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Transcriptional regulation of
central metabolism in Escherichia coli
Doctoral Thesis Author(s):
Haverkorn van Rijsewijk, Bart Rudolf Boudewijn Publication date:
2012
Permanent link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-007196085 Rights / license:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
Transcriptional regulation of central metabolism in Escherichia coli
A dissertation submitted to ETH ZURICH
for the degree of Doctor of Sciences
Presented by
Bart Rudolf Boudewijn Haverkorn van Rijsewijk Ir. Delft University of Technology
Born September 16th, 1981 Citizen of the Netherlands
Accepted on the recommendation of Prof. Dr. U. Sauer, examiner Prof. Dr. M. Heinemann, co-examiner
Prof. Dr. H. Hennecke, co-examiner Prof. Dr. J.H. de Winde, co-examiner
2012
Abstract
ABSTRACT
Metabolism sustains life and proliferation in all living organisms as it supplies the cell with building blocks and energy for all cellular processes. Understanding metabolism and how it is regulated is of great importance, for instance to interpret and treat metabolic diseases and for microbial production of fine and bulk chemicals. To determine which regulatory processes actively regulate and control flux through central metabolism is an ongoing endeavor and has become a key focus in microbial systems biology.
In Chapter 2 we identified surpisingly distinct metabolic states during growth on the metabolically very similar substrates galactose and glucose in Escherichia coli: fully respiratory galactose metabolism relies exclusively on the PEP-glyoxylate cycle, in contrast to the canonical respiro-fermentative growth on glucose. A large-scale 13C-flux analysis of 91 transcriptional regulator mutants on both substrates demonstrated the importance of transcriptional regulation, with 2/3 of the regulators directly or indirectly affecting absolute fluxes. Our data demonstrated, however, that the flux partitioning between different pathways remained largely stable, with only the acetyl-CoA branchpoint being subject to genetic control. Thus, we provide strong evidence that transcriptional regulation in E. coli is primarily involved in controlling the magnitude of flux through metabolic pathways but rarely the decision of flux distribution between pathways.
In line with the emerging view that the metabolome is an active player in regulating flux through central metabolism, we systematically investigated to which extent the metabolome might play a role in flux regulation in Chapter 3. By inferring distributions of intracellular fluxes using 13C-whole isotopologue balancing and by quantifying intracellular metabolites upon 8 carbon source perturbations, we confirmed known metabolite reporters and hypothesized potential reporting by 3 others. Rather surprisingly, we found about 2/3 of the 41 quantified intracellular metabolites to correlate with flux magnitude and/or flux usage, rendering them at least potential candidates for putative flux reporting. Whether or not this reporting potentially is actually used by E. coli remains to be tested. However, the results demonstrated the potential of future research in searching for additional allosteric
A very different question related to the distribution of fluxes is how cells actually control their network-wide balancing of catabolic NADPH-producing and anabolic NADPH- consuming fluxes? In Chapter 4 we demonstrated that transcriptional regulation of the two transhydrogenases does not respond directly to the intracellular redox cofactor requirements. Instead, by identifying the transcription factors that regulate transcription of both isoforms, we showed that the pntAB and udhA promoters respond to signals that influence the NADPH balance (more specifically the presence of amino acid in the environment, oxidized quinones and conditions of high growth rate). Additionally, our results demonstrated that at least one further regulation mechanism must exist. Therefore the transhydrogenase isoforms in E. coli might achieve the network-wide balancing of catabolic NADPH-producing and anabolic NADPH-consuming fluxes via other regulatory mechanisms, i.e. allosteric/kinetic control.
Finally, to achieve a more comprehensive understanding of the overall importance of transcriptional regulation of central metabolic flux, we conducted a regulation analysis on transcript and flux data for eight carbon-source perturbations in Chapter 5. We demonstrated that on average 16% of the flux changes can be explained through the corresponding changes in mRNA levels, which was surprisingly consistent with a previous, purely computational analysis. Within metabolic pathways the contribution of transcriptional regulation to flux regulation varied substantially, illustrating a complex regulation pattern. Also across conditions the contribution of transcriptional regulation for regulation of flux through enzymes varied substantially. Overall our results in Chapter 5 emphasized a much stronger role for transcriptional regulation of flux in E. coli when compared to the reported values in Saccharomyces cerevisiae. However, the results also demonstrated substantial contribution of flux regulation to occur via other regulatory mechanisms.
Abstract
ZUSAMMENFASSUNG
Stoffwechsel versorgt Zellen mit Bausteinen und Energie für alle zellulären Prozesse und ermöglicht dadurch Leben und Proliferation in sämtlichen Organismen. Das Verständnis des Stoffwechsels und seiner Regulation ist von zentraler Bedeutung nicht nur für Diagnose und Therapie von Stoffwechselerkrankungen, sondern auch für die mikrobielle Produktion von Chemikalien. Die Identifikation der Prozesse, die metabolische Flüsse im Zentralstoffwechsel aktiv regulieren, ist ein wichtiges Forschungsgebiet der mikrobiellen Systembiologie.
In Kapitel 2 dieser Arbeit untersuchten wir die erstaunlich grossen Unterschiede im Stoffwechsel der sehr ähnlichen Substrate Galaktose und Glukose in Escherichia coli: Der Galaktose-Stoffwechsel ist komplett respirativ und beschränkt sich ausschliesslich auf den PEP-Glyoxylat-Zyklus. Im Gegensatz dazu steht der respiro-fermentative von Glukose- Stoffwechsel. Eine grossangelegte 13C-Flussanalyse von 91 Transkriptions Faktor-Mutanten in beiden Substraten zeigte die Bedeutung von transkriptioneller Regulation auf: Zwei Drittel der Regulatoren beeinflussten direkt oder indirekt die absoluten Stoffwechselflüsse.
Die Daten zeigten allerdings, dass die relative Flussverteilung weitgehend unverändert bleibt. Ausnahme war die Acetyl-CoA-Verwzeigung. Insgesamt lieferte diese Studie deutliche Hinweise darauf, dass transkriptionelle Regulation in E.coli in erster Linie die absoluten Stoffwechselflüsse und nur in weit geringerem Ausmasse die relative Flussverteilung bestimmt.
Entsprechend der mehr und mehr etablierten Erkenntnis, dass das Metabolom ein aktive Rolle in der Regulation von Stoffwechselflüssen im Zentralstoffwechsel spielt, haben wir das Ausmass dieser Art der Regulation in Kapitel 3 bestimmt. Durch die Bestimmung von Stoffwechselflüssen mittels Bilanzierung von Isotopologen und die Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten in acht unterschiedlichen Kohlenstoffquellen konnten wir bekannte Metabolitreporter bestätigen und zusätzlich drei potentielle neue Metabolitreporter identifizieren. Erstaunlicherweise korrelieren zwei Drittel der 41 quantifizierten Metabolite mit Flussstärke oder Flussnutzung und sind dadurch potentielle Reporterkandidaten. Ob
Forschung über die Suche nach allosterischen Interaktionen von Metaboliten mit Proteinen auf.
Eine andere Frage bezüglich der Verteilung von Stoffwechselflüssen ist, wie Zellen die netzwerkweite Bilanzierung von katabolischen NADPH-produzierenden und anabolischen NAPDH-verbrauchenden Flüssen bewerkstelligen. In Kapitel 4 haben wir gezeigt, dass die transkriptionelle Regulation der zwei Transhydrogenasen nicht direkt auf die intrazellulären Anforderungen an Redox-Kofaktoren reagiert. Stattdessen haben wir durch die Identifikation von Transkriptions Faktoren, die die Transkription beider Isoformen regulieren, gezeigt, dass die pntAB- und udhA-Promotoren auf Signale reagieren, die die NADPH-Bilanz beeinflussen, insbesondere die Verfügbarkeit von Aminosäuren in der Umgebung, oxidierte Quinone und hohe Wachstumsraten. Zusätzlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass mindestens ein zusätzlicher Regulationsmechanismus existieren muss. Die netzwerkweite Bilanzierung von katabolischen NADPH-produzierenden und anabolischen NAPDH-verbrauchenden Flüssen durchs die Isoformen der Transhydrogenasen in E. coli erfolgt also vermutlich durch andere Regulationsmechanismen, wie zum Beispiel allosterische oder kinetische Regulation.
Um ein detaillierteres Verständnis der Bedeutung von transkriptioneller Regulation im Zentralstoffwechsel zu erhalten, haben wir in Kapitel 5 eine Regulationsanalyse basierend auf Transkript- und Flussdaten in acht unterschiedlichen Kohlenstoffquellen durchgeführt.
Wir haben zeigen können, dass durchschnittlich 16% der Flussänderungen durch entsprechende Änderungen in mRNA-Konzentrationen erklärt werden können, was erstaunlich gut mit den Ergebnissen einer früheren theoretischen Studie übereinstimmt. Der Anteil von transkriptioneller Regulation an der Regulation von Stoffwechselflüssen variierte beträchtlich innerhalb von Stoffwechselwegen und deutet auf komplexe Regulationsmuster hin. Zudem hing der Anteil von transkriptioneller Regulation erheblich von der Wachstumsbedingung ab. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse in Kapitel 5, dass in E. coli im Vergleich zu Berichten über S. cerevisiae transkriptionelle Regulation eine grössere Rolle für die Regulation von Stoffwechselflüssen spielt, auch wenn andere Regulationsmechanismen einen wesentlichen Einfluss haben.
