Aus der Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen der Medizinischen Hochschule Hannover
Einfluss von Bluthochdruck auf das akute und chronische Nierenversagen im Mausmodell
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Robert Greite aus Wolfenbüttel
Hannover 2018
Angenommen vom Senat: 25.02.2019
Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Wissenschaftliche Betreuung: Prof.‘in Dr. med. Faikah Güler
1. Referent: Prof. Dr. med. Andreas Leffler
2. Referent: Prof. Dr. med. Stephan Immenschuh
Tag der mündlichen Prüfung: 25.02.2019
Vorsitz: Prof. Dr. med. Arnold Ganser 1. Prüfer Prof. Dr. med. Anibh Das
2. Prüfer PD Dr. med. Sibylle von Vietinghoff
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Akutes und chronisches Nierenversagen 1
1.2 AKI zwischen Regeneration und Fibrose 2
1.3 Chronische Hypoxie 3
1.4 Persistierende Inflammation 4
1.5 Bluthochdruck, akutes Nierenversagen und chronischer Nierenschaden 5
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit 5
2. Einfluss von Bluthochdruck auf das ischämisch induzierte AKI und die Progression
zur CKD 6
2.1 Etablierung des Modells 6
2.2 Tierversuche 7
2.3 Zusammenfassung Publikation 1: Renal ischemia reperfusion injury causes hypertension and renal perfusion impairment in the CD1 mice which promotes
progressive renal fibrosis 7
3. Ausblick und übergreifende Diskussion 9
3.1 Weiterführende Studien zum Einfluss der medikamentösen Blutdrucksenkung 9 im IRI Modell
4. Weitere Publikationen 15
4.1 Zusammenfassung Publikation 2: Oral treatment of rodents with soluble epoxide hydrolase inhibitor
1-(1-propanoylpiperidin-4-yl)-3-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]urea (TPPU):
Resulting drug levels and modulation of oxylipin pattern 15 4.2 Zusammenfassung Publikation 3: Renal PKC-ε deficiency attenuates acute kidney
injury and ischemic allograft injury via TNF-α-dependent inhibition of apoptosis
and inflammation 16
5. Zusammenfassung 17
6. Literaturverzeichnis 18
7. Abkürzungsverzeichnis 21
8. Lebenslauf 22
9. Veröffentlichungen 24
10. Posterbeiträge auf nationalen und internationalen Kongressen 24
11. Vorträge auf internationalen Kongressen 25
12. Erklärung 26
13. Danksagung 27
14. Anhang: Originalarbeiten 1-3 28
1 1. Einleitung
1.1 Akutes und chronisches Nierenversagen
Das akute Nierenversagen (acute kidney injury, AKI) ist ein plötzlicher Funktionsverlust der Nieren.
Dieser kann reversibel sein oder zu einer dauerhaften Nierenschädigung führen.
Ein AKI geht mit einem Anstieg der Retentionsparameter (Serum-Kreatinin, Harnstoff, Cystatin C) und bei einem Teil der Patienten auch mit einer Reduktion der Urinausscheidung einher1-3 Das AKI tritt oft im Rahmen einer Sepsis4, nach großen herzchirurgischen Eingriffen5,6 oder bei soliden Organtransplantationen7-10 auf. Eine Meta-Analyse von 312 Studien zum AKI aus dem Jahr 2013 hat ergeben, dass einer von fünf Erwachsenen und eins von drei Kindern weltweit ein AKI während eines Krankenhausaufenthaltes erleidet11. Die Zahl der Patienten, die jährlich neu ein AKI erleiden (Inzidenz) liegt laut einer populations-basierten Studie bei 2147 Patienten pro einer Millionen Einwohner12 und ist damit vergleichbar mit der Zahl der jährlich neu auftretenden Herzinfarkte13. Das AKI ist mit einer erhöhten Mortalität assoziiert14 und kann den Einsatz von Nierenersatzverfahren notwendig machen15.
In den letzten Jahren wurde immer deutlicher, dass das AKI und die chronische Niereninsuffizienz (chronic kidney disease, CKD) nicht mehr als zwei getrennte Krankheitsbilder zu betrachten sind, sondern vielmehr einander auf unterschiedlichen Ebenen beeinflussen16. Beispielsweise haben Patienten, die ein AKI hatten, ein deutlich erhöhtes Risiko, eine Progression zum chronischen Schaden im Sinne eines CKD zu entwickeln17,18. Je höher der Schweregrad des AKI, desto größer ist dabei das Risiko für die Entstehung der CKD17. Außerdem ist eine vorbestehende Nierenfunktionseinschränkung im Rahmen einer CKD einer der wichtigsten Risikofaktoren für das Auftreten eines AKI, dem sogenannten akut-auf-chronischen Nierenversagen.19,20 Eine CKD ist außerdem mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Ereignisse, vermehrten Krankenhausaufenthalten (Hospitalisierungen) und allgemeiner Mortalität vergesellschaftet21. In den USA wurde hierzu die Nierenfunktion (glomeruläre Filtrationsrate, GFR) von 1,1 Millionen Patienten aus dem Register einer großen kalifornischen Krankenversicherung über einen Zeitraum von durchschnittlich 2,84 Jahren ermittelt21. Die Patienten waren im Mittel 52 Jahre alt, zu 55% Frauen und zu 51% kaukasischer Herkunft21 . Das Risiko, zu sterben – ungeachtet der Ursache – war für Patienten mit einer GFR von weniger als 15 ml/min/1,73m² um 600% erhöht21.
Bis heute gibt es keine therapeutischen Maßnahmen, die ein AKI verhindern oder das Voranschreiten zur CKD aufhalten22. Daher ist es wichtig, die pathophysiologischen Mechanismen besser zu verstehen, die das Outcome eines AKI beeinflussen können. Es ist noch ungenügend verstanden, welche Faktoren eine Regeneration begünstigen und welche die Progression zur CKD
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fördern. Die Identifikation von Risikofaktoren für die Progression des AKI zur CKD kann den Weg zu neuen Behandlungsansätzen eröffnen.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Mechanismen, die bei dem Voranschreiten des ischämisch-induzierten AKI zur CKD eine Rolle spielen könnten, diskutiert. Dabei hat sich gezeigt, dass drei pathophysiologische Phänomene offenbar die Entwicklung einer CKD nach AKI vorantreiben:
fehlerhafte tubuläre Regeneration23, chronische Hypoxie24 und persistierende Inflammation25 (Abbildung 1).
Abbildung 1: Regeneration versus CKD-Entwicklung nach IRI. Im Normalzustand haben die Tubulusepithelzellen einen Bürstensaum (A: weißer Pfeil). IRI führt zur Infiltration von Entzündungszellen in das Niereninterstitium (B) und zu einem Verlust des Bürstensaums (B: schwarzer Pfeil). Nach IRI kann es entweder zu einer Regeneration des Schadens kommen (C) oder zur Ausbildung einer CKD mit Tubulusatropie und Nierenfibrose (D). Dabei spielen chronische Hypoxie, persistierende Inflammation und fehlerhafte tubuläre Regeneration eine Rolle. Modifiziert nach Bonventre, Yang, J Clin Invest, 2011.
1.2 AKI zwischen Regeneration und Fibrose
Unter physiologischen Bedingungen unterliegen humane proximale Tubuluszellen einer geringen Zellteilungsrate26,27. Bei einer akuten Ischämie jedoch, kommt es vermehrt zu Zelltod durch Apoptose oder Nekrose27. Die Tubuli können bis zu einem gewissen Maß jedoch regenerieren.
normal IRI Regeneration
CKD chronische Hypoxie
persistierende Inflammation fehlerhafte tubuläre Regeneration
A B C
D
3
Die überlebenden Tubulusepithelzellen migrieren an den Ort der Schädigung27-30 und proliferieren, was im Idealfall zu einer weitgehend kompletten Regeneration mit Normalisierung der Nierenfunktion führen kann.
Allerdings kann nach einem AKI auch eine tubulointerstitielle Fibrose auftreten. Wie genau es zur Entstehung der Fibrose nach AKI kommt und welche Zellen dafür verantwortlich sind, wurde in den letzten Jahren sehr kontrovers diskutiert31. Es wurde vermutet, dass Tubulusepithelzellen mittels epithelialer-mesenchymaler-Transition (EMT) in Myofibroblasten übergehen können32. Die Hypothese der Rolle der EMT in der Entstehung von Fibrose ist jedoch umstritten33. Nach aktuellem Stand der Forschung werden mehrere Mechanismen für die Entstehung von Myofibroblasten diskutiert: Differenzierung von Knochenmarkszellen und Perizyten, Aktivierung renaler Fibroblasten EMT und endotheliale-mesenchymale Transition34,35.
Die eigentliche fehlerhafte tubuläre Regeneration besteht jedoch in einem Zellzyklus-Arrest in der G2/M-Phase23,27. Dieser Arrest führt dazu, dass die Tubulusepithelzelle über den c-Jun-N-terminale- Kinase-(JNK-) Signalweg vermehrt profibrotische Zytokine, wie Connective Tissue Growth Factor (CTGF) und Tissue Growth Factor beta (TGF) ausschüttet23,27. Das führt zu einer prolongierten Fibroblastenaktivierung und letztendlich zur vermehrten Fibrosierung27,36.
Darüber hinaus sollen weitere Faktoren, wie chronische Hypoxie und persistierende Inflammation an der Fibrose-Entstehung und damit an der Entwicklung einer CKD nach AKI beteiligt sein27.
1.3 Chronische Hypoxie
Im Rahmen eines IRI kommt es in der Niere zu einer erheblichen Reduktion der Kapillardichte37-39 (Abbildung 2). Es wird vermutet, dass dies zu Mikrozirkulationsstörungen und darüber zu einer chronischen Hypoxie führt27,37,40, die wiederum eine Vielzahl pro-fibrotischer Signalwege aktivieren kann40-43 . Eigentlich wäre zu erwarten, dass die Rarefizierung der peritubulären Kapillaren über eine Stimulation der Angiogenese durch die chronische Hypoxie kompensiert wird37. Allerdings konnte gezeigt werden, dass Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) als pro-angiogenetischer Faktor nach AKI nicht erhöht, sondern – im Gegenteil – erniedrigt ist37,44. Die chronische Hypoxie nach ischämisch-induziertem AKI kann somit wahrscheinlich nicht ausreichend durch Neoangiogenese kompensiert werden.
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Abbildung 2: Peritubuläres Kapillarnetz vor und nach IRI im Mausmodell. Im Normalzustand sind die glomerulären Kapillarschlingen und das peritubuläre Kapillarnetz intakt und lassen sich durch Lectin in vivo Färbung grün fluoreszierend visualisieren (A). Nach IRI kommt es im Verlauf von 3 Wochen zu einer Rarefizierung der peritubulären Kapillaren (B) und zur Infiltration von Makrophagen (rot) in das Interstitium (C).
1.4 Persistierende Inflammation
Nach IRI infiltrieren eine Vielzahl von Entzündungszellen in die Niere, darunter neutrophile Granulozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und Lymphozyten27,45,46. Dabei scheinen vor allem unterschiedliche Formen von Makrophagen eine Rolle in der Balance zwischen Nierenschädigung und Reparatur nach AKI zu spielen47. So konnte gezeigt werden, dass Makrophagen pro-inflammatorische Eigenschaften haben können und lokal Zytokine, wie IL-6, TNFMCP-1 und IL-1 sezernieren, was den Entzündungsprozess begünstigt. Es gibt aber auch anti-inflammatorische Makrophagen, die lokal im Nierengewebe einen positiven Einfluss auf die tubuläre Proliferation und damit die Reparaturprozesse in der akuten Phase des AKI zu haben scheinen, indem sie z.B. IL-10 sezernieren und das anti-inflammatorische Hämoxygenase-1 (HO-1) exprimieren. Eine anhaltende Aktivierung von pro-inflammatorischen Makrophagen kann die Fibrosierung und damit das Voranschreiten der CKD begünstigen50. Die Klassifikation der aktivierten Makrophagen hat sich in den letzten Jahren erheblich verändert. Eine neuere Arbeit teilt die Makrophagen anhand der Expression ihres Aktivierungsmarkers Ly6-C in drei unterschiedliche Subgruppen ein, von denen jeweils eine definierte Gruppe an den Prozessen Inflammation, Reparatur/Regeneration und Fibrose-Entwicklung beteiligt ist51. Persistierende Inflammation scheint also einen Einfluss auf die Regeneration eines AKI oder dessen Voranschreiten zur CKD zu haben, wobei die exakten Mechanismen noch unklar sind.
normal, Lectin IRI, Lectin IRI, Lectin + F4/80
A B C
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1.5 Bluthochdruck, akutes Nierenversagen und chronischer Nierenschaden
In den USA sind ca. 30% der Fälle mit terminaler Niereninsuffizienz (end stage renal disease, ESRD) bei Patienten durch Hypertonie bedingt.52 Zudem wird das Voranschreiten der CKD direkt durch Bluthochdruck gefördert53, sodass eine normotensive Blutdruckeinstellung sehr wichtig ist. Allerdings hat eine noch strengere Blutdruckeinstellung auf weniger als 130/80mmHg gegenüber der empfohlenen Standard-Blutdruckeinstellung auf weniger als 140/90mmHg keinen Vorteil in der Verhinderung der CKD-Progression erbracht52. Die Beziehung zwischen AKI und neu aufgetretenem Bluthochdruck hingegen ist weitestgehend unklar. Daten aus einer kürzlich erschienenen retrospektiven Kohorten-Studie lassen jedoch darauf schließen, dass ein AKI ein unabhängiger Risikofaktor für die Entwicklung von Bluthochdruck ist54. Bluthochdruck kann per se zur CKD führen und offenbar auch durch ein AKI verursacht werden54.
1.6 Zielsetzung dieser Arbeit
Ziel meiner Arbeit war die Untersuchung, ob die Entwicklung eines Bluthochdrucks nach AKI die Progression von AKI zu CKD beeinflusst und ob eine frühzeitige Normalisierung des AKI induzierten Bluthochdrucks das renale Outcome verbessern kann.
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2. Einfluss von Bluthochdruck auf das ischämisch induzierte AKI und die Progression zur CKD 2.1 Etablierung des Modells
Die meisten pathophysiologischen Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen ischämisch- induziertem AKI und anschließender CKD-Entstehung stammen aus Mausmodellen. Dabei werden häufig C57BL/6 (B6)-Mäuse verwendet. Dieser Mausstamm entwickelt jedoch keinen Bluthochdruck nach Nierenschädigung55. In der Literatur gab es Hinweise, dass CD1 Mäuse (Crl: CD1 (ICR);
Hintergrund Swiss Albino) bei partieller Nephrektomie einen Bluthochdruck entwickeln können55. Um ein geeignetes Mausmodell zu entwickeln, wurde daher ein Vergleich von CD1 und B6 Mäusen im IRI Modell durchgeführt. Je nach Dauer der Ischämiezeit kommt es in B6 zu einem chronischen Nierenschaden oder zu einer Regeneration des AKI. Nach einer Klippzeit von 45min sind die Nieren nach zwei Wochen in den B6 Mäusen deutlich geschrumpft und fibrosiert, während sie nach 35min Klippzeit eine nahezu normale Nierenmorphologie zeigen.56-58 Um eine geeignete Ischämiezeit für den CD1 Mausstamm zu ermitteln, haben wir in den CD1 Mäusen Klippzeiten von 25min, 35min und 45min getestet und das renale Outcome longitudinal in einem Beobachtungszeitraum von vier Wochen analysiert. Methodisch kamen Histologie, Immunhistochemie und funktionelles MRT zum Einsatz. Eine Ischämiezeit von 25min führt in den CD1 Mäusen zu einem AKI mit anschließender Regeneration. Allerdings entwickeln die CD1 Mäuse im Gegensatz zu B6 bereits nach einer Klippzeit von 35min einen schweren chronischen Nierenschaden. Im MRT zeigten sich zwei Wochen nach IRI bereits deutlich geschrumpfte Nieren. Histologisch war eine schwere tubulointersitielle Fibrose (Abbildung 3) und Tubulusatrophie zu erkennen. Der chronische Nierenschaden war dabei in CD1 schon nach 35min Klippzeit so ausgeprägt wie in B6 erst nach einer Ischämiezeit von 45min. Eine weitere Verlängerung der Ischämiezeit auf 45min in CD1 führte zu einem ähnlich starken Nierenschaden wie nach 35min Klippzeit.
Abbildung 3: Nierenfibrose (Sirius-Rot-Färbung) in den CD1 Mäusen 4 Wochen nach IRI mit unterschiedlicher Ischämiedauer. In den CD1 Mäusen führt eine Ischämiezeit von 25min zu einer Regeneration des AKI (B). Bereits
A B C D
IRI 45min
normal IRI 25min IRI 35min
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eine Ischämiezeit von 35min führt in CD1 zu einer Progression des AKI zur CKD mit schwerer Nierenfibrose (C).
Nach 45min Klippzeit entwickelt sich ebenfalls eine schwere Nierenfibrose in CD1 (D).
2.2 Tierversuche
Alle Tierversuche, die in dieser Arbeit beschrieben werden, waren beim Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) genehmigt (AZ 33.9-42502-04- 12/0916 und AZ 11/0492). Die Operationen, Blutentnahmen und Organentnahmen wurden von zwei Ärzten mit langjähriger Erfahrung im Bereich Kleintieroperationen (Dr. Song Rong und Dr. Rongjun Chen) durchgeführt. Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich die Tiere betreut, die Belastungsgrade überprüft und bei Organentnahmen assistiert. Die regelmäßigen Blutdruckmessungen habe ich selbständig durchgeführt.
2.3 Zusammenfassung Publikation 1:
Renal ischemia reperfusion injury causes hypertension and renal perfusion impairment in the CD1 mice which promotes progressive renal fibrosis.
Greite R, Thorenz A, Chen R, Jang MS, Rong S, Brownstein MJ, Tewes S, Wang L, Baniassad B, Kirsch T, Bräsen JH, Lichtinghagen R, Meier M, Haller H, Hueper K, Gueler F.
Am J Physiol Renal Physiol. 2017 Dec 20.
Nach Abschluss dieser Vorarbeiten haben wir eine longitudinale Studie zum Vergleich der beiden Mausstämme B6 und CD1 mit einer 35min Ischämiezeit durchgeführt. Bei dieser Ischämiezeit wird in B6 ein potenziell reversibler Schaden induziert, in CD1 jedoch kommt es zu einer progredienten Fibrose. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach IRI wurden die Nierenmorphologie, Inflammation und Fibrose mit Histologie, Immunhistochemie, FACS und qPCR analysiert. Die renale Perfusion und das Nierenvolumen wurden durch funktionelles MRT im Verlauf gemessen. Der Blutdruck wurde mit der Tail-cuff-Methode bestimmt. Wir haben ein unilaterales IRI Modell gewählt, um ein 100%iges Überleben der Mäuse zu gewährleisten und dadurch longitudinale Analysen durchführen zu können.
Die kontralaterale, nicht geklippte Niere hat den Ausfall der Nierenfunktion der geklippten Seite kompensiert, so dass es zu keiner Urämie kam und diente gleichzeitig als gesunde Kontrolle für die molekularen Gewebeanalysen.
In der Frühphase, an Tag 1 (d1) nach IRI, war der morphologische Schaden in beiden Tierstämmen ähnlich. Neutrophil-Gelatinase-associated Lipocalin (NGAL) als Marker für den akuten
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Tubulusschaden war in CD1 und B6 gleich stark exprimiert im Western Blot. Auffällig war allerdings, dass die B6 Mäuse bereits in dieser frühen Phase eine deutlich größere Proliferationsrate der Tubulusepithelzellen mit signifikanter Hochregulierung von Ki-67 zeigten, CD1 hingegen nicht. Damit ergab sich ein Hinweis, dass in den B6 Mäusen bereits früh eine Regeneration des Tubulusschadens beginnt, die in CD1 ausbleibt.
In den CD1 Mäusen findet im Gegensatz zu B6 eine stärkere inflammatorische Reaktion auf den Ischämieschaden statt. Ein erster Hinweis darauf ergab sich durch die unterschiedliche Expression des pro-inflammatorischen Zytokins TNF im Nierengewebe der Mäuse, das zwar an d1 nach IRI in beiden Mausstämmen gleich stark hochreguliert war, an d7 jedoch in CD1 Mäusen signifikant höher war. Auch zeigten IRI-CD1 Nieren deutlich mehr Zellinfiltrate mit längerer Persistenz. Nach IRI sind die ersten Entzündungszellen, die das Nierengewebe infiltrieren, Neutrophile. Im Verlauf nimmt die Infiltration durch Makrophagen zu.
Eine Quantifizierung der infiltrierenden Entzündungszellen mit Durchflusszytometrie (FACS) ergab, dass sich an d1 und d7 nach IRI signifikant mehr Neutrophile und Makrophagen im Nierengewebe von CD1 befanden als in B6. An d7 waren weniger Neutrophile nachweisbar, jedoch war der Anteil an Makrophagen weiter angestiegen.
Eine Lokalisierung der Entzündungszellen im Nierengewebe mit immunhistochemischen Färbemethoden ergab, dass Neutrophile und Makrophagen vor allem die äußere Medulla infiltrieren.
Neben der stärkeren und fortschreitenden Inflammation in CD1 war auch die Nierenperfusion stärker eingeschränkt. Diese wurde longitudinal mittels funtioneller MRT gemessen. In CD1 besteht eine langfristige deutliche Reduktion der renalen Perfusion, während B6 Mäuse zwei Wochen nach IRI eine normale Nierenperfusion aufweisen. Interessanterweise, ergab sich morphologisch zwei Wochen nach IRI in beiden Mausstämmen ein reduziertes peritubuläres Kapillarnetz. Allerdings regenerierte sich das Kapillarnetz in B6 vier Wochen nach IRI, während die Rarefizierung der peritubulären Kapillaren in CD1 Nieren weiter progredient war.
Zusätzlich zeigte sich im morphometrischen MRT auch, dass die CD1 Nieren zwei Wochen nach IRI ein deutlich reduziertes Nierenvolumen aufwiesen. Die Nieren von B6 nach IRI waren im Gegensatz dazu normal groß.
Histologisch ergab sich in den CD1 Nieren nach IRI das Bild einer ausgeprägten tubulointerstitiellen Fibrose, während in B6 nur fokale Narben zur Darstellung kamen. Dazu passend waren in CD1 Nieren die pro-fibrotischen Zytokine CTGF und Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) hochreguliert, in B6 Nieren nicht.
Da in anderen Nierenmodellen in CD1 Tieren ein Hypertonus festgestellt werden konnte, wurde in dieser Studie eine Blutdruckmessung mittels der Tail-cuff-Methode durchgeführt.
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In der Tat entwickelten die CD1 Mäuse nach IRI einen relevanten Blutdruckanstieg um + 20mmHg. In B6 blieb der Blutdruck stabil. Dieser Blutdruckanstieg war in CD1 mit einer deutlichen mesangialen Matrixexpansion als Zeichen einer Glomerulosklerose assoziiert, während die B6 Mäuse morphologisch unauffällige Glomeruli aufwiesen. Die Höhe des systolischen Blutdrucks korrelierte dabei mit dem Ausmaß der Fibrose und der mesangialen Matrixdicke.
Zusammenfassend konnte in B6 Mäusen eine verstärkte Proliferation der Tubulusepithelzellen nachgewiesen werden, die mit einer Regeneration des akuten Nierenschadens und Wiederherstellung einer normalen Nierenperfusion einherging.
In CD1 Mäusen hingegen führte die gleiche Ischämiezeit von 35min zu der Ausbildung eines Hypertonus, einer reduzierten Nierenperfusion und Rarefizierung der peritubulären Kapillaren, einer persistierenden Inflammation und progredienten Nierenfibrose im Sinne einer CKD.
3. Ausblick und übergreifende Diskussion:
Dies ist die erste Arbeit, die den CD1 Mausstamm als geeignetes Tiermodell für Studien zum ischämisch induzierten AKI mit Ausbildung eines manifesten Hypertonus und Progress zu CKD vorstellt.
Aufbauend auf der Studie zum Stammvergleich habe ich in meiner Doktorarbeit als nächstes untersucht, ob eine frühzeitige Normalisierung des Blutdruckes mittels Antihypertensiva einen günstigen Einfluss auf den Verlauf des AKI in CD1 Mäusen hat. Hierfür wurde eine Behandlungsstudie mit dem ACE-Hemmer Enalapril und als zweitem Wirkprinzip in einer weiteren Gruppe mit löslichen Epoxyhydroxylase-Inhibitoren (sEHI) durchgeführt. Nachdem das CD1 IRI Modell zur Publikation angenommen wurde, wird ein weiteres Manuskript zur Behandlungsstudie zeitnah zur Publikation eingereicht.
3.1 Weiterführende Studien zum Einfluss der medikamentösen Blutdrucksenkung im IRI Modell Lösliche Epoxyhydroxylase-Inhibitoren spielen in der Verstoffwechselung von Epoxyeicosatriensäuren (EETs) eine Rolle (Abbildung 4).
EETs sind viel versprechende neue Zielmoleküle in der Bluthochdrucktherapie. Sie werden von den Cytochrom P450 Enzymen (CYP450) aus Arachidonsäuren (ARAs) synthetisiert und gehören zu den Epoxiden59. EETs können den renalen Blutfluss (RBF) erhöhen, indem sie die präglomerulären glatten Muskelzellen hyperpolarisieren59. Zudem werden EETs normotensive und anti-inflammatorische Effekte in kardiovaskulären und renalen Erkrankungen zugeschrieben59-61, sodass ihr Einsatz im
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Kontext von AKI und CKD vielversprechend sein könnte. Der Abbau von EETs zu den Diolen Dihydroxyeicosatriensäuren (DHETE) wird von der löslichen Epoxyhydroxylase (sEH) katalysiert62. Um den Spiegel der EETs zu erhöhen und sich diesen therapeutisch zu Nutze zu machen, kann die sEH durch den Einsatz von sEHI gehemmt werden (Abbildung 4) 62.
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Durch die funktionelle MRT-Untersuchung konnten wir feststellen, dass die Blutdrucksenkung nach IRI die Einschränkung der Nierenperfusion am Tag 1 noch aggraviert hat (Abbildung 6). Hier scheint ähnlich wie bei einem Steal-Effekt die systemische Senkung des Blutdrucks zu einer weiteren Minderversorgung des entzündlich veränderten Nierengewebes beigetragen zu haben.
Abbildung 5.
Systolischer Blutdruck (SBP) im Verlauf nach IRI.
TPPU reduziert den Blutdruckanstieg nach IRI signifikant im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Kontrolltieren. Eine Tendenz zur Blutdruckreduktion nach IRI ist auch für die Standardtherapie mit Enalapril zu erkennen.
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Das in dieser Arbeit entwickelte und angewandte AKI Mausmodell eröffnet die Möglichkeit in weiteren experimentellen Studien, das „timing“ der Blutdrucksenkung auf die Entstehung einer CKD nach AKI zu untersuchen und zu optimieren.
16 4. Weitere Publikationen (Ko-Autorenschaft)
Während meiner Promotion habe ich auch noch an anderen Studien als Ko-Autor mitgearbeitet:
4.1 Zusammenfassung Publikation 2:
Oral treatment of rodents with soluble epoxide hydrolase inhibitor 1-(1-propanoylpiperidin-4-yl)-3- [4-(trifluoromethoxy)phenyl]urea (TPPU): Resulting drug levels and modulation of oxylipin pattern.
Ostermann AI, Herbers J, Willenberg I, Chen R, Hwang SH, Greite R, Morisseau C, Gueler F, Hammock BD, Schebb NH.
Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2015.
In dieser Arbeit wurden die pharmakodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften des sEHI TPPU, sowie dessen Anwendung in Mäusen und Ratten untersucht. Dabei wurde zunächst in vitro die Absorption durch intestinale Zellen und die metabolische Stabilität von TPPU getestet. Anschließend wurde die Pharmakokinetik von TPPU in vivo in gesunden männlichen Sprague Dawley Ratten und CD1 Mäusen getestet.
Um zu klären, ob sich TPPU für eine orale Therapie eignet, wurden in Zellkulturversuchen die Absorption und die metabolischen Eigenschaften von TPPU in unterschiedlichen Konzentrationen untersucht. Im Caco-2-Zell-Model, einem in vitro Model für intestinale Absorption, zeigte sich, dass TPPU effektiv die intestinale Barriere überwindet. Zudem ergab eine Inkubation mit Hepatozyten aus der Ratte eine gute metabolische Stabilität, sodass von einem geringen first-pass-Effekt und einer hohen Bioverfügbarkeit von TPPU ausgegangen werden kann. Diese Eigenschaften liefern zudem eine Erklärung für die lange Halbwertzeit von TPPU. So, stieg die Blutkonzentration der behandelten Tiere während des Behandlungszeitraums dosisabhängig an, erreichte jedoch nach acht Tagen ein Plateau. Um zu untersuchen, ob sich TPPU auch in ausreichenden Konzentrationen im Zielgewebe anreichert, wurden die TPPU-Spiegel in verschiedenen Gewebearten gemessen. Hierbei zeigte sich eine dosisabhängige Akkumulation von TPPU in Milz, Leber, Skelettmuskel, Herz, Kolon, Gehirn und Niere nach acht Tagen Behandlungsdauer. Mithilfe der Epoxid/Diol-Ratio wurde die Aktivität der sEH bestimmt, wodurch der Effekt von TPPU gemessen werden kann. Es zeigte sich eine erhöhte Epoxid/Diol-Ratio in allen genannten Gewebearten außer der Leber, was bedeutet, dass die sEH durch die orale Verabreichung von TPPU also auch in der Niere gehemmt werden kann.
17 4.2 Zusammenfassung Publikation 3:
Renal PKC-ε deficiency attenuates acute kidney injury and ischemic allograft injury via TNF-α- dependent inhibition of apoptosis and inflammation.
Rong S, Hueper K, Kirsch T, Greite R, Klemann C, Mengel M, Meier M, Menne J, Leitges M, Susnik N, Meier M, Haller H, Shushakova N, Gueler F.
Am J Physiol Renal Physiol. 2014.
In dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von Protein-Kinase C -epsilon -(PKC- ε) auf das ischämisch induzierte AKI und die ischämische Nierentransplantatschädigung im Mausmodell.
In PKC- ε knock out Mäusen und Wildtyp-Kontroll-Mäusen (WT) wurde ein AKI durch 35min transientes Klippen des Nierengefäßstiels induziert. Die PKC- ε Defizienz war mit einem besseren Erhalt der Nierenfunktion und auch einem besseren Überleben der Mäuse nach beidseitigem IRI assoziiert. Das IRI führte in beiden Gruppen zu einer Einschränkung der renalen Perfusion an d1, welche jedoch bei PKC- ε knock out Mäusen deutlich geringer ausgeprägt war im Vergleich zu den WT Mäusen. Die akute Tubulusnekrose als Folge des Ischämieschadens und die Infiltration mit Neutrophilen war in den PKC- ε knock out Mäusen ebenfalls signifikant geringer als in den WT Kontrolltieren.
Im nächsten Schritt untersuchten wir, ob das bessere Outcome der PKC- ε knock out Mäuse auf einem lokalen renalen Phänotyp beruht. Wir transplantierten die Nieren von PKC- ε knock out oder WT (129/SV) Spendern allogen auf BALB/c Empfänger. Durch eine 60min kalte und warme Ischämie wurde ein aktues Nierenversagen im Transplantat induziert. Die Empfänger von PKC- ε-knock-out- Spendernieren zeigten eine besseres Überleben und eine bessere Nierenfunktion im Vergleich zu den Empfängern von WT Nieren. Zudem war die Bildung von freien Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species, ROS) und pro-inflammatorischen Faktoren, wie TNFα, iNOS und ICAM-1, in den PKC- ε- knock-out-Transplantatnieren erheblich reduziert.
Zusammenfassend haben wir in dieser Arbeit gezeigt, dass ein lokale renale PKC- ε-Expression pro- inflammatorische und pro-apoptotische Signalwege zu aktivieren scheint, sodass ein Inhibitor des PKC- ε-Signalwegs einen günstigen Einfluss auf das ischämisch induzierte AKI haben könnte.
18 5. Zusammenfassung
In dieser experimentellen Doktorarbeit wurde zunächst ein neues Mausmodell für das ischämisch induzierte AKI an CD1 Mäusen etabliert. Durch einen unilateralen renalen Ischämie- Reperfusionsschaden (IRI 25min, 35min und 45min) wurden unterschiedliche renale Schädigungsmuster induziert und longitudinal über einen Zeitraum von vier Wochen analysiert. Ein IRI von 25min induzierte einen transienten Nierenschaden mit Regenerationspotential. Bei 35min IRI kam es jedoch zur Ausbildung einer progredienten Nierenfibrose mit erheblichem Volumenverlust im Sinne einer chronischen Niereninsuffizienz (CKD).
Das Standardmodell für IRI wird meist an C57BL/6 Mäusen (B6) in der Literatur durchgeführt, welche auch Hintergrund für viele genetisch modifizierte Mausstämme sind. In dieser Arbeit wurde im 35min IRI Modell der Phänotyp von B6 mit CD1 Mäusen verglichen. B6 Mäuse haben ein transientes AKI nach 35min Ischämie, während, wie oben erwähnt, CD1 Mäuse eine CKD ausbilden. In B6 konnte eine verstärkte Proliferation der Tubulusepithelzellen nachgewiesen werden. Zudem war eine Wiederherstellung der normalen Nierenperfusion mit einer Regeneration des akuten Nierenschadens assoziiert. In CD1 jedoch führte 35min IRI zur Ausbildung eines Bluthochdrucks und einer deutlich reduzierten Nierenperfusion durch die Rarefizierung der peritubulären Kapillaren und persistierende Inflammation. Es entwickelte sich eine progrediente Nierenfibrose mit Glomerulosklerose.
Dies ist die erste Arbeit, die den CD1 Mausstamm als geeignetes Mausmodell für das ischämisch induzierte AKI mit Progress zu CKD und Ausbildung eines Hypertonus vorstellt (Greite et. al., AJP renal, 2017).
In einer Folgestudie wurde untersucht, welchen Einfluss die frühzeitige Normalisierung des Blutdruckes durch Antihypertensiva auf den Verlauf des AKI in CD1 Mäusen hat. In dieser Behandlungsstudie wurden der Vasodilatator und sEH-Inhibitor TPPU und der ACE Hemmer Enalapril verwendet. Der Blutdruckanstieg nach IRI konnte erfolgreich medikamentös gehemmt werden.
Allerdings ließ sich die Entstehung einer progredienten Nierenfibrose nach IRI nicht aufhalten. Im Gegenteil, es zeigte sich, dass die antihypertensive Behandlung eine Aggravierung der Perfusionseinschränkung der Niere mit IRI bewirkte und der chronische Nierenschaden noch verstärkt wurde. Allerdings hatte die Hypertonus-Therapie einen positiven Effekt auf die Ausbildung einer Glomerulosklerose. TPPU und Enalapril führten nach IRI zu einer weitaus weniger ausgeprägten mesangialen Matrixexpansion als Zeichen der Glomerulosklerose. Diese Studie zeigt, dass eine zu frühe Blutdrucksenkung im Rahmen eines AKI nachteilig sein kann. Das neu etablierte CD1 AKI Modell bietet die Möglichkeit optimale Therapiestrategien im Kontext von AKI und Hypertonus auszutesten.
19 6. Literaturverzeichnis
1 Bellomo, R. et al. Acute renal failure - definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs: the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) Group. Crit Care 8, R204-212, doi:10.1186/cc2872 (2004).
2 Mehta, R. L. et al. Acute Kidney Injury Network: report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury. Crit Care 11, R31, doi:10.1186/cc5713 (2007).
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21
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22 7. Abkürzungsverzeichnis
ACE – Angiotensin converting enzyme AKI – acute kidney injury
ARA – Arachidonsäure CKD – chronic kidney disease
CTGF – Connective Tissue Growth Factor DHETE – Dihydroxyeicosatriensäure EET – Epoxyeicosatriensäure
EMT – epitheliale mesenchymale Transition ESRD – end stage renal disease
FACS – fluorescence activated cell sorting GFR – glomeruläre Filtrationsrate
ICAM-1 – intercellular adhesion molecule 1 IL-10 – Interleukin-10
IL-1β– Interleukin-1 beta IL-6 – Interleukin-6
iNOS – inducible nitric oxide synthase IRI – ischemia reperfusion injury JNK – c-Jun-N-terminale-Kinase Ly6-C – Lymphocyte antigen 6 complex MCP-1 – Monocyte Chemoattractant Protein-1 MRT – Magnetresonsanztomografie
NGAL – Neutrophil-Gelatinase-associated Lipocalin PAI-1 – Plasminogen activator inhibitor-1
PKC-ε– Protein Kinase epsilon
qPCR – quantitative polymerase chain reaction RBF – renaler Blutfluss
ROS – reactive oxygen species SBP – systolic blood pressure sEH – Epoxyhydroxylase
sEHI - soluble epoxyhydroxylase inhibitor TGFβ– Tissue Growth Factor beta TNFα– Nekrose Faktor alpha
TPPU – Trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-4-yl) urea VEGF – Vascular Endothelial Growth Factor
WT – Wildtyp
25 9. Veröffentlichungen
1. Greite R, Thorenz A, Chen R, Jang MS, Rong S, Brownstein MJ, Tewes S, Wang L, Baniassad B, Kirsch T, Bräsen JH, Lichtinghagen R, Meier M, Haller H, Hueper K, Gueler F. Renal ischemia reperfusion injury causes hypertension and renal perfusion impairment in the CD1 mice which promotes progressive renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 2017
2. Brännström M, Dahm Kähler P, Greite R, Mölne J, Díaz-García C, Tullius SG. Uterus transplantation: A Rapidly Expanding Field. Transplantation.2017
3. Ostermann AI, Herbers J, Willenberg I, Chen R, Hwang SH, Greite R, Morisseau C, Gueler F, Hammock BD, Schebb NH. Oral treatment of rodents with soluble epoxide hydrolase inhibitor 1-(1-propanoylpiperidin-4-yl)-3-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]urea (TPPU): Resulting drug levels and modulation of oxylipin pattern. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2015
4. Rong S, Hueper K, Kirsch T, Greite R, Klemann C, Mengel M, Meier M, Menne J, Leitges M, Susnik N, Meier M, Haller H, Shushakova N, Gueler F. Renal PKC-ε deficiency attenuates acute kidney injury and ischemic allograft injury via TNF-α-dependent inhibition of apoptosis and inflammation. Am J Physiol Renal Physiol. 2014
10. Posterbeiträge auf nationalen und internationalen Kongressen
1. Greite R, Thorenz A, Gueler F, Hueper K, Rong S, Haller H, Bräsen JH. Hypertension aggravates acute kidney injury (AKI) and accelerates progression to chronic kidney disease (CKD) in CD1 mice. American Society of Nephrology (ASN), San Diego, USA, 03.-08.11.2015
2. Greite R, Chen R, Rong S, Bräsen JH, Hensen B, Meier M, Hammock BD, Lee S, Schebb NH, Panigrahy D, Haller H, Hueper K, Gueler F. Effects of early antihypertensive therapy on acute renal ischemia reperfusion injury. Deutsche Transplantationsgesellschaft (DTG), Dresden, 22.-24.10.2015 – Preis für bestes Poster
3. GreiteR, ChenR, Thorenz A, Rong S, BräsenJH, Meier M, WillenbergI, SchebbNH, Hammock BD, Panigrahy D, Hensen B, HallerH, Hueper K, Gueler F. Effects of early antihypertensive treatment in the model of experimental acute kidney injury. Deutsche Gesellschaft für Nephrologie (DGfN), Berlin, 12.-15.09.2015
26
4. Greite R, Chen R, Wang L, Rong S, Thorenz A, Meier M, Jang MS, Bräsen JH, Haller H, Hueper K, Gueler F. Hypertension aggravates acute kidney injury (AKI) and accelerates progression to chronic kidney disease (CKD) in mice. ERA-EDTA Congress, London, Großbritannien, 28.- 31.05.2015
5. Gueler F, Jang MS, Peperhove M, Schroeder C, Greite R, Thorenz A, WieseB, Warnecke G Fegbeutel C, Lichtinghagen R, Jüttner B, Tewes S, Hartung D, Wacker F, Haller H, Hueper K.
Identification of early risk predictors for acute kidney injury after lung transplantation by antibody array and functional MRI. Deutsche Gesellschaft für Nephrologie (DGfN), Berlin, 06.- 09.09.2014
6. Greite R, ChenR, Rong S, Thorenz A, Meier M, Jang MS, Haller H, Tewes S, HensenB, Hueper K, Gueler F. RAAS activation aggravates acute kidney injury (AKI) and accelerates progression to chronic kidney disease (CKD). Deutsche Gesellschaft für Nephrologie (DGfN), Berlin, 06.- 09.09.2014
7. Greite R, Chen R, Rong S, Thorenz A, Meier M, Jang MS, Haller H, Hueper K, Gueler F.
Translationales Mausmodell mit Glomerulosklerose und chronischem tubulointerstitiellem Schaden nach kurzzeitiger renaler Ischämie. Deutsche Gesellschaft für Innere Medizin (DGIM), Wiesbaden, 26. – 29.04.2014
11. Vorträge auf internationalen Kongressen
1. Greite R, Chen R, Rong S, Thorenz A, Bräsen JH, Hensen B, Meier M, Schebb NH, Hammock BD, Lee S, Panigrahy D, Haller H, Hueper K, Gueler F. Early anti-hypertensive therapy in a mouse model of acute kidney injury is deleterious. ERA-EDTA Congress, Wien, Österreich, 21.-24.05.2016
2. Greite R, Chen R, Hensen B, Meier M, , Hammock BD, Lee S, Panigrahy D, Schebb NH, Hueper K, Gueler F. Functional MRI to monitor renal perfusion alterations in a model of renal IRI induced hypertension and treatment effects. International Meeting on Ischemia Reperfusion Injury in Transplantation, Poitiers, Frankreich, 19.-20.04.18
27 12. Erklärung
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover zur Promotion eingereichte Dissertation mit dem Titel „Einfluss von Bluthochdruck auf das akute und chronische Nierenversagen im Mausmodell“ in der Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen unter Betreuung von Frau Prof. Dr. med. Faikah Güler mit der Unterstützung durch Frau PD Dr. med. Katja Hüper ohne sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine anderen als die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Die Gelegenheit zum vorliegenden Promotionsverfahren ist mir nicht kommerziell vermittelt worden. Insbesondere habe ich keine Organisation eingeschaltet, die gegen Entgelt Betreuerinnen und Betreuer für die Anfertigung von Dissertationen sucht oder die mir obliegenden Pflichten hinsichtlich der Prüfungsleistungen für mich ganz oder teilweise erledigt.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel bisher noch nicht erworben habe. Ergebnisse der Dissertation wurden in folgendem Publikationsorgan veröffentlicht:
Rong S, Hueper K, Kirsch T, Greite R, Klemann C, Mengel M, Meier M, Menne J, Leitges M, Susnik N, Meier M, Haller H, Shushakova N, Gueler F. Renal PKC-ε deficiency attenuates acute kidney injury and ischemic allograft injury via TNF-α-dependent inhibition of apoptosis and inflammation. Am J Physiol Renal Physiol. 2014
Ostermann AI, Herbers J, Willenberg I, Chen R, Hwang SH, Greite R, Morisseau C, Gueler F, Hammock BD, Schebb NH. Oral treatment of rodents with soluble epoxide hydrolase inhibitor 1-(1- propanoylpiperidin-4-yl)-3-[4-(trifluoromethoxy)phenyl]urea (TPPU): Resulting drug levels and modulation of oxylipin pattern. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2015
Greite R, Thorenz A, Chen R, Jang MS, Rong S, Brownstein MJ, Tewes S, Wang L, Baniassad B, Kirsch T, Bräsen JH, Lichtinghagen R, Meier M, Haller H, Hueper K, Gueler F. Renal ischemia reperfusion injury causes hypertension and renal perfusion impairment in the CD1 mice which promotes progressive renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol. 2017
28 13. Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Klinik für Nieren- und Hochdruckerkrankungen (Leiter: Prof. Dr.
med. Hermann Haller) der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt.
Zunächst möchte ich meiner Betreuerin Frau Prof. Dr. med. Faikah Güler für die hervorragende Betreuung während der gesamten Zeit danken. Ohne ihre hilfreichen Anregungen und die ständige Diskussionsbereitschaft wäre das Projekt in dieser Form nicht möglich gewesen. Mein tiefer Dank gilt ihr ebenso für die wertvollen Ratschläge und die Hilfe bei der Gestaltung meiner beruflichen Ausbildung. Sie hat wesentlich zur Entdeckung meiner Begeisterung für wissenschaftliches Arbeiten beigetragen.
Frau PD Dr. med. Katja Hüper danke ich für ihre Unterstützung als Ko-Betreuerin dieser Arbeit und die Auswertung der MRT-Versuche.
Mein ganz besonderer Dank gilt Herle Chlebusch für ihre wertvolle Unterstützung bei der täglichen praktischen Laborarbeit. Durch ihre Tipps hat sie wesentlich zum Gelingen der Experimente beigetragen und dabei mit ihrer angenehmen Art stets für eine unverwechselbare Arbeitsatmosphäre gesorgt.
Anja Thorenz, Mi-Sun Jang und Rongjun Chen danke ich für die Unterstützung bei der Durchführung der Experimente und für die freundschaftliche Zusammenarbeit.
Vor allem aber möchte ich meiner Freundin Nina, meinen Eltern und meiner Schwester Lena danken.
Ihre bedingungslose und liebevolle Unterstützung zu jedem Zeitpunkt des Projektes war für die Fertigstellung dieser Arbeit unglaublich wertvoll.
29 14. Anhang
RESEARCH ARTICLE
Translational Physiology
Renal ischemia-reperfusion injury causes hypertension and renal perfusion impairment in the CD1 mice which promotes progressive renal fibrosis
Robert Greite,1* Anja Thorenz,1* Rongjun Chen,1Mi-Sun Jang,1Song Rong,1,3Michael J. Brownstein,7 Susanne Tewes,2Li Wang,1Bita Baniassad,1Torsten Kirsch,1Jan Hinrich Bräsen,5Ralf Lichtinghagen,6 Martin Meier,4Hermann Haller,1Katja Hueper,2* and Faikah Gueler1*
1Nephrology, Hannover Medical School, Hannover, Germany;2Diagnostic and Interventional Radiology, Hannover Medical School, Hannover, Germany;3The Transplantation Center of the Affiliated Hospital, Zunyi Medical College, Zunyi, China;
4Imaging Center, Institute of Laboratory Animal Sciences, Hannover Medical School, Hannover, Germany;5Pathology, Hannover Medical School, Hannover, Germany;6Clinical Chemistry, Hannover Medical School, Hannover, Germany; and
7Pisces Therapeutics, Rockville, Maryland
Submitted 21 September 2016; accepted in final form 19 December 2017
Greite R, Thorenz A, Chen R, Jang MS, Rong S, Brownstein MJ, Tewes S, Wang L, Baniassad B, Kirsch T, Bräsen JH, Lichtinghagen R, Meier M, Haller H, Hueper K, Gueler F.Renal ischemia-reperfusion injury causes hypertension and renal perfusion impairment in the CD1 mice which promotes progressive renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol 314: F881–F892, 2018. First published December 20, 2017; doi:10.1152/ajprenal.00519.2016.—
Renal ischemia-reperfusion injury (IRI) is a severe complication of major surgery and a risk factor for increased morbidity and mortality.
Here, we investigated mechanisms that might contribute to IRI- induced progression to chronic kidney disease (CKD). Acute kidney injury (AKI) was induced by unilateral IRI for 35 min in CD1 and C57BL/6 (B6) mice. Unilateral IRI was used to overcome early mortality. Renal morphology, NGAL upregulation, and neutrophil infiltration as well as peritubular capillary density were studied by immunohistochemistry. The composition of leukocyte infiltrates in the kidney after IRI was investigated by flow cytometry. Systemic blood pressure was measured with a tail cuff, and renal perfusion was quantified by functional magnetic resonance imaging (fMRI). Mesan- gial matrix expansion was assessed by silver staining. Following IRI, CD1 and B6 mice developed similar morphological signs of AKI and increases in NGAL expression, but neutrophil infiltration was greater in CD1 than B6 mice. IRI induced an increase in systemic blood pressure of 20 mmHg in CD1, but not in B6 mice; and CD1 mice also had a greater loss of renal perfusion and kidney volume than B6 mice (P⬍0.05). CD1 mice developed substantial interstitial fibrosis and decreased peritubular capillary (PTC) density by day 14 while B6 mice showed only mild renal scarring and almost normal PTC. Our results show that after IRI, CD1 mice develop more inflammation, hypertension, and later mesangial matrix expansion than B6 mice do.
Subsequently, CD1 animals suffer from CKD due to impaired renal perfusion and pronounced permanent loss of peritubular capillaries.
acute kidney injury; CKD; fibrosis; hypertension; ischemia-reperfu- sion injury
INTRODUCTION
Acute kidney injury (AKI) can either regenerate or cause ongoing renal fibrosis (8). The extent of renal damage is influenced by the onset of hypertension, local inflammation, and ongoing nephrotoxic medication. The most common mouse model to study AKI is renal ischemia-reperfusion injury (IRI) (5, 6).
The majority of renal IRI studies have been performed in C57BL/6 (B6) laboratory mice, which do not develop hyper- tension after renal injuries. However, CD1 mice have been shown to develop marked blood pressure elevation and glo- merular injury (16) following partial nephrectomy models.
Similarly, a subgroup of patients developed hypertension after renal IRI and worse clinical outcome (4). To learn more about the effect of hypertension on IRI, we compared B6 (12) and CD1 mice in the 35-min renal pedicle clamping IRI model. To overcome mortality and be able to study the pathophysiology of AKI and chronic kidney disease (CKD) longitudinally, unilateral IRI was done. Systemic blood pressure was correlated with mesangial matrix expansion and also with renal perfusion measured by arterial spin labeling (ASL), which is a functional magnetic resonance imaging (fMRI) technique. Renal pathology, inflammation, peritubular capillary density, and fibrosis were studied by immunohistochemistry.
METHODS
Animals.Adult male CD1 mice (30 –35 g; 8 –10 wk of age) and male C57BL/6N (B6) mice (25–30 g; 10 –11 wk of age) were purchased from Charles River (Sulzfeld, Germany) and used for all experiments. Mice were housed under conventional conditions in individually ventilated cages with a 14:10-h light-dark cycle and had free access to food (Altromin 1324 standard mouse diet) and domes- tic-quality drinking water. After surgery mice were monitored daily for physical condition. Animals were cared for in accordance with our institutions guidelines for experimental animals, and all experiments had been approved by the local animal protection committee of the Lower Saxony State department for animal welfare and food protec- tion. The German guidelines are in accordance with the National Institutes of Health guidelines for animal welfare.
For functional MRI studies, unilateral IRI was performed inn⫽5 CD1 mice andn⫽10 B6 mice. Animals were examined longitudi-
* R. Greite, A. Thorenz, K. Hueper, and F. Gueler contributed equally to this work.
Address for reprint requests and other correspondence: F. Gueler, Nephrol- ogy, Hannover Medical School, Carl-Neuberg-Str.1, 30625 Hanover, Germany (e-mail: gueler.faikah@mh-hannover.de).
Am J Physiol Renal Physiol314: F881–F892, 2018.
First published December 20, 2017; doi:10.1152/ajprenal.00519.2016.
1931-857X/18 Copyright©2018 the American Physiological Society
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