Hypothermer Kreislaufstillstand: Stellenwert der selektiven antegraden Hirnperfusion im Akutmodell des Schweins

des Zentrums Chirurgie

der Medizinischen Hochschule Hannover

Hypothermer Kreislaufstillstand: Stellenwert der selektiven antegraden Hirnperfusion im Akutmodell des Schweins

Dissertation

zur Erlangung eines Doktorgrades der Medizin in der

Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von Sven Peterß

aus

Hannover/Niedersachsen

Hannover 2007

Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: PD Dr. med. Christian Hagl

Referent: PD Dr. med. Konstantinos Raymondos

Koreferent: Prof.’in Dr. med. Karin Weißenborn

Tag der mündlichen Prüfung: 12.03.2008

Promotionsausschussmitglieder: Prof. Dr. med. Tobias Welte

Prof. Dr. med. Carlos Guzman

PD Dr. med. Frank Gossé

Meiner Familie gewidmet.

Hypothermer Kreislaufstillstand: Stellenwert der selektiven antegraden Hirnperfusion im Akutmodell des Schweins

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1. Klinischer Hintergrund 1 1.1.1. Neurologische Komplikationen durch unzureichende Protektion 2 1.1.2. Zerebrale Physiologie und Pathophysiologie der Ischämie 3 1.1.3. Formen des Zelltods 8 1.1.4. Selektive Vulnerabilität und Lokalisation von Ischämieschäden 9 1.2. Experimenteller Hintergrund 10 1.2.1. Veränderte Expression von Genen und deren Nutzen als Ischämiemarker 10 1.2.1.1. „Immediate early genes“ 11 1.2.1.2. Hitzeschock-Proteine 12 1.2.1.3. Cyclooxygenase-2 14 1.3. Zerebrale Protektionsverfahren 16 1.3.1. Hypothermer Kreislaufstillstand 16 1.3.2. Retrograde zerebrale Perfusion 18 1.3.3. Selektive antegrade zerebrale Perfusion 19 1.3.4. Medikamentöse Ansätze 21 1.3.5. Neuromonitoring 22 1.4. Aufgabenstellung und Zielsetzung 23

2. Material und Methoden 24

2.1. Modelletablierung 24 2.2. Studienkonzept 26 2.3. Versuchstiere 26

2.4. Anästhesie 27

2.5. Präoperative Vorbereitungen 28

2.6. Operation 29

2.6.1. Leistensitus 29

2.6.2. Schädelsitus 30

2.6.3. Thoraxsitus 32

2.7. Extrakorporale Zirkulation 35

2.7.1. Gruppe 1: isolierter hypothermer Kreislaufstillstand (HCA) 37 2.7.2. Gruppe 2: hypothermer Kreislaufstillstand mit selektiver antegrader zerebraler Perfusion (SACP) 37 2.7.3. Kontrollgruppe 38

2.7.4. Reperfusionsphase und Nachbeobachtung 38

2.8. Neurophysiologie 39

2.8.1. Elektroenzephalogramm 39

2.8.2. Somatosensorisch evozierte Potentiale 40

2.9. Studienprotokoll 41

2.10. Tötung und Probenentnahme 41

2.10.1. Perfusion 41

2.10.2. Probenentnahme 41

2.10.3. Probenasservierung 42

2.11. Nass- und Trockengewicht 42

2.12. Histologie 43

2.12.1. Paraffinschnitte 43

2.12.2. Hämatoxylin-Eosin-Färbung 44

2.12.3. Auswertung 44

2.13. Molekulargenetische Analyse 45

2.13.1. Primerdesign 45

2.13.2. Polymerasekettenreaktion 46

2.13.3. Auswertung 49

2.14. Statistik 50

3. Ergebnisse 51

3.1. Allgemeine Versuchsdaten 51 3.2. Allgemeine hämodynamische und metabolische Parameter 52 3.3. Hämodynamische und metabolische Parameter des Gehirns 61 3.4. Intrakranieller Druck 63 3.5. Elektrophysiologische Parameter 64 3.6. Nass- und Trockengewichte 65 3.7. Histologische Analyse 65 3.8. Molekulargenetische Analyse 68

4. Diskussion 69

4.1. Methodik und Modelletablierung 69 4.1.1. Modelletablierung 69 4.1.2. Extrakorporale Zirkulation und „Capillary-Leak-Syndrom” 72 4.1.3. Hämodynamische und metabolische Daten 74 4.1.4. Neurophysiologische Daten 75 4.1.5. Neurohistologische und molekulargenetische Daten 77 4.1.5.1. Histologie in Hämatoxylin-Eosin-Färbung 77 4.1.5.2. Polymerasekettenreaktion und Ischämiemarker im zerebralen

Parenchym 78

4.2. Allgemeine Diskussion 81

5. Zusammenfassung 87

6. Literaturverzeichnis 89

7. Abkürzungsverzeichnis 104

8. Materialliste 108

8.1. Medikamente 108

8.2. Chemikalien 109

8.3. Kits 109

8.4. Geräte 110

9. Veröffentlichungen 111

9.1 Originalarbeiten 111

9.1.1. Eur J Cardiothorac Surg 26 (1), 73-80 (2004) 112

9.1.2. Eur J Cardiothorac Surg 30 (3), 492-498 (2006) 120

9.2. Weitere Publikationen 127

10. Danksagungen 130

11. Lebenslauf 131

12. Erklärung 135

1. Einleitung

1.1. Klinischer Hintergrund

Der erste erfolgreich durchgeführte Ersatz eines Aortenbogens wurde 1957 in Houston (Texas) durchgeführt [1]. DeBakey und seinen Mitarbeitern gelang es damals, unter

Verwendung einer Herz-Lungenmaschine ein fusiformes Aneurysma durch eine Homograft- Prothese zu ersetzen. Die Blutversorgung des Gehirnes während dieses Eingriffes wurde durch Kanülen in den beiden Halsschlagadern sichergestellt. Frühere sowie spätere Versuche mit dieser Technik, z.T. kombiniert mit einer Oberflächenkühlung, scheiterten zumeist an letalen zerebralen Komplikationen [2-4].

Trotz intensiver Forschungen und Modifikation der zerebralen Perfusion seit jener Zeit ist die Morbidität und Mortalität bei Operation an der thorakalen Aorta im Bereich des Aorten- bogens wie auch bei Operationen von kongenitalen Herzvitien immer noch signifikant hoch [5,6]. Fortschritte auf dem Gebiet der extrakorporalen Zirkulation [7] und beim

intraoperativen Management der Anästhesie [8] führten zwar zu einer Verbesserung, konnten jedoch die Probleme nur ansatzweise lösen.

Eine der Hauptursachen für die weiterhin beunruhigend hohe Morbidität und Mortalität bleibt die ischämische Schädigung des zentralen Nervensystems [6,9]. Dieser Umstand erklärt sich zum Teil aus der Notwendigkeit eines temporären Kreislaufstillstands. Dieser erlaubt eine Operation in einem von Kanülen freien und blutleeren Arbeitsfeld. Die Inzidenz der

entstandenen neurologischen Komplikationen wird in der Literatur trotz geeigneter moderner Protektionsverfahren immer noch mit der weiten Spanne zwischen 5% und 70% angegeben [9,10]. Dies hängt im Wesentlichen von der Sensitivität verwendeter neurologischer

Testungen ab.

Die Toleranz des Gehirns, selbst gegen kurzzeitige Unterbrechungen der zerebralen Blutperfusion, ist extrem niedrig. Aus diesem Grund wurden, neben der Verbesserung der operativen Technik [11,12], im Laufe der Jahre verschiedene Protektionsverfahren zur Minimierung von neurologischen Komplikationen entwickelt [13].

Die Grundlage der zerebralen Protektion bildet die Hypothermie. Der hypotherme Kreislauf- stillstand, kurz HCA (engl.: „hypothermic circulatory arrest“), reduziert den Metabolismus

und folglich auch den Sauerstoffverbrauch des Gehirns. Die „ideale“ Temperatur zur Protektion der Neurone ist dabei derzeit noch Gegenstand der aktuellen Forschung.

Ergänzend zum alleinigen hypothermen Kreislaufstillstand wurde gerade in den letzten Jahren die selektive antegrade zerebrale Perfusion, kurz SACP (engl.: „selective antegrade cerebral perfusion“), etabliert. Diese Methode liefert, nach bisherigen klinischen Erfahrungen, die besten postoperativen Ergebnisse [14,15]. Eine anfänglich ebenfalls als Erfolg versprechend angesehene retrograde zerebrale Perfusion über die Vena cava superior wird mittlerweile auf der Basis von klinischen und experimentellen Daten eher kritisch gesehen [10,16].

Neurologische Komplikationen während und nach Operationen an der Aorta beeinflussen letztendlich nicht nur die Dauer des Krankenhausaufenthalts der Patienten [15], sondern ziehen auch weit reichende sozioökonomische Folgen nach sich. Durch die Analyse der pathophysiologischen Mechanismen könnten die etablierten Protektionsverfahren optimiert werden und somit zu einer Verbesserung der Patientenversorgung beitragen.

1.1.1. Neurologische Komplikationen durch unzureichende Protektion

Basierend auf klinischen und experimentellen Untersuchungen unterscheidet man grund- sätzlich zwei Arten von neurologischen Komplikationen nach hypothermen Kreislauf-

stillstand: zum einen die so genannten temporären neurologischen Dysfunktionen (TND) und zum anderen den manifesten Schlaganfall (PND = permanentes neurologisches Defizit) [17].

Die temporäre neurologische Dysfunktion wird als ein Ausdruck globaler unzureichender Neuroprotektion während des temporären Kreislaufstillstands angesehen. Dabei handelt es sich um einen reversiblen Symptomenkomplex, der je nach Ausprägung durch folgende Symptome charakterisiert wird: verlangsamtes Erwachen des Patienten mit verlängerter Beatmungspflichtigkeit, postoperative Verwirrung, Agitiertheit und Delirien. Außerdem wurden Parkinson-ähnliche Symptome beschrieben. Im Gegensatz zum Schlaganfall korrelieren Symptomatik und bildgebende Verfahren nicht miteinander. Als Risikofaktoren dieser neurologischen Ausfallserscheinungen sind prolongierte Kreislaufstillstandszeiten und das hohe Alter der Patienten anzusehen [15,17]. Lange Zeit galt der Symptomkomplex der temporären neurologischen Dysfunktion als harmlos und reversibel und wurde deswegen in der Forschung vernachlässigt. Klinische Studien jedoch haben unter Verwendung sensitiver neuropsychologischer und motorischer Tests gezeigt, dass auch noch nach 3 bis 6 Monaten

eine kognitive Leistungsminderung oder eine Störung der Feinmotorik nachgewiesen werden kann, die mit dem Auftreten einer temporären neurologischen Dysfunktion einhergehen [18,19].

Die weitere Form der neurologischen Komplikation ist der manifeste Schlaganfall. Dieser wird primär durch Embolisation ins arterielle System ausgelöst. Eine Infarkthäufung wird dabei v.a. bei Patienten mit intravaskulären Plaques und Atheromen sowie ab einem Alter über 60 Jahre mit den entsprechenden Kalzifikationen der Gefäße beobachtet [15,17]. Die Symptomatik des embolisch bedingten Apoplex variiert je nach Lokalisation und Größe des Infarktgebietes und ist von Patient zu Patient unterschiedlich. Eine generelle Aussage über die Langzeitprognose ist ebenfalls nur bedingt zu treffen und unterliegt starken Schwankungen.

Radiologisch lässt sich der manifeste Schlaganfall in der Regel, anders als die TND, sowohl im MRT nach 12 bis 18 Stunden als auch im CT 24 bis 48 Stunden nach dem Ereignis darstellen.

Beiden Neurologien gemeinsam ist, dass trotz unterschiedlicher Pathogenese ein Zusammen- hang zwischen der Inzidenz ihres Auftretens und der Dauer des Kreislaufstillstands nach- gewiesen werden konnte [15,20].

1.1.2. Zerebrale Physiologie und Pathophysiologie der Ischämie

Obwohl das Gehirn nur rund 2% der Körpermasse ausmacht, nimmt es allein rund 15% des gesamten Energiebedarfs des Körpers für sich in Anspruch [21]. Gedeckt wird dieser Energiebedarf unter physiologischen Vorraussetzungen hauptsächlich durch die aerobe Glykolyse, bei der pro Mol Glukose 38 Mol Adenosintriphosphat (ATP) entstehen. Zur Aufrechterhaltung des zerebralen Metabolismus ist ein regulierter Blutfluss notwendig. Das Gehirn eines Erwachsenen benötigt dazu rund 750 ml Blut pro Minute, das entspricht ungefähr 15% der Auswurffraktion des Herzens. Schon eine kurze Unterbrechung des zerebralen Blutzuflusses führt unter normothermen Bedingungen in der Regel zu schweren und meist irreversiblen Hirnschädigungen [22]. In dieser Phase stehen dem Gehirn nur einige limitierte Energiereserven in Form von Phosphokreatin-, Adenosintriphosphat- und

Adenosindiphosphat-Speichern zur Verfügung [23] sowie 2 Mol Adenosintriphosphat pro Mol Glukose aus der anaeroben Glykolyse [24]. Erschwerend kommt hinzu, dass das

zerebrale Parenchym, trotz einer wesentlich höheren metabolischen Umsatzrate im Vergleich

zu anderen Gewebezellen des Körpers, über einen nur verhältnismäßig kleinen Glykogenspeicher verfügt.

Das Gehirn toleriert eine Reduktion des Blutflusses auf ungefähr 40% des Ausgangsflusses.

Eine weitere Reduktion des Flusses würde zu einem Verbrauch der Energiereserven führen und biochemische Prozesse in Gang setzten, die unweigerlich zum Zelltod führen können.

Die Pathogenese des ischämisch-bedingten Zelltods kann dabei in drei Phasen unterteilt werden:

1. Phase: „Depolarisation“

Das Fehlen von Sauerstoff für die aerobe Glykolyse führt zu einem Verbrauch der ATP- Reserven und folglich zu einer Anhäufung von Adenosinmonophosphat (AMP) und Adenosin, beides potente Vasodilatatoren, im interzellulären Raum. Bedingt durch die Vasodilatation wird vermehrt Glukose dem anaeroben Metabolismus des Gehirns zugeführt.

Theoretisch scheint dies von Vorteil zu sein, die so entstehende Hyperglykämie jedoch steht selbst auch in Verdacht, den ischämisch-bedingten Hirnschaden zu verstärken.

Die produzierte Energie stammt nun zum großen Teil, wie anfänglich schon beschrieben, aus der anaeroben Glykolyse und produziert letztendlich aus einem Mol Glukose nur 2 Mol ATP und Laktat. Da jedoch weder das Gehirn in der Lage ist, Laktat und andere Abbauprodukte der anaerob-bedingten Vorgänge zu verarbeiten noch ein adäquater Blutfluss vorherrscht, der die entstandenen Metabolite abtransportieren könnte, kommt es folglich zu einem Abfall des intrazellulären pH-Wertes. Das saure Milieu stimuliert die Ausschüttung von exzitatorischen Neurotransmittern, hauptsächlich Glutamat und Aspartat, in den interneuronalen Raum.

Physiologischerweise würde das Glutamat im interzellulären Raum unter Verbrauch von ATP in Glutamin umgewandelt und anschließend wieder in das präsynaptische Neuron auf-

genommen werden, um erneut als Transmitter zur Verfügung zu stehen. Aufgrund des ATP- Mangels bleibt die für die präsynaptische Wiederaufnahme notwendige Umwandlung in Glutamin jedoch aus und die Neurotransmitter sammeln sich in ihrer ursprünglichen Form im Interzellularraum an [25].

Durch den ATP-Mangel bedingt wird zudem die Funktion der Na⁺/K⁺-Pumpe der Zell- membran beeinträchtigt und folglich kann der Ionen-Gradient von Na⁺, K⁺ und Ca²⁺ nicht mehr aufrechterhalten werden [26]. Es kommt zu einem Einstrom von Natrium- und Chlorid- Ionen in die Zelle, durch den osmotischen Druck gefolgt von Wasser und zu einem Ausstrom

von zellulärem Kalium [27]. Die so verursachte „Depolarisation“ der Zelle bewirkt ebenfalls eine gesteigerte Ausschüttung von Glutamat [28].

Da die beschriebenen Abläufe in dieser Phase noch potentiell reversibel sind, ermöglichen sie damit eine eventuelle Beeinflussung des Ischämieschadens. Nicht zuletzt deshalb ist

besonders diese Phase in das Interesse der Forschung gerückt.

2. Phase: „Biochemische Kaskade“

Der totale Zusammenbruch der Transportsysteme für die Neurotransmitter und die Ansammlung dieser im interzellulären Raum sowie die Depolarisation der Zelle sind der Beginn eines fatalen Kreislaufs.

Eine Akkumulation von Glutamat im Interzellularraum führt zur neuronalen Schädigung und zum Zelltod [29,30]. Glutamat bewirkt dabei über postsynaptische Glutamatrezeptoren, hauptsächlich dabei über N-methyl-d-aspartat-Rezeptoren (NMDA), einen massiven

Kalzium-Einstrom in die Zelle [31]. Die erhöhte Kalziumkonzentration im Zytosol der Zelle führt zur Aktivierung kalziumabhängiger intrazellulärer Enzyme, v.a. Proteasen und Lipasen wie z.B. der Phospholipase A2 (PLA2) und der Proteinkinase C (PKC). Dies hat einen

vermehrten Abbau von Membranphospholipiden, Proteinen und Desoxyribonukleinsäuren zur Folge und führt somit über Abbau der Zellmembranen und –organellen sowie Fragmentation der DNA unweigerlich zum Untergang der Zelle [32]. Diese Wirkungsweise und

Neurotoxizität des Glutamats bezeichnet man auch als „Exzitotoxizität“ [33].

Neben dem Einfluss des Glutamats auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration hat auch die eigentliche Depolarisation eine entscheidende Rolle beim Untergang der Zelle. Auf der einen Seite führt ein osmotisch-bedingter Wassereinstrom in die Zelle zu einem Zellödem [26,34], auf der anderen Seite kommt es durch Öffnung spannungs-abhängiger Kalzium-Kanäle zum vermehrten Einstrom von Kalzium mit den beschrieben Effekten auf die Zelle wie bei dem Glutamat-bedingten Kalzium-Einstrom [35]. Darüber hinaus führt eine erhöhte Kalzium- Konzentration in den Mitochondrien der Zelle über einen vermehrten Anfall an freien Fettsäuren zu einer mitochondrialen Dysfunktion und Schädigung des oxidativen Stoff- wechsels. Dies hat eine Entkopplung der oxidativen Phosphorilierung der Atmungskette und Störung des ATP/ADP-Transportes zur Folge.

Pharmakologische Forschungen konzentrieren sich in dieser Phase auf den Einsatz von Neurotransmitter-Antagonisten (z.B. MK801), Neurotransmitter-Rezeptor-Blockern und Kalziumkanal-Blockern und versuchen dadurch den Zelltod zu verhindern [29,36].

Ischämie ^{ATP ↓ Glutamat ↑} NMDA-Rezeptor

Störung der Na⁺/K⁺-Pumpe

spannungs-abhängige Ca²⁺-Kanäle Na^+, Cl^- K⁺

Depolarisation

Aktivierung von Proteasen, Lipasen, etc.

Zelltod

intrazellulärer Ca²⁺-Einstrom

Zelle

Stickstoffmonoxid-Synthase

L-Arginin + O2 L-Citrullin + NO IL-1β, IFN-γ, Granulozyten, etc.

Abb. 1: Vereinfachte Darstellung der ischämisch-bedingten pathophysiologischen Prozesse der „Depolarisation“

und der „biochemischen Kaskade“.

Abbildung modifiziert nach Baumgartner, Journal of Neurosurgical Anesthesiology 2004 und Perlman, Clinical Therapeutics 2006 [37,38]

3. Phase: „Reperfusionsschaden“

Diese letzte Phase der Ischämie-bedingten neurologischen Schädigung wird im Allgemeinen als die wichtigste angesehen.

Die Reperfusion führt in der Regel nicht nur zu einer Reoxygenierung des ischämischen Gewebes, sondern zieht auch die Bildung von freien Radikalen und das Einschwemmen von inflammatorischen Zellen nach sich, die einen Reperfusionsschadens auslösen [39].

Verantwortlich dafür ist vermutlich eine Interaktion zwischen den Endothelzellen der Blutgefäße und verschiedenen Komponenten des Blutes [40]. Unter physiologischen Bedingungen bildet das Gefäßendothel zytoprotektive Substanzen, wie z.B. Prostaglandin I2

und Stickstoffmonoxid (NO = endothelium-derived relaxing factor = EDRF), deren

Wirkungsweise in einer Vasodilatation und dem Verhindern von Thrombozytenaggregation besteht sowie einen anti-adhäsiven Effekt aufweisen [41]. Die Reperfusion nach Ischämie

jedoch induziert am Endothel eine Produktion von adhäsionsfördernden Molekülen und anderen chemotaktischen Faktoren, beides zytotoxische Mediatoren [42]. Insbesondere kommt es dabei zu einer gesteigerten Produktion und Ausschüttung von Komplementfaktoren (C3a, C5a), vom Plättchenaktivierenden Faktor (PAF), von Interleukinen (speziell IL-8) und von dem so genannten „granulocyte-makrophage colony-stimulating factor“, kurz GM-CSF.

Daraus folgt eine Steigerung der Thrombozytenaggregation, eine Aktivierung und

Chemotaxis von Leukozyten - hierbei insbesonders von neutrophilen, polymorphkernigen Granulozyten - sowie zur Zunahme der Gefäßpermeabilität, wodurch eine Abwanderung ins zerebrale Parenchym begünstigt wird [43,44]. Über die Freisetzung von proteolytischen Enzymen, Zytokinen und anderen inflammatorischen Mediatoren aus den Leukozyten kommt es dann zu parenchymalen Schädigungen und einer Störung in der Permeabilität der Blut- Hirn-Schranke. Dies fördert die Entstehung eines Hirnödems, getriggert nicht zuletzt durch entstandene freie Sauerstoffradikale [45]. Der erhöhte intrakranielle Druck führt letztendlich, einen ausbleibenden Blutdruckanstieg vorausgesetzt, zu einer Reduktion der zerebralen Perfusion (zerebraler Perfusionsdruck = mittlerer arterieller Druck – intrakranieller Druck [CPP = MAD - ICP]).

Kontrovers diskutiert wird zurzeit noch der Stellenwert des Stickstoffmonoxids bei der Entstehung des Reperfusionsschadens. Studien haben gezeigt, dass, neben dem oben erwähnten zytoprotektiven Eigenschaften des Stickstoffmonoxids (NO), neuronal

produziertes Stickstoffmonoxid (NO) über verschiedene Mediatoren vermutlich auch einen neurotoxischen Effekt hat [46]. Stickstoffmonoxid (NO) entsteht aus der Reaktion von L- Arginin und Sauerstoff zu L-Citrullin, katalysiert durch die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS). Unter ischämischen Perfusionsbedingungen kommt es zu einer gesteigerten Expression verschiedener Isoformen der NOS, v.a. auch über die NMDA-Rezeptoren

vermittelt (siehe Abb. 1). NO führt dabei zur Störung der mitochondrialen Energieproduktion, Störung der Glykolyse und Reduktion des antioxidativen Moleküls Glutathion sowie durch seinen Radikalcharakter zu DNA-Strangbrüchen [47]. Eine Inhibition der Stickstoffmonoxid- Synthase (NO-Synthase) führte bei Hunden nach hypothermen Kreislaufstillstand zu einer besseren neurologischen Funktion [48]. Die protektiven Eigenschaften des NO dagegen resultieren vermutlich aus einer über die extrazelluläre Redoxbindungsstelle vermittelte reduzierte Aktivität des NMDA-Glutamatrezeptors.

1.1.3. Formen des Zelltods

Der Untergang der Zelle kann grundsätzlich in verschiedenen Formen ablaufen: auf der einen Seite als Apoptose oder andererseits als Nekrose.

Unter Apoptose versteht man den so genannten programmierten Zelltod, d.h. der Untergang der Zelle wird durch genetische Informationen der Zelle selbst gesteuert [49]. Jede Zelle enthält ein entsprechendes genetisches Programm zur Zerstörung, welches gestartet wird, wenn das herrschende Gleichgewicht zwischen pro- und antiapoptotischen Faktoren gestört ist [50,51]. Nicht nur unter pathologischen Bedingungen spielt die Apoptose eine wichtige Rolle, diese ist auch am physiologischen Gleichgewicht von Zellvermehrung und Zellverlust, besonders während der Embryogenese, beteiligt [52]. Am Ablauf der Apoptose sind dabei besonders Caspasen beteiligt, v.a. Caspase 8 und 3, die zum einen extrinsisch über eine klassische Entzündungsreaktion (Fas und TNFα), zum anderen intrinsisch über das mitochondriale Cytochrom C aktiviert werden [53].

Im Gegensatz dazu ist die Nekrose eher als eine Folge der Denaturierung von Proteinen und der enzymatischen Auflösung von Zell- und Gewebskomponenten zu verstehen, eine

Programmierung oder Steuerung durch genetische Informationen wie bei der Apoptose lässt sich nicht erkennen. Die Zelle selbst nimmt also nicht „aktiv“ an der Zerstörung teil.

Die histologischen Erscheinungsformen der Apoptose und der Nekrose sind entsprechend unterschiedlich. Während bei der Apoptose eher eine Zellschrumpfung mit Pyknose und Kondensation des Zellkerns sowie segmentiertem Kernchromatin zu beobachten ist, fällt die Nekrose durch eine Zellschwellung mit Karyolyse oder Karyorrhexis des Zellkerns sowie einer Zusammenballung des Kernchromatins auf. Die Apoptose betrifft meist einzelne Zellen, die Nekrose eher ganze Zellverbände [54].

Tierexperimentelle Studien zeigten, dass vermutlich sowohl der apoptotische als auch der nekrotische Zelltod an der neuronalen Schädigung beteiligt sind [33,55,56]. So fand man drei verschiedene Arten des Zelltods in einem Modell mit hypothermen Kreislaufstillstand: neben eindeutig apoptotischen Zellen zeigten sich zusätzlich zwei weitere Formen des Zelltods. Eine Form ähnelte stark dem nekrotischen Zelluntergang, die andere war eher eine Mischform aus beidem [57,58]. Die Schwere der Ischämie scheint zudem einen Einfluss auf das Verhältnis von Apoptose zu Nekrose zu haben, wobei das Überwiegen der Apoptose eher für eine mildere Schädigung zu stehen scheint.

1.1.4. Selektive Vulnerabilität und Lokalisation von Ischämieschäden

Damit Folgen wie Apoptose und Nekrose vermieden werden können, muss eine ausreichende Blutzufuhr zum Gehirn gewährleistet werden. Verantwortlich für die Regulation der

Blutversorgung unter physiologischen Bedingungen ist die Autoregulation, gesteuert anhand metabolischer Parameter [59]. Die Autoregulation hält dabei den Perfusionsdruck bei

mittleren arteriellen Druckschwankungen von 50 bis knapp 130 mmHg konstant.

Innerhalb des zerebralen Parenchyms unterscheiden sich verschiedene Regionen in ihrem Energieverbrauch und damit auch in ihrer Metabolismusrate. Die graue Substanz verbraucht mehr als das Mark, der Cortex benötigt mehr Energie als z.B. die Basalganglien und

selbstverständlich verbrauchen aktive Neurone mehr als weniger aktive. Dem folgend ändert sich der Blutfluss intraparenchymatös: steigt die Aktivität der Neurone in einem bestimmten Areal des Gehirns, und damit lokal deren Energieverbrauch und Metabolismusrate, bzw.

herrscht ein erhöhter Grundbedarf in einer definierten Region, so erhöht sich parallel dazu auch der Blutfluss in diesem Bereich.

Aus diesem Grund sind einige Areale des Gehirns anfälliger für Hypoxie und Ischämie als andere. Die frühsten Manifestationen einer solchen Schädigung findet man also in den Regionen mit einer hohen Metabolismusrate bzw. in jenen Regionen, in denen der Metabolismus durch Protektionsverfahren nicht adäquat minimiert werden kann. In experimentellen Studien wurden die ersten histopathologischen Zeichen einer neuronalen Schädigung im Hippocampus entdeckt [60]. Es ist allgemein bekannt, dass dieses Hirnareal für die Verarbeitung neu gewonnener Informationen verantwortlich ist und deshalb, durch die hohe Metabolismusrate, anfällig auf Ischämie reagiert [61]. Passend dazu wurde klinisch ein Defizit des Erinnerungsvermögens als erstes Anzeichen einer zerebralen Minderperfusion beobachtet [19]. Unterschiede in der Vulnerabilität sind jedoch nicht nur auf makroskopischer Ebene zu beobachten, sondern auch zwischen den einzelnen Zelltypen im zentralen

Nervensystem. Am empfindlichsten auf Ischämie reagieren die Neurone, dagegen zeigen sich Gliazellen, wie z.B. Oligodendroglia und Astroglia, und Endothelzellen weniger anfällig gegenüber Sauerstoffmangel [62].

1.2. Experimenteller Hintergrund

1.2.1. Veränderte Expression von Genen und deren Nutzen als Ischämiemarker

Zerebrale Ischämie aktiviert im Parenchym eine Vielzahl von verschiedenen molekular- genetischen Prozessen. In der Folge kommt es zu einer gesteigerten bzw. de novo Expression von Genen, deren Produkte in ihrer Funktion und dem Zeitpunkt und Ort ihres Auftretens sehr unterschiedlich sind.

Beispielhaft sind hier in der Grafik ausgesuchte Marker dargestellt (vgl. Abbildung 2).

1 2 3 4

Tage nach fokaler Ischämie Entzündung

Apoptose

Adhäsion Zytokine

Hitzeschock- Proteine

„immediate early genes“

COX-2, p53, DNA- Fragmentierung

TNF-α, IL-1β, IL-6, ICAM-1

HSP70, HSP72

c-fos, c-jun, zif-268

Abb. 2: Die Abbildung zeigt den zeitlichen Verlauf ausgewählter Gene nach fokaler zerebraler Ischämie.

Abbildung modifiziert nach Iadecola und Ross, Annals New York Academy of Science 1997 [63]

Initial kann bereits nach ca. 30 Minuten eine Expression von „immediate-early“-Genen beobachtet werden, anfangs nur lokal im Ischämieareal, später auch in peripheren Bereichen.

Hitzeschock-Proteine (engl.: „heat-shock proteins“), deren Maximum nach ungefähr einer Stunde erreicht ist, treten dagegen vor allem in Regionen mit einer Reduktion des Blutflusses auf unter 50% des Normalzustands auf [64]. Weiterhin kommt es zur Expression von Genen, die verantwortlich sind für die Codierung von inflammatorischen Zytokinen und Adhäsions- molekülen, wie z.B. TNFα, Interleukine oder ICAM-1 [65,66]. Unter anderem durch Zytokine induziert wird letztlich eine vierte Expressionswelle ausgelöst, die neben Genprodukten des programmierten Zelltods auch die Transkription der Cyclooxygenasen steigert.

1.2.1.1. „Immediate-early genes“

Die pathophysiologischen Vorgänge der zerebralen Ischämie münden meist, wie unter 1.1.2.

detailliert beschrieben, über die exzessive Ausschüttung von Glutamat in einen intrazellulären Anstieg von Kalzium und anderen sekundären Botenstoffen wie Calmodulin und cAMP- abhängigen Reaktionen [67]. Dies führt über kaskadenartige Prozesse schon nach Minuten zu einer gesteigerten Expression von so genannten „immediate-early genes“, kurz IEGs [68].

Man unterscheidet verschiedene Familien der IEGs: bekannt sind zurzeit die Familien der fos, jun und „zinc finger“ Gene. Eines der am frühsten expremierten IEGs ist das c-fos aus der fos-Familie. c-fos kann bereits rund 30 Minuten nach Ischämie nachgewiesen werden [69].

Die Mitglieder der fos-Familie regulieren, gebunden an Mitglieder der jun-Familie, über das Aktivator Protein 1 (AP1) bestimmter Promotorregionen die Transkription von „late response genes“, die wiederum eigene Effekte an der Zelle bewirken (vgl. Abbildung 3) [67,70].

Glutamat ↑ intrazellulärer Ca²⁺-Einstrom sekundäre Botenstoffe

fos-Protein

jun-Protein

AP1 Prom

late response gene↑

genomische DNA

Abb. 3: Vereinfachte Darstellung der Induktion und Wirkungsweise der „immediate-early genes“. Die „late response“-Gene sind in diesem Fall die Effektor-Proteine an der Zelle.

Typische Beispiele für durch c-fos regulierte Expressionen sind Preproenkephalin, „nerve growth factor“, Dynorphin, vasoaktive intestinale Polypeptide, Tyrosinhydroxylase und andere Genprodukte mit einer AP1-Seite in ihrem Promotor [67,71]. Neben der für

gewöhnlich ablaufenden Expressionssteigerung der IEGs via Transmitterinduktion wurden zudem noch weitere verschiedenartige Ursachen beschrieben.

Die Funktion der IEGs, speziell die Funktion von c-fos, ist momentan noch unklar. Auf der einen Seite sind c-fos induzierte „late response genes“ mit Apoptose assoziiert, auf der anderen Seite sichern andere c-fos-induzierte „late response genes“ das Überleben von gestressten Zellen [72]. Zusammenfassend kann c-fos als Indikator für Stress, Hypoxie und Ischämie von Neuronen angesehen werden [67], da eine Expression in Verbindung mit

genannten Ereignissen mehrfach aufgezeigt werden konnte [69,73], und zwar unabhängig von den Folgen einer gesteigerten Transkription.

1.2.1.2. Hitzeschock-Proteine

Eine weitere Klasse von Genen, die relativ früh nach Ischämie expremiert werden, sind die Hitzeschock-Proteine (engl.: „heat-shock proteins“, kurz HSPs). Im Gegensatz zu den IEGs erfolgt die Transkription der Hitzeschock-Proteine nicht unter physiologischen Bedingungen, sondern ist einzig eine Reaktion auf verschiedene Stressoren. Der initial erforschte Stressor und Namensgeber dieser 1974 erstmals beschriebenen Proteine war die Hyperthermie [74].

Mittlerweile ist jedoch eine Vielzahl an Stressoren bekannt, zu denen u.a. Dysbalancen des metabolischen Status, pharmakologischen Interventionen und auch und besonders die Ischämie gehört [75,76].

Nach heutigem Stand der Forschung sind drei große Familien von Hitzeschock-Proteinen bekannt, deren Einteilung sich aus ihrem Molekulargewicht ergibt. Die bekannteste Familie ist die Gruppe der Hitzeschock-Proteine mit einem mittleren Molekulargewicht um die 70 kDa. Zu dieser Familie gehört das durch ischämie-induzierte Hitzeschock-Protein 72, kurz HSP72. Die Nomenklatur innerhalb dieser Familie ist jedoch nicht einheitlich, so wird das HSP72 von einigen Autoren auch als induzierbare Form des HSP70 („inducible“ HSP70, HSP70i) im Gegensatz zum „constitutive“ bzw. „cognate“ HSP70 bezeichnet [77].

Die Expression von HSP wird über so genannte „heat-shock factors“ (HSF) reguliert, deren Aktivierung durch denaturierte Proteine erfolgt (vgl. Abbildung 4). Die HSP erzielen ihre Wirkung, indem sie als Chaperone fungieren und so die Konfiguration sowohl von normalen als auch von denaturierten Proteinen stabilisieren [78]. Die Induktion ihrer Transkription ist

dabei abhängig von der Dauer der Ischämie und findet anfangs erst in den Neuronen statt, dabei v.a. in den ischämie-sensitiven, später dann auch in Glia- und Endothelzellen.

Lange Zeit wurde über die Funktion der HSPs diskutiert. Anfängliche Vermutungen der Beteiligung der HSPs an dem stress-induzierten Zelltod erwiesen sich als nicht richtig.

Stattdessen können sie sowohl den apoptotischen als auch den nekrotischen Zelltod inhibieren und sind in ihrer Funktion eher als protektiv-wirksame Proteine zu verstehen [79,80].

Eine gesteigerte Transkription von HSPs, speziell von HSP72, konnte mehrfach in

Korrelation mit neuronalen Schädigungen gebracht werden [81,82], was ihnen eine Rolle als ein geeigneter Marker für generellen ischämisch-bedingten Stress und entstandene zerebrale Schäden einräumt [82]. Als direkter Nachweis der einzelnen ischämisch-geschädigten Zelle, wie zwischenzeitlich vermutet, können die HSPs jedoch nicht verstanden werden [83].

MAPK-Familie (ERK1) JNK/SAPK p38 Proteinkinase

„heat shock factors“, v.a. HSF-1

HSP72 noch unbekannte

Faktoren

HSP40 UP

HSP72

HSP40

UP UP

HSP40 UP HSP72

HSP72

Abb. 4: Vereinfachte Darstellung der Induktion und Wirkungsweise von Hitzeschock-Proteinen: Der ischämie- abhängige Transkriptionsfaktor HSF-1 wird von Mitgliedern der Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Familie (MAPK), der c-Jun N-terminal Kinase bzw. Stress-induzierten Proteinkinase (JNK/SAPK) und der p38

Proteinkinase via Hyperphosphorilierung induziert [84]. Nach Expression des Hitzeschock-Proteins 72 (HSP72) entfaltet sich seine Wirkung zwei Theorien folgend. Der ersten Theorie nach bindet sich ein zunächst

entstandener Komplex aus dem Hitzeschock-Protein 40 (HSP40) und dem ungefalteten Protein (UP) über die N- terminale ATPase des Hitzeschock-Proteins 72. Anderen Untersuchungen nach koppelt sich das HSP40 direkt an den Komplex aus HSP72 und ungefalteten Protein [85,86].

Abbildung modifiziert und erweitert nach Wegele, Müller und Buchner, Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 2004 [87]

1.2.1.3. Cyclooxygenase-2

Die postischämische Entzündungsreaktion spielt eine wichtige Rolle in den späteren

Prozessen der neuronalen Schädigung [39]. Bei der Zytotoxizität dieser Prozesse kommt den Cyclooxygenasen eine zentrale Funktion zu [63,88].

Cyclooxygenasen (COX), auch als Prostaglandin-G/H₂ Synthasen bekannt, sind Schlüssel- enzyme der Prostanoid-Synthese (Prostaglandine, Prostacycline und Thromboxane). Sie kommen in Form von zwei Isoformen vor: der COX-1 und der COX-2. COX-1 wird physiologisch von vielen Zellen expremiert und ist an den normalen zellulären Funktionen beteiligt [89]. COX-2 dagegen wird unter physiologischen Bedingungen in den meisten Zellen nicht produziert, ist aber durch Zytokine [90], den Plättchen-aktivierenden Faktor (PAF) [91] und durch einige weitere Faktoren induzierbar (vgl. Abbildung 5) [89].

Die Cyclooxygenasen katalysieren die Produktion von Prostanoiden aus Arachidonsäure, die als Antwort auf zellulären Stress aus Phospholipiden der Zellmembran freigesetzt werden [92]. Die Reaktionsprodukte besonders der COX-2 stehen dabei in Verdacht, Zell-

schädigungen zu fördern bzw. zu verursachen. Eine gesteigerte Aktivität der COX-2 konnte in Assoziation mit der Produktion von freien Sauerstoffradikalen, die zytotoxisch wirksam sind, nachgewiesen werden [93]. Weiterhin produziert die COX-2 auch zellschädigende

Prostanoide [88], wobei besonders das Prostaglandin E2, PGE2, als zytotoxisches Produkt via Initiierung der Apoptose vermutet wird [63,92].

Die Aktivität der Isoform COX-2 wurde vielfach in Zusammenhang mit ischämischbedingten zerebralen Schädigungen untersucht und mehrfach eine gesteigerte Expression bei neuronalen Schäden beobachtet [92]. Die Funktion der COX-1 bei der zerebralen Ischämie ist dagegen noch nicht hinreichend geklärt. Während frühere Untersuchungen eine alleinige Steigerung der Expression von COX-2 als Folge einer Ischämie beschrieben [94], zeigen aktuellere Studien, dass eine selektive Hemmung der COX-1 zu verminderten Schädigungen führt und deshalb vermutlich beide Isoformen an der Progression des neuronalen Schadens nach Ischämie beteiligt sind [95]. Die Cyclooxygenasen, speziell die Isoform COX-2, bieten sich also nicht nur als Indikator für zerebrale Schädigungsprozesse an, sondern sind eventuell auch therapeutisch nutzbare Mitspieler.

MAPK-Familie (ERK1) JNK/SAPK p38 Proteinkinase

COX-2 ↑

Prostanoidsynthese, v.a.:

Prostaglandin E₂ Thromboxan A₂

freie Radikale

…

Inflammation Vasokonstriktion Plättchenaggrevation

Chemotaxis

Modulation der Glutamatfreisetzung

… Glutamat ↑

NMDA-Rezeptor

Zytokine

iNOS

L-Arginin + O2 NO + L-Citrullin

Phospholipase A₂

Arachidonsäure Plättchen-aktivierender Faktor

Abb. 5: Vereinfachte Darstellung der Induktion von COX-2. Die Induktion via NMDA-Rezeptor erfolgt innerhalb von Minuten bis Stunden, die Zytokin- und iNOS-gesteuerte Expression über Stunden bis Tage.

MAPK: der Mitogen-aktivierte Proteinkinase; JNK/SAPK: Jun N-terminal Kinase/Stress-induzierte Proteinkinase; iNOS: induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase

Abbildung modifiziert nach Koistinaho und Chan, Neurochemical Research 2000 [96]

1.3. Zerebrale Protektionsverfahren

Weltweit werden unterschiedliche chirurgische Lösungsansätze zur Minderung der Inzidenz von neurologischen Ausfallerscheinungen verwendet. Welches Verfahren jedoch am besten geeignete ist, ist zurzeit Gegenstand anhaltender Diskussionen [10].

1.3.1. Hypothermer Kreislaufstillstand

Der hypotherme Kreislaufstillstand war das erste Protektionsverfahren, welches durchweg Anerkennung fand und auch heute noch die Basis für nahezu alle Protektionsverfahren darstellt. Die ersten veröffentlichten Versuche stammen aus dem Jahr 1950 und wurden von Bigelow und Lindsay an Hunden durchgeführt [97]. In den Folgejahren konnten erfolgreiche Operationen unter Verwendung des Kreislaufstillstands unter Hypothermie durchgeführt werden [98,99]. Klinische Routine wurde der Kreislaufstillstand 1975 durch Griepp, der das Verfahren für komplexe Aortenbogeneingriffe etablierte [100]. Die Methode ermöglicht neben einer Gewebsprotektion ein Operationsfeld frei von Blut und störenden Kanülen [13].

Der hypotherme Kreislaufstillstand basiert auf der Reduktion des intrazellulären

Metabolismus mit Senkung des zellulären Sauerstoffverbrauchs. Bei einer Temperatur von 18°C, die in vielen Kliniken als Zieltemperatur für den hypothermen Kreislaufstillstand verwendet wird, entspricht dies einer Reduktion des zerebralen Metabolismus auf 34% des Ausgangswertes [101]. Dies gewährt darüber hinaus einen Schutz vor Toxizität der

Neurotransmitter und hält den pH-Wert und den ATP-Gehalt im Normbereich [102].

Experimentelle Studien konnten einen Zusammenhang zwischen der Temperatur und der metabolischen Rate für Sauerstoff (CMRO2) zeigen [103]. Dieser Zusammenhang wird durch den Temperatur-Koeffizienten Q₁₀ ausgedrückt, wobei Q₁₀, in dem klinisch relevanten

Intervall zwischen 38°C und 14°C betrachtet, die exponentielle Funktion für die Reduktions- rate des Metabolismus über eine Spanne von jeweils 10°C darstellt (vgl. Abbildung 6)

[103,104]. Damit besteht die Möglichkeit zu einer Temperaturkalkulation, abgestimmt auf die Dauer des operativen Eingriffes und den dafür notwendigen Suppressionsgrad des Zell-

metabolismus.

0 20 40 60 80 100

37 30 25 20 15 10

0 15 30 45

5 10 20 25 35 40

% CMRO₂ HCA/min

Temperatur in °C

Abb. 6: Berechnung der "sicheren" Dauer des hypothermen Kreislaufstillstandes (HCA). Der Q10 für das erwachsene Gehirn wurde durch direkte Messung des CMRO2 bei 37 Patienten während Operationen unter Verwendung des HCA bestimmt. Zu sehen sind die temperaturabhängige metabolische Rate (linke Ordinate) sowie die daraus berechnete "sichere" Dauer des Kreislaufstillstandes (rechte Ordinate).

Abbildung modifiziert nach McCullough et al., Annals of Thoracic Surgery 1999 [104]

Der Zeitraum, in dem eine „sichere“ Protektion mit errechneter Temperatur möglich ist, wurde in einer klinischen Studie mittels direkter Messung der zerebralen metabolischen Rate (CMRO2) ermittelt. Die Berechnungen basieren auf der Annahme, dass bei einer Körper- temperatur von 37°C eine CMRO2 von 100% besteht und sich unter diesen Bedingungen ein

„sicherer“ Zeitraum für den Kreislaufstillstand von fünf Minuten ergibt. Durch eine Kühlung, verbunden mit einer Senkung des zerebralen Metabolismus, erreicht man theoretisch

„sichere“ Zeiträume von 30 Minuten bei 15°C und sogar 40 Minuten bei 10°C [104].

Klinische Studien jedoch zeigten, dass ab Stillstandszeiten über 25 Minuten insbesondere die Symptome der TND auftraten [15,17,105,106]. Für ausgedehnte Eingriffe wurden somit weitere Protektionsverfahren notwendig.

1.3.2. Retrograde zerebrale Perfusion (RCP)

Initial diente das Verfahren der Therapie von massiven arteriellen Luftembolien während der extrakorporalen Zirkulation [107]. Zwei Jahre später wurden die ersten intraluminalen Grafts unter Zuhilfenahme dieser Protektionmöglichkeit in die Aorta platziert [108]. Erst 1990 aber wurde diese Methode im klinischen Alltag routinemäßig zur Neuroprotektion in der

Aortenchirurgie eingesetzt [109].

Der Grundgedanke dieses Verfahrens besteht darin, toxische Metabolite aus dem Gehirn zu waschen, Atherom- und Gas-bedingte Embolisation zu verhindern und das Gehirn durch Kühlung vor Schäden zu bewahren [16]. Dazu wird ein retrograder Fluss mit oxygeniertem Blut über die Vena cava superior initiiert. (vgl. Abbildung 7).

Abb. 7: Schematische Darstellung der retrograden zerebralen Perfusion

Trotz der anfänglich weit verbreiteten Akzeptanz fehlten lange Zeit aussagekräftige experimentelle Daten. Darüber hinaus stellen unterschiedliche anatomische und physiologische Gegebenheiten zwischen Tier und Mensch Probleme in Bezug auf Interpretierbarkeit der Ergebnisse dar.

Nachdem erste klinische Studien einen Erfolg dieses Verfahrens aufzuzeigen schienen, wurde 1995 in einem relevanten und vergleichbaren Primatenmodell nachgewiesen, dass nur ein

geringer Teil des retrograden Blutflusses auch wirklich das Gehirn erreicht, der größte Anteil jedoch durch veno-venöse Shunts verloren geht [110]. Diese Ergebnisse konnten bei

verschiedenen Tierarten mittels unterschiedlicher Methoden verifiziert werden [111,112]. Im Gegensatz dazu konnten in anderen experimentellen Studien indirekte Hinweise für eine suffiziente zerebrale Perfusion gefunden werden [113,114]. Ebenfalls widersprüchlich waren die histopathologischen Untersuchungen. Während einige Studien einen signifikanten Vorteil in der retrograden Perfusion im Vergleich zum alleinigen hypothermen Kreislaufstillstand sahen [115], konnten in anderen Studien keine Unterschiede nachgewiesen werden [116]. Die fehlende Vergleichbarkeit der Studien sowie die unterschiedlichen klinischen Ergebnisse haben zu kontroversen Diskussionen geführt, die letztendlich die Anwendung dieser Technik nicht mehr favorisieren.

1.3.3. Selektive antegrade zerebrale Perfusion

Die zurzeit populärste Methode zur Hirnprotektion ist die selektive antegrade zerebrale Perfusion. Schon DeBakey nutzte 1957 diese Technik [1], nicht zuletzt, weil sie den

physiologischen Verhältnissen am ähnlichsten zu sein schien. Obwohl die Operation dieses ersten Patienten erfolgreich verlief, ließen die klinischen und experimentellen Ergebnisse der vorangegangenen und folgenden Jahre an dem Nutzen dieses Verfahrens zweifeln [2,117].

Als dann 1975 Griepp den alleinigen hypothermen Kreislaufstillstand in der aortalen Chirurgie erfolgreich etablierte, wendete man sich vorerst gänzlich von dieser Art von Protektion ab. Nachdem jedoch im Laufe der Jahre und mit steigender klinischer Erfahrung der alleinige protrahierte hypotherme Kreislaufstillstand, aufgrund des Auftretens von

neurologischen Komplikationen, in die Diskussion kam, suchte man nach additiven Verfahren zur Neuroprotektion.

Das Prinzip der selektiven antegraden Perfusion (vgl. Abbildung 8) beruht darauf, das Gehirn über die entsprechenden arteriellen Gefäße mit Blut zu versorgen und damit eine

Verlängerung der „sicheren“ Stillstandsphase zu erreichen [13].

Abb. 8: Schematische Darstellung der selektiven antegraden zerebralen Perfusion (SACP) nach Hannover- Technik. Zur Anwendung für die antegrade Perfusion kommen retrograde Kardioplegiekatheter (RSCP MR20, Medtronic GmbH, Düsseldorf, Deutschland)

Nach enttäuschenden Ergebnissen mit normothermer Perfusion in der Vergangenheit

kombinierte man zunächst die selektive antegrade zerebrale Perfusion mit dem hypothermen Kreislaufstillstand und erhielt akzeptable Ergebnisse [118,119]. Auch experimentell wurde ein deutlicher Vorteil in Bezug auf Stabilität des pH-Wertes und der Energiereserven in Kombination mit Hypothermie gesehen [120]. Über die optimale Technik der bilateralen Kanülierung der Carotiden zur antegraden Perfusion besteht jedoch noch Uneinigkeit. Von einer einseitigen unilateralen Kanülierung wird mittlerweile in der Erwachsenenchirurgie abgeraten, da ein hierfür notwendiger kompetenter Circulus arteriosus Willisi in einem Teil der Patienten nicht oder nicht mehr vorhanden ist [121].

Die exakte klinische Anwendung erfolgt zumeist aufgrund von empirischen Daten, da sowohl das pathophysiologische Verständnis bezüglich optimaler Temperatur und Flussraten

unbekannt ist als auch entsprechende tierexperimentelle Daten fehlen. Die bisherigen klinischen Ergebnisse sind zwar viel versprechend, müssen aber noch durch experimentelle Daten sowie randomisierte klinische Studien belegt werden [15,122,123]. Während

tierexperimentelle Modelle sich etablieren lassen, ist die Durchführung einer klinischen Studie aufgrund der Datenlage problematisch, da die Vorteile deutlich zugunsten einer Kombination aus hypothermen Kreislaufstillstand mit selektiver antegrader zerebraler Perfusion zu liegen scheinen [124].

1.3.4. Medikamentöse Ansätze

Neben den genannten Protektionsverfahren werden zusätzlich in der Klinik verschiedene Medikamente eingesetzt, um die unterschiedlichen Effekte der Verfahren zu unterstützen.

In der klinischen Routine kommen dabei vor allem Cortison und Mannitol zum Einsatz.

Cortison, ein Glukokortikoid, wird zum einen wegen seiner antiinflammatorischen

Wirkungsweise eingesetzt, zum anderen wirkt Cortison aber auch membranstabilisierend und soll hierdurch protektiv auf die Entstehung eines Hirnödems wirken [125]. Der Einsatz erfolgt zumeist vor Kreislaufstillstand.

Mannitol dagegen ist eine osmotisch wirksame Substanz. Es reduziert nicht nur bestehende Organödeme, speziell Hirnödeme, sondern wirkt auch erfahrungsgemäß als Fänger freier Sauerstoffradikale dem ischämie-bedingten Schaden entgegen [126]. Mannitol wird v.a.

während der Reperfusion nach Kreislaufstillstand eingesetzt.

Weitere medikamentöse Ansätze stammen aus experimentellen Studien, die sich bisher noch nicht im klinischen Einsatz befinden, da die potentiellen Nebenwirkungen dieses zumeist nicht erlauben. Ein getestetes Pharmazeutikum ist das Cyclosporin A, das in einigen Studien positive Effekte im Bezug auf histologische und neurologisch funktionelle Aspekte zeigte [58,127,128].

Weiterhin befinden sich viele Medikamente, insbesondere aus der Schlaganfallforschung, im Fokus der Wissenschaft. Diese wurden allerdings noch nicht in herzchirurgisch relevanten Tiermodellen mit hypothermen Kreislaufstillstand evaluiert.

1.3.5. Neuromonitoring

Zur Beurteilung einer Suppression des zerebralen Metabolismus werden in der klinischen Routine neurophysiologische Verfahren angewendet, um die verwendeten Protektions- verfahren zu steuern bzw. während des Eingriffs ggf. eine Abschätzung des Schadens vornehmen zu können.

Elektroenzephalogramm

Das Elektroenzephalogramm (EEG) ist eine etablierte Methodik zur Beurteilung der elektrischen Aktivität des Gehirns. Dabei werden Potentialschwankungen der Hirnrinde unipolar, also mit einer differenten und einer indifferenten Elektrode, oder bipolar mit zwei differenten Elektroden abgeleitet [129]. Eine Nulllinie im EEG galt lange Zeit als Indikator für eine optimale Reduktion des Metabolismus. Experimentelle Daten zeigten allerdings, dass es bei einer Temperatur um die 20°C bereits zu einem Sistieren der Aktivität kommt, was einer Reduktion der CMRO2 auf 50 % entspricht [104].

Des Weiteren macht man sich das EEG bei der Identifizierung von zerebralen Hypo- perfusionen und zerebralen Hypoxien zu Nutze. Es konnte gezeigt werden, dass EEG- Veränderungen nach zerebraler Ischämie einen Anhalt bezüglich des Ausmaßes einer zerebralen Schädigung geben kann [130,131]. Im Umkehrschluss korrelierten identische EEG-Frequenzen zwischen präoperativ- und postoperativ-abgeleiteten EEGs mit einer guten neurologischen Prognose [132].

Somatosensorisch evozierte Potentiale

Somatosensorisch evozierte Potentiale (SSEP) gelten als eine besser geeignete Alternative zum alleinigen EEG. Bei SSEP handelt es sich um elektrophysiologische Antworten des Nervensystems auf sensorische Stimulation [133]. Dazu wird ein peripherer Nerv mit elektrischen Impulsen stimuliert und die darauf folgenden zerebralen Potentiale über Elektroden abgeleitet.

Eine Minderung bzw. ein Verlust der Antwort auf die Stimulationen postoperativ wurde dabei im Zusammenhang mit zerebraler Ischämie mit einer konsekutiven Hirnschädigungen

beobachtet [134].

Zusammenfassend lässt sich mittels beider Methoden zwar das Ausmaß bzw. das Auftreten von Ischämien erfassen, der Einsatz als Parameter für einen reduzierten Metabolismus ist bisher noch umstritten und sollte daher nicht alleine verwandt werden.

Eine Alternative hierzu stellt die Messung der Sauerstoffsättigung in beiden Gehirn- hemisphären mittels fiberoptischer Sonden („Near-infrared spectroscopy“, NIRS), ähnlich dem Verfahren der Pulsoxymetrie [135]. Diese Technik ist einfach in der Anwendung und Interpretation und erlaubt zumindest eine semiquantitative Beurteilung.

1.4. Aufgabenstellung und Zielsetzung

In den vergangenen Jahren konnte wiederholt in klinischen Studien die unzureichende Protektion des Gehirns bei Operationen komplexer Pathologien des Aortenbogens sowie kongenitaler Herzvitien unter Verwendung des alleinigen hypothermen Kreislaufstillstands gezeigt werden. Fortschritte im intraoperativen Management sowie bei der extrakorporalen Zirkulation konnten die Problematik nicht vollständig lösen. Somit wurden alternative und ergänzende Protektionsmethoden notwendig.

Die selektive antegrade zerebrale Perfusion in Kombination mit einem hypothermen

Kreislaufstillstand stellt aufgrund der Ergebnisse einiger großer klinischer Studien zurzeit das populärste Verfahren zur Zerebroprotektion dar. Dennoch ist das Wissen in Bezug auf die pathophysiologischen Mechanismen limitiert und die Anwendung basiert auf empirischen Untersuchungen. Darüber hinaus besteht Uneinigkeit in Bezug auf die Temperatur und Methodik der Perfusion.

Ziel dieser Arbeit war es, ein reproduzierbares experimentelles Tiermodell zu etablieren, das neben der Erforschung aktueller und zukünftiger Protektionsverfahren auch als Basis für Langzeitstudien in Bezug auf Neuroprotektionsstudien verwendet werden kann. Des Weiteren sollen mittels eines komplexen intraoperativen Monitorings sowie verschiedener post mortem Analysen weitere mechanistische Erkenntnisse gewonnen werden.

2. Material und Methoden

2.1. Modelletablierung

Als Vorlage des verwendeten Modellaufbaus diente ein seit längerem bereits etabliertes und bewährtes Versuchsmodell der Arbeitsgruppe um Prof. Randall B. Griepp vom Department for Cardiothoracic Surgery der Mount Sinai School of Medicine in New York (USA) [127].

Das dort angewante Modell galt es vor Studienbeginn an der Medizinischen Hochschule Hannover zu etablieren und den Gegebenheiten und entsprechenden Fragestellungen anzupassen.

Dabei sollten als Grundvoraussetzungen folgende Ansätze durch den gewählten Versuchs- aufbau erfüllt werden:

1. Gewährleistung einer selektiven Perfusion des Gehirns. Im Gegensatz dazu wird in vielen Studien die gesamte obere Körperhälfte perfundiert [136].

2. Auskommen ohne zusätzliche Manipulation durch Präparation o.ä. an den zuführenden Gefäßen des Gehirns mit dem Risiko konsekutiver Embolisierungen.

3. Vermeidung zusätzlicher Gefäßkanülierungen.

4. Durchführbarkeit der Versuche als chronisches Überlebermodell.

5. Vergleichbarkeit und Übertragbarkeit in den klinischen Alltag.

Zur Modelletablierung wurden 6 weibliche Landrasseschweine im Vorfeld der Studie operiert. Das Gewicht betrug 30 kg ± 4 kg, das Alter lag zwischen 3-4 Monaten. Die Anatomie des Schweins liefert optimale Vorraussetzungen für eine selektive Hirnperfusion ohne zusätzliche Kanülierung der Carotiden. Denn im Gegensatz zur Anatomie des Menschen entspringen beim Schwein beide Carotiden als Truncus bicaroticus aus dem Truncus

brachiocephalicus (vgl. Abb. 13 auf Seite 32). Die Grundidee war, nach dem Ausklemmen der beiden Vorderläufe eine selektive Hirnperfusion via Truncus brachiocephalicus über die arterielle Kanüle in der Aorta zu ermöglichen (vgl. Abb. 16 auf Seite 37). Zum Nachweis wurde eine Kontrastmittel-Angiographie (Ultravist^®) des arteriellen zerebralen Gefäßsystems über die arterielle Kanüle mittels eines C-Bogens (9600 Mobile Imaging System (Type B), OEC Medical Systems, Salt Lake City, Utah, USA) durchgeführt.

kranial kaudal

4 1

2

3

5 5 5

Abb. 9: Die Abbildung zeigte eine intraoperative angiographische Darstellung der supraaortalen Gefäße über die arterielle Kanüle im hypothermen Kreislaufstillstand mit selektiver antegrader zerebraler Perfusion:

1: Arteria carotis dextra et sinistra; 2: Truncus brachiocephalicus mit Truncus bicaroticus; 3: Klemme auf der Arteria subclavia dextra; 4: arterielle Kanüle in der Aorta; 5: EKG-Elektrode

Diese Darstellung zeigte in allen Versuchen einen selektiven Blutfluss ins Gehirn ohne Volumenverluste in andere Versorgungsgebiete oder sonstige Kollateralisierung. Somit konnte mit den entsprechenden Klemmebenen ausschließlich eine zerebrale Perfusion gewährleistet werden.

Um jedoch eine sichere Gefäßdarstellung während der Präparation zu erhalten, musste zuvor ein geeigneter thorakaler Zugang gefunden werden. Die optimalen Bedingungen für

Präparation, Kanülierung und Ausklemmen der nicht zu perfundierenden Stromgebiete bot dabei die linkslaterale Thorakotomie auf Höhe des 3. bzw. 4. Interkostalraums. Andere erprobte Zugangswege zum Herzen und zur Aorta erwiesen sich als eher ungünstig.

Die pathophysiologischen Untersuchungen der zerebralen Veränderungen erfordern ein aufwendiges Neuromonitoring. Neben dem Elektroenzephalogramm und den somato-

sensorisch evozierten Potentialen wurden der Codman Neurotrend^® von Johnson and Johnson Professional, Inc. (Raynham, MA, USA), das INVOS^® Zerebral Oximeter von Somanetics (Troy, MI, USA) und der Codman ICP Express^® ebenfalls von Johnson and Johnson Professional, Inc. (Raynham, MA, USA) verwendet. Da die aufgeführten Apparate im tierexperimentellen Gebrauch nur bedingt etabliert sind und um der Komplexität des Monitorings Rechnung zu tragen, wurden Einbau und Funktionsweise ebenfalls in den o.g.

Vorversuchen genauestens erprobt und die Lagepositionierung im Anschluss makroskopisch nach Kraniotomie kontrolliert. Dabei wurde zudem auf eventuell entstandene Parenchym- schädigungen und Einblutungen geachtet, die es zu vermeiden galt.

Zuletzt wurde vor Studienbeginn das Protokoll erstellt und modifiziert sowie der komplexe Ablauf und die Operationstechnik etabliert.

2.2. Studienkonzept

12 weibliche Landrasseschweine wurden prospektiv randomisiert 100 Minuten lang einem hypothermen Kreislaufstillstand ohne (n=6) bzw. mit (n=6) 90 Minuten selektiver antegrader zerebraler Perfusion unterzogen. Intra- und postoperativ wurden hämodynamische und metabolische Parameter erhoben sowie ein quantitatives Elektroenzephalogramm und somatosensorisch evozierte Potentiale aufgezeichnet und auf Monitoren dargestellt.

Ergänzend wurden Serumproben abgenommen und eingefroren. Alle Tiere wurden für 4 Stunden, ab der Reperfusion gerechnet, nachbeobachtet. Anschließend wurden die Tiere getötet, das Gehirn entnommen und die so gewonnen Gewebeproben für die histologische und molekulargenetische Analyse aufbereitet und ausgewertet.

2.3. Versuchstiere

Bei den Versuchstieren handelte es sich um weibliche Schweine der deutschen Landrasse, 3-4 Monate (13,5±3 Wochen) alt und mit einem Gewicht von 26-32 kg (30,5±5 kg). Die Tiere wurden zur Akklimatisierung zwei Wochen vor Versuchsbeginn in das Zentrale

Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover verbracht. Gehalten wurden die Schweine in gefliesten Boxen mit Bodenheizung bei kontrolliertem Luftwechsel ohne

Klimaanlage. Der Tag-/Nachtwechsel betrug je 12 Stunden. Die Reinigung der Boxen erfolgte täglich durch Ausspritzen mit Wasser. Gefüttert wurden die Tiere mit pelletiertem Haltungs- futter, ergänzend erhielten sie täglich eine Rispe Stroh vom Ballen zur Ballaststoffergänzung.

Die Flüssigkeitszufuhr erfolgte ad libitum über eine Selbsttränke. Präoperativ wurden Untersuchungen auf Ekto- und Endoparasiten durchgeführt.

Die Haltung sowie der Umgang mit den Tieren geschah in Einvernehmen mit den „Principles of Laboratory Animal Care“ der National Society for Medical Research und der „Guide for

the Care and Use of Laboratory Animals”, veröffentlicht durch das National Institute of Health (NIH Publication No. 88-23, revised 1996). Die Versuche wurden sowohl vom Tierschutzbeauftragten der Medizinischen Hochschule Hannover als auch vom Land

Niedersachsen geprüft und nach §8 Abs.1 des Tierschutzgesetzes vom 23.05.1998 (BGBI. I S.

1105) in der derzeit geltenden Fassung genehmigt (Tierschutznummer 01/467).

2.4. Anästhesie

Am Morgen des Operationstages wurden die Tiere um acht Uhr in den Einleitungsraum gebracht. Die Narkoseeinleitung wurde durch Tierpfleger des Zentralen Tierlaboratoriums der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Dazu erhielten die Tiere initial 8 mg/kg KG Azaperon und 0,5 mg Atropin intramuskulär injiziert. Nach Platzierung einer 22G1“

Venenverweilkanüle (B.Braun, Melsungen, Deutschland) in eine oberflächliche Ohrvene wurden 8-10 mg Propofol intravenös appliziert, gefolgt von der endotrachealen Intubation mit einem 7-0-0 Mallinckrodt Tubus (Mallinckrodt Medical, Athlone, Irland) unter Zuhilfenahme eines Laryngoskopes für Schweine (MHH-Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule Hannover, Deutschland). Zur Überprüfung der Tubuslage wurden beide Thoraxhälften sowie der Magen auskultiert. Anschließend wurde die linke Thoraxhälfte mit einem Rasierer von den Borsten befreit. Manuell beatmet wurden die Tiere dann in den Operationssaal gefahren und an eine Beatmungsmaschine (Servo Ventilator 900C, Siemens-Elena AG, Solna,

Schweden) und einen EKG-Monitor (Eagle 1000, marquette HELLIGE medical systems, Freiburg, Deutschland) angeschlossen.

Die mechanische Ventilation erfolgte mit einer inspiratorischen FiO2 von 0,5, einem positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) von 3-5 mmHg und 1-2 % Isofluran. Nach initialer Gabe von 0,25 mg Fentanyl wurden 1 μg kg^-1h^-1 kontinuierlich intravenös zur weiteren Analgesie verabreicht, die Muskelrelaxation wurde durch intermittierende Gaben von 0,1 mg/kg KG Pancuronium aufrechterhalten. Die Atemfrequenz und das inspiratorische Tidalvolumen wurden anhand des arteriellen CO₂-Wert, der zwischen 35 und 45 mmHg (unkorrigiert für die Temperatur) gehalten wurde, angepasst (BGA Omni 8 Modular System, AVL List GmbH Medizintechnik, Graz, Österreich).

2.5. Präoperative Vorbereitung

Die Lagerung des Tieres erfolgte in Bauchlage auf einer Heizmatte mit Warmwasser-

zirkulation (Hico-Aquatherm 650, Hirtz, Köln, Deutschland) bei einer Temperatur von 38°C, um ein Auskühlen des Tieres während der Präparation zu verhindern und das Wieder-

erwärmen nach der Kühlung zu unterstützen. Unter Zuhilfenahme eines Katzen- Laryngoskopes (MHH-Forschungswerkstätten, Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland) wurde transkloakal in die Blase des Tieres ein 8-10 F Foley- Dauerkatheter (Norta^®, Beiersdorf AG, Hamburg, Deutschland) eingelegt, um die Urin- ausscheidung zu überwachen. Anschließend wurde das Tier in die eigentliche Lagerungs- position in Rechts-Seiten-Lage gebracht (vgl. Abbildung 10).

Abb. 10: Die Abbildung zeigt die Lagerung des Tieres auf dem OP-Tisch in Rechts-Seiten Lage (Zeichnung by Negin Khaladj)

Die Vorderläufe wurden mit Stoffbändern unter leichtem Zug nach kranial fixiert, der rechte Hinterlauf wurde nach kaudal gelagert und der linke Hinterlauf wurde ausgelagert. Durch die Lagerung der Hinterläufe wurde ein besserer Zugang zur Leiste mit den dort zu

präparierenden Gefäßen ermöglicht. Anschließend wurden Temperaturmesssonden (Oregon Scientific Deutschland GmbH, Neu-Isenburg, Deutschland) in das Rektum und in den Ösophagus platziert.

Folgende Notfallmedikamente lagen während des Versuches bereit: Suprarenin 1 mg (1:10 und 1:100), Arterenol 1 mg (1:10 und 1:100), Xylocain 2%ig, Kalzium und Magnesium.

Des Weiteren erhielt das Tier direkt präoperativ 2 g des Antibiotikums Ceftriaxon.

2.6. Operation

2.6.1. Leistensitus

Zuerst wurde der Gefäßverlauf der rechten Arteria femoralis durch Ertasten des Pulses bestimmt. Nach mehrfachem Waschen der Region mit Braunoderm-Lösung erfolgte der Hautschnitt auf einer ungefähren Länge von 8-10 cm entlang der Gefäß-Nervenstraße. Es folgte das Aufsuchen des Musculus satorius und des Musculus gracilis, zwischen deren Bäuchen die Gefäße nach Präparation zum Vorschein kamen (vgl. Abbildung 11).

2 1

Abb. 11: Das Foto zeigt den Leistensitus nach Präparation der zu kanülierenden Gefäße:

1: Arteria femoralis; 2: Vena femoralis

Die Arteria und Vena femoralis wurden unter Schonung des Nervus femoralis von um- schließendem Gewebe befreit und mittels einer Overholdklemme umfahren, Gefäßabgänge wurden je nach Größe mit Titanclips verschlossen. Beide Gefäße wurden distal einfach und proximal zweifach mit einer Ligatur umschlungen und anschließend distal legiert. Die proximalen Fäden wurden je mit einem Tourniquet versehen und dieser mit einem Klemmchen gesichert. Proximal des Tourniquets wurde die Arterie mittels anatomischer Pinzette okkludiert. Mit einer feinen Präparierschere wurde das Gefäß schräg eingeschnitten und ein PICCO^®-Katheter (Pulsion Medical Systems, München, Deutschland) eingelegt.

Anschließend wurde der Katheter mittels des Tourniquet gesichert. Auf identische Weise wurde mit der Vene verfahren und dort ein vierlumiger zentraler Venenkatheter (Arrow- Hewes™ Quad-Lumen Central Venous Catheterization Set, Arrow Deutschland GmbH, Erding, Deutschland) eingebracht. Nach Überprüfung sämtlicher Katheter-Schenkel durch

Aspiration wurden Druckmesslinien (ZVD, arterieller Blutdruck) an elektromechanische Druckwandler angeschlossen. Abschließend wurde die Leisteninzision provisorisch verschlossen.

2.6.2. Schädelsitus

Präparation

Die Kopfschwarte wurde durch einen ca. 10 cm langen medianen Hautschnitt eröffnet. Es folgte die Präparation der Schwarte bis auf die Schädelkalotte. Mit einem Trepanations- besteck wurde dann ein 10 mm großes Trepanationsloch geschaffen. Anschließend wurde ein weiteres ca. 3 mm großes Loch 0,5 cm rechts lateral davon angelegt.

Messung von metabolischen Gewebeparametern im Gehirn

Der Neurotrend^® (Codman Neurotrend^®, Johnson and Johnson Professional, Inc., Raynham, MA, USA) ist ein Messgerät, welches über einen optische Sensor und eine Clarck-Elektrode nicht nur die Temperatur, sondern auch metabolische Parameter (pH, pO2, pCO2 und HCO3) im Hirngewebe messen kann. Zur Einlage der Sonde wurde eine gewöhnliche 22 GA

Venenverweilkanüle (BD Adsyte Pro, Becton Dickinson S.A., Madrid, Spanien) verwendet und nach einem selbst entwickelten Verfahren in das kleinere Trepanationsloch eingelegt. Die optimale Positionierung wurde in den Vorversuchen erprobt und nach Kraniotomie validiert.

Messung des intrakraniellen Drucks und Blutentnahme aus Sinus sagittalis

Mit einem Stichskalpell wurde die Dura mater im größeren Trepanationsloch an zwei Stellen inzidiert. Durch die erste Inzision wurde eine ICP-Sonde (Codman ICP Express^®, Johnson and Johnson Professional, Inc., Raynham, MA, USA) zur Messung des intrakraniellen Drucks in den Subduralraum eingeführt und ungefähr 3 cm vorgeschoben. Über den anderen

Einschnitt erfolgte die Punktion des Sinus sagittalis mittels einer 24 G ¾’’ Venenverweil- kanüle (B.Braun, Melsungen, Deutschland). Aus dem Sinus sagittalis wurde venöses Blut

entnommen, um über die Messung der Sättigung (BGA Omni 8 Modular System, AVL List GmbH Medizintechnik, Graz, Österreich) die Sauerstoffausbeute des Gehirns zu ermitteln.

kaudal kranial

1

2

3

Abb. 12: Das Foto zeigt den Schädelsitus nach Punktion des venösen Sinus sagittalis:

1: Dura mater; 2: Veneverweilkanüle im Sinus sagittalis; 3: linke Augenhöhle

INVOS-Sonde

Die Sonden des in der Klinik standardmäßig bei Operationen mit Kreislaufstillstand verwendeten INVOS^® Zerebral Oximeter (Somanetics, Troy, MI, USA) können von der oberflächlichen Haut aus über die so genannte „near-infrared spectroscopy“, kurz NIRS, via fiberoptischen Sensoren den Sauerstoffgehalt (RSO2) im Blut messen.

Die Messsonde wurde zur Verbesserung des Kontaktes zwischen Haut und Sonde mit Medisept^® eingesprüht und etwas kranial der Verbindungslinie zwischen beiden Ohren mit wasserfestem Pflaster und durch Annaht fixiert. Aufgrund stark abweichender Ausgangswerte wurde zur Auswertung nicht der angezeigte Wert in Prozent verwendet, sondern die

prozentuale Abweichung vom Ausgangswert registriert.