Nachweis von Rhodococcus equi in Kot und
Trachealsekret bei Fohlen:
Vergleichende Untersuchung zwischen gesunden Fohlen und Fohlen mit Lungenabszessen
INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae –
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Marc Lämmer Kaufungen (Hess.)
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: PD. Dr. Dr. habil. Monica Venner, PhD.
Klinik für Pferde, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachterin: PD. Dr. Dr. habil. Monica Venner, PhD.
2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. Karl-Heinz Waldmann
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Mai 2010
Meinen Eltern und
Birgit und Wolfgang Kähn
1 EINLEITUNG ... 13
2 LITERATURÜBERSICHT ... 15
2.1 Atemwegsinfektionen bei Fohlen ... 15
2.2 Rhodococcus equi ... 16
2.2.2 Vorkommen und Bedeutung von Rhodococcus equi... 17
2.2.3 Morphologie, Kultivierung und biochemische Eigenschaften ... 18
2.2.4 Virulenzfaktoren ... 20
2.2.5 Rhodococcus equi bedingte Erkrankungen bei Fohlen ... 21
2.2.6 Pathogenese der Rhodokokkose ... 23
2.3 Diagnose von Rhodococcus equi-Erkrankungen bei Fohlen ... 24
2.3.1 Hämatologische Parameter ... 25
2.3.2 Bildgebende Verfahren ... 25
2.3.3 Nachweis von R. equi ... 27
2.3.4 Ausscheidung von R. equi beim Pferd ... 29
2.3.5 Pathologie und Pathohistologie der R. equi-Pneumonie ... 31
2.4 Therapie der R. equi-Pneumonie des Fohlens ... 32
3 MATERIAL UND METHODE ... 34
3.1 Material ... 34
3.1.1 Probanden ... 34
3.1.2 Haltung und Management der neonaten Fohlen ... 34
3.1.3 Haltung und Management der älteren Fohlen ... 35
3.1.4 Impfung und Entwurmung ... 35
3.2.1 Methode ... 36
3.2.1 Klinische Allgemeinuntersuchung der Fohlen ... 36
3.2.2 Spezielle klinische Untersuchung des Respirationstrakts ... 36
3.2.3 Labordiagnostische Untersuchung ... 38
3.2.4 Ultrasonographische Untersuchung der Lungen ... 38
3.2.5 Röntgenologische Lungenuntersuchung ... 39
3.3 Probenentnahme... 40
3.3.1 Aufnahmekriterien und Gruppeneinteilung der Fohlen ... 40
3.3.2 Zeitpunkt der Gewinnung von Tracheobronchialsekret und Kotproben ... 41
3.3.3 Endoskopische Probenentnahme aus der Trachea (TBS ... 42
3.3.4 Kotprobrnentnahme ... 43
3.3.5 Handhabung der Proben nach der Entnahme ... 44
3.3.6 Mikrobiologische Untersuchung ... 44
3.3.7 Mikroskopische Beurteilung ... 45
3.3.8 Statistische Auswertung ... 46
4 ERGEBNISSE ... 49
4.1 Anzahl und Geschlecht der Fohlen ... 49
4.2 Alter der Fohlen zu Studienbeginn ... 49
4.3 Befunde der klinischen Lungenuntersuchung zu Studienbeginn ... 50
4.4 Blutleukozytenzahl bei den Fohlen zu Studienbeginn ... 51
4.5 Befunde der sonographischen Lungenuntersuchung zu Studienbeginn 52 4.6 Nachweis von Rhodococcus equi im Kot und Tracheobronchialsekret . 53 4.6.1 R. equi-Nachweis im Tracheobronchialsekret an Tag 0, Tag 7 und ... 53
Tag 14 ... 53
4.6.2 R. equi-Nachweis im Kot an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 ... 55
4.8 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi bei den drei Fohlengruppen über die 14 tägige Beobachtungsphase ... 58
4.8.1 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi im Tracheobronchialsekret am Tag 0 ... 58 4.8.2 Zusammenhang des klinischen Scores und des Nachweises von R. equi im Kot am Tag 0 ... 59 4.9 Zusammenhang des Nachweises von R. equi und dem
Blutleukozytenwert am Tag der Diagnose in allen drei Fohlengruppen ... 60 4.9.1 Blutleukozytenwert und Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret bei den drei Fohlengruppen am Tag 0 ... 60 4.9.2 Blutleukozytenwert und Nachweis von R. equi im Kot bei den drei
Fohlengruppen am Tag 0 ... 60 4.10 Zusammenhang des Nachweises von R. equi und dem Abszess-Score am Tag der Diagnose in allen drei Fohlengruppen ... 61
4.10.1 Zusammenhang des Abszess-Score und des R. equi-Nachweises im TBS der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose (Tag 0) ... 61 4.10.2 Zusammenhang des Abszess-Score und des R. equi-Nachweises im Kot der drei Fohlengruppen am Tag der Diagnose (Tag 0) ... 62 4.11 Vergleich des Nachweises von R. equi im Tracheobronchialsekret über die zweiwöchige Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen ... 64 4.12 Vergleich des Nachweises von R. equi im Kot über die zweiwöchige Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen ... 66 4.13 Nachweis von R. equi über die zweiwöchige Beobachtungsphase in den drei Fohlengruppen ... 68
5 DISKUSSION ... 71
5.1 Probanden ... 71
5.2 Probenentnahme... 72
5.3 Ergebnisse ... 73
5.3.1 Beziehung zwischen dem Erkrankungsalter der Fohlen und dem ... 73
Nachweis von R. equi im Tracheobronchialsekret und im Kot ... 73
5.3.2 Gegenüberstellung der kulturellen Anzucht von R. equi aus dem Tracheobronchialsekret und Kot mit den Befunden der klinischen und sonographischen Untersuchung ... 74
5.3.3 Gegenüberstellung der Ergebnisse der kulturellen Anzucht von R. equi aus Tracheobronchialsekret und Kot ... 77
5.4 Schlussfolgerung... 78
6 ZUSAMMENFASSUNG ... 80
7 SUMMARY ... 82
8 LITERATURVERZEICHNIS ... 84
9 ANHANG……….…105
Abb. Abbildung
AG Aktiengesellschaft
AGID Agar-Gel-Immundiffusionstest Art. Nr. Artikelnummer
BAL Bronchoalveoläre Lavage bzw. beziehungsweise
C Celsius
ca. circa
CAMP Christie-Aktins-Munch-Petersen cm Centimeter
CRP C-reaktives-Protein
d Day
dest. destillata dl Deziliter
DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EHV Equines Herpes Virus
ELISA Enzyme linked immunosorbent assey
g Gramm
ggr. geringgradig
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
h Stunde
HIV Humanes Immundefizienz Virus hgr. hochgradig
IgG Immunglobulin G
i. m. intramuskulär i. v. intravenös kb Kilobase kDA Kilodalton kg Kilogramm KM Körpermasse kV Kilovolt
l Liter
Lnn Lymphonodii
m Meter
M. Musculus
mAs Milliampere-Sekunde mg Milligramm
mgr. mittelgradig MHz Megahertz min. Minute ml Milliliter mm Millimeter MW Mittelwert µl Mikroliter µm Mikrometer
n Anzahl
NANAT Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit
Nr. Nummer
o.b.B. ohne besonderen Befund PCR Polymerase-Chain-Reaction
Pn Pneumonie
SAA Serum-Amyloid A spp. species
Staph. Staphylokokkus Stdabw. Standartabweichung Strep. Streptokokkus Tab. Tabelle
TBS Tracheobronchialsekret
TCP Trimethoprim-Cefoperazon-Polymyxin B u. a. unter anderem
U Unit
Vap Virulenz assoziiertes Protein z.B. zum Beispiel
♀ weiblich
♂ männlich
Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt
13
1 Einleitung
Atemwegserkrankungen gehören bei Fohlen im Alter von bis zu sechs Monaten zu den häufigsten Erkrankungen. Dafür gibt es zahlreiche Ursachen. Wobei einer der häufigsten bakteriellen Auslöser von schweren Pneumonien bei Fohlen Rhodococcus equi ist.
Rhodococcus equi (R. equi) ist ein weltweit verbreiteter Infektionserreger, der bei Fohlen zu Bronchopneumonien und pyogranulomatösen Entzündungen der Lunge führt. Die Erkrankung kann sowohl sporadisch als auch endemisch in Zuchtbetrieben auftreten. In betroffenen Beständen liegt die Morbidität bei bis zu 80 %, die Mortalität bei 5 % bis 17 %.
Die Krankheit verläuft über mehrere Wochen subklinisch. Deshalb werden die kranken Fohlen häufig erst spät für den Besitzer auffällig, obwohl bereits zahlreiche Lungenabszesse vorliegen. Oft sind die Lungenveränderungen daher sehr fortgeschritten, wenn die Diagnose gestellt wird. Nur durch eine frühe Diagnose und eine gezielte antibiotische Therapie lassen sich die Verluste bei den Fohlen reduzieren. Durch die antibiotische Therapie kann die Überlebensrate von 20 % auf bis zu 90 % gesteigert werden. Die Therapie sollte mindestens vier Wochen durchgeführt werden, sie kann in manchen Fällen bis zu neun Wochen erfordern und ist deshalb sehr kostenaufwendig.
In endemisch betroffenen Betrieben wird daher zu einem Screeningsystem geraten, da die frühestmögliche Erkennung der R. equi- Pneumonie die Prognose verbessert und eine kürzere Behandlungsdauer ermöglicht.
Die weltweite Verbreitung von R. equi in der Umwelt und die ausgesprochene Widerstandsfähigkeit des Keims im Boden und im Kot von Pferden erklären den Verbleib und das Vorkommen auf endemisch betroffenen Betrieben. Die Fohlen infizieren sich durch aerogene Aufnahme von kontaminierter, staubiger Luft und möglicherweise durch die orale Aufnahme von Kot.
1. Einleitung
_________________________________________________________________________________
14
Um eine Infektion bei den Tieren nachzuweisen oder eine Verdachtsdiagnose zu bestätigen, werden Proben aus den tieferen Atemwegen oder Kotproben empfohlen.
Die Diagnose über die exspiratorische Atemluft konnte nicht als sicheres Diagnostikum bestätigt werden.
Der Nachweis des Erregers ist über die kulturelle Anzucht am zuverlässigsten, jedoch durch die intrazelluläre Überlebensstrategie des Erregers nicht immer möglich.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu prüfen, ob der kulturelle Nachweis von R.
equi aus den Atemwegen mit dem Nachweis aus Kot bei gesunden und bei kranken Fohlen vergleichbar ist. Weiterhin soll untersucht werden, wie lange erkrankte Fohlen unter antibiotischer Therapie R. equi über die Atemwege und den Kot ausscheiden.
Daraus liesse sich der richtige Zeitpunkt bestimmen, zu dem ein behandeltes Fohlen wieder in eine Pferde-Gruppe integriert werden kann.
15
2 Literaturübersicht
2.1 Atemwegsinfektionen bei Fohlen
Atemwegsinfektionen und Durchfallerkrankungen sind die häufigsten Krankheits- und Todesursachen bei Fohlen bis zum sechsten Lebensmonat (LEENDERTSE u.
KÖHLER 1996). Die Gesundheit der jungen Tiere kann durch den Verlauf der Trächtigkeit, den Zeitpunkt und den Verlauf der Geburt, aber auch die Haltungs- und Umweltbedingungen, das Stallklima, die Besatzdichte und die Witterung beeinflusst werden (BEECH 1985; BOSTEDT 1999). Aber nicht nur äußere Umstände können bei Fohlen die Entstehung der Lungenerkrankungen fördern, sondern auch anatomische Besonderheiten des juvenilen Atmungsapparates, wie z.B. die zur Lungenoberfläche verhältnismäßig kleinen Alveolen und die bei der Geburt noch unzureichend entwickelte mukoziliäre Clearance (BEECH 1985). Demzufolge sind die Ursachen für eine auftretende Erkrankung nach einer Infektion meist multifaktoriell. Als Krankheitsursache müssen daher viele verschiedene Erreger in Betracht gezogen werden.
Von besonderer Bedeutung als virale Erreger von Atemwegsinfektionen sind Herpesviren der Serotypen 1 und 2, Influenzaviren, Adenoviren und das Equine Arteriitis Virus (BOSTEDT 1999). Diese und andere Viren werden ebenso wie Endoparasiten, wie z.B. Parascaris equorum als Wegbereiter für bakterielle Infektionen angesehen (BEECH 1985; CHAPMAN 2000; TIMONEY 2004; VARGA et al. 1997). Pilze, wie Aspergillus spp., Sporozoa und Hefen wie Histoplasma capsulatum und Pneumocystis carinii werden bei Fohlen wie auch bei Säuglingen immer wieder im Zusammenhang mit Atemwegsinfektionen genannt (BEECH u.
SWEENEY 1991; PERRON-LAPAGE et. al. 1999).
2. Literaturübersicht
16
2.2 Rhodococcus equi
2.2.1 Geschichtlicher Überblick und taxonomische Einordnung
Die erste Beschreibung von Rhodococcus equi (R. equi) als Erreger von eitriger Bronchopneumonie bei Fohlen geht auf MAGNUSSON (1923) in Schweden zurück.
Zunächst ordnete MAGNUSSON den Erreger, den er beschrieb, auf Grund seiner Unbeweglichkeit, der fehlenden Sporenbildung, der grampositiven Anfärbbarkeit, der Pleomorphie und der Indolbildung der Gattung Corynebakterium zu.
In Deutschland wurde im selben Jahr von MIESSNER und WETZEL (1923) der gleiche Erreger isoliert. Die Autoren bezeichneten ihn auf Grund seiner eiterbildenden Eigenschaften als Corynebakterium pyogenes equi. LÜTJE schlug ebenfalls 1923 vor, den Erreger Corynebakterium pyogenes equi roseum zu nennen.
In den folgenden Jahren wurde der Erreger weltweit von unterschiedlichen Autoren isoliert, u.a. von BULL (1924) in Australien, von DIMOCK und EDWARDS (1931) in den USA, in Indien durch RAJAGOPLANA (1936) und durch die Engländer CRAIG und DAVIES (1940) in Großbritannien. Nachdem es möglich wurde den Erreger durch moderne Methoden besser zu untersuchen und eine Ähnlichkeit zu Mykobakterien festgestellt wurde, entstand die Benennung Mycobacterium equi (JENSEN 1934; KRASIL’NIKOV 1966). GORDON wollte 1966 das Bakterium auf Grund seiner Eigenschaften zwischen Mykobakterien und Nocardien als neue Spezies mit dem Namen Mycobacterium rhodochrous einordnen. Nachdem man die Erkenntnis hatte, dass in der Zellwand des Erregers N-glykolierte Muraminreste enthalten sind (UCHIDA u. KO 1977), welche man sonst nur bei Mykobakterien, Nokardien und Rhodokokken kannte, wurde der Erreger nach Vorschlägen von GOODFELLOW und ALDERSON (1977) in Rhodococcus equi umbenannt. Die Bezeichnung Rhodococcus ist auf Grund seiner unterschiedlichen Morphologie, von stäbchenförmig bis kugelig (rod to coccus), gewählt worden (PRESCOTT 1991).
17
2.2.2 Vorkommen und Bedeutung von Rhodococcus equi
Rhodococcus equi (R. equi) ist ein ubiquitär vorkommender Bodensaprophyt mit ausgesprochen hoher Tenazität (KNOTTENBELT 1993; MAKRAI et al. 2002;
MEYER-HAMME 2004; MUSCATELLO et. al. 2006). Es ist möglich R. equi weltweit, außer in der Antarktis, nachzuweisen (ELLENBERGER u. GENETZKY 1986). Der Nachweis gelang 1984 (BARTON u. HUGHES) nicht nur bei Pferden, sondern auch bei Rindern, Schafen, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Außerdem wurde gezeigt, dass sich der Erreger innerhalb von 14 Tagen bei allen Tierarten, bei denen er nachgewiesen wurde, um das 10.000 fache vermehren kann. JENSEN (1934) konnte den Keim aus Böden ohne Tierpopulation isolieren, jedoch wird der Keim in Gegenden mit Tierhaltungen vermehrt angetroffen. Dass es sich bei dem Bakterium um einen Bestandteil der physiologischen Darmflora handelt, wurde 1980 von WOOLCOCK, MUTIMER und FARMER publiziert.
R. equi kann im Frühjahr ab April und über die Sommermonate in der nördlichen Hemisphäre in steigenden Konzentrationen im Boden isoliert werden (TAKAI et. al.
1987). Das Überleben des Erregers in der Umwelt ist von verschiedenen Faktoren abhängig. R. equi ist ein obligat aerober Keim, der sein Wachstumsoptimum bei einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5 und einer Temperatur von ca. 30° C hat. Ausreichende Konzentrationen von Propionat oder Acetat im Pferdekot können das Wachstum des Erregers positiv beeinflussen (HUGHES u. SULAIMAN 1987). Seine Widerstandsfähigkeit gegenüber Säuren, Basen und Desinfektionsmitteln ist von diversen Autoren beschrieben worden (MAGNUSSON 1938; WILSON 1955;
BARTON u. HUGHES 1980; TAKAI et. al. 1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).
R. equi ist für unterschiedliche Krankheitsgeschehen bei Mensch und Tier verantwortlich (PRESCOTT 1991; HONDALUS 1997; TKACUK-SAAD et al. 1998;
HYLTON et al. 2006). In der Humanmedizin ist der Keim vor allem bei immunsuppremierten Patienten mit dem HI-Virus als pathogener Keim in Erscheinung getreten (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).
2. Literaturübersicht
18
In der Veterinärmedizin ist der wichtigste Wirt von R. equi das Fohlen. Bei Fohlen im Alter von bis zu sechs Monaten führt R. equi vor allem während der Sommermonate, also in der Zeit, in der die Konzentration des Erregers in der Umwelt am höchsten ist (TAKAI et al. 1987), zu abszedierenden Bronchopneumonien, die sporadisch oder endemisch auftreten können (MAGNUSSON 1923; WILSON 1955; PRESCOTT et al.
1984; YAGER 1987; BEECH u. SWEENEY 1991; AINSWORTH 1999; ALTHAUS 2004). Der Krankheitsverlauf soll nach TAKAI et. al. (1991, 1994) allerdings nicht mit dem Keimdruck, sondern mit dem Vorhandensein des Virulenzproteins A (Vap A) korrelieren.
Die Morbidität durch R. equi-Infektionen bei Fohlen eines Betriebes mit endemischer Rhodokokkose liegt zwischen 5 % und 60 %, bei einer Letalität von 40 % bis 80 % und einer Mortalität von 5 % bis 17 %. Die Todesfälle zeigen eine Häufung im Lebensalter von zwei Monaten (BEECH u. SWEENEY 1991). Es treten bei ca. 50 % der an R. equi erkrankten Fohlen zusätzlich extrapulmonale Erkrankungsanzeichen auf (CIMPRICH u. ROONEY 1977; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999). Adulte Pferde erkranken im Gegensatz zu Fohlen äußerst selten, sie können aber Träger bzw. Überträger des Bakteriums sein und R. equi kann bei Infektionen des Genitaltraktes der Stute, bei Fertilitätsproblemen und Abortgeschehen eine Rolle spielen (BRUNER et al. 1939; SIPPEL et al. 1968; SZEREDI et al. 2006).
Infektionswege für den Erreger sind vor allem das Einatmen von R. equi-haltigem Staub und die orale Aufnahme von kontaminiertem Kot (PRESCOTT et al. 1985).
Eine weitere Möglichkeit sind omphalogene und intrauterine Infektionswege und eine kontaminierte Umgebung (BARTON u. HUGHES 1980; BEECH u. SWEENEY 1991;
MUSCATELLO et al. 2006).
2.2.3 Morphologie, Kultivierung und biochemische Eigenschaften
Rhodococcus equi ist ein grampositives, säurefestes, pleomorphes, unbewegliches, ca. 1,2 x 1,4 µm großes Stäbchen mit einer Polysaccharidkapsel (WILSON 1955;
19
SMITH 1966; WOOLCOCK u. MUTIMER 1978; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997).
R. equi ist obligat aerob und stellt keine besonderen Ansprüche an Nährmedien (PRESCOTT 1991; TAKAI et al. 1994, 1996). Das Bakterium wächst auf bluthaltigen Nährböden ohne Hämolyse, in feuchten, großen Kolonien, die zunächst schleimig weiß-grau glänzend erscheinen, bis sie nach 48 h Bebrütung zu rötlich- lachsfarbenen, 1-4 mm großen Kolonien mit erdigem Geruch konfluieren (MIESSNER u. WETZEL 1923; MUTIMER u. WOOLCOCK 1981; PRESCOTT 1991).
In flüssigen Medien können bazilläre Formen zu beobachten sein, diese sind teilweise in der Lage Verzweigungen zu bilden (GOODFELLOW 1989; PRESCOTT 1991). Zur kulturellen Anzucht eignen sich das NANAT-Selektivmedium (Nalidixin- Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit), auf dem das Bakterium in schwarzen Kolonien wächst (WOOLCOCK et al. 1979; BARTON u. HUGHES 1981; MUSCATELLO u.
BROWNING 2004) und das CAZ-NB-Agar (Ceftazidim-Novobiocin) nach VON GRAEVENITZ und PÜNTER-STREIT (1995). Auf Blutagar haben MUTIMER und WOOLCOCK (1981) eine Unterscheidung von vier Typen nach der jeweiligen Morphologie, von klassisch-schleimig bis sehr klein und trocken, vorgenommen. Das optimale Wachstumsmilieu für R. equi liegt bei 37°Celsius. Überleben ist den Isolaten jedoch auch noch bei Temperaturen zwischen 10° und 40°C möglich. Ein schwach saurer pH-Wert zwischen 6 und 8 begünstigen das Wachstum des Bakteriums (MAGNUSSON 1923; BARTON u. HUGHES 1980).
Während der mikroskopischen Untersuchung ist eine Veränderung von R. equi je nach Bebrütungsdauer zu erkennen. Nach einer Inkubation von 6 h zeigen die Kulturen eine eher bazilläre Form, wohingegen nach einer Bebrütung von 24 h kokkoide Formen dominieren (Mc NEIL u. BROWN 1994). Diese Veränderung der Gestalt entsteht durch Fragmentierung der stäbchenförmigen Keime (GOODFELLOW 1989). Die Größe und Form von R. equi variieren je nach Milieu und Temperatur der Bebrütung (MAGNUSSON 1938; ROGOSA et al. 1974).
Mikroskopisch stellt sich das einzelne Bakterium in einer Größe von 1 µm im Durchmesser und ca. 2 µm in der Länge dar und es kann einzeln, paarweise oder in Haufen zu sehen sein (BOHN u. ROTHSCHILD 2002).
2. Literaturübersicht
20
Die charakteristischen biochemischen Eigenschaften von R. equi sind die Bildung von Urease und Katalase, sowie von Lipase und Phosphatase und die Reduktion von Nitrat. Einige Stämme bilden Schwefelwasserstoff oder hydrolysieren Hippurat und Äskulin oder zeigen eine positive Leucin-Arylamidase-, Varyl-Arylamidase- und α- Glucosidasereaktion (SIPPEL et al. 1968; BARTON u. HUGHES 1980; MUTIMER u, WOOLCOCK 1981, 1983; PRESCOTT 1991) R. equi kann verschiedene Kohlenstoffquellen wie Alkohole und Natriumlaktat nutzen (GOODFELLOW 1986), auch kann es Kaliumnitrat und Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle verwenden (ROWBOTHAM u. CROSS 1977; PRADIP et al. 1966) und Glucose verstoffwechseln (Mc NEIL u. BROWN 1994).
2.2.4 Virulenzfaktoren
Die Virulenz von R. equi ist auf die Fähigkeit zurückzuführen, dass das Bakterium sich in Makrophagen vermehren und dort von immunschwachen Individuen nicht erfolgreich bekämpft werden kann (HONDULAS u. MOSER 1994).
Dies ist dem Erreger möglich, weil er in der Lage ist, die endosomale Reifung der Makrophagen zu beeinflussen und die Ansäuerung der Vakuole, in der er sich befindet, zu verhindern (ZINK et al. 1987; FERNANDEZ-MORA et al. 2005;
TOYOOKA et al. 2005). Es wird vermutet, dass R. equi-Stämme nicht immer die gleichen Virulenzfaktoren besitzen, da das Bakterium zwar in den meisten Pferdebeständen nachgewiesen werden kann, jedoch nicht immer zu endemischen Krankheitsausbrüchen bei Fohlen führt (ROONEY 1966). Es besteht auch ein großer Unterschied in der Virulenz zwischen R. equi-Stämmen aus endemisch-infizierten Betrieben und Stämmen aus Betrieben ohne Krankheitsausbrüche, die auf R. equi zurückzuführen sind (BOWLES et al. 1987; TAKAI et al. 1991). Außerdem weisen Isolate, die man von klinisch kranken Fohlen gewonnen hat, eine höhere Virulenz als Isolate aus der Umgebung auf (ROONEY 1966).
21
Mögliche Virulenzfaktoren sind so genannte „Equi-Faktoren“. Als „Equi-Faktoren“
bezeichnet man Exoenzyme mit membranolytischen Eigenschaften, zum Beispiel Cholesteroloxidase und Phospholipase C. Möglicherweise spielen auch Kapselpolysaccharide eine Rolle, indem sie die Phagozytose des Wirts verhindern (PRESCOTT et al. 1982, 1984; HONDALUS 1997).
Der wichtigste Virulenzfaktor von R. equi ist jedoch das Protein Vap A (Virulence associated protein A), ein 15 - 17 kDa großes Protein, welches auf der Bakterienoberfläche exprimiert wird (TAKAI et al. 1995; GIGUÈRE et al. 1999;
LÜHRMANN et al. 2004). Das Vap A Gen ist auf einem Plasmid von 80 – 85 kb Größe lokalisiert, welches ausschließlich von virulentem R. equi-Stämmen exprimiert wird. Avirulenten Stämmen, die das Vap A-Gen nicht bilden können, fehlt durch das fehlende Gen die Fähigkeit sich in Makrophagen zu vermehren (HONDALUS u.
MOSSER 1994; WADA et al. 1997; GIGUÈRE et al. 1999; MEIJER u. PRESCOTT 2004). Das Vorhandensein des Vap A -Gens wird durch einen pH-Wert von 5,0 bis 6,5 und eine Temperatur von 37° bis 38° C und eine erhöhte Eisenkonzentration begünstigt. Hingegen hemmt ein Magnesiummangel die Expression des Proteins auf der Bakterienoberfläche (TAKAI et al. 1996; JORDAN et al. 2003; MEIJER u.
PRESCOTT 2004). Es sind weitere sieben extrazelluläre Proteine bekannt, die in der Lage sind, Vap-Gene zu kodieren (BYRNE et al. 2001; POLIDORI u. HAAS 2006).
Das Vap B-Gen konnte von TAKAI (1996) und LÜHRMANN et al. (2004) isoliert werden, es ist ein 20 kDa großes Protein, das in R. equi-Stämmen erkrankter Hausschweine gefunden wurde.
2.2.5 Rhodococcus equi bedingte Erkrankungen bei Fohlen
Die charakteristische Erkrankung, die durch R. equi bei Fohlen hervorgerufen wird, ist eine abszedierende Bronchopneumonie mit eitriger Lymphadenitis. Dieses Krankheitsgeschehen tritt meist im Alter von bis zu sechs Monaten auf und bleibt klinisch inapparent, bis die durch den Erreger hervorgerufenen Läsionen in einem
2. Literaturübersicht
22
fortgeschrittenen Stadium sind. Die Symptome der R. equi-Erkrankung sind nicht pathognomisch, sondern gleichen Befunden von Lungenerkrankungen, die auch von anderen Erregern hervorgerufen werden können (BEECH u. SWEENEY 1991;
PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; AINSWORTH 1999; ALTHAUS 2004).
Es wird bei der R. equi -Erkrankung zwischen perakuten, akuten und chronischen Verlaufsformen unterschieden. Bei der perakuten Verlaufsform sind die klinischen Anzeichen plötzliche Atemnot und hohes Fieber bei zuvor unauffälligen Tieren. Der perakute Verlauf der Infektion hat nicht selten den Tod des betroffenen Fohlens zu Folge (MARTENS et al. 1982; BEECH u. SWEENEY 1991). Bei der akuten Verlaufsform kann hohes Fieber (bis 41,5°C), Lethargie, Tachypnoe, Husten, abdominal verstärkte Atmung, Inappetenz und ein- oder beidseitiger muköser bis purulenter Nasenausfluss beobachtet werden. Bei einer eingehenden Untersuchung der Lunge können auskultatorisch ein verschärftes Atemgeräusch, Rasseln oder Giemen in der Lunge und Trachea festgestellt werden. Die Befunde der Auskultation sind meist im kranioventralen Thoraxbereich verstärkt festzustellen. Die Atemgeräusche können durch eine Bronchopneumonie oder fokal durch Abszesse vermindert sein, was einen Rückschluss zwischen Atemgeräusch und Krankheitszustand nicht zulässig macht (MARTENS et al. 1982; FALCON et al.
1985; BEECH u. SWEENEY 1991; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999). Der chronische Verlauf der R. equi-Erkrankung stellt sich mit deutlich abgeschwächten Symptomen dar. Zusätzlich können typische Anzeichen von chronischen Erkrankungen, wie Abmagerung und struppiges Haarkleid oder trockener Husten, festgestellt werden (FALCON et al. 1985).
Die Lungenabszesse, die durch R. equi bei Fohlen auftreten, können in allen Bereichen der Lunge und in allen Größen vereinzelt sowie zahlreich nachgewiesen werden. Bei einer geringen Anzahl und einem kleinem Abszess-Durchmesser (bis max. 5,0 cm) kann es bei diesen Lungenabszessen auch zu Spontanheilungen kommen (GRAVERT 2006).
Im Zusammenhang mit R. equi-Infektionen werden selten auch extrapulmonale Krankheitsbilder beobachtet. So können Abszesse nicht nur im Lungengewebe
23
sondern auch intrathorakal, intraabdominal, intrakranial, vertebral und paravertebral nachgewiesen werden (CHAFFIN et al. 1995; WION et al. 2001; BOHN u.
ROTHSCHILD 2002; VALDES u. JOHNSON 2005; JANICEK et al. 2006).
Weiterhin treten bei ca. 50% der an R. equi erkrankten Fohlen Durchfälle und Kolik auf, die durch eine ulzerative Typhlocolitis hervorgerufen werden (PRESCOTT u.
HOFFMAN 1993; CHAFFIN u. MARTENS 1997; HONDALUS, 1997). Vereinzelt können auch septische Arthritiden oder Osteomyelitiden und Polysynovitis auftreten (MARKEL et al. 1988; MADISON u. SCARRATT 1990; FIRTH et al. 1993; GIGUÈRE u. LAVOIE 1994; OLCHOWY 1994; COLLATOS et al. 1999). Weiterhin sind Uveitis, Hypopyon, Anämie und Thrombozytopenie beschrieben (BLOGG et al. 1983;
CHAFFIN u. MARTENS 1997). Infektionen mit R. equi führen in einzelnen Fällen auch bei adulten Pferden in stark abgeschwächter Form zu denselben Krankheitsbildern wie beim Fohlen (PRESCOTT 1991).
2.2.6 Pathogenese der Rhodokokkose
Erkrankungen durch R. equi sind in einigen Pferdebeständen endemisch, in anderen sporadisch und in den meisten Beständen nicht bekannt (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; MEIJER u. PRESCOTT 2003). Diese Unterschiede hängen auch mit unterschiedlichen klimatischen Verhältnissen zusammen. In Gebieten mit höheren Temperaturen und staubigen Böden tritt eine Erkrankung durch R. equi häufiger auf. Auch der pH-Wert der Böden, die Luftfeuchtigkeit und die bakterielle Umgebung nehmen Einfluss auf den Erreger (TAKAI et al. 1991; PRESCOTT u. HOFFMAN 1993). Das Hygiene-Management auf einem betroffenen Betrieb kann eine Rolle für die Häufigkeit einer R. equi Erkrankung spielen. Mit Pferdekot kontaminierte Böden und staubige oder graslose Ausläufe stellen für die Tiere einen starken Infektionsherd dar, da der Erreger sich in einem solchen Milieu optimal vermehren kann (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993;
MEIJER u. PRESCOTT 2003; CHAFFIN et al. 2007). Unabhängig von der
2. Literaturübersicht
24
Umgebung nehmen auch die Fohlen selbst Einfluss auf die Entwicklung des Bakteriums, da diese eine besondere Anfälligkeit aufweisen können. Die Erstbesiedlung oder eine Infektion der Fohlen mit dem Erreger erfolgen meist durch Inhalation mit Staub oder durch Ingestion von Kot der Stute oder Boden aus der Umgebung. Im Darm kann sich der aerobe R. equi nicht besonders gut vermehren, aber der Kot im Darm lässt eine Vermehrung des Erregers bis zu einem Faktor von 1000 zu (BARTON u. HUGHES 1984; HUGES u. SULAIMAN 1987). Infizierte Fohlen stellen allerdings die größte Infektionsquelle dar, da sie in großer Anzahl den Erreger ausscheiden und so ihre gesamte Umgebung kontaminieren (TAKAI 1997).
Als Infektionswege werden neben oraler Aufnahme und Inhalation die Infektion über den Nabel und die intrauterine Infektion beschrieben (BARTON u. HUGHES 1980).
Für eine Erkrankung begünstigend wirkende Faktoren sind unter anderem eine Schwäche des Immunsystems, Endoparasitenbefall, Stress durch Transporte, zu große Besatzdichte oder veränderte Herdenzusammenstellungen oder andere Erkrankungen (PRESCOTT u. HOFFMAN 1993).
2.3 Diagnose von Rhodococcus equi-Erkrankungen bei Fohlen
Eine möglichst frühe Diagnose der R. equi-Pneumonie verbessert die Prognose für die erkrankten Tiere erheblich. Eine klinische Verdachtsdiagnose ist nicht in allen Fällen durch einen kulturellen Nachweis zu bestätigen. Erschwerend für die Diagnose ist, dass der Erreger nur bei knapp 50 % der betroffenen Fohlen isoliert wird, da der Erreger über eine intrazelluläre Überlebensstrategie verfügt und nur periodisch ausgeschieden wird (MARTENS 1982; VENNER et al. 2007). Um eine möglichst sichere Diagnose stellen zu können, sollten daher mehrere Untersuchungsverfahren gewählt werden. Neben den klinischen Befunden sollte eine genaue Anamnese erhoben werden. Um die dadurch gestellte Verdachtsdiagnose zu festigen, stellt die Methode der Wahl eine Kombination aus kultureller und zytologischer Untersuchung von Tracheobronchialsekret dar und die Untersuchung
25
mit Hilfe von bildgebenden Verfahren wie Ultraschall oder Röntgen (PRESCOTT 1991; GIGUÈRE u. PRESCOTT 1997; ALTHAUS 2004; WEIMAR 2006).
2.3.1 Hämatologische Parameter
Die hämatologischen Parameter zur Erkennung einer R. equi-Erkrankung können nur als Hilfsmittel angesehen werden. Es steht kein spezifischer Parameter zur Verfügung, an dem sich ein eindeutiges Anzeichen für eine Rhodococcus equi- Erkrankung erkennen lässt, da bei einer Rhodokokkose nur unspezifische Veränderungen des Blutes festzustellen sind. Hinweise für eine R. equi-Erkrankung kann eine Leukozytose mit einer Leukozytenzahl von > 13.000 Zellen / µl Blut und eine Hyperfibrinogenämie über 500 mg / dl geben. Die Aussagekraft der Leukozyten erwies sich als zuverlässiger, als die Bestimmung der Plasmafibrinogen- Konzentration (GIGUÈRE 2003).
Bisher hat sich die Bestimmung des C-reaktiven-Protein als nicht diagnostisch verwertbar bei der R. equi-Pneumonie des Fohlens erwiesen (HEYERS 2004).
2.3.2 Bildgebende Verfahren
Als Standard zur Erkennung von R. equi-Erkrankungen haben sich besonders die röntgenologische und die ultrasonographische Untersuchung etabliert. In der Literatur werden auch computertomographische und szintigraphische Untersuchungen beschrieben. Ihre Durchführung hat sich allerdings auf Grund von Aufwand und Kosten als unakzeptable und nicht praxisrelevant erwiesen (MARKEL et al. 1986, 1988; WION et al. 2001). Die durch die R. equi-Infektion hervorgerufenen Lungenveränderungen sind mittels Röntgentechnik bereits vor Auftreten klinischer Befunde zu erkennen (HILLIDGE 1987; ZERTUCHE u. HILLIDGE 1987). Als technische Ausstattung wird eine Film-Folien-Kombination mit einer Körnung von 400
2. Literaturübersicht
26
empfohlen, bei einem Film-Focus-Abstand von 100 cm (WALTHER 2006). Im latero- lateralen Strahlengang werden beide Lungenhälften zwar übereinander projiziert, jedoch sind die relevanten Bereiche gut zu diagnostizieren, da sich die röntgenkassettennahe Lungenhälfte deutlicher darstellt als die Kassettenferne (LESTER u. LESTER 2001; SANDE u. TUCKER 2004). Veränderte Bereiche stellen sich röntgenologisch als regionale Verschattung dar, ein Abszess wird als rundliches Gebilde auf den Röntgenfilm projiziert (FALCON et al. 1985; WALTHER 2006).
Die transkutane Ultraschalluntersuchung ist ebenfalls gut geeignet um veränderte Befunde im Lungenbereich festzustellen, wobei die veränderten Bereiche hier im peripheren Lungengewebe vorhanden sein müssen und die Ausdehnung und die Anzahl der Veränderungen teilweise nicht genau festzustellen sind (WALTHER 2006).
Die Kombination aus sonographischer und röntgenologischer Untersuchung hat sich bewährt und wird empfohlen (REEF 1991; RAMIREZ et al. 2004; WALTHER 2006).
Die transkutane Ultraschalluntersuchung der Lunge sollte von möglichst weit kaudal nach möglichst weit kranial in den Rippenzwischenräumen, dem sogenannten akustischen Fenster (SCHWERK 1993), beidseits durchgeführt werden. In den meisten Untersuchungen ist eine Befundung des 3. bis 17. Rippenzwischenraums möglich. Für die Untersuchung am Fohlen werden Ultraschallgeräte mit einer Linear- oder Sektor-Sonde und einer Frequenz von 5,0 bis 7,5 MHz empfohlen, es sollte eine Eindringtiefe von vier bis zwölf Zentimetern gewählt werden (O’BRIEN u.
BILLER 1997; ALTHAUS 2004; WALTHER 2006).
Bei Untersuchungen von Fohlen auf einem Gestüt mit endemischer R. equi- Pneumonie konnte nach Diagnosestellung durch bildgebende Verfahren bei vier von fünf Fohlen post mortem der Erreger R. equi aus dem Abszess-Material isoliert werden (WEIMAR 2006). Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Ultraschall- und Röntgentechnik zur Diagnostik von R. equi-Erkrankungen.
27 2.3.3 Nachweis von R. equi
2.3.3.1 Probenmaterialien
R. equi ist als ubiquitär vorhandener, nocardiformer Actinomycet in Erde, Wasser und Dung zu finden, auch als Erdsaprophyt wurde er nachgewiesen (JENSEN 1934;
ROONEY 1966; SMITH 1966). Ebenso wurde R. equi als physiologischer Bestandteil der Gastrointestinalflora des Pferdes beschrieben (KARLSON et al. 1940). Der kulturelle Nachweis von R. equi erfolgt beim Pferd bzw. Fohlen üblicherweise aus Proben der Atemwege, meistens aus Tracheobronchialsekret oder einer Trachealspülprobe. Bei Fohlen sind Nasentupfer als Nachweismaterial nicht geeignet. In einer klinischen Studie an 217 Fohlen eines endemisch-infizierten Betriebes konnte der Erreger nur bei 52 von 217 (24%) Proben aus dem Nasentupfer isoliert werden. Der Keim wurde hingegen aus dem Tracheobronchialsekret bei den gleichen 217 Fohlen in 118 Proben (54%) nachgewiesen (MEYER-HAMME 2004).
Der Nachweis aus dem Kot ist auch bei Pferden möglich, die keinerlei Kontakt mit R.
equi hatten (ARDENS et al. 1986).
Um den Nachweis zu optimieren, werden Selektivmedien eingesetzt (BARTON u.
HUGHES 1981). Selektivmedien enthalten verschiedene antibiotische Substanzen, die das Wachstum anderer Keime, als den zu Untersuchenden hindern sollen. So wurde von WOLLCOCK et al. (1979) z.B. das NANAT-Selektivnährmedium (Nalidixin-Acid-Novobiocin-Acid-Tellurit) entwickelt. R. equi stellt zwar keine besonderen Ansprüche an Nährmedien und wächst gut auf Blutagar (PRESCOTT 1991; TAKAI et al. 1994, 1996), wird aber auf Grund seines langsamen Wachstums, häufig von anderen, schneller wachsenden Bakterien überwuchert. Mit dem von WOOLCOCK et al. entwickeltem Medium war es SMITH und ROBINSON (1981) möglich, R. equi selbst aus staubigen Spinnenweben nachzuweisen. Ebenso kann der Erreger auch in der Stallluft nachgewiesen werden, indem die Agar-Platten einen Meter hoch für 15 Minuten im Stall platziert und anschließend kultiviert werden (TAKAI et al. 1986). Der Nachweis aus der Atemluft von Fohlen auf endemischen
2. Literaturübersicht
28
Betrieben gelang MUSCATELLO (2007). In einer Studie von KILIAN (2008) konnte diese Methode nicht als sensitives Diagnostikum bestätigt werden. In einer Vergleichsstudie an acht Selektivnährmedien konnten mit dem CAZ-NB Medium (Ceftazidim-Novobiocin-Cycloheximd) und dem TCP-Medium (Trimethoprim- Cefoperazon-Polymyxin B) die besten Anzuchtresultate erzielt werden (MAKRAI et 2005).
Eine Unterscheidung zwischen virulenten und avirulenten R. equi-Stämmen in der Kultur ist aber nicht möglich (MUSCATELLO u. BROWNING 2004). Auf Grund der unterschiedlichen Ergebnisse in den verschiedenen Untersuchungen zum Nachweis des Erregers, sollten zur Diagnose der R. equi-Pneumonie neben dem kulturellen Nachweis stets die Befunde der klinischen und bildgebenden Untersuchungen mit berücksichtigt werden (GIGUÈRE u PRESCOTT 1997).
2.3.3.2 Molekularbiologischer Nachweis, Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine In-vitro-Methode, um spezifische DNA- Sequenzen zu vermehren (amplifizieren) und zu identifizieren. Der Vorteil gegenüber der Kultivierung eines Erregers liegt bei der PCR in der Möglichkeit ein schnelleres Ergebnis zu erhalten und auch von toten Mikroorganismen oder deren Bestandteilen noch einen Nachweis in einer Probe anfertigen zu können (SELLON et al. 2001). Ein Nachteil gegenüber der Kultur ist allerdings, dass die Sensitivität derzeit noch geringer ist als die der kulturellen Isolierung (NEUDERT 2007) und dass ein Resistenztest bei der PCR nicht möglich ist. Eine Kombination aus beiden mikrobiologischen Verfahren ist daher ratsam (SELLON et al. 2001; BOHN u.
ROTHSCHILD 2002; VENNER et al. 2007).
29 2.3.3.3 Zytologischer Nachweis
So wie der kulturelle Nachweis ist auch die zytologische Untersuchung ein semiquantitatives Nachweisverfahren, bei dem eine Aussage über die Virulenz von Rhodococcus equi-Stämmen nicht möglich ist.
Für die Darstellung der Bakterien im zytologischen Ausstrich aus einer Atemwegsprobe ist die Gram-Färbung am besten geeignet. Die grampositiven Keime, wie Rhodokokken, werden durch die Färbung dunkelblau von den übrigen, gramnegativen Zellen hervorgehoben (BEECH 1991; BOHN u. ROTHSCHILD 2002).
In einer vergleichenden Untersuchung konnte bei 61 % der kulturell-positiven Proben der Erreger aus Tracheobronchialsekret auch zytologisch bestätigt werden (SWEENEY et al. 1987).
Bei einer Atemwegsprobe sollte zusätzlich eine Zelldifferenzierung durchgeführt werden, da die Zellzusammensetzung der Probe eine weitere Aussage über den aktuellen Krankheitszustand erlauben kann (NEUDERT 2007). Weiterführende Untersuchungen mit Hilfe der Immunzytologie stehen noch aus.
2.3.4 Ausscheidung von R. equi beim Pferd
Die Erkenntnis über die Ausscheidung von R. equi von infizierten Tieren trägt zum Verständnis des Erregers erheblich bei. R. equi kann oft im Boden nachgewiesen werden und ist ebenfalls in Kot von grasenden Tieren nachweisbar (BARTON u.
HUGHES 1984). Das Bakterium wird von den grasenden oder vom Erdboden fressenden Tieren in den Verdauungstrakt aufgenommen und überlebt und vermehrt sich im Darm der Tiere. Der Erreger wird mit dem Kot wieder ausgeschieden (MUSCATELLO et al. 2007). Die Bodenverhältnisse nehmen Einfluss auf das Wachstum von R. equi im Boden und somit auch auf die Konzentration. So sind der pH, die Feuchtigkeit und die Temperatur im Erdboden entscheidende Kriterien für die
2. Literaturübersicht
30
Entwicklung des Keimes in der Umwelt bzw. im Erdboden (HUGHES u. SULAIMAN 1987).
Die Ausscheidung über den Kot ist sowohl bei Stuten als auch bei Fohlen untersucht worden. Auf endemischen Farmen ist ein Nachweis des Erregers aus dem Kot bei Stuten und Fohlen bei bis zu 100 % der Proben möglich (TAKAI et al. 1991). Der Nachweis im Kot von Fohlen ist als signifikant höher beschrieben worden, als der Nachweis aus dem Kot der Stuten (TAKAI et al. 1985). In anderen Untersuchungen wurde kein signifikanter Unterschied in der Ausscheidung bei Stuten und Fohlen festgestellt (NAKAZAWA et al. 1983). Bei Fohlen ist der Nachweis aus dem Kot schon ab der ersten Lebenswoche möglich. Die stärkste Ausscheidung ist in den ersten acht Lebenswochen festzustellen (TAKAI et al. 1986), wobei die Ausscheidung von R. equi über den Kot bei klinisch unauffälligen Fohlen nicht signifikant niedriger ist, als bei Fohlen bei denen eine R. equi assoziierte Pneumonie festzustellen ist (MARTENS et al. 2007).
Neben der Ausscheidung über den Kot gilt die Ausscheidung des Erregers über die Atemwege als bedeutend. Auf endemisch oder sporadisch betroffenen Farmen ist die Anzahl der positiven Ergebnisse aus den Atemwegen signifikant höher als bei Proben von Tieren auf einer Farm ohne bekannte R. equi Problematik (TAKAI et al.
1998).
Die Ergebnisse des Nachweises aus den Atemwegen sind stark abhängig vom Ort der Probenentnahme. Ein Tupferabstrich der Nasenschleimhaut bzw. Sekret der oberen Atemwege zum Nachweis von R. equi ist weniger sensitiv als ein Nachweis aus Tracheobronchialsekret. So waren bei 217 beprobten Fohlen mit sonographisch nachgewiesenen Lungenabszessen auf einem Betrieb mit endemischer Rhodokokkose nur bei 24 % der Nasentupfer R. equi-positiv. Im Vergleich dazu konnte R. equi bei 54 % der 217 Fohlen aus dem Tracheobronchialsekret nachgewiesen werden (MEYER-HAMME 2004).
Dass R. equi auch aus Proben der Atemluft von Fohlen nachgewiesen werden kann, wurde von MUSCATELLO et al. (2006) beschrieben. Die Autoren sammelten Proben
31
von 55 Fohlen, von denen bei 48 Tieren vorher eine R. equi-Pneumonie mit einem transkutanen Ultraschall diagnostiziert wurde. Die Atemproben wurden gewonnen, indem ein Gerät, welches die Atemluft ansaugt, vor das Fohlenmaul gehalten und 100 oder 250 Liter Luft ansaugt wurde. 31 dieser 48 Probanden (64,4 %) hatten nachweisbare Gehalte an virulenten R. equi in den Atemluftproben. Von den übrigen sieben klinisch gesunden Fohlen haben sechs virulente R. equi ausgeatmet. Aus den Ergebnissen wurde geschlossen, dass das Gewinnen von Proben der Atemluft ein sensitives diagnostisches Mittel zur Früherkennung infizierter Fohlen ist und somit die Ausscheidung des Erregers über die Atemluft ebenfalls eine Bedeutung hat. In einer Studie von KILIAN (2008) konnten die Ergebnisse von MUSCATELLO et al.
(2006) in einer Studie an 60 Fohlen nicht reproduziert werden.
2.3.5 Pathologie und Pathohistologie der R. equi-Pneumonie
Die durch R. equi hervorgerufene Pneumonie ist charakterisiert durch eine uni- oder meist bilateral abszedierende Bronchopneumonie (MARTENS et al. 1982; ZINK et al.
1986; AINSWORTH 1999; WEIMAR 2006). Das typische Erkrankungsalter liegt bei Fohlen bis zum sechsten Lebensmonat. Bei der chronischen Verlaufsform treten vor allem im cranio-ventralen Bereich der Lunge Abszesse auf, die bis zu mehreren Zentimetern im Durchmesser erreichen können.
Die Abszesse zeigen pathologisch einen purulentem, gelb-schmierigem bis bröckelig-käsigem Inhalt (MAGNUSSON 1923; ELLENBERGER u. GENETZKY 1986; ALTHAUS 2004). Die Lungenveränderungen im Bereich der Abszesse variieren im Anschnitt von speckig und derb bis rahmig und zähflüssig. Außerdem können in der pathologischen Untersuchung palpatorisch ödematöse und emphysematöse Bereiche beobachtet werden (WEIMAR 2006). Die Abszedierung kann auf die bronchialen und mediastinalen Lymphknoten übergreifen und die gesamte Lunge kann sich als schweres, dunkel verfärbtes und nicht kollabiertes
2. Literaturübersicht
32
Organ darstellen (SMITH u. ROBINSON 1981). Die luftführenden Wege sind in der Sektion im betroffenen Abschnitt mit mukopurulenten Sekret gefüllt.
Histologisch stellen sich Veränderungen im Charakter einer granulomatösen Entzündung dar. In den nekrotischen Bereichen sind randständig massenhaft Makrophagen und neutrophile Granulozyten zu erkennen. In diesen phagozytierenden Zellen sind unbeschädigte Rhodokokken darzustellen (HILLIDGE 1986; PRESCOTT 1991).
Die histologisch zu erkennenden Lungenveränderungen können eitrige, eitrig- nekrotisierende oder katarrhalisch-eitrige Pneumonien sein. Ebenfalls können alveoläre und alveolär-interstitielle Ödeme festgestellt werden (WEIMAR 2006).
Die seltenere akute Verlaufsform stellt sich mit milliären, dünnwandigen Abszessen im Parenchym der Lunge dar (BARTON u. HUGHES 1980; MARTENS et al. 1982).
Bei einem gastrointestinalen Verlauf der R. equi-Infektion können in der Sektion Veränderungen im gesamten unteren Verdauungsapparat festgestellt werden. Meist wird eine ulzerative Typhlitis oder Kolitis diagnostiziert (BARTON u. HUGHES 1980;
BEECH u. SWEENEY 1991).
2.4 Therapie der R. equi-Pneumonie des Fohlens
Die frühzeitige Diagnose ist ein wichtiges Kriterium für die Prognose bei der R. equi- Pneumonie des Fohlens. Bei der Behandlung steht eine antimikrobielle Therapie an erster Stelle. Bei der Wahl eines Antibiotikums müssen die charakteristischen Überlebensstrategien der Rhodokokken in einem Organismus berücksichtigt werden.
Ein geeigneter antimikrobieller Wirkstoff muss intrazellulär einen ausreichenden Wirkspiegel aufbauen können und eine geeignete Affinität besitzen, um in granulomatöses Entzündungsgewebe eindringen zu können (PRESCOTT u.
SWEENEY 1985; HILLIDGE 1986; AINSWORTH 1999). Damit das Antibiotikum in die Makrophagen und Granulozyten eindringen kann und gegen die intrazellulären
33
Rhodokokken wirken kann, muss der Wirkstoff lipophil sein, im Lungengewebe eine gute Anreicherung erzielen und das geeignete Wirkspektrum aufweisen (HILLIDGE 1986; BOHN u. ROTSCHILD 2002). Eine Kombination aus zwei Antibiotika vermindert das Risiko einer Resistenzentwicklung und wird deshalb bei der Behandlung der Rhodokokkose empfohlen (AINSWORTH 1999; GIGUÉRE et al.
2004; ROTHHAAR 2006). Die geeignetsten Antibiotika sind zurzeit eine Kombination aus Rifampicin und einem Makrolid. Die Kombination aus Rifampicin und Erythromycin war lange Zeit die Kombination der Wahl. Da Erythromycin aber starke Nebenwirkungen bei den Tieren, insbesondere bei den Stuten, in Form von lebensbedrohlicher Kolitis hervorrufen kann, wird Erythromycin nur noch selten eingesetzt (VIVRETTE 1992; GIGUÉRE u. PRESCOTT 1997; AINSWORTH 1999;
LAKRITZ u. WILSON 2002; KERTH 2005). Weitere sehr wirksame Makrolid- Antibiotika mit weniger Nebenwirkung als Erythromycin stellen Azithromycin, Tulathromycin (Draxxin®) und Clarithromycin dar, welche nach der Umwidmungskaskade gemäß Arzneimittelrecht eingesetzt werden können (DAVIS et al. 2002; LAKRITZ u. WILSON 2002; GIGUÉRE et al. 2004; PILTZ 2004; REINHOLD 2006).
Die Dauer der Antibiotikabehandlung liegt bei allen Antibiotika-Kombinationen in einem Bereich von vier bis neun Wochen. Die Behandlungsdauer sollte auch nicht kürzer gewählt werden, da eine kürzere Behandlung die Rezidivrate erhöht. Die Behandlung sollte so lange weitergeführt werden, bis klinisch, ultrasonographisch und radiologisch keine Lungenveränderungen mehr feststellbar sind (HILLIGE 1986;
REEF 1998; PILTZ 2004). Als begleitende Therapie sollten neben der gezielten Behandlung mit Rifampicin und einem Makrolid noch ein schleimlösendes Medikament eingesetzt werden. Bei einer Pneumonie ist auch von einem Bronchospasmus auszugehen, was den Einsatz von Bronchodilatatoren sinnvoll macht (VIVRETTE 1992; AINSWORTH 1999).
3. Material und Methode
34
3 Material und Methode
3.1 Material
3.1.1 Probanden
Die Untersuchungen fanden in der Zeit vom 17. Mai 2007 bis zum 25. Oktober 2007 auf einem Gestüt in Mecklenburg-Vorpommern, Deutschland statt, auf dem seit geraumer Zeit endemisch Rhodococcus equi Pneumonien auftraten. Für die Untersuchungen standen Warmblutfohlen zur Verfügung. Alle Fohlen wurden auf dem Gestüt unter gleichen Bedingungen geboren und für alle Tiere herrschten dieselben Haltungs- und Fütterungsbedingungen.
3.1.2 Haltung und Management der neonaten Fohlen
Die Fohlen wurden auf dem Gestüt in seperaten Stallungen geboren. Der Stall der für die Abfohlungen zur Verfügung stand, war nur über eine Hygieneschleuse zu begehen. Für die Geburt standen Boxen mit Stroheinstreu zur Verfügung, die Geburt der Fohlen wurde von geschultem Personal überwacht. Nach der Geburt wurden die Stuten mit Fohlen innerhalb der ersten Lebensstunden in eine unbenutzte, zuvor gereinigte und desinfizierte Box mit frischer Stoheinstreu innerhalb des Abfohlstallbereiches umgestallt. Nach der Geburt wurde den Fohlen der Nabelstumpf mit Chlorhexidindigluconat-Lösung 20 % (COM Pharma, Hamburg, Deutschland), welche auf 1 % verdünnt wurde, desinfiziert und es wurde ein Klistier (Practoclyss®, Fresenius, Bad Homburg, Deutschland) rektal verabreicht.
Acht bis zehn Stunden nach der Geburt wurden die Fohlen klinisch untersucht und venöses Blut aus der Vena jugularis externa entnommen, um den
35
Immunglobulingehalt zu bestimmen. Dies wurde mit Hilfe des Snap Foal IgG Tests®
(IDEXX, Westbrook, Maine, USA) durchgeführt. Lag das Ergebniss der IgG Bestimmung unter einem Wert von 8 g / l, so wurde den Fohlen hochwertiges Kolostrum oral oder per Nasenschlundsonde eingegeben. Der IgG-Wert wurde ca.
zwei Stunden nach dem eingeben des Kolostrum nochmal gemessen. War der Wert der zweiten Messung dann ebenfalls < 8 g / l, wurde den Fohlen Plasma infundiert.
3.1.3 Haltung und Management der älteren Fohlen
Zehn bis 14 Tage nach der Geburt wurden die Stuten mit ihren Fohlen in Laufställe umgestallt. Die Laufställe waren vor der Einstallung der jungen Fohlen und den Stuten gereinigt, desinfiziert (Neopredisan 4 %, Menno-Chemie, Norderstedt, Deutschland) und mit Stroh eingestreut. Jeder Laufstall verfügt über ein betoniertes Außenpaddock, die Pferdeanzahl variierte je nach Größe des Laufstalles zwischen acht und 14 Stuten mit Fohlen je Laufstall.
3.1.4 Impfung und Entwurmung
Impfungen und Entwurmungen wurden regelmäßig durchgeführt. Die Stuten waren alle gegen EHV 1 und 4, Equine Influenza und Tetanus nach Impfstoffhersteller- Angaben geimpft. Die Fohlen wurden erstmalig im Alter von 5 Monaten vacciniert.
Entwurmungen wurden bei den Stuten kurz vor dem Geburtstermin und sonst in Abständen von 3 Monaten mit wechselnden Wirstoffen durchgeführt. Die Fohlen wurden erstmals am 8. Lebenstag und weiter im Abstand von sechs Wochen mit Antiparasitika behandelt.
3. Material und Methode
36
3.2.1 Methode
3.2.1 Klinische Allgemeinuntersuchung der Fohlen
Alle Fohlen wurden wöchentlich einer klinischen Untersuchung unterzogen. Die Tiere wurden allgemein in ihrem Verhalten und Habitus beurteilt, die Körpertemperatur wurde rektal gemessen, die Kotkonsistenz beurteilt, der Nabelstumpf wurde kontrolliert, es wurde auf Verletzungen, Schwellungen oder sonstige Besonderheiten geachtet, und es wurden die Mandibularlymphknoten nach Größe, Konsistenz und Schmerzhaftigkeit beurteilt.
3.2.2 Spezielle klinische Untersuchung des Respirationstrakts
Im Rahmen der wöchentlichen Allgemeinuntersuchung wurde eine spezielle Untersuchung des Respirationstrakts durchgeführt. Es wurden die Nüstern auf Vorhandensein von Ausfluss untersucht, die Trachea und die Lunge auskultiert und beurteilt. Bei Vorliegen von nicht physiologischen Befunden wurde die Qualität und die Art der Befunde dokumentiert.
Die so erhobenen Befunde wurden anschließend nach Schweregrad in einem klinischen Score festgehalten (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998, Tab. 1).
37
Tab. 1: Klinischer Score zur Beurteilung des Schweregrades respiratorischer Symptome (modifiziert nach OHNESORGE et al. 1998)
Merkmal Befund Punktzahl
Nasenausfluss
nein 0
serös, seromukös 1
purulent 2
Hustenauslösung
nicht auslösbar 0
mehrfach 1
spontan 2
Lnn. mandibulares o.b.B. 0
vergrößert 1
Ruhedyspnoe nein 0
Einsinken der Interkostalräume,
Nüsternblähen 3
Lungenauskultation vesikulär, vesikulär verschärft 0 rasseln, knistern, giemen 2
Tracheaauskultation o.b.B 0
rasseln 2
Gesamtscore 0 – 12
Gradeinteilung der klinischen Befunde:
Klinischer Score von 0 - 1 = lungengesund
Klinischer Score von 2 - 3 = geringgradig erkrankt Klinischer Score von 4 - 5 = mittelgradig erkrankt Klinischer Score von > 5 = hochgradig erkrankt
3. Material und Methode
38 3.2.3 Labordiagnostische Untersuchung
Die Bestimmung der Blutleukozytenzahl wurde bei jedem Fohlen im Rahmen der wöchentlichen klinischen Untersuchung durchgeführt. Hierzu wurden den Fohlen aus der rechten oder linken Vena jugularis externa 1 - 2 ml Blut entnommen. Die Entnahme erfolgte durch die Punktion der Vene mit einer 1,2 x 40 mm großen Kanüle (20G; Becton, Dickinson and Company). Das Blut wurde in einem Kalium- EDTA beschichtetem Probenröhrchen (EDTA-K, Sarstedt) aufgefangen. Das so gewonnene Blut wurde daraufhin auf seinen Leukozytengehalt untersucht. Die Untersuchung erfolgte mit Hilfe eines Blutanalysegeräts (Sysmex KX-21N, Sysmex Deutschland GmbH, Hamburg) nach dem elektrischen Widerstandsprinzip.
3.2.4 Ultrasonographische Untersuchung der Lungen
Im Anschluss an die allgemeine und spezielle Untersuchung der Fohlen und der Auswertung der Blutleukozyten wurde bei Fohlen mit einem klinischen Score > 3, einer rektal gemessenen Körperinnentemperatur über 39,0°C oder einem Blutleukozytenwert von > 13000 Zellen / µl eine sonograhische Untersuchung der Lunge durchgeführt. Die sonographische Untersuchung wurde mit einem tragbaren Ultraschallgerät mit Akkubetrieb (Tringa L, Esaote Pie Medical, Maastricht, Niederlande) und dem mit dem Gerät fest verbundenem 5 MHz Linearschallkopf durchgeführt. Die betreffenden Fohlen wurden dabei von zwei Helfern an Hals und Hinterhand fixiert. Zur Vorbereitung des Schallbereichs wurde die Haut mit Isopropyl- Alkohol (2-Propanol 99 %, Pharma-Depot GmbH, Versmold) entfettet und anschließend Transmissionsgel (BLR Sonic Ultraschallgel, Waldeck, Münster) aufgetragen. Die transcutanen Ultraschall-Untersuchungsbereiche erstreckten sich auf beiden Thoraxseiten zwischen der Stammuskulatur (M. longissimus dorsi) dorsal, der Schultergürtelmuskulatur (M. tensor fasciae antebrachii, M. triceps brachii) kranial und dem Sternum sowie dem Zwerchfell ventral. Beginnend kaudodorsal im 15. Interkostalraum wurden so nach kranioventral bis zum vierten Interkostalraum
39
beide Thoraxhälften untersucht. Jeder Interkostalraum wurde dabei in drei vertikal verlaufende Bereiche A, B, C (dorsal, mittig, ventral) eingeteilt (ALTHAUS 2004).
Daraus ergibt sich, dass an der rechten und linken Körperseite jeweils 39 Bereiche sonographisch untersucht und in einem speziellen Ultraschallbefundblatt protokolliert werden konnten (s. Abb. 15). Im Anschluss an die Ultraschalluntersuchung erfolgte die Befundung. Im Ultraschallbild wurden hypoechogene, rundliche Bereiche ab einem Durchmesser von 10mm als Abszesse angesprochen. Um den Abszess- Score zu errechnen, der als Indikator für den Schweregrad der Lungenveränderung verwendet wurde, musste die Summe der Abszessdurchmesser in Zentimeter berechnet werden. Die so errechnete Zahl entspricht dem angegebenen Abszess- Score.
3.2.5 Röntgenologische Lungenuntersuchung
Alle Fohlen, die als gesund in die Studie aufgenommen werden sollten, wurden ein bis zwei Tage vor der Probengewinnung nach dem Protokoll von WALTHER (2006) röntgenologisch untersucht. Dies diente zur Sicherstellung der Aussage, dass es sich um lungengesunde Tiere handelte. Bei der Anfertigung der Röntgenbilder wurden ein mobiles Röntgengerät (HF 90/20, Gierth, Riesa), zwei 30 x 40 cm große Röntgenkassetten (Life Ray™ medium, Ferrania, USA und X-omatic medium, Kodak, USA), eine medium Film-Folien-Kombination (Vet-X-Ray, Dunker/Einfeldt, Eckernförde) sowie ein automatisches Entwicklungssystem (1135 X-OMAT Processor, Kodak, USA) verwendet.
Die Fohlen wurden ohne Sedierung im Stehen im latero-lateralen Strahlengang von beiden Seiten geröntgt. Sie wurden von zwei mit Bleischürzen ausgestatteten Personen an Hals und Hinterhand fixiert und von einer dritten Person mit Bleischürze wurde die Röntgenkassette so neben dem Fohlen platziert, dass der gesamte Lungenbereich abgedeckt wurde. Zur Kennzeichnung der plattennahen Thoraxseite wurde in der rechten bzw. linken oberen Ecke der Röntgenplatte ein entsprechendes Seitenzeichen angebracht. Bei einem Film-Focus-Abstand von 0,75 m wurde der Zentralstrahl so eingerichtet, dass er ca. eine handbreit hinter dem kaudalen Rand
3. Material und Methode
40
des M. triceps brachii und auf der Mittellinie des Thorax lag. Es wurde eine Belichtungszeit von 0,05 mAs bis 0,12 mAs gewählt. Die kV-Zahl variierte je nach Größe der Fohlen zwischen 78 und 88. Ausgelöst wurde jeweils am Ende der inspiratorischen Atemphase.
3.3 Probenentnahme
3.3.1 Aufnahmekriterien und Gruppeneinteilung der Fohlen
Die Fohlen, die in die Studie aufgenommen wurden, sind am Tag der klinischen Untersuchung in eine von drei Gruppen eingeteilt wurden. Die 1. Gruppe sind gesunde Fohlen, in die Gruppe 2 wurden lungenkranke Fohlen eingeteilt, die auf Grund der Befunde ein Antibiotikum bekommen haben und die 3. Gruppe sind Fohlen, die als lungenkrank diagnostiziert wurden, aber kein Antibiotikum appliziert bekommen haben.
Gruppe 1: Kontrollgruppe, gesunde Fohlen (n = 20)
Die Fohlen die in die Gruppe 1 aufgenommen wurden, mußten folgende Aufnahmekriterien erfüllen:
Die klinische Untersuchung der Tiere durfte am Tag der Untersuchung und bei vorausgegangenen Untersuchungen für die Gruppeneinteilung keine Auffälligkeiten aufweisen, die von den Normbefunden abweichen (klinischer Score < 2).
Die Untersuchung der Blutleukozyten durfte ebenfalls am Tag der Untersuchung und bei vorausgegangenen Untersuchungen für die Gruppeneinteilung nicht über einem Wert von 13000 Zellen / µl Blut liegen. Die beidseitige sonographische Untersuchung der Lunge durfte keine pneumologischen Veränderungen aufweisen. Die Fohlen waren zuvor nicht sonographisch untersucht worden, da es klinisch keine Indikation gab. Unmittelbar vor der Aufnahme in diese Gruppe und somit vor Probenentnahme wurden Röntgenbilder der Lunge angefertigt. Auf den Röntgenbildern durften keine Auffälligkeiten zu erkennen sein.
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Gruppe 2: R.equi-lungenerkrankte Fohlen mit Antibiotika (n = 21)
In die Gruppe 2 wurden Fohlen aufgenommen, bei denen nach der klinischen Untersuchung eine Indikation bestand die Lunge sonographisch zu untersuchen.
Die Ultraschalluntersuchung der Lunge mußte einen Abszess-Score > 5 cm im untersuchten Bereich aufweisen, damit die Fohlen in die Gruppe aufgenommen werden konnten. Diesen Fohlen wurde einen Tag nach der Diagnosestellung, über den gesamten Zeitraum der vorliegenden Studie, Antibiotika verabreicht.
Auf Grund der Ergebnisse von WEIMAR (2006), in der bei fünf euthanasierten Fohlen desselben Betriebes der Keimgehalt von Lungenabszessen untersucht wurde und dabei bei 80 % der Tiere pathomorphologisch Rhodococcus equi aus dem Abszessmaterial isoliert werden konnte, wird das Auftreten sonographisch darstellbarer Lungenabszesse in der vorliegenden Arbeit mit einer R. equi bedingten Lungenerkrankung gleichgesetzt.
Gruppe 3: R. equi-Lungenerkrankte Fohlen ohne Antibiotika (n = 27)
Fohlen, die am Tag der Untersuchung klinisch auffällig waren und bei denen daraufhin ebenfalls der Lungenbereich ultrasonographisch untersucht wurde und ein Abszess-Score < 5 cm diagnostiziert werden konnte, wurden der Gruppe 3 zugeordnet. Diese Fohlen wurden im Verlauf der Untersuchung zweimal wöchentlich klinisch und sonographisch untersucht. Wurde im zeitlichen Verlauf eine Zunahme des Abszess-Scores von > 5 cm im untersuchten Lungenbereich festgestellt, mussten die Tiere aus der Studie genommen werden und wurden entsprechend behandelt. Wenn ein Tier aus Gruppe 3 herausfiel, da es antibiotisch behandelt werden musste, wurden die bis zu diesem Zeitpunkt erhobenen Befunde und Ergebnisse mit in die Auswertung einbezogen.
3.3.2 Zeitpunkt der Gewinnung von Tracheobronchialsekret und Kotproben
Die Probengewinnung erfolgte bei allen Tieren der drei Gruppen gleich. Die Probenentnahme von Kot und Trachealsekret erfolgte immer zeitgleich.
3. Material und Methode
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Die erste Probenentnahme von Kot und Trachealsekret erfolgte am Tag der Diagnosestellung (Tag 0). Die zweite Kotprobe wurde an Tag 3 gewonnen. An Tag 7 nach Diagnose erfolgte die zweite Trachealsekretproben- und die dritte Kotprobenentnahme. Die dritte Trachealsekretproben- und die vierte Kotprobenentnahme wurde schließlich an Tag 14 nach Diagnosestellung durchgeführt.
Tab. 2: Zeitpunkt der Probenentnahme
Entnahme am:
___________
Probe aus:
Tag 0 Tag 3 Tag 7 Tag 14 Atemwege
(TBS)
X Probe 1
X Probe 2
X Probe 3
Kot X
Probe 1
X Probe 2
X Probe 3
X Probe 4
3.3.3 Endoskopische Probenentnahme aus der Trachea
Allen Fohlen, die in die Gruppen 1, 2 und 3 für die Durchführung der vorliegenden Studie aufgenommen wurden, wurden endoskopische Tracheobronchialsekretproben (TBS) entnommen.
Hierfür wurden die Stuten mit ihren Fohlen in nebeneinanderliegende Untersuchungsstände geführt. Die Fohlen wurden mit Xylazin in einer Dosierung von 0,5 mg / kg KM i.v. sediert. Nach einsetztender Wirkung der Sedation wurden die Fohlen von zwei Personen im Untersuchungsstand an Kopf und Hinterhand fixiert.
Vor Beginn der endoskopischen Probenentnahme wurden die Nüstern mit einem trockenen Papiertuch gereinigt. Für die Probenentnahme wurde ein 140 cm langes, flexibles Videoendoskop (Video-Endoskop Serie 138xx, 139 xx, Typ SG22-140, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) mit einem Durchmesser von 9,0 mm verwendet. Das Videoendoskop wurde an eine Lichtquelle (Xenon 100 Typ
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20132520, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) angeschlossen und mit dem Bildprozessor (Tele pack pal Typ 200430 20, Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Deutschland) verbunden. Die Möglichkeit, die Optik des Endoskops zu reinigen, bestand über eine Spüleinrichtung, die mit demineralisierten Wasser (IGEFA Handelsg. mbH & Co. KG, Dahlewitz, Deutschland) gefüllt war. Zur Probenentnahme aus der Trachea wurde in den Arbeitskanal des Videoendoskops ein 250 cm langer, steriler Kunststoffkatheter eingeführt. Zur Probenaspiration wurde am hinteren Ende des Katheters eine 20 ml Einmalspritze (B. Braun, Melsungen, Deutschland) aufgesetzt. Das Videoendoskop wurde von einer Person über den ventralen Nasengang in die Trachea eingeführt und von einer weiteren Person wurde vorhandenes Trachealsekret aspiriert.
Nach der Endoskopie wurde das Videoendoskop zunächst manuell gereinigt und der Arbeitskanal mit einer Reinigungsbürste gesäubert. Die weitere Reinigung und Desinfektion fand in einer Endoskopwaschmaschine (Dr. Fritz, Germany) statt. Als Reinigungsmittel wurde Neodisher mediclean (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich), und als Desinfektionsmittel Neodisher Septo DN (Dr. Weigert GmbH, Wien, Österreich) verwendet. Die benutzten Kunststoffkatheter wurden manuell gereinigt, getrocknet und mit einem Folienschweißgerät (Melaseal 101 comfort, Melag Apparate GmbH, Berlin) eingeschweißt. Danach wurden sie im Autoklaven (Autoklav 23, Melag Apparate GmbH, Berlin) bei 1 bar für 50 min autoklaviert.
3.3.4 Kotprobenentnahme
Die Kotprobenentnahme bei den Fohlen erfolgte mit Hilfe eines sterilen Tupferprobenentnahmebesteck mit Transportmedium nach Amies CLR (Meus, Piove di Sacco, Italien). Zur Beprobung wurde das sterile Tupferstäbchen des Probenbestecks in das Rektum des Fohlens vorsichtig 6,0 bis 8,0 cm eingeführt. Das Probenstäbchen wurde, um eine gute Haftung des Rektuminhaltes an dem Probenstäbchen zu erreichen, in kurzen Bewegungen hin und her bewegt und anschließend in das sterile Transportmedium eingeführt.
