Dialysierschlauch gegeben.
Dieser Schlauch wurde über Nacht in 5 Liter (l) auf 4 °C gekühlten Boratpuffer gehängt. Nach diesem Pufferwechsel von PBS zu Boratpuffer konnte am nächsten Tag die eigentliche Markierungsreaktion stattfinden. Der Dialysierschlauch wurde aus dem Boratpuffer entnommen, je 500 μl der enthaltenen Antikörperlösung wurden dann mit je 65 μg DyLight 594 gemischt und 1 h bei Raumtemperatur in Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurden die Lösungen mit den nun markierten Antikörpern wieder in einen Dialysierschlauch gegeben. Wie zuvor beschrieben fand nun ein Rücktransfer der Antikörper von Boratpuffer zu PBS statt. Die markierten Antikörper wurden anschließend bis zur Benutzung bei -20 °C gelagert.
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2.2.4 Testung der Bindekapazität des spezifischen, fluoreszenzmarkierten Antikörpers
Zum Testen der Bindekapazität der aufgereinigten und fluoreszenzmarkierten Antikörper wurden 6 μm dicke Gefrierschnitte von Ohren gesunder C57Bl/6 – Mäuse aufgetaut. Die Schnitte wurden mit einem DAKO-Fettstift umkreist, anschließend wurden 100 μl der zu testenden IgG-Lösung in einer Konzentration von 20 μg/ml auf die Gewebeschnitte gegeben. Nach einer Stunde Inkubation in einer Feuchtkammer wurden die Schnitte dreimal für je 5 min in PBS gewaschen. Die Bindung an die dermo-epidermale Junktionszone wurde anschließend mithilfe des Keyence BZ 9000 – Mikroskops analysiert.2.3 Visualisierung der Neutrophilenextravasation mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie Die zu untersuchende Maus wurde mittels i.p.-Injektion von 400 μl einer klassischen Tripelnarkose (50 μl Fentanyl, 400 μl Medetomidinhydrochlorid und 800 μl Midazolam verdünnt in 3,5 ml steriler Ringerlösung) in Narkose gelegt. Vor der ersten Visualisierung wurde das Ohr mithilfe einer Schere und Enthaarungscreme enthaart. Die Maus wurde anschließend bäuchlings auf eine Wärmeplatte gelegt, welche eine Temperatur von 39 °C hatte. Ein Metallblock wurde neben dem Kopf der Maus mittels doppelseitigem Klebeband auf der Wärmeplatte fixiert. Der Block wurde anschließend auch auf der Oberseite mit doppelseitigem Klebeband präpariert. Das zu untersuchende Mausohr wurde auf den Metallblock geklebt. Etwaige Unebenheiten im aufgeklebten Ohrabschnitt wurden mithilfe einer Pinzette ausgestrichen. Anschließend wurde das Ohr durch dreimaliges Bestreichen mit der Pinzette mechanisch irritiert. Auf das Ohr wurde dann ein Tropfen Vidisic-Augensalbe gegeben.
Hierbei wurde darauf geachtet, dass in der Salbe keine Luftblasen eingeschlossen waren. Ein Deckgläschen wurde auf die Augensalbe gelegt und mit Tape an der Wärmeplatte befestigt. Auf das Deckgläschen wurde anschließend erneut luftblasenfrei ein Tropfen Vidisic-Augensalbe aufgetragen.
Für die Visualisierung wurde ein TrimScope II, ausgerüstet mit 2 MaiTai-Lasern und einem XLUMPLFL 20x W/0.95-Objektiv, verwendet (Abbildung 10). Das Ohr wurde unter dem Objektiv platziert und das Objektiv in die oberste Vidisic-Schicht eingetaucht. Zur Anregung sowohl des SHG- Signals des dermalen Kollagens Typ I als auch des eGFPs in den neutrophilen Granulozyten wurde ein Laser auf eine Wellenlänge von 900 nm eingestellt. Der zweite Laser wurde zur Anregung des DyLight 594 – also des fluoreszenzmarkierten Antikörpers - auf eine Wellenlänge von 740 nm eingestellt. Beide Laser wurden an jedem Versuchstag mehrfach manuell mithilfe zweier Spiegel justiert. Die emittierten Lichtsignale wurden mithilfe dreier Photomultiplier (PMT) gemessen. Ein PMT amplifizierte alle Signale mit Wellenlängen von 425 – 495 nm und diente so zur Darstellung des SHG-Signals des Kollagen Typ I. Durch Amplifikation aller Signale zwischen 495 - 560 nm wurde das eGFP und somit die neutrophilen Granulozyten detektiert. Die Detektion der Signale mit
33 Wellenlängen zwischen 560 – 594 nm erlaubte die Darstellung des DyLight 594 und somit des fluoreszenzmarkierten Antikörpers.
Abbildung 11: Schematischer Aufbau des Zwei-Photonen-Mikroskops. 3 verschiedene Laser können Licht unterschiedlicher Wellenlängen generieren. Über manuell einstellbare Spiegelsyteme werden die generierten Lichtstrahlen auf die Probe gelenkt, Beamshaper und Scanhead dienen der Modulierung und Fokussierung der Lichtstrahlen. Von der Probe emittierte Photonen werden mittels wellenlängenspezifischer Photomultiplier registriert und amplifiziert. Die so erhaltenen Signale werden computergestützt in ein Bild übersetzt.
Durch Nutzung der ImSpector-Software wurden standardisierte Messparameter angewendet. Von jedem Mausohr wurden an jedem Visualisierungstag sieben Bildserien aufgenommen. Eine Bildserie bestand aus 46 250 x 250 μm großen Bildern, die im vertikalen Abstand von 2 μm aufgenommen wurden. Vor Aufnahme jeder Bildserie wurde durch Orientierung durch das Kollagen Typ I-Signal sowie durch das DyLight 594-Signal die Lage der DEJ bestimmt. Die Bildserien wurden dann derart aufgenommen, dass das erste Bild 20 μm oberhalb der DEJ aufgenommen wurde, das letzte 70 μm unterhalb. Jedes Bild bestand aus 520 x 520 Pixeln, aufgenommen wurde mit einer Frequenz von 400 Hertz (Hz) und einer Line Average von 3.
Nach Aufnahme wurden die Daten in msr.-Dateien konvertiert und mittels Imaris-Software ausgewertet. Hierbei wurden hell leuchtende Zellen als neutrophile Granulozyten, wenig Leuchtende als Makrophagen klassifiziert. Anhand der Form konnten ausgewanderte Zellen von solchen in Blutgefäßen differenziert werden. Ausgewanderte neutrophile Granulozyten wurden
34 gezählt, darüber hinaus wurde erhoben, wie viele dieser Zellen sich in unmittelbarer Nähe (16 μm) zur DEJ befanden.
2.4 Isolation muriner neutrophiler Granulozyten
Zur Gewinnung muriner neutrophiler Granulozyten wurden sowohl C57Bl/6- als auch LysM-eGFP- Mäuse durch zervikale Dislokation unter Narkose getötet. Operativ wurden die Femora sowie die Tibiae beider Hinterbeine entnommen und in Hank’s balanced salt soution (HBSS) prep bei 4 °C zwischengelagert. Nach Abschluss der Operation wurden mit einer Schere die jeweiligen Gelenkköpfe der Knochen angeschnitten, um einen Zugang zur Markhöhle zu erhalten. Mithilfe einer 26 ½ G-Nadel wurde das Knochenmark jedes Knochens mit HBSS prep in ein 50 ml Falconröhrchen ausgespült. Die so isolierten Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 1400 rpm und 4 °C für 4 min gewaschen. Der Überstand wurde verworfen und das erhaltene Zellpellet in 6 ml 0,2
% NaCl resuspendiert, um enthaltene Erythrozyten zu lysieren. Nach 30 Sekunden (s) wurden 14 ml 1,4 % NaCl zugegeben, um die Lyse zu stoppen. Nach Zugabe von 10 ml HBSS prep folgte ein weiterer Waschschritt bei den zuvor genannten Parametern. Das erhaltene Zellpellet wurde in 4 ml HBSS prep resuspendiert und die Suspension durch ein Zellsieb in ein weiteres Falconröhrchen überführt. Das Zellsieb wurde anschließend mit 1 ml HBSS prep gespült.
Durch Mischen von 2,8 ml Percoll, 1,9 ml HBSS und 310 μl zehnfach konzentriertem PBS wurde eine 62 %ige Percoll-Lösung hergestellt. 5 ml dieser Lösung wurden in ein 15 ml – Falconröhrchen vorgelegt und vorsichtig mit 5 ml Zellsuspension überschichtet. Anschließend wurde das Röhrchen ohne Bremse bei 2000 rpm und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde der Zellring, der sich im Gradienten abgesetzt hatte, zusammen mit dem Überstand verworfen, das wolkige Pellet am Grunde des Röhrchens wurde in 1 ml HBSS resuspendiert. Nun wurden die Zelllösungen beider Mausbeine gepoolt, 10 μl dieser Lösung wurden entnommen und mit 90 μl Trypanblau gemischt. Mithilfe des Olympus-Mikroskops und einer Neubauer-Zählkammer wurde nun die Zellzahl in der gewonnenen Lösung bestimmt.
Währenddessen wurden die Zelllösungen mit Magnetic activated cell sorting (MACS)-Puffer auf 6 ml aufgefüllt und durch Zentrifugation bei 1400 rpm und 4 °C für 5 min gewaschen. Das erhaltene Pellet wurde in 100 μl MACS-Puffer pro 107 Zellen resuspendiert. Pro 107 Zellen wurden nun 10 μl Cluster of differentiation (CD) 3e-phycoerythin (PE) sowie CD19-PE hinzugegeben - diese Antikörper binden an murine T – bzw. B- Lymphozyten. Die Lösung wurde 10 min bei 4 °C inkubiert, anschließend wurden 2 ml MACS-Puffer pro 107 Zellen hinzugefügt. Nach einem Waschschritt bei 1400 rpm und 4 °C für 7 min wurde das erhaltene Zellpellet in 80 μl MACS-Puffer pro 107 Zellen resuspendiert. Pro 107 Zellen wurden 20 μl anti-PE-Microbeads hinzugefügt, um die durch die zuvor
