Zur Regulation der C3 und der C3a Rezeptor Expression auf humanen Keratinozyten bei Psoriasis

Aus der Klinik für Dermatologie, Allergologie und Venerologie Abteilung Immundermatologie und experimentelle Allergologie

der Medizinischen Hochschule Hannover

angefertigt im Rahmen der strukturierten Doktorandenausbildung (StrucMed)

Zur Regulation der C3 und der C3a Rezeptor Expression auf humanen Keratinozyten bei Psoriasis

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Frerk Hinnerk Beyer

aus Sulingen

Hannover 2020

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 19.02.2021

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Michael P. Manns Betreuer: Prof. Dr. med. Thomas Werfel

Kobetreuer: Prof. Dr. med. vet. Manfred Kietzmann

1. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Klos 2. Referent: Prof. Dr. rer. nat. Detlef Neumann

Tag der mündlichen Prüfung: 19.02.2021 Prüfungsausschuss

Vorsitz: Prof. Dr. med. Constantin von Kaisenberg 1. Prüferin: Prof.‘in Dr. med. Anette Melk

2. Prüfer: Prof. Dr. med. Hossein Tezval

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis III

5 Zusammenfassung ... 96

6 Literaturverzeichnis ... 98

7 Anhang ... 106

7.1 Abkürzungsverzeichnis ... 106

7.2 Tabellenverzeichnis ... 106

7.3 Abbildungsverzeichnis ... 107

7.4 Fotoverzeichnis ... 108

7.5 Schemazeichnungsverzeichnis ... 108

8 Curriculum vitae ... 109

9 Erklärung nach §2 Abs. 2 Nrn. 7 und 8 PromO ... 110

10 Veröffentlichungen ... 111

10.1 Publikationen ... 111

10.2 Vorträge ... 111

10.3 Preis ... 111

11 Danksagung ... 112

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Die menschliche Haut und humane Keratinozyten

Die Haut als äußere Barriere des Organismus zu seiner Umwelt erfüllt eine Vielzahl von Funktionen. Beispielsweise schützt sie vor Wasser- und Wärmeverlusten und dem Eindringen von Pathogenen. Außerdem spielt sie eine entscheidende Rolle beim Tastempfinden und auch im sozialen Miteinander bei der Wahrnehmung des äußeren Erscheinungsbildes. Die menschliche Haut zeichnet sich aus durch ein Zusammenspiel verschiedener Immunzellen wie T-Zellen, Makrophagen, Mastzellen und dendritischen Zellen auf der einen und mit endothelialen Zellen, Fibroblasten sowie Keratinozyten auf der anderen Seite (1).

Sie ist aufgebaut aus der Epidermis (Oberhaut), die durch die Basalmembran nach unten hin von der Dermis (Lederhaut) getrennt wird. Darunter befindet sich die Subcutis (Unterhaut). Die Epidermis besteht zu etwa 90% aus Keratinozyten. Deren Stammzellen teilen sich kontinuierlich in der basalen Zellschicht und drücken dadurch weiter oben gelegene, ältere Keratinozyten hoch. Im Rahmen der epidermalen Differenzierung können die Keratinozyten durch die Expression spezifischer Proteine genau charakterisiert werden. Beispielsweise zeigt sich eine Expression von Keratin 14 in frühen Phasen (basal) und eine Expression von Filaggrin in späteren Phasen (apikal) als weiter ausdifferenzierte Keratinozyten (2).

Schließlich sterben die Keratinozyten ab und werden als Horn abgeschilfert.

Aufgrund dieser Beobachtungen wird die Epidermis von basal nach apikal eingeteilt in das Stratum basale, Stratum spinosum, Stratum granulosum, Stratum lucidum (nur an der Leistenhaut) und das Stratum corneum (3).

Einleitung 2

1.2 Das Komplementsystem 1.2.1 Die Komplementkaskade

Ende des 19. Jahrhunderts führten Jules Bordets Beobachtungen über die bakteriolytische Wirkung eines aktivierbaren hitzelabilen Serumbestandteils in Ergänzung zur bakteriziden Wirkung hitzestabiler Antikörperkomponenten zur Entdeckung des Komplementsystems (4,5). Die Begrifflichkeit „Komplement“

(lat. complementum = „Ergänzung“)wurde durch Paul Ehrlich eingeführt (6).

Das Komplementsystem ist von wesentlicher Bedeutung bei der wirksamen Erkennung und Elimination von Pathogenen und darüber hinaus als Immunüberwachungs- und Immunkoordinationssystem (7). Es besteht aus über 50 in der Leber synthetisierten Plasmaproteinen, die im Rahmen einer Immunantwort in einer proteolytischen Kaskade aktiviert werden. Das Komplementsystem kann auf bisher drei bekannten Wegen aktiviert werden (8-11):

1. Der klassische Weg: Über (Antikörper-)Komplexe vermittelt kommt es über die Komplementkomponenten C1q, C1r, C1s, C4 und C2 zur Ausbildung des C4b2a- Komplexes, der sogenannten C3-Konvertase (12).

2. Der Lectin-Weg: Nachdem Ende der 1980er Jahre entdeckt wurde, dass der klassische Weg antikörperunabhängig über das Mannose-bindende Lektin (MBL) aktiviert werden konnte (13), wurde kurz darauf dieses Modell erweitert und eine C1- und antikörperunabhängige Aktivierung über MBL auf Oberflächen von Pathogenen beschrieben, die über MBL-assoziierte Serinproteasen zur Ausbildung eines C4b2a-Komplexes (C3-Konvertase) führt (14-16).

3. Der alternative Weg: Als „Properdinsystem“ Mitte der 1950er Jahre entdeckt (17), führt im Rahmen der angeborenen Immunität eine unspezifische Aktivierung durch beispielsweise Zymosan (18) oder Kunststoffoberflächen (19) zur Stabilisation von Komplementprodukten nach spontanem Zerfall von C3 und weiter zur Bindung an Komplementfaktor B und anschließend unter Einfluss von Faktor D zur Ausbildung der C3bBb-Konvertase (8).

Einleitung 3 Die drei Wege münden in einer gemeinsamen Endstrecke. Die Spaltprodukte von C3, C3a und C3b, haben unterschiedliche Funktionen. C3a hat lokal inflammatorische Effekte, C3b kann als Opsonin wirken oder bei Anlagerung an die C3-Konvertase über den C4b2a3b-Komplex zu einer Umwandlung von C5 in seine aktiven Komponenten führen. Durch weitere Aktivierung kann ein sogenannter membrane attack complex C5b678(9)n (MAC) entstehen, der durch Porenbildung in der Zellwandmembran den Zelltod induzieren kann (7).

Komplementrezeptoren werden auf nahezu allen Immunzellen exprimiert und ermöglichen regulierte Immunantworten, sodass das Komplementsystem nicht strikt dem angeborenen oder erworbenen Immunsystem zuzuordnen ist, sondern vielmehr Komponenten beider enthält (20).

Die wichtigsten Funktionen des Komplementsystems in der Immunabwehr sind neben der Zytolyse durch den MAC, die Opsonierung von Pathogenen (über C3b), die Induktion inflammatorischer Effekte (über die Anaphylatoxine C3a, C4a, C5a) und Chemotaxis (über C3a, C5a, Ba). Bei Komplementaktivierung kann es neben der Elimination von Pathogenen zu Gewebszerstörungen oder Dysregulationen kommen, die zur Entstehung von Krankheiten verschiedener Organsysteme wie beispielsweise zu entzündlichen Hautkrankheiten beitragen können (1,12).

1.2.2 Die Komplementkomponente C3 und der C3a Rezeptor (C3aR)

Bei der Spaltung der Komplementkomponente C3 entstehendes C3a besteht aus 77 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 9kDa. Das Molekül macht etwa 5% des ursprünglichen C3-Moleküls aus und ist relativ stabil gegenüber Temperatur- und pH-Einflüssen. C3a besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette, die terminal eine kationische COOH-Gruppe aufweist, die wahrscheinlich eine Interaktion mit Rezeptoren vermittelt (21). Das Gen für das C3 Protein liegt auf Chromosom 19 (22).

Der Komplementkomponente C3a Rezeptor (C3aR) wurde erstmals Mitte der 1990er Jahre kloniert. Dieser G-Protein gekoppelte Rezeptor besteht aus 482 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 54kDa (23).

Einleitung 4 Trotz struktureller Ähnlichkeit zum C5aR unterscheidet sich der C3aR von diesem durch eine zweite 175 Aminosäuren umfassende extrazelluläre Domäne, die spezifische Bindung der entsprechenden Rezeptorliganden vermittelt und die speziesübergreifend konserviert vorliegt (24-26). Als Einzelkopie liegt das Gen für den C3aR beim Menschen auf Chromosom 12p13.2-3 (23).

Keratinozyten sind in der Lage, C3 zu synthetisieren (27). Außerdem exprimieren neben verschiedenen Immunzellen wie verschiedenen Granulozyten, dendritischen Zellen, T-Zellen und B-Zellen auch Keratinozyten den C3aR (28-32).

Im Zentrum dieser Arbeit stehen neben Untersuchungen zur Expression von C3 auch deren zugrundeliegende Mechanismen zur C3-Generierung auf humanen Keratinozyten.

1.3 Psoriasis

Die Psoriasis (dt. Schuppenflechte) ist eine rezidivierend chronisch-entzündliche Dermatose, die bei der häufigsten Erscheinungsform, der Psoriasis vulgaris, durch typische erythematöse und silbrig schuppende Plaques als Effloreszenz gekennzeichnet ist. In der Literatur wird zumeist eine Psoriasis-Prävalenz von weltweit etwa zwei Prozent postuliert, wenngleich viele Studien geographische und ethnische Prävalenzunterschiede darlegen (33). Histologisch imponiert eine hyperproliferative Epidermis mit verbreitertem Stratum spinosum (Akanthose), verdünntem Stratum granulosum und einem verbreiterten Stratum corneum, in dem die Keratinozyten teilweise noch Zellkerne enthalten (Hyperparakeratose). Die Erkrankung ist mit diversen Komorbiditäten assoziiert. Im Falle einer Beteiligung der Gelenke spricht man von einer Psoriasisarthritis (34).

Einleitung 5

1.3.1 Ätiopathogenese und die Rolle proentzündlicher Zytokine

Die Psoriasis ist eine multifaktoriell bedingte Erkrankung, die neben prädisponierenden Umweltfaktoren eine starke genetische Komponente aufweist (35). Mehrere Suszeptibilitätsgene verschiedener Chromosomenlokalisation sind bekannt, die meist im Zusammenhang mit immunregulatorischen Prozessen wie der T-Zell-Differenzierung stehen. Komplexe Mechanismen der Immundysregulation führen zu charakteristischen psoriatischen Läsionen, bei denen eine erhöhte Immunzellenzahl (insbesondere T-Zellen und dendritische Zellen) auffällt (36-38).

Die Psoriasis wird hauptsächlich durch T-Zellen und deren Interaktion mit Keratinozyten nach Infiltration in die Epidermis getriggert (39). Diese Annahme stützen Versuche an T-Zell-Überständen aus psoriatischer Haut, die in der Keratinozyten-Zellkultur einen psoriasisähnlichen Phänotyp hervorrufen (40).

Außerdem wird dieses auch unterstrichen durch Untersuchungen an α1β1-Integrin, einem Oberflächenrezeptor zuständig für Kollagenbindung, die darlegen, dass eine Blockade dieses Integrins eine T-Zell-Migration in die Epidermis mindert und daraufhin typische psoriatische Veränderungen ausbleiben (41).

Vermittelt wird das Zusammenspiel von T-Zellen und Keratinozyten durch kleine Peptidmoleküle, sogenannte Zytokine oder Chemokine, die als Botenstoffe fungieren. Die Psoriasis ist durch Zytokine des Th1-Profils (insbesondere TNF-α und IFN-γ) und der T-Helfer-17-(Th17-) Achse (insbesondere IL-17 und IL-22) gekennzeichnet (42-45). Bekräftigend dazu können erhöhte mRNA Level von TNF- α, IFN-γ, IL-17, IL-22 und IL-23 in psoriatischen Läsionen gefunden werden (42,46- 48).

Diverse wirksame Therapien z.B. mit dem T-Zell-Aktivität supprimierenden Cyclosporin, mit TNFα-Blockern oder mit IL-17- oder IL-23-Antikörpern unterstreichen die funktionelle Rolle des Th17-Netzwerkes in der Psoriasis (49-53).

Für die einzelnen Zytokine wie IFN-γ, TNF-α und IL-17 sind neben der proinflammatorischen Komponente auch gegensätzliche antiinflammatorische Effekte bekannt, was die Komplexität im Verständnis der Rolle der Zytokine in der Psoriasis aufzeigt und eine genaue Einordnung im Kontext nötig macht (54,55).

Einleitung 6 IL-17, ein Th17-Zytokin, kann die Expression proinflammatorischer Proteine und dadurch entzündliche Dermatosen induzieren, teilweise auch synergistisch in Kombination mit weiteren Zytokinen wie IFN-γ. Effekte auf die Keratinozytenwachstumsrate durch IL-17 wurden nicht beobachtet (56,57).

IL-22, ein weiteres Th17-Zytokin, das an der Regulation der Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten beteiligt ist (58), mediiert die durch IL-23 induzierte Akanthose unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors STAT3. IL-23 aus dendritischen Zellen sorgt für eine Differenzierung zu Th17-Lymphozyten (59).

Oncostatin M (OSM), ein von verschiedenen aktivierten Immunzellen gebildetes Zytokin der Glykoprotein gp130 Familie, ist ebenfalls in der Lage, die Expression Psoriasis typischer proinflammatorischer Proteine wie antimikrobielle Peptide (AMPs) und Transkriptionsfaktoren zu erhöhen und kommt vermehrt in psoriatischen Läsionen vor (60-62).

Konträr zu anderen Schlüsselzytokinen der Psoriasis wie TNF-α und IFN-γ sorgt OSM in menschlicher Haut für eine Verminderung der Th1-Antwort, was auch auf antiinflammatorische Effekte hindeutet. Darüber hinaus beeinflusst OSM die epidermale Differenzierung (63).

Verschiedene Modelle zur Psoriasis sollen die zugrundeliegenden pathophysiologischen Zusammenhänge aufdecken und die Erkrankung weiter erklären, wobei es zu beachten gilt, dass die Psoriasis mit Ausnahme einiger beschriebener erkrankter Primaten eine auf die Spezies Mensch begrenzte Erkrankung darstellt (36,64).

Im Mausmodell kann durch den immunaktivierenden und Psoriasis exazerbierenden toll-like-receptor (TLR) 7/8-Agonisten Imiquimod eine IL-23/IL-17 mediierte psoriasisartige Effloreszenz induziert werden (65).

In einem anderen Modell von Guilloteau et al. fanden sich in einem Screening in IL- 17A, OSM, TNF-α, IL-22 und IL-1α fünf spezifische Zytokine, die gemeinsam und synergistisch Hautentzündungen hervorrufen können. In vitro bilden diese ein menschliches Psoriasis-Keratinozytenmodell, welches ebenfalls wie bei intradermaler Applikation dieser Zytokinzusammenstellung bei Mäusen in vivo und an menschlichen Hautexplantaten ex vivo mit dem transkriptionellen Profil aus Psoriasisläsionen korreliert (66).

Einleitung 7

1.3.2 Die Rolle von C3 und des C3a Rezeptors in der Psoriasis

Erhöhte Konzentrationen der Komplementkomponente C3a im Serum von Patienten mit Psoriasis gegenüber Kontrollen führten zur weiteren Untersuchung der Beteiligung des Komplementsystems an chronisch-entzündlichen Erkrankungen wie der Psoriasis (67-70). Außerdem wurde eine Aktivierung des Komplementsystems über den alternativen Weg unter Beteiligung des Stratum corneums festgestellt, die eine Rolle in entzündlichen Dermatosen spielen könnte (71).

Schonthaler et al. zeigten in einer Proteinanalyse aus Hautexplantaten von Psoriasis-Patienten, dass unter über 1200 nachweisbaren Proteinen neben den beiden antimikrobiellen Peptiden S100A8 und S100A9 die Komplementkomponente C3 als drittstärkstes heraufreguliertes entzündliches Protein imponierte (72).

Darüber hinaus stellte sich im Rahmen der Einteilung der identifizierten Proteine in die Kategorien Immunzellregulation, Akute-Phase-Antworten und Fettstoffwechsel heraus, dass C3 nachweislich an all diesen Stoffwechselvorgängen beteiligt ist (7).

In dieser Arbeitsgruppe wurde zudem die funktionelle Rolle von C3 in der Psoriasis untersucht und präsentiert, dass im Mausmodell mittels Imiquimod psoriasisartige Effloreszenzen induziert werden können. Nach Stilllegen des C3-Gens durch lentivirale shRNAs verschwand daraufhin der psoriasisartige Phänotyp. Es verblieb einzig eine histologisch nachweisbare Verdickung der Epidermis mit einer im Vergleich zu vorher verminderten aber weiterhin erhöhten Anzahl Proliferationsmarker-Ki-67-positiver Zellen (72).

Die Assoziation der Psoriasis mit verschiedenen Komorbiditäten ist lange bekannt.

Studien belegen eine erhöhte kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität bei Psoriasis-Erkrankten, wobei das proinflammatorische Milieu vermutlich eine entscheidende Rolle spielt (73,74). Zusammengefasst werden hier die Gründe für eine um einige Jahre verkürzte Lebenserwartung von Psoriasis-Patienten gesehen (75). Passend dazu finden sich erhöhte Serumkonzentrationen der Komplementkomponente C3 in Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen, weshalb eine Rolle von C3 in der Pathogenese angenommen wird (76). Zudem wird C3 vermehrt in viszeralem Fettgewebe gebildet, wobei Psoriasis-Erkrankte einen höheren Anteil an diesem besitzen (77,78).

Einleitung 8 Für den C3aR ist bereits eine Beteiligung in der Th-2-mediierten Sensibilisierungsphase der allergischen Kontaktdermatitis und in der Effektorphase des Asthmas beschrieben (79,80).

Ergebnisse nach Einsatz eines Anti-C3-Rezeptor-Antikörpers im Mausmodell deuten darauf hin, dass eine Durchbrechung der biologischen C3/C3aR-Achse in entzündlichen Erkrankungen wie der Psoriasis therapeutisch sinnvoll sein kann (81).

Im Rahmen der Psoriasis wird die Generierung von C3 unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine systemisch in der Leber oder im Fettgewebe von der lokalen Produktion beispielsweise in der Haut unterschieden (74,82,83).

Verschiedene Studien deuten auf eine lokale Zytokin-abhängige Regulation von C3 in Keratinozyten hin. So erhöhen Überstände aktivierter T-Zellen, sowie Stimulationen mit IL-1α, TNF-α und IFN-γ die C3 mRNA Expression und Protein Produktion in humanen Keratinozyten (84,85).

Gegensätzlich dazu führt das Psoriasis-Schlüsselzytokin IFN-γ in glomerulären Epithelzellen und Hepatozyten der Ratte nicht zur Erhöhung der C3 Genexpression.

Die C3 mRNA Expression wird durch IL-1α in Ratten-Hepatozyten erhöht und in glomerulären Epithelzellen von Ratten nicht beeinflusst, sodass vermutlich eine genaue spezies- und auch zellspezifische Auseinandersetzung der komplexen Regulation von C3 im Rahmen bestimmter Zytokin-Milieus erfolgen sollte (86).

Weiterhin ist bekannt, dass IFN-γ und IFN-α den C3aR auf der Zelloberfläche von Keratinozyten hochregulieren (28).

Zusätzlich zu den bereits erwähnten proinflammatorischen Wirkungen werden in der Literatur auch anti-entzündliche Effekte von C3a und dem C3aR beschrieben wie die Minderung der LPS-induzierten TNF-α Proteinexpression durch C3a- Stimulation in PBMCs oder durch eine erhöhte Letälität beim endotoxischen Schock in C3aR-defizienten Mäusen (87,88).

Die Expression, Regulation und Funktion von C3 und des C3aR im Kontext der Pathogenese der Psoriasis und beteiligter Zytokine ist bisher in humanen Keratinozyten noch unzureichend untersucht.

Einleitung 9

1.3.1 Therapie der Psoriasis

Die Schuppenflechte kann sich phänotypisch sehr unterschiedlich manifestieren.

Dennoch wird die Diagnose meist klinisch gestellt. Zur Behandlung stehen diverse lokale und systemische Therapien zur Auswahl. Alle erzielen letztlich - passend zur Theorie der komplexen Mechanismen der Immundysfunktion im Rahmen der Erkrankung - eine immunmodulatorische Wirkung, wobei derzeit keine kurative Maßnahme bekannt ist (1,34). Entscheidend für eine bestimmte Therapie-Einleitung ist eine Erhebung der Krankheitsintensität im Rahmen des PASI-Scores (Akronym für Psoriasis Area and Severity Index). Die Beurteilung der Haut ergibt aus einer quantitativen Aussage zur Ausdehnung und einer qualitativen Einschätzung zum Schweregrad von Rötung, Infiltrationstiefe sowie Schuppung einen Punkte-Score zwischen 0 und 72 (89).

Im Zuge der fortschreitenden Erkenntnisse um die Ätiopathogenese der Psoriasis und fehlendem Erfolg bei erheblichen Nebenwirkungen in der Langzeittherapie mit Standardmedikamenten wurden in letzter Zeit im Rahmen der zielgerichteten Therapie verschiedene sogenannte Biologika entwickelt und zugelassen. Biologika lassen sich in zwei Gruppen klassifizieren, monoklonale Antikörper (Endung -mab) und Fusionsproteine (Endung -cept). Sie stellen hinsichtlich der Wirksamkeit Alternativen zur konventionellen systemischen Therapie bei höherem Schweregrad dar, zumal eine Patientenunzufriedenheit mit herkömmlichen Medikamenten in der Literatur beschrieben ist (1,36,90,91).

TNF-α-Antagonisten (Etanercept, Adalimumab und Infliximab) wurden über viele Jahre als Goldstandard bei schwerer Psoriasis eingesetzt (92-94). Weiterhin steht ein IL-12/IL-23-Antagonist (Ustekinumab) zur Verfügung, der immunpathogenetisch anders als die TNF-α-Antagonisten an Zytokinen der antigenpräsentierenden Zellen eingreift (95). Neuere Therapie-Entwicklungen richten sich gegen IL-17 (Secukinumab und Ixekizumab) bzw. dessen Rezeptor (Brodalumab) (51,52,96) oder gegen IL-23 (Guselkumab und Risankizumab) (53,97).

Zusammenfassend unterstreichen die neueren Therapieoptionen die Rolle des Zytokin-Netzwerkes in der Psoriasis und die Bedeutung der Forschung in diesem Bereich. Die pathogenetische Rolle von IL-17 in der Psoriasis in Verbindung mit dem Komplementsystem steht im Fokus dieser Arbeit.

Einleitung 10

1.4 Die Rolle der S100-Proteine bei der Psoriasis und mögliche kausale Verbindungen zu C3

Die Calcium-bindenden Proteine der S100-Familie sind kleine Moleküle (ca. 10-12 kDa) und gehören zu den antimikrobiellen Peptiden (AMPs). Sie sind an einer Vielzahl von intrazellulären Prozessen und extrazellulären Aufgaben wie der Immunabwehr beteiligt. Konsens besteht in der Literatur über die Beteiligung von Proteinen der S100-Familie an chronisch-inflammatorischen Erkrankungen wie Bronchitis, rheumatoider Arthritis, Mukoviszidose, Morbus Crohn, sowie inflammatorischen Hauterkrankungen (98-100). Viele Gene der S100-Familie liegen innerhalb des sogenannten epidermalen Differenzierungskomplex (EDC) auf Chromosom 1q21, einem Psoriasis-Suszeptibilitätsfokus. Auf dem Chromosom sind sie nach ihrer Anordnung benannt. Darunter befinden sich S100A7 (auch Psoriasin genannt), S100A8 (auch myeloid-related protein 8 (MRP-8) oder Calgranulin A genannt) und S100A9 (auch MRP-14 oder Calgranulin B genannt) (101,102).

Liegen S100A8 und S100A9 als Homo- oder Heterodimerkomplexe vor, werden sie als Calprotectin bezeichnet (103).

S100A8 und S100A9 können an verschiedene Rezeptoren binden, beispielsweise an den receptor for advanced glycation endproducts (RAGE), der mit Entzündung und Psoriasis assoziiert wird (104).

Unter physiologischen Bedingungen werden S100A7-S100A9 minimal in der Haut exprimiert (98,99). Im pathophysiologischen Kontext der Psoriasis wird die Expression dieser drei S100-Proteine in psoriatischen Läsionen stark heraufreguliert (105-107).

Eine vermehrte Calprotectin-Expression konnte ebenso in verschieden Studien durch externe Reize mittels Tape-Stripping, Vaseline-Applikation, Detergenzien oder UV-Bestrahlung erzielt werden (108,109) und zeigte sich auch bei der menschlichen und murinen Wundheilung (110).

Extrazelluläre Effekte von Psoriasin präsentieren sich in vitro durch eine chemotaktische Wirkung auf T-Lymphozyten und neutrophile Granulozyten, die auf eine inflammatorische Mediatorrolle hinweisen (111).

Einleitung 11 Mittels adenoviraler Transduktion in Keratinozyten bildet sich durch Überexpression von S100A8 und S100A9 ein Zytokinmileu, das vermehrt proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-8 enthält (107).

Darüber hinaus ließen sich im Serum von Psoriasis-Patienten erhöhte S100A8 und S100A9 Konzentrationen gegenüber Kontrollen nachweisen, die neben intrazellulären auch extrazelluläre Effekte der Proteine nahelegen. Außerdem detektierte dieselbe Arbeitsgruppe - wie auch Broome et al. - durch in situ Hybridisierung und Immunhistochemie eine erhöhte S100A8 und S100A9 mRNA Expression und Protein Produktion in suprabasalen Schichten der läsionalen psoriatischen Epidermis, was auf eine Beteiligung an der gestörten Differenzierung der Keratinozyten in der Psoriasis hindeutet (112,113). In der Keratinozyten- Zellkultur erhöht Calprotectin weiterhin typische und mit der Psoriasis in Verbindung stehende Zytokine wie IL-6 und TNF-α (114).

In einem Modell von Zenz et al. erschienen JunB- und c-Jun-Knockout-Mäuse (zur Untersuchung der Herunterregulation des Transkriptionsfaktors AP-1) phänotypisch, histologisch und molekular mit typischen Aspekten der Psoriasis. Als Besonderheit gegenüber anderen Psoriasis-Modellen zeigten diese Mäuse Anzeichen der assoziierten Psoriasis-Arthritis. Weiterhin war die genetische Expression von S100A8 und S100A9 von JunB- und c-Jun-defizienten Zellkultur- Keratinozyten in Untersuchungen der gleichen Arbeitsgruppe stark erhöht. Diese erhöhte Calprotectin Expression zeigte sich nach Deletion als eine frühzeitige Veränderung, was für eine entscheidende Rolle von Calprotectin im Rahmen der Psoriasis-Pathogenese spricht (115).

Auf diesem Modell von Zenz et al. und der bereits im Kapitel 1.3.2 zur Rolle von C3 in der Psoriasis erwähnten Proteinanalyse, die unter über 1200 nachweisbaren Proteinen aus Psoriasis-Hautexplantaten die beiden antimikrobiellen Peptide S100A8, S100A9 und die Komplementkomponente C3 als stärkste heraufregulierte entzündliche Proteine identifizierte, bauten Schonthaler et al. auf. Sie zeigten eine Verbindung von S100A8/S100A9 zu C3 und dem alternativen Aktivierungsweg des Komplementsystems auf (72).

Einleitung 12 Die immunaktivierende und Psoriasis exazerbierende Substanz Imiquimod führte im Mausmodell zu einer starken Heraufregulation der S100A8/S100A9 mRNA Expression. Außerdem stellte sich die Expression von Calprotectin und C3 an Hautproben von Psoriasis-Patienten innerhalb psoriatischer Läsionen ähnlich lokalisiert dar, wobei Keratinozyten in der Haut beide Moleküle am meisten bilden.

Zudem zeigten JunB- und c-Jun-Knockout-Mäuse – in Einklang mit Zenz et al. – eine hohe Calprotectin-Expression und eine vermehrte C3-Expression. Bei Deletion des S100A9-Gens ergaben sich phänotypisch geringere Psoriasis-Aspekte verbunden mit einer geringeren C3-Expression, die einen möglichen direkten Zusammenhang aufzeigt. In der weiteren Untersuchung von Schonthaler et al.

erschien S100A9 als C3-Expression modulierende Chromatin-Komponente in Maus- und humanen Keratinozyten, die in der Nähe der Promotorregion des C3- Gens bindet (72).

Die Regulation und Aktivierung des C3-Gens deutet auf eine wichtige Rolle in der Psoriasis-Pathogenese hin, die im Hinblick auf das Erkrankungsverständnis und die Entwicklung neuer Therapien weiter erforscht werden sollte.

Einleitung 13

1.5 Die Rolle von Histamin in der Psoriasis

Histamin ist ein biogenes Amin, das im gesamten Körper sowohl lokal als auch systemisch physiologische und pathophysiologische Effekte ausübt, beispielsweise Neurotransmission, Entzündung, Kontraktion glatter Muskulatur, Kapillardilatation, Chemotaxis, Magensäuresekretion, Juckreizvermittlung und auch Zytokin- Produktion. Histamin wird durch basophile Granulozyten und insbesondere durch Mastzellen gebildet und freigesetzt. Seine vielfältigen Funktionen vermittelt Histamin über vier G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die Histaminrezeptor-Subtypen (HXR) H1R, H2R, H3R und H4R (116). Von diesen vier strukturell ähnlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren werden der H1R, der H2R und der H4R auf humanen Keratinozyten exprimiert (117-120).

Die Benennung der Histaminrezeptor-Subtypen erfolgte chronologisch nach ihrer Erforschung. Der H1R wurde als erster Histaminrezeptor von Bovet und Staub 1937 in Frankreich entdeckt (121). Er spielt hauptsächlich eine Rolle in allergischen Reaktionen vom Soforttyp und ist daher allen voran von klinischer Relevanz in der allergischen Rhinitis oder Urtikaria (122). Als nächster Histaminrezeptor wurde der H2R von Black et al. 1972 in seiner Funktion beschrieben (123). Der H2R vermittelt die Sekretion der Magensäure und steht damit klinisch im Zusammenhang mit Erkrankungen wie der gastroösophagealen Refluxkrankheit (122). Weiterhin wurde mit dem H3R ein Histaminrezeptor von Arrang et al. 1983 entdeckt, dem insbesondere Einfluss im neuronalen System zugeschrieben wird (124). Zuletzt Anfang der 2000er Jahre wurde der H4R beschrieben (125). Ihm werden hauptsächlich immunmodulatorische Funktionen in allergischen oder chronisch- entzündlichen Erkrankungen zugerechnet (122). Erst kürzlich wurde dazu eine vielversprechende Studie zu einem neuen Behandlungsansatz von Patienten mit atopischer Dermatitis mit einem H4R-Blocker von Werfel et al. veröffentlicht (126).

Einige Studien zeigen, dass Pruritus in der Psoriasis anders als bei anderen Dermatosen wie atopischer Dermatitis oder Lichen ruber planus meist nicht als Hauptproblem betrachtet wird, aber dennoch bei etwa 70-90% der Psoriasispatienten auftritt, einen hohen Leidensdruck erzeugt und die Lebensqualität deutlich beeinflusst (127-129).

Einleitung 14 Insgesamt wird die Rolle von Histamin in der Psoriasis in der Literatur im Hinblick auf die klinische Anwendung von Antihistaminika kontrovers diskutiert, da sie einerseits einen juckreizlindernden Effekt haben und in der Praxis häufig angewendet werden, andererseits jedoch Pruritus nicht vollständig verhindern und Histamin als Pruritus-Mediator keine bedeutende Rolle in der Psoriasis zugeschrieben wird (127-129). Stattdessen werden das Opioidsystem, Prostanoide, Interleukin-31, Serotonin oder Proteasen als Vermittler diskutiert (130).

Es gibt jedoch Hinweise in der Literatur, die auf eine Beteiligung von Histamin in der Pathogenese der Psoriasis hindeuten. Die Arbeitsgruppe von Krogstad et al.

beobachtete per Radioimmunoassay zweifach erhöhte interstitielle und 10-fach erhöhte dermale Histaminkonzentrationen in läsionaler gegenüber nicht-läsionaler Haut und vermutete eine Rolle in der Inflammation der Schuppenflechte (131).

Außerdem bilden teils degranulierte Mastzellen ein frühes Merkmal wieder auftretender psoriatischer Läsionen nach beendeter Kortisontherapie (132).

Gschwandtner et al. legten dar, dass sich im Blut von Psoriasis-Patienten gegenüber gesunden Probanden und Neurodermitispatienten eine erhöhte Expression des H4R auf plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) finden lässt.

Infolge einer Histamin-Stimulation trat eine Herunterregulation von TNF-α, IFN- α und CXCL8 auf, die als Zytokine in der Psoriasis beteiligt sind (133). Darüber hinaus kann Histamin bzw. 4-Methylhistamin als H4R-Agonist die Produktion von IL-17 durch Th17-Zellen verstärken (134). Aus basophilen Granolozyten freigesetztes Histamin ist in der Lage, die IL-17 Produktion zu verstärken. Dieses Phänomen lässt sich durch H2- und H4R-Antagonisten supprimieren, was zusätzlich auf eine Beteiligung von Histamin in der Psoriasis hinweist (135).

Interessanterweise potenziert Histamin mutmaßlich über den H1R die Effekte von proentzündlichen und in der Psoriasis relevanten Zytokinen wie IL-17 und TNF-α in humanen Keratinozyten (136).

Im Fokus dieser Arbeit stehen die Regulationsmechanismen der Komplementkomponente C3, hier insbesondere der Einfluss von Histamin auf die C3 Expression auch im Kontext beteiligter Zytokine in der Psoriasis. Dieses ist bisher weitestgehend unerforscht und soll näher betrachtet werden.

Einleitung 15

1.6 Fragestellung und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Die Psoriasis ist eine komplexe multifaktoriell bedingte Erkrankung. In der Literatur werden verschiedenste Dysregulationen des Immunsystems im Rahmen der Pathogenese der Psoriasis diskutiert, wobei Immunzellen mittels Zytokinen mit dem Hauptzelltyp der Epidermis, den Keratinozyten, interagieren. Außerdem zeigen verschiedene Studien eine Beteiligung des Komplementsystems und dessen wichtiger Komponente C3 an der Pathophysiologie. Es existieren verschiedene tierische und menschliche Modelle chronisch-entzündlicher Hauterkrankungen, die pathophysiologische Mechanismen erklären und verschiedene (Schlüssel-) Zytokine aufzeigen.

Die Expression und Regulationen der Komplementkomponente C3 sowie des C3a Rezeptors im Kontext der Pathogenese der Psoriasis und deren Schlüssel- Zytokinen sollen in dieser Arbeit auf humanen Keratinozyten weiter untersucht werden.

Dabei stehen insbesondere die pathogenetische Rolle von IL-17 in Verbindung mit der Komplementkomponente C3 und die zugrundeliegenden Mechanismen der C3- Generierung auf humanen Keratinozyten im Fokus.

Der Einfluss von IL-17 soll in Keratinozyten bei unterschiedlichen Differenzierungsgraden analysiert werden. Diese Beobachtungen zur Expression verschiedener Proteine in der Zellkultur sollen auch nach Etablierungsarbeit im Rahmen der Laser-Capture Mikrodissektion bei Normalhaut untersucht werden.

Analysen des Proteoms der Epidermis zeigten, dass S100-Proteine und C3 stark hochregulierte Proteine in der Epidermis der Psoriasis-Haut darstellen (72). Im Rahmen dieser Arbeit soll der Einfluss von in der Psoriasis relevanten Zytokinen wie OSM, IL-17, TNF-α und IL-22 auf die Expression der Komplementkomponente C3, des C3aRs sowie der S100-Proteine untersucht werden.

Bisher sind zwei Mechanismen der lokalen Hochregulation von C3/C3aR-Achse in der Literatur beschrieben. Zum einen wird die intrinsische C3-Generierung in myeloiden Zellen über die Proteinase Cathepsin L mediiert (137), zum anderen wird im Mausmodell und in humanen Zellen dem Calcium-bindenden-Protein S100A9 eine C3 modifizierende Funktion zugeschrieben (72).

Einleitung 16 Im Falle einer Regulation der C3/C3aR-Achse durch die Zytokine OSM, IL-17, TNF- α und IL-22, sollen in dieser Arbeit die Regulationsmechanismen näher untersucht werden.

Außerdem soll der Einfluss von Histamin und der Subtyp-spezifischen Histaminrezeptor-Agonisten auf die C3- und die S100-Protein-Transkription überprüft und im Falle einer Regulation näher untersucht werden.

Material und Methoden 17

2 Material und Methoden 2.1 Material

2.1.1 Menschliche Ausgangsmaterialien

Normale humane epitheliale Keratinozyten (NHEKs) für die Zellkulturen

Die humanen epithelialen Keratinozyten wurden aus juveniler Vorhaut isoliert, die anonymisiert freundlicherweise aus der MHH Klinik für Kinderchirugie zur Verfügung gestellt wurden.

Die Generierung erfolgte nach publizierten Protokollen und die Zellen wurden im Labor für diese Arbeit bereitgestellt (138). Dazu wurden die Vorhäute in kleine Stücke zerschnitten und über Nacht in 2,4U/ml Dispase II (Roche, Mannheim) bei 4°C inkubiert. Nun wurde die Epidermis von der Dermis nach Erwärmen auf Raumtemperatur getrennt und für 5min bei 37°C in 5ml Trypsin 0,05%/ EDTA 0,02%

(Pan, Aidenbach) inkubiert und gevortext. Nach dem Stoppen der Reaktion mittels 5ml Trypsin Inhibitor (TNS) 1mg/ml (Pan, Aidenbach) wurde die Keratinozyten- Zellsuspension durch einen speziellen 40 µm Zellfilter geleitet und nach dem Waschen mittels PBS isoliert. Die weiteren Zellkulturhandlungsabläufe sind im Kapitel 2.2.1.1. zur Kultivierung und Stimulation von Keratinozyten erläutert.

Weitere NHEKs wurden von der Firma PromoCell, Heidelberg bezogen.

Hautstanzen für die Laser Capture Mikrodissektion

Die Hautstanzen wurden freundlicherweise aus der Sophienklinik, Hannover zur Verfügung gestellt.

Alle Teilnehmer erteilten ihre schriftlich informierte Einwilligung. Bei Probanden unter 18 Jahren wurde diese Einwilligung der gesetzlichen Vertreter bzw.

Erziehungsberechtigten eingeholt.

Die Verwendung dieser menschlichen Ausgangsprodukte zur Forschung an entzündlichen Hauterkrankungen (Ethikvotum 2603-2015) und Histaminrezeptoren (Ethikvotum 4253) wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover genehmigt.

Die Untersuchungen erfolgten im Einklang mit der Deklaration von Helsinki.

Material und Methoden 18

2.1.2 Tabellarische Auflistung der Materialien

Tabelle 1: Chemikalien und Reagenzien

Tabelle 2: Zellkulturmedien

Zellkulturmedium Hersteller Sitz des Herstellers

CryoPAN I 50ml PAN Aidenbach

FuGENE HD Transfektionsreagenz Promega Madison, USA

HiPerFect Transfektionsreagenz Qiagen Hilden

Keratinozyten Basal Medium 2 500ml PromoCell Heidelberg SupplementPack Keratinocyte GM 2

Bovine Pituitary Extract 0,004ml/ml Epidermal Growth Factor 0,125ng/ml Insulin 5µg/ml

Hydrocortisone 0,33µg/ml Epinephrine 0,39µg/ml Transferrin 10µg/ml CaCl2 0,06mM

PromoCell

Heidelberg

Chemikalie/Reagenz Hersteller Sitz des Herstellers

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich St. Louis, USA

2-Propanol 99,5% Carl Roth Karlsruhe

Ampuwa Spüllösung Fresenius Kabi France Sevres, Frankreich

BSA 1% in PBS Miltenyi Biotec Bergisch Gladbach

DPBS 500ml PAN Aidenbach

Dispase II Roche Mannheim

EDTA 1% 100ml PAN Aidenbach

Ethanol 70% Carl Roth Karlsruhe

Ethanol 70% vergällt 5L Carl Roth Karlsruhe

Ethanol 99,5% Carl Roth Karlsruhe

HyQtase solution GE Healthcare

Bio-Sciences AB Uppsala, Schweden

Isopropanol 99,5 % Carl Roth Karlsruhe

LightCycler 480 SYBR Green I Master Roche Mannheim

Millipore Merck Millipore Molsheim, Frankreich

PBS Biochrom Berlin

PBS R&D Systems Minneapolis, USA

Schwefelsäure (H2SO4) Carl Roth Karlsruhe

Tissue-Tek Sakura Finetek Torrance, USA

Trypan Blue Solution (0,4%) Sigma-Aldrich Darmstadt

Trypsin Inhibitor (TNS) 1mg/ml PAN Aidenbach

Trypsin/EDTA 0,05%/0,02% PAN Aidenbach

Tween 0.05% R&D Systems Minneapolis, USA

Vectashild Mounting Medium For

Fluorescence with DAPI Vector Laboratories Burlingame, USA

Wasser Carl Roth Karlsruhe

Material und Methoden 19 Tabelle 3: Stimulanzien

Tabelle 4: Small interfering RNA

Stimulanz Hersteller Sitz des Herstellers

AllStars Neg. Control Qiagen Hilden

si-control FITC-gelabelt Qiagen Hilden

siRNA Hs_S100A9_2 Qiagen Hilden

siRNA Hs_S100A9_7 Qiagen Hilden

siRNA Hs_S100A9_9 Qiagen Hilden

siRNA Hs_S100A9_10 Qiagen Hilden

Tabelle 5: Primer

Primer Hersteller Sitz des Herstellers

C3 (QT00089698) Qiagen Hilden

C3aR (QT00090398) Qiagen Hilden

CTSL (QT01664978) Qiagen Hilden

Filaggrin (QT00092218) Qiagen Hilden

IL-17RA (QT02451071) Qiagen Hilden

Keratin 14 (QT00052283) Qiagen Hilden

PGK1 (QT00013776) Qiagen Hilden

S100A7 (QT00018746) Qiagen Hilden

S100A8 (QT02503907) Qiagen Hilden

S100A9 (QT00018739) Qiagen Hilden

Stimulanz Hersteller Sitz des Herstellers Konzentration Calciumchlorid CaCl2 PromoCell Heidelberg 1,3mMol H1R-Agonist

2-

Pyridylethylamindihydrochlorid

Tocris bioscience

Bristol, Vereinigtes Königreich

10^-5M H1R-Antagonist

Clemastine Novartis Nürnberg 10^-5M

H2R-Agonist

Amthamindihydrobromid

Tocris bioscience

Bristol, Vereinigtes

Königreich 10^-5M H2R-Antagonist

Ranitidin Biomol Hamburg 10^-5M

H4R-Agonist

ST-1006 Holger Stark Uni Düsseldorf 10^-5M

H4R-Antagonist

JNJ7777120 Sigma-Aldrich St. Louis, USA 10^-5M

H4R-Antagonist

ZPL-389 Ziarco Pharma Sandwich,

Vereinigtes Königreich

10^-9M Histamindihydrochlorid ALK-Abelló Madrid, Spanien 10⁵M IL-17 (rhIL-17A) R&D Systems Minneapolis, USA 25ng/ml

IL-22 (rhIL-22) PeproTech,

INC Rocky Hill, USA 10ng/ml

OSM PeproTech,

INC Rocky Hill, USA 25ng/ml

TNF-α (rhTNFa) ImmunoTools Friesoythe 10ng/ml

Material und Methoden 20 Tabelle 6: Verwendete Kits

Verwendetes Kit Hersteller Sitz des Herstellers

Carrier RNA Qiagen Hilden

Complement C3 Human ELISA Kit

(for cell culture supernatants) abcam Cambridge, Vereinigtes Königreich Complement C3 Human ELISA Kit

(for serum samples) abcam Cambridge,

Vereinigtes Königreich H&E Staining Kit Plus Molecular Machines

& Industries Eching

Human S100A9 DuoSet ELISA R&D Systems Minneapolis, USA innuPREP Micro RNA Kit Analytik Jena Jena

QuantiTect RT-Kit Qiagen Hilden

Real Time ready cDNA Pre-Amp

Master 1 Roche Mannheim

RevertAid First Strand cDNA

Synthesis Kit Thermo Scientific Waltham, USA

RNase-Free DNase Set Qiagen Hilden

RNeasy Micro Kit Qiagen Hilden

Substrat Solution Color Reagent A (H2O2) und Color Reagent B (Tetramethylbenzidine)

R&D Systems Minneapolis, USA

Tabelle 7: Geräte und sonstige Hilfsmittel

Gerät/ Hilfsmittel Hersteller Sitz

des Herstellers

-80°C Gefrierschrank GFL Burgwedel

Autoklav Integra Biosciences Chur, Schweiz

Centrifuge 5425 D Eppendorf Hamburg

CO2 Inkubatotor Hera cell 150 Kendro Hanau

CryoStar NX70 Thermo Scientific Walldorf

ELISA-Wascher ELx50 BioTek Winooski, USA

FACS Calibur Becton Dickinson Heidelberg

Flake Ice Machine Manitowoc Herborn, USA

Fluoreszenzlicht Olympus U-HGLGPS Olympus Hamburg

FLUOstar Optima BMG Labtech Ortenberg

Kühl-Gefrierkombination Premium Liebherr Bulle, Schweiz

Laser Olympus Hamburg

LC Carousel Centrifuge Roche Mannheim

LightCycler 1.5 Roche Mannheim

LightCycler 480 II Roche Mannheim

Mikroskop ID03 Zeiss Oberkochen

Mikroskop IX2-UBC Olympus Hamburg

Mikroskop Olympus BX43 Olympus Hamburg

Mikroskopobjektiv IX81 Olympus Hamburg

Mikrowelle 5067 TEC unbekannt

mmiCellcut Molecular Machines

& Industries Eching Mr. Frosty

Nalgene Cryo 1°C Freezing Container Thermo Scientific Wilmington, USA

Multipette plus Eppendorf Hamburg

Material und Methoden 21

Tabelle 8: Software

Software Hersteller Sitz

des Herstellers CellQuest Pro Software v. 5.2.1 Becton Dickinson Heidelberg

Excel 2010, 2013, 2016 Microsoft Redmond, USA

GraphPad Prism 8.0.0 GraphPad Software La Jolla, USA

LightCycler 480 Software release 1.5.1.62 SP2 Roche Mannheim mmiCellTools Version celltools-4.4 #303 Molecular Machines

& Industries Eching

NanoDrop2000/200c Software Firmware 1.5 Thermo Scientific Wilmington, USA

Optima Version 2.10 BMG Labtech Ortenberg

Software cellSens Dimension 1.11 Olympus Hamburg

Word 2010, 2013, 2016 Microsoft Redmond, USA

Gerät/ Hilfsmittel Hersteller Sitz des

Herstellers NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific Wilmington,

USA

Neubauer-Zählkammer Brand Wertheim

Pipetboy acu Integra Biosciences Zizers, Schweiz

Pipette Research plus 0,1-2,5µl Eppendorf Hamburg

Pipette Research plus 0,5-10µl Eppendorf Hamburg

Pipette Research plus 10-100µl Eppendorf Hamburg

Pipette Research plus 100-1000µl Eppendorf Hamburg

PTC-200 Peltier Thermal Cycler MJ Research Watertown, USA

Sterilbank HERA safe 205 Heraeus Instruments Hanau

Stickstofftank Chronos Biosafe Messer Griesheim Bad Soden a.T.

Vakuumpumpe N86 KN.18 KNF Neuberger Laboport Freiburg

Ventilator Airwave Berlin

Vortexer IKA MS1 Minishaker Sigma-Aldrich Darmstadt

Wasserbad AL 12 Aqualine Lauda Lauda-Königshofen

Zentrifuge Rotanta/RP Hettich Zentrifugen Tuttlingen

Zentrifuge Rotina 48R Hettich Zentrifugen Tuttlingen

Zentrifuge Sprout Heathrow Scientific LLC Illinois, USA

Material und Methoden 22 Tabelle 9: Labor- und Verbrauchsmaterialien

Labor-/Verbrauchsmaterial Hersteller Sitz des Herstellers

96-Well Mikrotiterplatte Thermo Scientific Roskilde, Dänemark

96-Well Mikrotiterplatte R&D Systems Minneapolis, USA

Abdichtfolie im Labor R&D Systems Minneapolis, USA

Biosphere Filter Tips 0,1-2,5µl Sarstedt Nümbrecht

Biosphere Filter Tips 0,5-10µl Sarstedt Nümbrecht

Biosphere Filter Tips 2-100µl Sarstedt Nümbrecht

Biosphere Filter Tips 100-1000µl Sarstedt Nümbrecht

Cellstar - 24 Well Cell Culture Plate greiner bio-one Frickenhausen

Cellstar Tubes 15ml greiner bio-one Frickenhausen

Cellstar Tubes 50ml greiner bio-one Frickenhausen

Combitips advanced 2,5ml Eppendorf Hamburg

Deckgläser 24-60mm Waldemar Knittel Glasbearbeitung Braunschweig

DNA loBind Tube 0,5ml Eppendorf Hamburg

Eppendorf Reference Pipette 0,5-10µl Eppendorf Hamburg

Eppendorf Reference Pipette 10-100µl Eppendorf Hamburg

Eppendorf Reference Pipette 100-1000µl Eppendorf Hamburg

Handschuhe Vasco Nitril Braun Melsungen

Kimtech Science 200 Labortücher Kimberly-Clark Professional Koblenz

Kryoröhrchen CRYO.S greiner bio-one Frickenhausen

LightCycler 480 Multiwell Plate 96 Roche Mannheim

LightCycler 480 Sealing Foil Roche Mannheim

LightCycler Capillaries (20µl) Roche Mannheim

Lymphoprep Axis-Shiled PoC AS Oslo, Norwegen

MembraneSlide for Lasermicrodissction Molecular Machines & Industries Eching

Microtome Blade S-35 pfm Feather Safety Razor Osaka, Japan

Nagellack Maybelline New York, USA

Objektträger Superfrost Plus Gerhard Menzel B.V. Braunschweig

Pasteurpipettten Th. Geyer Renningen

Pipettenspitzen 0,5-20µl Eppendorf Hamburg

Pipettenspitzen 200µl Sarstedt Nümbrecht

Pipettenspitzen 1000µl Sarstedt Nümbrecht

Quali-Mikrozentrifugengefäß 0,6ml Kisker Biotech Steinfurt Quali-Mikrozentrifugengefäß 1,7ml Kisker Biotech Steinfurt

Quick Dry and High Shin Top Coat Cosnova Sulzbach

RNAse AWAY Molecular BioProducts San Diego, USA

Safe-Lock Tubes 1,5ml Eppendorf Hamburg

Sekundenkleber Superglue Stanger PV Espelkamp

Serological Pipette 5ml Sarstedt Nümbrecht

Serological Pipette 10ml Sarstedt Nümbrecht

Serological Pipette 25ml Sarstedt Nümbrecht

Stericup and Steritop Filtration System Millipore Billerica, USA Tube with adhesive lid Molecular Machines & Industries Eching

x-Well Zellkulturkammern Sarstedt Nümbrecht

Zellkulturflasche Nunc EasYFlask 75cm² Thermo Scientific Roskilde, Dänemark

Material und Methoden 24 Die Keratinozyten konnten anschließend vorsichtig resuspendiert werden in definiertem Volumen:

- Medium zur weiteren Subkultivierung mit gleichmäßiger Aufteilung auf neue Zellkulturflaschen oder

- PBS zur Zellzahlbestimmung für die Stimulation oder - Einfriermedium zur Tiefkühllagerung im Stickstofftank

Foto 1: Keratinozytenkultur bei einer Konfluenz von ca. 70- 80%

Zur Zellzahlbestimmung in PBS wurde gemäß erwarteter Zellzahl in PBS eine 1:5 (mit 5ml PBS) oder 1:10 (mit 10ml PBS) Zellsuspension erstellt und 25 µl hiervon 1:2 mit Trypanblau verdünnt. Lebende Zellen mit intakter Zellmembran nehmen diesen Farbstoff nicht auf und stellen sich gelblich dar. Abgestorbene Zellen mit Zellmembrandefekten erscheinen dadurch bläulich. Mittels Neubauer-Zählkammer wurde unter dem Lichtmikroskop die Anzahl lebender Zellen aus vier Großquadraten ausgezählt und der Mittelwert pro Großquadrat ermittelt. Die Gesamtzellzahl (pro ml) ergab sich damit aus den Verdünnungen mit PBS (1:5 oder 1:10) und Typanblau (1:2) multipliziert mit dem Mittelwert der Großquadrate und mit dem Kammerfaktor der Neubauer-Zählkammer (1:10.000), der das Volumen dieser berücksichtigt. Nun wurde erneut bei 1000 U/min und 21°C drei Minuten zentrifugiert, die Zellen daraufhin in einem definierten Volumen Medium resuspendiert und in 1ml Medium je Well in 24er Well-Platten gemäß Stimulationsplan gleichmäßig ausplattiert. Danach wurden die Keratinozyten 24 Stunden inkubiert, sodass sie am Well-Platten-Boden adhärierten.

Für die Stimulation bei etwa 60-70% Konfluenz der Zellen wurden die Wells abgesaugt, mit 500µl frischem Medium befüllt und unmittelbar danach die (ersten) Stimuli hinzugegeben. Hierbei wurde zeitlich „rückwärts stimuliert“.

Dementsprechend wurde mit der Stimulation der längsten Dauer begonnen und die Ernte aller Wells einer Wellplatte fand zum selben Zeitpunkt statt. Die jeweilige Stimulation ist im Ergebnisteil unter den Graphiken in der Legende erläutert.

Material und Methoden 29 Die im LightCycler gemessene Fluoreszenz steigt proportional mit dem PCR Produkt. Der Ct-Wert (Cycle of Threshold), auch CP-Wert (Crossing Point) ergibt sich hieraus in jenem PCR-Zyklus, in dem das Fluoreszenzsignal über das

„Hintergrundrauschen“ steigt. Dieser Effekt ist Zeichen für die Amplifikation eines Produkts und ist abhängig von der DNA-Ausgangskonzentration.

In einer graphischen Darstellung der Fluoreszenz gegen die Amplifikationszyklen ergibt sich eine logistische Wachstumskurve, wobei initial höhere Konzentrationen des Ziel-DNA-Abschnittes und damit einhergehend die verstärkte Expression bestimmter Gene eine Linksverschiebung der Kurve bzw. einen niedrigeren Ct-Wert bewirken.

Im Anschluss daran folgte als dritter Schritt die Überprüfung der Spezifität des erzeugten PCR-Produkts, da der Fluoreszenzfarbstoff unspezifisch in vervielfältigte doppelsträngige DNA interkaliert. Grundlage hierfür bot die Annahme, dass spezifische DNA-Produkte vor allem abhängig von ihrer Länge und Basenzusammensetzung eine charakteristische Schmelztemperatur (melting peak) aufweisen, bei der doppel- und einzelsträngige DNA in gleichen Anteilen (50:50) vorliegen. Um eine solche Schmelzkurve zu erstellen, wurde die Temperatur kontinuierlich um 0,11°C/sek bis 97°C erhöht. Dabei denaturierte die doppelsträngige DNA und das Fluoreszenzsignal von SYBR Green nahm ab.

Im Rahmen dieser Überprüfung entsprach ein melting peak einem reinen Produkt einer charakteristischen Schmelztemperatur, wobei höhere Schmelztemperaturen meist spezifischere Vervielfältigungen bedeuteten. Abweichungen davon zeigten weitere Produkte wie Primer-Dimere oder unspezifische Amplifikate an. Graphisch wurde dies von der Software automatisch durch Auftragung der negativen ersten Ableitung des Wechsels der Fluoreszenzaktivität bei Temperaturänderung gegen die Temperatur dargestellt. In allen qRT-PCR-Durchläufen wurden Negativkontrollen mit Wasser anstelle von cDNA durchgeführt.

Zur Quantifizierung im LightCycler 480 II wurde cDNA-Template zu Mastermix im Verhältnis 1:20 aus folgenden Komponenten in je ein Well einer speziellen 96- Multiwellplatte pipettiert und anschließend einige Sekunden bei 1000 U/min zentrifugiert:

Material und Methoden 30

Tabelle 11: Mastermix-Komponenten für die PCR am Light Cycler 480 II

Der Light Cycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Mannheim) beinhaltete auch die FastStart Taq DNA Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) und entsprechende Puffer mit fester MgCl2-Konzentration.

Das Experiment-Protokoll (Tabelle 12) umfasste eine Prä-Inkubation zur Denaturierung der DNA und Aktivierung der DNA Polymerase, gefolgt von der eigentlichen Amplifikation und der Schmelzkurvenanalyse und zuletzt eine Kühlung des Gerätes.

Programm Zyklen Programmphase Ziel-

Temperatur

Dauer Temperatur- änderung 1. Prä-Inkubation

1 95°C 5min 4,40°C/sek

2. Amplifikation

45 Denaturierung 95°C 10sek 4,40°C/sek

Annealing 55°C 10sek 2,20°C/sek

Elongation 72°C 10sek 4,40°C/sek

3. Schmelzkurve

1 Denaturierung 95°C 5sek 4,40°C/sek

Annealing 65°C 60sek 2,20°C/sek

Melting 97°C 0,11°C/sek

4. Kühlung

1 40°C 30 sek 2,20°C/sek

Tabelle 12: Experiment-Protokoll der Quantitativen Real-Time PCR am Light Cycler 480 II

2.2.1.7.2 Auswertung der quantitativen Real-Time PCR über die C

- Methode

Die Expression der Zielgene wurde mit Hilfe der relativen Quantifizierung ermittelt, wobei ein nicht reguliertes und möglichst gleichmäßig exprimiertes Referenz-Gen (housekeeping gene) genutzt wurde, um verschiedene Proben miteinander vergleichen zu können. In dieser Arbeit wurde dafür die LightCycler-Software advanced relative quantification genutzt und als Referenz-Gen die Phosphoglyceratkinase 1 (PGK1) ausgewählt. Bei der sogenannten Delta-Delta-Ct- Methode (Ct-Methode, Schemazeichnung 2) war die exakte Kopienanzahl von Referenz- und Zielgen unerheblich, stattdessen wurden die Ct- bzw. CP-Werte beider voneinander subtrahiert.

Mastermix-Komponente je Probe

QuantiTect Primer 1µl

PCR geeignetes Wasser 3,5µl Light Cycler 480 SYBR Green I Master 5µl

Material und Methoden 32 Nach zweistündiger Inkubation abgedichtet mit Folie bei Raumtemperatur wurde jedes Well mit 200µl einfach konzentriertem Waschpuffer gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen. Anschließend wurde die Platte auf mit einem Labortuch bedecktem Zellstoffpapier abgeklopft, um Flüssigkeitsreste zu eliminieren. Der Waschvorgang bei diesem ELISA wurde insgesamt fünfmal durchgeführt.

Nun wurden je 50µl des biotinylierten Detektionsantikörpers hinzugefügt und eine Stunde folienabgedichtet inkubiert und erneut gewaschen. Im Anschluss wurden je 50µl Streptavidin-Peroxidase für 30min in die Wells pipettiert und dann gewaschen.

In einer enzymatischen Reaktion verfärben sich die Well-Inhalte bei Zugabe von 50µl des chromogenen Substrates Tetramethylbenzidin (TMB) proportional zur Konzentration an C3 bläulich. Die Reaktion konnte bei optimaler Farbintensität durch Zugabe von je 50µl der sauren Stoplösung angehalten werden, woraufhin ein Farbumschlag zu gelb stattfand.

Unmittelbar danach wurde in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (FLUOstar Optima, BMG Labtech, Ortenberg) computergesteuert die Absorption bei 450nm gemessen.

Mit Hilfe der Standard-Kurve in log-log-Darstellung, Subtraktion der Werte der Leerprobe und durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor 8 wurde die Probenkonzentration an C3 quantitativ ermittelt.

Material und Methoden 35 Anschließend wurden in Diagrammen die Zellgröße im Forward-Scatter auf der x- Achse und die Signale der FITC-gelabelten siRNA auf der y-Achse aufgezeichnet.

Die Daten wurden mit Hilfe der Software CellQuest Pro Software v. 5.2.1 (Becton Dickinson, Heidelberg) ausgewertet.

Um eine visuelle Beurteilung der Aufnahme der FITC-gelabelten-Kontroll-siRNA in die Keratinozyten mittels Immunfluoreszenzmikroskop zu ermöglichen, wurde parallel zu den durchflusszytometrischen Messungen der Keratinozyten aus 24- Well-Platten eine Transfektion von Keratinozyten in 8-Well-Zellkulturkammern auf Objektträgern (Sarstedt, Nümbrecht) durchgeführt. Aufgrund der halb so großen Wachstumsfläche fanden diese Versuche in 250µl Medium statt.

Das Medium der Transfektion wurde hierfür abgesaugt und im Anschluss wurden die Wells mehrmals mit PBS gewaschen. Die Zellkulturkammern wurden nun entfernt und der übrig gebliebene Objektträger wurde mittels Vectashild Mounting Medium For Fluorescence with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, USA) und Deckglas (Waldemar Knittel Glasbearbeitung, Braunschweig) eingedeckt. Zur Stabilität konnte das Deckglas am Objektträger fern von den Zellen am Rand mit Hilfe von Nagellack fixiert werden. Das 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) sorgte für eine DNA-Markierung bzw. Zellkernvisualisierung. Mit Hilfe des Mikroskop Olympus BX43, dessen Fluoreszenzlichtquelle Olympus U-HGLGPS und der Software cellSens Dimension 1.11 (alle von Olympus, Hamburg) wurden über eine Kombination des DAPI- und FITC-Kanals Immunfluoreszenzbilder aufgenommen.

Die „Downstream-Analyse“ der Versuche erfolgte, wie in den jeweiligen Kapiteln beschrieben, mittels qRT-PCR auf mRNA-Ebene (2.2.1.7.1) und mittels ELISA auf Proteinebene (2.2.1.8 und 2.2.1.9).

Material und Methoden 44

Programm Zyklen Programmphase Ziel-

Temperatur

Dauer Temperatur- änderung 1. Prä-Inkubation

1 95°C 5min 20°C/sek

2. Amplifikation

50 Denaturierung 95°C 10sek 20°C/sek

Annealing 56°C 20sek 20°C/sek

Elongation 72°C 25sek 20°C/sek

3. Schmelzkurve

1 Denaturierung 95°C 20°C/sek

Annealing 65°C 60sek 20°C/sek

Melting 95°C 0,1°C/sek

4. Kühlung

1 40°C 30 sek 20°C/sek

Tabelle 16: Experiment-Protokoll der qRT-PCR am Light Cycler 1.5

2.2.3 Statistik

Die statistische Auswertung wurde mit Hilfe der Software GraphPad Prism Version 8.0.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA) durchgeführt. Eine Normalverteilung wurde bei positiver Übereinstimmung des Anderson-Darling Tests, des D’Agostino- Pearson Tests, des Shapiro-Wilk Tests und des Kolmogorov-Smirnov Tests angenommen und hier der gepaarte t-Test und bei mehr als zwei gepaarten Stichproben der one-way ANOVA-Test durchgeführt, sowie graphisch der Mittelwert (mean) dargestellt. Nicht normalverteilte gepaarte Daten wurden mit Hilfe des Wilcoxon matched-pairs signed rank Test bzw. bei mehr als zwei gepaarten Stichproben per Friedmann-Test mit Dunn’s multiple comparison Test analysiert, sowie graphisch der mittlere Wert (median) dargestellt.

In diesem Programm wurden Datensätze bei einem p-Wert<0,05 als statistisch signifikant betrachtet (p<0,05 wurde mit einem „*“ ; p<0,01 mit „**“ ; p-Wert<0,001 mit „***“ und p<0,0001 mit „****“ gekennzeichnet). Zudem wurden teilweise auch p- Werte >0,05 zur Kennzeichnung statistischer Tendenzen angegeben.

Die statistische Auswertung der jeweiligen Abbildung des Ergebnisteils ist in der Legende ersichtlich.