Epidemiologische Untersuchungen zur Bedeutung und zum Vorkommen einer vermuteten Eperythrozoon-Infektion beim Pferd

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Epidemiologische Untersuchungen zur Bedeutung und zum Vorkommen einer vermuteten Eperythrozoon-Infektion

beim Pferd

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder eines Doktors der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae - ( Dr. med. vet. )

vorgelegt von Rutmer Niemendal

Sneek

Hannover 2009

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. T. Blaha

Außenstelle für Epidemiologie

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. T. Blaha 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. K. Feige

Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2009

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1. EINLEITUNG ... 1

2. LITERATURÜBERSICHT ... 2

2.1 Definition ... 2

2.2 Ätiologie ... 2

2.2.1 Nomenklatur ... 2

2.2.2 Phylogenetischer Analyse ... 4

2.2.3 Sonstige hämotrophe Mykoplasmen ... 5

2.2.4 In Situ Hybridisation ... 6

2.3 Morphologie ... 6

2.3.1 Feinstrukturelle Morphologie ... 6

2.3.2 Lichtmikroskopische Morphologie ... 8

2.4 Pathogenese ... 9

2.4.1 Übertragung ... 9

2.4.2 Stadien der Infektion ... 10

2.4.3 Erythrozyten-Beschädigung ... 10

2.4.4 Einfluss auf den Säure-Basen-Haushalt und den Kohlenhydratstoffwechsel ... 11

2.5 Immunologie ... 11

2.6 Diagnostik ... 12

2.6.1 Einleitung ... 12

2.6.2 Direkter Erregernachweis ... 12

2.6.3 Indirekter Erregernachweis ... 14

2.7 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schwein ... 15

2.7.1 Symptome ... 15

2.7.1.1 Klinisches Erscheinungsbild ... 15

2.7.1.2 Hämatologische Veränderungen ... 15

2.7.2 Pathologie ... 16

2.7.2.1 Sektionsbild ... 16

2.7.2.2 Histologie ... 17

2.7.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ... 17

2.7.4 Diagnostik ... 18

2.7.5 Therapie und Prävention ... 18

2.7.6 Bedeutung ... 19

2.8 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schaf ... 19

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2.9 Hämotrophe Mykoplasmen bei der Katze ... 21

2.9.1 Symptome ... 21

2.10 Hämotrophe Mykoplasmen beim Hund ... 26

2.10.1 Symptome ... 26

2.10.5 Therapie ... 27

2.10.6 Bedeutung ... 28

2.11 Hämotrophe Mykoplasmen beim Rind ... 28

2.11.1 Symptome ... 28

2.11.5 Therapie ... 29

2.11.6 Bedeutung ... 30

2.12 Hämotrophe Mykoplasmen bei andere Tierarten und beim Menschen ... 30

2.12.1 Symptome ... 30

2.12.5 Therapie ... 31

2.12.6 Bedeutung ... 31

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2.14 Hämatologie beim Pferd ... 34

2.14.1 Normale Hämatologie ... 34

2.14.2 Periphere Blutausstriche mit besonderer Beachtung der Erythrozyten ... 35

2.14.3 Hämolytische Anämie ... 36

3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN ... 38

3.1 Material und Methoden ... 38

3.1.1 Tiermaterial ... 38

3.1.2 Untersuchungsgruppen ... 38

3.1.3 Blutentnahme und Probenverarbeitung ... 40

3.1.4 Zytologische Untersuchung ... 41

3.1.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ... 42

3.1.6 Hämatologische Messwerte ... 42

3.1.7 Biometrische Analyse ... 42

3.2 Ergebnisse ... 44

3.2.1 Untersuchungsgruppen ... 44

3.2.2 Symptome ... 45

3.2.3 Zytologie ... 46

3.2.4 Hämatologie ... 54

3.2.5 Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits ... 58

3.2.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ... 59

4. DISKUSSION ... 60

4.1 Allgemeine Anmerkungen ... 60

4.2 Zytologie ... 61

4.3 Hämatologie ... 63

4.4 Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits ... 64

4.5 Bewertung der Fragestellung ... 65

5. ZUSAMMENFASSUNG ... 67

6. SUMMARY ... 70

7. LITERATURVERZEICHNIS ... 73

8. ANHANG ... 112

8.1 Abkürzungsverzeichnis ... 112

8.2 Herkunftsnachweis der verwendeten Materialien ... 113

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8.4 Tabellenverzeichnis ... 121

8.5 Abbildungsverzeichnis ... 122

8.6 Curriculum Vitae ... 123

8.7 Dankwort ... 124

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1. EINLEITUNG

Hämotrophe Mykoplasmen (Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies) sind Bakterien, die die roten Blutzellen parasitieren. Infektionen mit hämotrophen Mykoplasmen sind beim Schwein (SPLITTER 1950; NEIMARK et al. 2002 b), beim Schaf und bei der Ziege (NEITZ et al. 1934;

OVERAS 1969; NEIMARK et al. 2004), beim Rind (ADLER u. ELLENBOGEN 1934;

NEIMARK et al. 2002 b), bei der Katze (CLARK 1942; FOLEY u. PEDERSEN 2001;

NEIMARK et al. 2002 b; WILLI et al. 2005), beim Hund (TYZZER u. WEINMAN 1939;

MESSICK et al. 2002) und bei der Maus (SCHILLING 1928; TYZZER u. WEINMAN 1939;

NEIMARK et al. 2002 b, 2005) ausführlich beschrieben. Als Krankheitsverursacher sind diese hämotrophen Mykoplasmen-Spezies wissenschaftlich anerkannt.

In der Massentierhaltung, wie zum Beispiel in den sehr großen Betrieben in der ehemaligen DDR, wird diesen Erregern eine bedeutende Rolle zugeschrieben (BUGNOWSKI 1988;

BUGNOWSKI et al. 1989, 1990; WU et al. 2006). Verschiedene Fallberichte aus der letzten Zeit, u.a. beim Rind (ANON. 2007), beim Schwein (DE BUSSER et al. 2008), beim Schaf (PHILBEY et al. 2006) und beim Löwen (GUIMARAES et al. 2007 b), sowie die Beschreibung neuer hämotropher Mykoplasmen-Spezies bei der Katze (WILLI et al. 2005) und beim Rind (TAGAWA et al. 2008), zeigen zudem das aktuelle Interesse an diesem Thema.

In der wissenschaftlichen Literatur sind bisher keine Publikationen über die systematische Untersuchung zum Vorkommen von hämothrophen Mykoplasmen beim Pferd veröffentlicht worden. Nur eine Veröffentlichung aus dem Jahr 1978 beschreibt die Haemobartonellose bei Pferden in Nigeria (GRETILLAT 1978). Seit einigen Jahren kommt es aber immer häufiger zu Berichten aus der Praxis über Diagnose und Behandlung einer vermuteten Eperythrozoonose bei Pferden. Zum Teil bitten die Pferdebesitzer den Tierarzt explizit darum, ihre Pferde auf diesen

„Blutparasiten“ zu untersuchen. In verschiedenen Internetportalen ohne Anspruch auf

Wissenschaftlichkeit, zum Beispiel dem “ Hufreheforum „ (www.hufreheforum.de), wird diese Materie von Pferdebesitzern ausführlich diskutiert.

Laut Praxisberichten erfolgt der Nachweis dieser Parasiten beim Pferd an Hand einer lichtmikroskopischen Untersuchung eines Blutausstriches. Eine Behandlung wird mit Tetrazyklinen oder alternativen Heilverfahren durchgeführt.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zunächst, eine Übersicht über die wissenschaftlich beschriebenen hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei den unterschiedlichen Tierarten zu geben. Des Weiteren soll mittels einer explorativen epidemiologischen Studie die von vielen Tierärzten angenommene Kausalität zwischen Eperythrozoon (hämotrophe Mykoplasmen) und beobachteten klinischen Symptomen überprüft werden.

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2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Definition

Hämotrophe Mykoplasmen (Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies) sind sehr kleine, pleomorphe Bakterien ohne Zellwand oder Flagellen, welche resistent gegen Penicillin, aber empfänglich für Tetrazyklin sind. Eine in-vitro Vermehrung ist nicht möglich. Die Erreger werden auch als Hämoplasmen bezeichnet. Es sind die Krankheitsverursacher der

Eperythrozoonose und Haemobartonellose, bei der Katze auch als Infektiöse Anämie bekannt.

Hämotrophe Mykoplasmen sind weitverbreitet und wurden bei vielen Tierarten und beim

Menschen beschrieben (NEITZ 1968; PUNTARIC et al. 1986; GANTER et al. 1993; MESSICK 2003, 2004; SYKES 2003; TASKER 2006; HOELZLE 2007; WILLI et al. 2007 b).

KIKUTH (1928) führte in Deutschland Übertragungsversuche auf splenektomierte Hunde durch und ordnete den von ihm beobachteten Bakterien das Genus Bartonella zu. Später wurde der Name Bartonella canis in Haemobartonella canis geändert (TYZZER u. WEINMAN 1939).

Ebenfalls in Deutschland beschrieb SCHILLING (1928) diese Parasiten bei der weißen Maus.

Mit dem Namen Eperythrozoon coccoides kennzeichnete er das kokkenähnliche Aussehen und die Beziehung zum Erythrozyten. Bis vor wenigen Jahren wurden die Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies den Rickettsien zugeordnet. Basierend auf der Analyse des 16S rRNA Gens wurden die Spezies neu zu den Mykoplasmen eingeteilt (NEIMARK et al. 2001, 2002 b, 2004, 2005; MESSICK et al. 2002).

Eine Infektion verläuft im immunkompetenten Tier häufig latent und wird als Faktorenkrankheit angesehen, ein akuter Anfall kann durch Splenektomie hervorgerufen werden. Hauptsymptom ist eine hämolytische Anämie (NEITZ 1968; OVERAS 1969; MESSICK 2003, 2004; SYKES 2003; HOELZLE 2007).

2.2 Ätiologie 2.2.1 Nomenklatur

Über die Namensgebung der Eperythrozoonose- und Haemobartonelloseverursacher besteht aus mehreren Gründen Uneinigkeit. Kürzlich wurden diese Erreger basierend auf der Analyse des 16S rRNA Gens umklassifiziert in das Genus Mycoplasma (Ordnung Mycoplasmatales). Auch über diese Neueinteilung in das Genus Mycoplasma besteht Kontoverse (UILENBERG et al.

2004). Davor wurden diese Spezies als Eperythrozoon und Haemobartonella in der Ordnung der Rickettsiales eingeteilt. Als eigenständige Genera waren Eperythrozoon und Haemobartonella neben Anaplasma der Familie der Anaplasmataceae zugeordnet (KREIER et al. 1992). Die Namen dieser Spezies, sowie deren Wirte, sind in den Tabellen 2.1 und 2.2 aufgelistet. Es wurde nie klar definiert, welche Kriterien darüber entscheiden, ob von Eperythrozoon oder von

Haemobartonella zu sprechen ist. Hinzu kommt, dass von verschiedenen Autoren bei schon beschriebenen Spezies andere Namen verwendet wurden. So benutzen WEINMAN (1944) Haemobartonella wenyonii und SHERIFF et al. (1966) Bartonella bovis als Synonym für Eperythrozoon wenyonii. Haemobartonella felis wurde auch als Eperythrozoon felis bezeichnet (CLARK 1942).

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Spezies Wirt Referenz

Haemobartonella canis Hund TYZZER u. WEINMANN

1939

Haemobartonella felis Katze CLARK 1942

Haemobartonella muris Maus und andere Rodentia TYZZER u. WEINMAN 1939

Haemobartonella procyoni

Waschbär FRERICHS u.

HOLBROOK 1971

Tabelle 2.1: Beschriebene Haemobartonella-Spezies und deren Wirte

Spezies Wirt Referenz

Eperythrozoon coccoides

Maus und andere Rodentia

SCHILLING 1928 Eperythrozoon parvum Schwein SPLITTER 1950

Eperythrozoon suis Schwein SPLITTER 1950

Eperythrozoon ovis Schaf und Ziege NEITZ et al. 1934

Eperythrozoon wenyonii Rind ADLER u. ELLENBOGEN

1934 Eperythrozoon

teganodes

Rind HOYTE 1962

Eperythrozoon tuomii Rind UILENBERG 1967

Eperythrozoon mariboi Flughund EWERS 1971

Tabelle 2.2: Beschriebene Eperythrozoon-Spezies und deren Wirte

Eperythrozoon tuomii wurde nur auf Thrombozyten der Rinder beobachtet (UILENBERG 1967;

ZWART et al. 1970) und wird nicht weiter besprochen.

Aus Tabelle 2.3 sind die Namen von Spezies zu entnehmen, die basierend auf Genanalyse umklassifiziert oder kürzlich entdeckt wurden. Nicht alle klassisch beschriebenen Spezies wurden umbenannt. Mit dem Zusatznamen Candidatus wird noch nicht vollständig beschriebenen Prokaryoten ein provisorischer Status verliehen (MURRAY u.

STACKEBRANDT 1995). Der Candidatus Status darf aber nicht verwendet werden, um einer schon beschriebenen Spezies einen provisorischen neuen Namen zu geben (NEIMARK et al.

2002 b). Statt Mycoplasma suis ist auch der Name Mycoplasma haemosuis als neue Kombination fälschlicherweise benutzt worden (NEIMARK et al. 2001). Statt Mycoplasma haematoparvum benutzen einige Autoren auch Mycoplasma haemoparvum (KENNY et al. 2004).

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Mycoplasma coccoides Maus NEIMARK et al. 2005

Mycoplasma haemomuris Maus NEIMARK et al. 2002 b

Mycoplasma suis Schwein NEIMARK et al. 2002 b

Mycoplasma ovis Schaf und Ziege NEIMARK et al. 2004

Mycoplasma wenyonii Rind NEIMARK et al. 2002 b

Candidatus Mycoplasma haemobos Rind TAGAWA et al. 2008

Mycoplasma haemocanis Hund

MESSICK et al. 2002

Candidatus Mycoplasma haematoparvum Hund SYKES et al. 2005 Mycoplasma haemofelis Katze und andere

Feliden

NEIMARK et al. 2002 b Candidatus Mycoplasma turicensis Katze und andere

Feliden

WILLI et al.2006 b Candidatus Mycoplasma haemominitum Katze und andere

Feliden

FOLEY u. PEDERSEN 2001

Candidatus Mycoplasma

haemodidelphidis Beutelratte MESSICK et al. 2002

Candidatus Mycoplasma haemolamae Alpaka MESSICK et al. 2002 Candidatus Mycoplasma kahanei Totenkopfaffen NEIMARK et al. 2002 a

Tabelle 2.3: Namen der hämotrophen Mykoplasmen nach neuer Einteilung in das Genus Mykoplasma und deren Wirte

Ein Teil der genannten Spezies sind nicht vollständig beschrieben oder haben nicht korrekte Namen und sind deswegen nicht in die offizielle Liste der bakteriologischen Namen

aufgenommen. Für eine Beschreibung der Regeln dieser Nomenklatur und die validierten Listen der bakteriologischen Namen wird auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen (SKERMAN et al. 1980; SNEATH 1992; ANON. 2001; ANON. 2002).

2.2.2 Phylogenetischer Analyse

Anhand von Gensequenzen des 16S rRNA Gens wurden phylogenetische Analysen für die in Tabelle 2.3 aufgelisteten Spezies durchgeführt (RIKIHISA et al. 1997; FOLEY u. PEDERSEN 2001; NEIMARK et al. 2001, 2004; MESSICK et al. 2002; TASKER et al. 2003 c; SYKES et al.

2005; WILLI et al. 2005, 2006 a, b; TAGAWA et al. 2008). Phylogenetische Stammbäume wurden erstellt und zeigen eine große Homologie zwischen den beschriebenen hämotrophen Mykoplasmen. So haben die Gensequenzen des 16S rRNA Gens von Candidatus M. turencis 92%ige Ähnlichkeit mit denen von M. coccoides und 90%ige Ähnlichkeit mit denen von M.

haemomuris (WILLI et al. 2006 b). Auf Grund dieser Analysen werden die hämotrophen Mykoplasmen der Pneumoniae Gruppe der Mykoplasmen der Klasse der Mollicutes zugeteilt (NEIMARK et al. 2001). Eine sehr enge Verwandtschaft von Mycoplasma cavipharyngis und

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Mykoplasmen wurde beschrieben (JOHANSSON et al. 1999). Das Genom besteht aus einer zirkulären, doppelsträngigen DNA, wovon die Größe bei M. suis auf 745 kbp geschätzt wurde (MESSICK et al. 2000 b). Dies stellt eine theoretische Minimalgröße für die Fähigkeit zur Auto- Replikation dar (HOELZLE 2007). Das Genom von M. haemofelis wurde auf 1245 kbp

geschätzt und 75 Gene wurden beschrieben (BERENT u. MESSICK 2003). HARASAWA et al.

(2002) untersuchten die 16S-23S rRNA Region von M. haemomuris. Diese genetischen Analysen bekräftigen sämtlich die Verwandtschaft mit der Pneumonia Gruppe der Mykoplasmen. Abbildung 2.1 zeigt die hieraus folgende taxonomische Leiter.

Bakterien Domäne

Firmicutes Abteilung

Mollicutes Klasse

Mycoplasmateles Ordnung

Mycoplasmataceae Familie

Mykoplasmen Genus

Pneumoniae Gruppe der Mykoplasmen

hämotrophe Mykplasmen Spezies

Abbildung 2.1: Taxonomische Leiter der hämotrophen Mykoplasmen

Bis vor Kurzem war es fraglich, ob M. felis und M. haemocanis nicht die gleiche Spezies repräsentierten (LUMB 2001). Eine Analyse des RNase P Gens zeigte aber zwei genetisch deutlich unterschiedliche Spezies (BIRKENHEUER et al. 2002). Innerhalb M. felis werden auf Grund morphologischer, pathogener und genetischer Eigenschaften eine große und eine kleine Form dieser hämotrophen Mykoplasmen beschrieben (FOLEY et al. 1998). Auf Grund weiterer Genanalysen unterschied man verschiedene Stämme, die geografisch unterschiedlich

vorkommen (JENSEN et al. 2001; TASKER et al. 2001; CLARK et al. 2002). Nach neustem Wissen wurden diese Isolate, die „Ohio“ und „California“ Stämme, jetzt als M. haemofelis, beziehungsweise Candidatus M. haemominitum bezeichnet (WILLI et al. 2007 b).

2.2.3 Sonstige hämotrophe Mykoplasmen

Bei einer Gruppe anämischer Rentiere wurden die klinischen Symptome der Eperythrozoonose beobachtet. Basierend auf zytologischen Untersuchungen wurde DNA aus Blut von den

betroffenen Tieren mittels PCR verarbeitet. Die phylogenetische Analyse ergab eine große Homologie mit Gensequenzen bekannter hämotrophe Mykoplasmen (STOFFREGEN et al.

2006).

PETERS et al. (1974) beschrieben die Anwesenheit von Eperythrozoon-ähnlichen Strukturen im Blut von Affen und legten deren Morphologie mittels Elektronenmikroskop fest. In einer anderen Gruppe anämischer Affen wurden Haemobartonella-ähnliche Strukturen im Blut

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zwischen diesen Strukturen und der Anämie blieb aber unklar (DILLBERGER et al. 1994).

Humane Eperythrozoonose wurde zum ersten Mal von PUNCTARIC et al. (1986) im ehemaligen Jugoslawien beschrieben. Seitdem wird aus China diese Krankheit sporadisch gemeldet. Erstaunlicherweise findet die Diagnostik auch heute noch mittels Licht-,

Elektronenmikroskopie und Inokulation von Tieren statt. Ein PCR ist bisher in der humanen Diagnostik nicht beschrieben worden (YANG et al. 2000).

2.2.4 In Situ Hybridisation

In Gewebeproben infizierter Schweine und Katzen wurde mittels In Situ Hybridisationen DNA der hämotrophen Mykoplasmen angezeigt. Dies gilt als starker Beweis dafür, dass hämotrophe Mykoplasmen ursächliches Agens bei Infektionen dieser Art sind (GWALTNEY et al. 1993 b;

BERENT et al. 2000; HA et al. 2005). Auch elektronenmikroskopisch wurden von hämotrophen Mykoplasmen befallene Erythrozyten in Makrophagen der Lunge und der Milz angezeigt

(SIMPSON et al. 1978).

2.3 Morphologie

2.3.1 Feinstrukturelle Morphologie

Die feinstrukturellen Eigenschaften von H. muris wurden 1965 von TANAKA et al. zum ersten Mal beschrieben und mit denen von E. coccoides und Mycoplasma pulmonis verglichen. Seitdem wurde die Morphologie von H. felis (SMALL u. RISTIC 1967; DEMAREE u. NESSMITH 1972; JAIN u. KEETON 1973; SIMPSON et al. 1978), H. canis (VENABLE u. EWING 1968;

McKEE et al. 1973), E. ovis (McKEE et al. 1973; ICHIJO et al. 1982; GULLAND et al. 1987 a), E. wenyonii (KEETON u. JAIN 1973) und E. suis (POSPISCHIL u. HOFFMANN 1982;

ZACHARY u. BASGALL 1985; LIEBICH u. HEINRITZI 1992) mittels licht- und elektronenmikroskopischer Studien dokumentiert. Auch von nicht näher identifizierten hämotrophen Mykoplasmen bei Affen (PETERS et al. 1974; DILLBERGER et al. 1994), Waschbären (FRERICHS u. HOLBROOK 1971), Lamas (REAGAN et al. 1990), Menschen (DUARTE et al. 1992), Beutelratten (MESSICK et al. 2000 a), Alpakas (MESSICK et al. 2002) und Rentieren (STOFFREGEN et al. 2006) wurden die feinstrukturellen Eigenschaften

dokumentiert.

Es wurde ein großes Maß an Übereinstimmung der morphologischen Eigenschaften zwischen den verschiedenen hämotrophen Mykoplasmen festgestellt. Sie kommen in vielen

Erscheinungsformen vor, meistens rund bis lang gestreckt, und haben einen Durchmesser von 0,3 bis 3 μm. Je nach Vermehrungsstadium unterscheidet man bei E. suis kokkoide unreife, diskusförmige jugendliche und ringförmige reife Organismen (ZACHARY u. BASGALL 1985).

Während akuten eperythrozoonotischen Anfällen bei Schweinen wurden diese

Erscheinungsformen auf der Erythrozyten-Membran nebeneinander beobachtet, wobei bei chronisch infizierten Schweinen kreisrunde bis elliptische, abgerundete Ruheformen zu erkennen waren (LIEBICH u. HEINRITZI 1992). Beim Schaf wurden Hinweise gefunden, dass die

Erscheinungsform mit dem Grad der Bakteriämie zusammen hängt (GULLAND et al. 1987 a).

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sind kleine Granulen und filamentöse Strukturen zu finden. Die meisten Autoren beschreiben nur eine einzelne Zellmembran, von der das Zytoplasma umgeben wird. SMALL und RISTIC (1967) beobachteten bei H. felis eine doppelte Membran. Die hämotrophen Mykoplasmen befinden sich in Eindellungen oder Falten der Erythrozyten-Membran, aber es wurden auch freie Formen beobachtet.

Abbildung 2.2 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild von einem von M.suis befallenen porcinen Erythrozyten. Eine intrazelluläre Invasion der Erythrozyten wurde nicht nachgewiesen.

Ein 15 bis 25 nm breiter Spalt trennt die Bakterien von der Erythrozyten-Membran. Die Bindung scheint von Mikrofilamenten versorgt zu werden. Durch gemeinsamen Kontakt mit den

Organismen können mehrere Erythrozyten miteinander verbunden werden (VENABLE u.

EWING 1968; SIMPSON et al. 1978). Die Vermehrung findet durch Spaltung oder Knospung statt (DEMAREE u. NESSMITH 1972; KEETON u. JAIN 1973).

Die Eindellungen der Erythrozyten-Membran, sowie die hämotrophen Mykoplasmen (1) sind deutlich erkennbar.

17.000 x (Foto: Dr. L. Hoelzle)

Abbildung 2.2: Elektronenmikroskopisches Bild eines von M. suis befallenen Erythrozyten des Schweines

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Im peripheren Blutausstrich sind die hämotrophen Mykoplasmen vereinzelt, in Ketten, als Aggregate oder als Ringe lichtmikroskopisch zu beobachten und werden marginal, mittig oder verteilt über der gesamten Oberfläche der Erythrozyten angetroffen. Im Plasma werden auch freie Formen gefunden. Die pleomorphen Strukturen sind meistens als Ring- oder Stäbchenform erkennbar (VENABLE u. EWING 1968; OVERAS 1969; ICHIJO et al. 1982; MESSICK et al.

2000 a). Die Ketten können sich aufteilen und eine Y-Form oder streichholz-ähnliche Form annehmen (KIKUTH 1928; MESSICK 2003). Die Erscheinungsform von E. ovis änderte sich unter Einfluss der Außentemperatur und Lagerungszeit im Blutröhrchen. Auch innerhalb eines Blutausstrichs und zwischen Blutausstrichen von demselben Tier wurden Unterschiede im Aussehen beobachtet (OVERAS 1969). Abbildung 2.3 zeigt das mikroskopische Bild der hämotrophen Mykoplasmen in einem Ausstrich infizierten Schweineblutes nach Anfärbung mit Akridin-Orange.

Sowohl auf den Erythrozyten, als auch in freier Form sind die hämotrophen Mykoplasmen (M. suis) als orange Punkte deutlich erkennbar. Die Erythrozyten stellen sich grün dar. Akridinorange Färbung, 1000 x (Foto: Dr. L. Hoelzle)

Abbildung 2.3: Fluoreszenz-Mikroskopisches Bild

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2.4.1 Übertragung

Die natürlichen Übertragungsmechanismen der hämotrophen Mykoplasmen sind noch teilweise ungeklärt (WILLI et al. 2007 b). Experimentelle Übertragungen infizierten Blutes durch orale, intravenöse, subkutane und intraperitoneale Inokulation waren erfolgreich (THURSTON 1955;

FLINT et al. 1958; OVERAS 1969). Iatrogene Übertragung durch zootechnische Eingriffe (HENRY 1979; WEIKEL und GRAUNKE 1995; HASHEMI-FESHARKI 1997) und

Bluttransfusionen (LESTER et al. 1995; SYKES et al. 2004; GARY et al. 2006; WILLI et al.

2006 c; PAUL et al. 2008) sind wahrscheinlich.

Es wird vermutet, dass blutsaugende Arthropoden eine wichtige Rolle in der Transmission spielen. Hämotrophe Mykoplasmen-DNA wurde bei unterschiedlichen Arthropoden

nachgewiesen. Diese wurden zum einen auf Tieren gesammelt (SHAW et al. 2004; LAPPIN et al. 2006), aber auch in freier Form auf Vegetation aufgefunden (TAROURA et al. 2005).

Übertragungsexperimente mittels verschiedener Arthropoden verliefen aber nicht eindeutig (OVERAS 1969; SENEVIRATNA et al. 1973; BERKENKAMP u. WESCOTT 1988;

PRULLAGE et al. 1993; WOODS et al. 2005, 2006). In der Studie von GRINDEM et al. (1990) war die Anwesenheit von Flöhen bei Katzen kein erhöhtes Risiko für Haemobartonellose.

Klimatische Umstände beeinflussen das Vorkommen unterschiedlicher Arthropoden und können so indirekt die Infektionsfrequenz beeinträchtigen (SHERIFF et al. 1966; WILLI et al. 2007 a;

WENGI et al. 2008). Rodentia scheinen kein Reservoir für feline hämotrophe Mykoplasmen zu sein (WILLI et al. 2007 a).

Eine direkte Übertragung über Speichel und Fezes könnte bei Katzen eine wichtige Rolle

spielen. Hämotrophe Mykoplasmen-DNA wurde in diesen Exkretionen nachgewiesen (WILLI et al. 2007 a). Zudem wurde eine signifikante Assoziation von hämotrophen Mykoplasmen-

Infektionen mit dem männlichen Geschlecht, Freigang, und Beiß-Abszessen beschrieben (GRINDEM et al. 1990; TASKER et al. 2003 a; LURIA et al. 2004; WILLI et al. 2006 b).

Bei Schweinen wurde die vertikale Übertragung beschrieben (BERRIER u. GOUGE 1954;

HENDERSON et al. 1997). Bei Lamas wurden Infektionen bei Neugeborenen festgestellt und eine in utero Übertragung für wahrscheinlich gehalten (FISHER u. ZINKL 1996; ALMY et al.

2006). YANG et al. (2000) wiesen beim Menschen Eperythrozoon in der Nabelschnur nach, sowie im peripheren Blutausstrich von neugeborenen Babys. Beim Schaf wurden keine kongenitalen Infektionen beobachtet. Die infizierten Lämmer waren älter als 5 Monate (OVERAS 1969).

Hämotrophe Mykoplasmen werden als wirtspezifisch betrachtet. Eperythrozoon wenyonii konnte nicht erfolgreich auf Ziegen, Hirsche oder splenektomierte Schafe übertragen werden (NEITZ 1940; KREIER u. RISTIC 1963). Im Rahmen von Kreuzexperimenten mit mit

hämotrophen Mykoplasmen infizierten Hunden und Katzen konnte keine eindeutige Übertragung zwischen diesen Spezies festgestellt werden (LUMB 2001). Auch nicht näher identifizierte hämotrophe Mykoplasmen von Lamas konnten bei Schweinen, Schafen und Katzen keinen Bakteriämie oder Anämie auslösen. Auch die Serologie verlief in diesen Experimenten negativ (McLAUGHLIN et al. 1991). Demgegenüber zeigten Übertragungsexperimente bei Schafen und

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STATHAM 1991 a). Beim Waschbär isolierte Haemobartonella Spezies wurden bei 6 anderen Tierarten, darunter ein Hund, inokuliert. Diese Tierarten wurden als nicht empfindlich befunden (FRERICHS u. HOLBROOK 1971).

2.4.2 Stadien der Infektion

Der Krankheitsverlauf einer hämotrophen Mykoplasmen-Infektion kann in eine präparasitäre, eine akute, eine Herstell- und eine Träger-Phase eingeteilt werden (ALLEMAN et al. 1999). Die präparasitäre Phase oder Inkubationszeit beträgt bei der Katze zwei bis drei Wochen (FOLEY et al. 1998; WESTFALL et al. 2001; TASKER et al. 2006 b). Bei splenektomierten Schweinen wurden experimentell nach drei Tagen die ersten Erreger im Blut festgestellt (BUGNOWSKI et al. 1990). In der Praxis treten klinische Erscheinungen meist 3 bis 4 Tage nach Stressbelastungen auf (HEINRITZI 1983). Beim Schaf lag die Inkubationszeit bei intravenös inokulierten, intakten Schafen durchschnittlich bei 4,5 Tage (OVERAS 1969). Die Bakteriämie erreicht meist

zwischen zwei bis vier Wochen post-Infektion seinen Gipfel (OVERAS 1969; WILLI et al.

2005), ist aber variabel und kann sogar mehrere Monate anhalten (OVERAS 1969). Experimente an splenektomierten Schweinen zeigten schon nach fünf Tage einen 100% Befall der

Erythrozyten (BUGNOWSKI et al. 1990). Der Einfluss der Infektion auf den Hämatokrit ist abhängig von dem Grad und der Länge der Bakteriämie (OVERAS 1969). Bei Tieren, die die akute Phase überlebt haben, steigt der Hämatokrit in der Herstellphase langsam wieder an (SYKES 2003). Chronisch infizierte Tiere bleiben häufig Träger, auch wenn Antibiotika verabreicht werden (HEINRITZI 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985; MESSICK 2003, 2004;

HOELZLE 2007). Diese Träger können andere Tiere anstecken oder selbst wieder durch Reaktivierung erkranken (FOLEY et al. 1998; FOLEY u. PEDERSEN 2001). Chronisch erkrankte Schweine sind sehr empfänglich für faktorenabhängige Mischinfektionen (BUGNOWSKI 1988).

2.4.3 Erythrozyten-Beschädigung

Bei an Infektiöser Anämie erkrankten Katzen wurden ultrastrukturelle Untersuchungen durchgeführt. Dabei zeigten sich deutliche Veränderungen an der Zelloberfläche der

Wirterythrozyten durch die Anheftung der Parasiten, so dass von einer direkten Beschädigung ausgegangen wird (SMALL u. RISTIC 1967; JAIN u. KEETON 1973). Bei Schwein und Rind wurden diese Zellmembran-Veränderungen vorerst nicht beobachtet (KEETON u. JAIN 1973;

POSPISCHIL u. HOFFMANN 1982). Abhängig vom Stadium der Infektion wurden aber auch bei E. suis-infizierten roten Blutzellen gravierende Membran-Veränderungen festgestellt

(ZACHARY u. BASGALL 1985). Sowohl bei Schweinen, Schafen, Mäusen als auch bei Katzen führt eine akute Infektion zu einer Erniedrigung der osmotischen Resistenz der rote Blutzellen (THURSTON 1954; OVERAS 1969; MAEDE u. HATA 1975; HEINRITZI u. PLANK 1992).

Auch Kälteagglutininen könnten über immunologische Mechanismen zu einer indirekten Beschädigung der Erythrozyten-Membran führen (COX u. CALAF-ITURRI 1976; BELLAMY et al. 1978; IRALU u. GANONG 1983; ZACHARY u. SMITH 1985; JÜNGLING et al. 1994;

ZULTY u. KOCIBA 1990; SCHMIDT et al. 1992). Bei verschiedenen Tierarten wurde während der Infektion ein positiver Coomb’s Test festgestellt (SHERIFF 1967; SHERIFF u. GEERING 1969; MAEDE u. HATA 1975; BUNDZA et al. 1976; ZULTY u. KOCIBA 1990). Bei

(17)

kristalloide Strukturen aufwiesen (SIMPSON et al. 1978). Die Einschränkung der Flexibilität zur Formveränderung der Zellen könnte so zur schnelleren Entfernung durch das

Retikuloendotheliale System aus dem Blut führen (SYKES 2003).

Die resultierende Anämie beruht bei Katzen hauptsächlich auf einer extravaskulären Hämolyse (SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). Intravaskuläre Hämolyse wurde bei einer Candidatus M.

turicensis-Infektion beschrieben (WILLI et al. 2005). Bei Schafen scheint intravaskuläre Hämolyse Hauptmechanismus der Erythrozyten-Entfernung zu sein (OVERAS 1969, 1987;

SUTTON 1978).

2.4.4 Einfluss auf den Säure-Basen-Haushalt und den Kohlenhydratstoffwechsel Sowohl bei Schweinen als auch bei Schafen wurden massive metabolische Störungen im Zusammenhang mit der akuten Phase der Eperythrozoonose festgestellt. Die

Blutkonzentrationen von Lactat und Pyruvat, sowie der pCO2 sind stark erhöht, Bicarbonat ist herabgesetzt, und die Basenabweichung ist negativ (SUTTON 1976; ILEMOBADE u.

BLOTKAMP 1978 c; HEINRITZI et al. 1990 a, b). Die vorliegende Blutazidose setzt sich aus einer metabolischen und respiratorischen Komponente zusammen (HEINRITZI 1989;

HEINRITZI et al. 1990 b). Ein sehr starker Abfall des Blutzuckerspiegels tritt auf und kann zu einer möglicherweise lebensbedrohlichen Situation führen. Dieser Glucoseabbau ist

nachweislich mit dem Stoffwechsel des Parasiten assoziiert (SUTTON 1976; ILEMOBADE u.

BLOTKAMP 1978 c; HEINRITZI et al. 1990 a, b; SMITH et al. 1990 b; NONAKA et al. 1996;

BURKHARD u. GARRY 2004). Auch eine latente Infektion führt beim Schwein zu einer kontinuierlichen Abnahme des Blutzuckerspiegels (HEINRITZI 1989; HEINRITZI et al. 1990 a).

2.5 Immunologie

Immunologische Reaktionen scheinen eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Anämie zu spielen. Die akute Phase der Krankheit geht mit der Bildung von Kälteagglutininen einher und wurde bei den meisten Tieren nachgewiesen (COX u. CALAF-ITURRI 1976; BELLAMY et al.

1978; IRALU u. GANONG 1983; ZACHARY u. SMITH 1985; ZULTY u. KOCIBA 1990;

SCHMIDT et al. 1992; JÜNGLING et al. 1994). Es handelt sich um Antikörper der Klasse IgM, welche nicht gegen den Erreger, sondern gegen Antigene der Erythrozytenmembran gerichtet sind. Auch Auto-Antikörper der Klasse IgG wurden beschrieben (HOELZLE et al. 2006).

Immunkomplexe könnten in der Haut zu Überempfindlichkeitsreaktionen mit Ödem-Bildung führen, wie es schon beim Rind vermutet wird (MONTES et al. 1994). Auch beim Schwein sind allergische Hauterscheinungen beschrieben (HEINRITZI 1983).

Tiere, die die Krankheit überstanden haben, bleiben empfindlich und können wieder erkranken (FLINT et al. 1959; BUGNOWSKI 1988). Es scheint nur eine kurzzeitige Immunität

aufzutreten, wobei keine richtigen protektiven Antikörper gebildet werden (BUGNOWSKI 1988). Der Verlauf der Antikörperbildung nach klinischer Erkrankung ist beim Schwein wellenförmig und persistiert nur zwei bis drei Monate. Eine Boosterreaktion wurde nicht beobachtet (BALJER et al. 1989). In der latenten Phase stellt sich wahrscheinlich ein Gleichgewicht zwischen Wirt, Erreger und Umwelt ein, wobei bei Zerstörung dieses

(18)

Splenektomierte Schweine scheinen mehr IgM zu produzieren, wobei bei intakten Tieren der Titer länger anhält (HEINRITZI 1989). Eine erregerspezifische Immunantwort mittels Immunglobulinen der Klasse G wurde kürzlich bei dieser Tierart veröffentlicht, wobei die protektiven Eigenschaften noch untersucht werden müssen (HOELZLE 2007). Studien am Schaf zeigten teilweise eine Protektion, ausgehend von Antikörpern in hyperimmunen Sera (HUNG u.

LLOYD 1985). Zudem waren Lämmer, die von latent infizierten Schafen gesäugt wurden, gegen klinische Erkrankungen bis zum Absetzten geschützt (DADDOW 1982). Hauptantigene von M.

haemofelis (ALLEMAN et al. 1999) und M. suis (HOELZLE et al. 2006, 2007a, c, d) sind beschrieben worden. Die Rolle solcher Antigene in der Entwicklung von Schutzimpfungen erfordert weitere Untersuchungen (SYKES 2003; HOELZLE 2007). Kreuzimmunität zwischen M. haemofelis und Candidatus M. haemominitum wurde beschrieben (FOLEY et al. 1998;

FOLEY u. PEDERSEN 2001).

Während der akuten Phase scheint der zelluläre Immunrespons reduziert zu sein (ZACHARY u.

SMITH 1985).

2.6 Diagnostik 2.6.1 Einleitung

1928 beschrieb SCHILLING die lichtmikroskopische Diagnose der Eperythrozoonose bei weißen Mäusen. Latente Infektionen ließen sich durch Splenektomie hervorrufen und konnten auch durch Blutimpfung auf vorher negative und entmilzte Mäuse übertragen werden. Dabei erkrankten die inokulierten Tiere schnell und die Erreger konnten lichtmikroskopisch im

peripheren Blutausstrich nachgewiesen werden. Die Diagnose an Hand der klinischen Symptome kann nur während eines akut verlaufenden Krankheitsprozesses mit Sicherheit gestellt werden, obwohl die Symptomatik sicher nicht pathognomonisch ist. Außerhalb der akuten klinischen Phase ist die Diagnose schwierig zu stellen, wobei ein direkter Erregernachweis durch PCR oder ein indirekter Erregernachweis durch Serologie Anwendung finden. Der Goldstandard zur Diagnose chronisch latenter Infektionen bleibt auch heute noch der mikroskopische Nachweis einer Bakteriämie nach Splenektomie verdächtiger Tiere oder nach Übertragung einer

verdächtigen Blutprobe auf bereits splenektomierte Versuchstiere (BUGNOWSKI et al. 1989;

HOELZLE 2007). Hämotrophe Mykoplasmen wurden bisher nicht in vitro kultiviert (OVERAS 1969; MESSICK 2004; HOELZLE 2007; WILLI et al. 2007 b).

2.6.2 Direkter Erregernachweis

Während der akuten Phase der Eperythrozoonose können die Erreger in hoher Zahl

lichtmikroskopisch im peripheren Blutausstrich nachgewiesen werden (SCHILLING 1928;

OVERAS 1969; PURNELL et al. 1976; HEINRITZI 1990; MESSICK 2003). Der Zeitraum dieser Bakteriämie ist aber sehr kurz und variabel, wodurch mit falsch negativen Ergebnissen gerechnet werden muss (OVERAS 1969; HEINRITZI 1990; ALLEMAN et al. 1999; MESSICK 2003). Sogar innerhalb weniger Stunden könnte ein Zustand mit deutlicher Bakteriämie in einen Zustand übergehen, in dem kaum Organismen nachzuweisen sind (ALLEMAN et al. 1999;

MESSICK 2003). Im Übrigen wurden auch sehr starke Schwankungen in der nachweisbaren

(19)

höhere Wahrscheinlichkeit zu erreichen, die Bakterien im Blut anzutreffen, könnte man mehrere Ausstriche über einen bestimmten Zeitraum anfertigen (TASKER u. LAPPIN 2002). OVERAS (1969) beschrieb einen starken Einfluss der Außentemperatur, bei der die Blutentnahme und die Anfertigung des Ausstrichs stattfanden, auf die Nachweishäufigkeit von E. ovis. Auch zwischen Ausstrichen derselben Blutproben und innerhalb eines Ausstrichs wurde einige Variabilität im Nachweis festgestellt. Eine längere Aufbewahrungszeit der Blutproben bis zur Anfertigung der Ausstriche könnte zur Lösung der Mikroorganismen von der Erythrozytenmembran und auch zur Änderung der Morphologie führen. Auch EDTA könnte zur Lösung der Bakterien von der Zellmembran führen und so die Identifizierung erschweren (HALL et al. 1988; ALLEMAN et al.

1999). Das Bewerten von Artefakten, Heinz-Körpern oder Howell-Jolly-Körpern als

Mikroorganismen führt schnell zur falsch positiven Ergebnisse (OVERAS 1969; HENRY 1979;

HEINRITZI 1990; TASKER u. LAPIN 2002; SYKES 2003). Farbartefakte werden häufig oberhalb der Fokusfläche der Erythrozyten gefunden (TASKER u. LAPPIN 2002).

Routinemäßig werden die Blutausstriche mit einer Romanowsky-Typen Färbung gefärbt (SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). Um Artefakte zu vermeiden, sollten neue gefilterte Farblösungen verwendet werden (TASKER u. LAPPIN 2002). Die Anwendung einer Färbung mittels Akridinorange zum Nachweis von Kernmaterial könnte die Sensitivität und Spezifität erhöhen, setzt aber die Verfügbarkeit eines Fluoreszenz-Mikroskops voraus (BOBADE u. NASH 1987).

Um den Infektionsgrad der Erythrozyten zu erfassen, wurden verschiedene Schlüssel beschrieben (NEITZ 1937; THURSTON 1953; LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969;

MCLAUGHLIN et al. 1990). Beispielhaft zeigt Tabelle 2.4 die Schlüssel nach HEINRITZI et al.

(1984). TASKER et al. (2003 a) beurteilen 10 Blickfelder. Identifikation von drei oder mehr Mikroorganismen ergibt ein positives Ergebnis, weniger als drei oder nicht eindeutige Strukturen ein fragliches, und das Nicht-Vorhandensein von Mikroorganismen ein negatives Ergebnis.

Grad Befallstärke

0 keine Eperythrozoon im Ausstrich 1 vereinzelt E.suis im Ausstrich

2 max. 10% der Erythrozyten mit E. suis behaftet 3 max. 25% der Erythrozyten mit E. suis behaftet 4 max. 50% der Erythrozyten mit E. suis behaftet 5 max. 75% der Erythrozyten mit E. suis behaftet 6 alle Erythrozyten mit mindestens 1 E. suis behaftet

(HEINRITZI et al. 1984)

Tabelle 2.4: Infektionsgrad der Erythrozyten mit E. suis

1990 wurde von OBERST et al. (1990 a, b) E. suis- DNA im Blut von Schweinen mittels Hybridisierung detektiert. Drei Jahre später wurden von GWALTNEY et al. (1993 a) und OBERST et al. (1993) die ersten PCR-Assays zum Nachweis von E. suis beschrieben.

Heutzutage ist die PCR-Untersuchung die beste Methode zur Diagnose von hämotrophen

Mykoplasmen-Infektionen (WILLI et al. 2007 b). Die PCR-Untersuchung ist ein hoch sensitiver

(20)

detektiert werden kann (TASKER u. LAPPIN 2002).

Beim Nachweis von Bakterien mittels PCR ist das ribosomale RNA Gen das wichtigste

Angriffsziel in vielen Tests. Strukturell ist dieses Gen aus drei Gensequenzen (16S, 23S und 5S) und zwei Spacer Regionen aufgebaut (SACHSE 2003). Viele der PCR-Assays zum Nachweis von hämotrophen Mykoplasmen beruhen auf der Amplifikation von 16S rRNA DNA-Sequenzen (TASKER u. LAPPIN 2002; HOELZLE 2007). HOELZLE et al. (2003, 2007 b) beschrieben PCR-Assays basierend auf EcoRI-Genomfragment und MSG1 Gen als M. suis Ziel-DNA. Die Entwicklung von Real-time PCR-Assays (COOPER et al. 1999; TASKER et al. 2003 b, 2004 a;

BRADDOCK et al. 2004; LOBETTI u. TASKER 2004; SYKES et al. 2007 a, b; HOELZLE et al. 2007 b; GATTINGER et al. 2008; PETERS et al. 2008; WENGI et al. 2008) ermöglicht den quantitativen Nachweis von hämotropher Mykoplasmen-DNA. Dies ist hilfreich bei der

Beurteilung des Infektionsgrades und dem Erfolg einer Antibiotikatherapie. Zudem bleiben bei diesem Verfahren die Reaktionsbehälter geschlossen, wodurch Kontamination vermieden wird und die Tests zuverlässiger sind (WILLI et al. 2007 b).

2.6.3 Indirekter Erregernachweis

Die serologischen Methoden werden bei den einzelnen Tierarten besprochen.

(21)

2.7.1 Symptome

2.7.1.1 Klinisches Erscheinungsbild

Das klinische Bild einer hämotrophen Mykoplasmen-Infektion kann von asymptomatisch bis zu einer lebensbedrohlichen akuten hämolytischen Krise variieren. In wie weit sich die Krankheit präsentiert, hängt von viele Faktoren ab, wie z.B. der involvierten hämotrophen Mykoplasmen- Spezies, der Tierart, dem Stadium der Infektion, der Empfindlichkeit des Wirtes, den

Haltungsbedingungen, sowie den immunsuppressiven Umständen und Begleitkrankheiten (OVERAS 1969; HARBUTT 1969 a; UILENBERG 1981; GULLAND et al. 1987 b;

NICHOLLS et al. 1989; WILLI et al. 2007 b). Chronische Infektionen werden typischerweise bei nicht splenektomierten, immunkompetenten Tieren beobachtet (MESSICK 2004).

Beim Schwein ist der akute Anfall durch hohes Fieber, Anorexie, Dyspnoe, Anämie, milden Ikterus und Zyanosen an den Akren gekennzeichnet und wird vor allem bei Absetzern und Mastschweinen beobachtet. Die Diagnose an Hand dieser Symptome wäre in der akuten Phase möglich (HENRY 1979; BRÖMEL u. ZETTL 1985; BUGNOWSKI 1988; HOELZLE 2007).

Nach der akuten Phase werden Produktionsverluste durch Abfall der zootechnischen Leistungen evident. Es handelt sich hier um Störungen der Fertilität und des Wachstums. Auch werden verschiedene Mischinfektionen beobachtet. Am individuellen Tier sind Folgeerscheinungen der überstandenen Anfälle sichtbar wie Ohrrandnekrose und Kachexie. Zudem wurden Vulva- und Mamma-ödem beobachtet (BROWNBACK 1981; ZINN et al. 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985;

BUGNOWSKI 1988; HENDERSON et al. 1997; MESSICK 2004).

2.7.1.2 Hämatologische Veränderungen

Die Veränderungen im Blutbild bei hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen sind der Hämolyse zuzuschreiben. Meistens betrifft es hier eine regenerative Anämie, häufig gekennzeichnet durch eine Normozytose, Makrozytose oder Anisozytose, Retikulozytose und Normo- oder

Polychromasie (HARBUTT 1969 a; SUTTON et al. 1977; HENDERSON et al. 1997;

MESSICK 2003, 2004; LOBETTI u. TASKER 2004; WILLI et al. 2007 b). Beim Schwein wurden neben Erythroblasten als Ausdruck einer verstärkten Erythropoese auch gelegentlich Heinzsche und Howell-Jolly Körperchen beobachtet (BUGNOWSKI et al. 1989). Beim Schwein zeigt die akute Phase bei splenektomierten Tieren einen klassischen Verlauf, wobei die

hämatologischen Werte -zusammen mit der Körpertemperatur- eng verbunden mit der

Bakteriämie sind (Abbildung 2.4). Es kommt zu einem massiven Abfall der Erythrozyten, des Hämatokrits und des Hämoglobins, mit einem Tiefpunkt ungefähr 4 Tage nach Beginn des Anfalls (HEINRITZI et al. 1984; BUGNOWSKI et al. 1989; HEINRITZI 1989). Der Höhepunkt der Fieberphase wird von einer deutlichen Leukozytose begleitet (BUGNOWSKI et al. 1989).

(22)

Geändert nach HEINRITZI (1989)

Abbildung 2.4: Klassischer Verlauf der Bakteriämie, Erythrozytenzahl und Körpertemperatur beim infizierten, klinisch unauffälligen Schwein nach Splenektomie am Tag 1

2.7.2 Pathologie 2.7.2.1 Sektionsbild

Ausführliche Beschreibungen der pathologisch-anatomischen Veränderungen liegen

hauptsächlich bei Schweinen und Schafen vor. Abweichungen werden abhängig von der Phase der Infektion angetroffen (NEITZ 1937; HENDERSON et al. 1997). Als deutlicher Hinweis auf das Vorliegen von Eperythrozoonose wird die sofortige Agglutination des Blutes bei

Gefäßaustritt angesehen (HEINRITZI 1983; HEINRITZI et al. 1984). Sehr auffällig ist eine starke Vergrößerung der Milz (BRÖMEL u. ZETTL 1985). Neben unspezifischen Merkmalen wie Abmagerung wird das Sektionsbild weiter von einer allgemeinen Blässe und/oder

0 200 400 600 800

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

E.suis/1000 Ery

0 1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Erythrozyten

Erythrozyten T/l

37 38 39 40 41 42

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Körpertemperatur

Körpertemperatur °C

(23)

Körperhöhlenflüssigkeiten und Ödeme sind häufig anzutreffen (BRÖMEL u. ZETTL 1985).

Durchblutungsstörungen werden vor allem beim Schwein deutlich sichtbar durch

Hautveränderungen wie Petechien, Zyanosen und Nekrosen, zum Beispiel an der Ohrspitze (HEINRITZI 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985; HENDERSON et al. 1997). Häufig leiden die Tiere unter Ekto- und Endoparasitenbefall (BRÖMEL u. ZETTL 1985).

2.7.2.2 Histologie

Das histologische Bild zeigt ein Hämosiderose, wobei Milzhämosiderose zusammen mit einem aktivierten Knochenmark Hinweise auf die hämolytische Anämie sind. Zellbeschädigungen in Leber und Nieren sind häufig zu sehen (BRÖMEL u. ZETTL 1985). Thrombosierung der Gefäße wurde in der Leber, Lunge und Myokard nachgewiesen (BELLAMY et al. 1978; BUGNOWSKI et al. 1990). PLANK und HEINRITZI (1990) zeigten eine die akute Phase der Eperythrozoonose begleitende erhöhte Blutungsneigung. Als Ursache kommt eine intravasale

Gerinnungsaktivierung mit anschließender Verbrauchskoagulopathie in Frage.

2.7.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen

Antikörper gegen E. suis wurden in 16 Beständen in Süd-Deutschland bei insgesamt 138 Schweinen bestimmt. Zehn Bestände waren klinisch unauffällig und serologisch negativ.

Schweine aus 4 von 6 klinisch auffälligen Beständen wiesen einen positiven Antikörper-Titer auf. Zwanzig von insgesamt 78 Tieren dieser klinisch auffälligen Bestände hatten einen positiven E. suis Anitkörper-Titer (BALJER et al. 1989). In China nimmt die Ausbreitung von porciner Eperythrozoonose von Jahr zu Jahr zu und die Krankheit gewinnt immer mehr an Bedeutung.

Ein Surveillance Untersuchung in 57 Beständen im Jahr 2002 ergab eine gesamte Morbidität von 30% und Mortalität von 10-20%. Innerhalb infizierter Bestände war die Morbidität bis zur 100%, meistens mit einer Mortalität von über 50%. Unklar blieb, in wieweit hier Mischinfektionen (u.a.

Schweinepest, PRRS, Toxoplasmose) eine Rolle spielten. Die diagnostische Methode wurde nicht beschrieben (WU et al. 2006). Vier Bestände im Süden Brasiliens wurden mittels PCR und Southern Blot auf M. suis untersucht. Proben von 121 Schweinen wurden ausgewertet.

Achtzehn Prozent der Tiere war PCR positiv und 33 % waren Southern Blot positiv, wobei alle PCR-positiven Proben auch in der Southern Blot Analyse positiv waren (GUIMARAES et al.

2007 a).

Hämotrophe Mykoplasmen können Infektionen mit verschiedenen Mikro-Organismen

beeinflussen. Dabei kann sowohl ein hemmender, als auch ein verstärkender Effekt beobachtet werden (ZWART et al. 1970). Beim Schwein wird während einer Ko-Infektion von E. suis und Babesia trautmanni eine deutlich verzögerte Parasitämie des Babesia Parasiten beobachtet (DIPEOLU et al. 1983). Von E. parvum wurde ein vergleichbarer Einfluss beobachtet

(BARNETT 1963). GRESHAM et al. (1994) beschrieben PRRS als prädisponierenden Faktor bei einem Ausbruch von Eperythrozoonose. In einem aktuellen Ausbruch von Eperythrozoonose unter Ferkeln in einem belgischen Betrieb wurden nach antibiotischer Behandlung die Zahl der anämischen Tiere sowie die Mortalität deutlich niedriger. Die festgestellte Fertilitätsstörung wurde aber nicht verbessert. Die nachgewiesene Ko-Infektion mit dem PRRS Virus könnte die ausgebliebene Verbesserung erklären (DE BUSSER et al. 2008).

(24)

Die Diagnose der akuten Eperythrozoonose beim Schwein kann an Hand der klinischen, mikroskopischen und hämatologischen Untersuchungen sicher und schnell gestellt werden (BUGNOWSKI et al. 1989). Neben dem Erregernachweis in dieser akuten Phase ermöglicht die PCR Untersuchung auch die Identifikation von chronisch persistierenden Infektionen

(HOELZLE 2007). Es wurden mehrere PCR-Tests zum Nachweis von M. suis veröffentlicht (GWALTNEY u. OBERST 1994; RIKIHISA et al. 1997; MESSICK et al. 1999; HOELZLE et al. 2003, 2007 b; STRIMITZER et al. 2004; GATTINGER et al. 2008).

Die serologische Diagnose der porcinen Eperythrozoonose basiert klassischerweise auf dem Nachweis von Kälteagglutininen der Klasse IgM mittels Komplementbindungsreaktion

(SPLITTER 1950), indirekter Hämagglutinationassay (SMITH u. RAHN 1975; BALJER et al.

1989) und ELISA (SCHULLER et al. 1990; HSU et al. 1992). Wegen eines sehr variablen und undulierenden Titer-Verlaufs eignen sich diese Verfahren zur Herdendiagnostik. Beim Einzeltier ist nur ein positives Ergebnis als sicher zu bewerten (HEINRITZI 1989, 1990; SCHULLER et al.

1990). Rezent wurden spezifische Antigene als Zielproteine für Immunglobuline der Klasse G detektiert (HOELZLE et al. 2006). Zwei Hauptantigene wurden näher identifiziert (HOELZLE et al. 2007 c, d). Mit diesen beiden Proteinen als Testantigene wurde ein ELISA entwickelt. Neben guter Sensitivität und Spezifität wurde eine signifikante Korrelation zwischen die IgG-Titer und erniedrigte Hämatokrit-, Erythrozyten-, und Hämoglobinwerte festgestellt (HOELZLE et al.

2007 a).

2.7.5 Therapie und Prävention

Traditionell werden hämotrophe Mykoplasmen mit Tetrazyklinen oder Arsenderivaten behandelt (NEITZ 1968; SUTTON 1970; BRÖMELL u. ZETTL 1985). Von Oxytetrazyklin, Doxyzyklin und Diminazen Aceturat ist die Effektivität nachgewiesen. Der Einsatz von traditionellen chinesischen Kräutern scheint weniger effektiv wegen einer hohen Rezidivenrate und zu hohen Kosten (WU et al. 2006).

Vorbeugend können Tetrazykline als Medizinalfutter eingesetzt werden (BRÖMEL u. ZETTL 1985; WU et al. 2006). Es wird empfohlen, in infizierten Beständen direkte und indirekte Blutübertragung über Instrumentarien zu vermeiden, die Haltungs- und Futterbedingungen optimal zu halten und Stress zu reduzieren. Verschiedene Studien geben Hinweise über die Rolle von Flöhen (SHAW et al. 2004; WOODS et al. 2005, 2006; LAPPIN et al. 2006; WILLI et al.

2007 a), Zecken (SENEVIRATNA et al. 1973; TAROURA et al. 2005), Läusen (HENRY 1979;

BERKENKAMP u. WESCOTT 1988) und Moskitos (PRULLAGE et al. 1993) bei der

Übertragung von hämotrophen Mykoplasmen. Die Bekämpfung von Ekto- und Endoparasiten sollte Infektionen reduzieren können (BRÖMEL u. ZETTL 1985; WU et al. 2006).

Obwohl mittlerweile Hauptantigene von M. suis beschrieben wurden, stehen derzeit noch keine Impfstoffe zur Verfügung (HOELZLE et al. 2007 c, d).

(25)

In der intensiven Nutztierhaltung können hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bedeutende ökonomische Produktionsverluste verursachen (BROWNBACK 1981; ZINN et al. 1983;

BRÖMEL u. ZETTL 1985; HENDERSON et al. 1997; HOELZLE 2007). In China wird eine schnelle Ausbreitung der porcinen Eperythrozoonose beobachtet und es wird dem eine große sozialökonomische Bedeutung zugeschrieben (WU et al. 2006). Durch den Einsatz von Tetrazyklinen als Medizinalfutter beim Schwein könnten Infektionen verschleiert bleiben (BRÖMEL u. ZETTL 1985).

2.8 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schaf 2.8.1 Symptome

Leitsymptome beim Schaf sind ein Verkümmern der Tiere, meist einhergehend mit Anämie oder Ikterus, Anorexie, Schwäche und Mortalität. Schnell treten auch hier zootechnische

Leistungsabfälle in den Vordergrund. Diese variieren von weniger Gewichtsansatz,

Abmagerung, weniger Produktion von Wolle bis Bewegungsschwäche (NEITZ 1968; OVERAS 1969; SUTTON 1970; CAMPBELL et al. 1971; FRIEDHOFF et al. 1971; DADDOW 1979 a;

SHERIFF 1979; BURROUGHS 1988; WEIKEL u. GRAUNKE 1995; HOFF et al. 1996). Auch Steifheit der Hinterhand wurde beobachtet. Fieber scheint beim Schaf nicht als Hauptsymptom aufzutreten. Hämoglobinurie wird hingegen häufig beobachtet (OVERAS 1969, 1987; GANTER et al. 1993). In der Blutchemie sind Hyperbilirubinämie, Hyper- oder Hypoproteinämie und erhöhte Leberwerte anzutreffen (NEITZ 1937; SHERIFF et al. 1966; GRESHAM et al. 1994;

TASKER 2006). Letzteres wird vielleicht durch Beschädigungen in Folge von Hypoxie ausgelöst (TASKER 2006).

2.8.2 Pathologie

Sehr auffällig ist eine starke Vergrößerung der Milz (NEITZ 1937; LITTLEJOHNS 1960;

OVERAS 1969; SUTTON 1978) und eventuell auch der Leber (NEITZ 1937; SUTTON 1978).

Neben unspezifischen Merkmalen wie Abmagerung wird das Sektionsbild weiter von einer allgemeinen Blässe und/oder Gelbfärbung beherrscht (NEITZ 1937; ARCHER u.

LITTLEJOHNS 1984). Vermehrte Körperhöhlenflüssigkeiten und Ödeme sind häufig anzutreffen (NEITZ 1937; LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969). Manche Autoren stellten auch Veränderungen an den Nieren fest. Nephrose wird als ein Folgeschaden der

Hämoglobinurie betrachtet, und nicht als direkter Effekt der Erreger (SHERIFF et al. 1966;

OVERAS 1969). Das histologische Bild zeigt ein Hämosiderose (OVERAS 1969; SUTTON 1978). Zellbeschädigungen in Leber und Nieren sind häufig zu sehen (OVERAS 1969).

Eine Vielzahl von Veröffentlichungen aus Australien und Neuseeland zeigt das Interesse an der Epidemiologie der Eperythrozoonose beim Schaf in diesem Raum (MAXWELL 1969;

CAMPBELL et al. 1971; LAWS u. DADDOWS 1976; MASON et al. 1981, 1989;

LITTLEJOHNS u. NICHOLLS 1989; MASON u, STATHAM 1991 b). Drei weitere australische Studien und einige aus anderen Räumen werden hier besprochen.

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Routineautopsie vorgestellt wurden, wurde in einer Periode von 19 Monate eine Inzidenz von 4,8% festgestellt. In der gleichen Untersuchungsreihe wurde in verschiedenen Herden bei 10- 35% der Lämmer eine Infektion mit E. ovis beobachtet. Die Diagnose erfolgte durch

lichtmikroskopische Untersuchung eines peripheren Blutausstrichs (HARBUTT 1969 b). Über eine Periode von zwei Jahren wurden 1110 sechs bis zwölf Monate junge Schafe und 198 erwachsene Schafe aus 22 Betrieben auf E. ovis Antikörper getestet. 10 % der jungen und 51%

der erwachsenen Schafe waren serologisch positiv. In 27% der Betriebe waren junge Schafe positiv und in 90% der Betriebe erwachsene Tiere (NICHOLLS u. VEALE 1986 b). In einer anderen Studie wurden 4,5% (N= 1820) der jungen Schafe von 47% (N= 91) der Betriebe in West-Australien serologisch getestet. Die Prävalenz der E. ovis Infektion der Schafe wurde zwischen 3,6 % und 5,5 % geschätzt und die Prävalenz der Betriebe zwischen 37,5 % und 56,5%

(KABAY et al. 1991).

Die Prävalenz von E. ovis Antikörpern in einer norwegischen Untersuchung von 9 blind ausgewählten Herden betrug 92% der Schafe (N=144), wobei in allen Herden positive Tiere nachgewiesen wurden. Die Zahl der positiven Schafe innerhalb der Herde lag zwischen 83 und 100% (BRUN-HANSEN et al. 1997 a). Aus einer norwegischen Schafsherde mit 60-70 Tieren wurden in der Periode von 1991-1995 vier Mal Blutproben bei 30 % der Schafe gezogen. Die Prävalenz der E. ovis Antikörper variierte zwischen 58% und 100%. Nur im Jahr 1995 wurde bei 11 von 26 Tieren E. ovis im peripheren Blutausstrich nachgewiesen (BRUN-HANSEN et al.

1997 b). In einer Forschungsherde mit 30 anämischen Lämmern wurde bei 13 Tieren E. ovis im peripheren Blutausstrich nachgewiesen. Die Geschlechter waren gleichmäßig verteilt (MARTIN et al. 1988). Aus verschiedenen für die Schafzucht bedeutenden Gebieten in Nigeria wurden von 402 Tieren Blutproben gesammelt. Sechsunddreißig Prozent der Schafe war serologisch positiv.

Nur bei 12 der serologisch positiven Tiere wurde im peripheren Blutausstrich E. ovis nachgewiesen (ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 b).

Beim Schaf wurden mehrere Ko-Infektionen beschrieben. Ehrlichiose scheint eine latente Infektion mit E. ovis zu aktivieren (OHDER 1967). In Süd-Afrika wurden mehrere Mischinfektionen von Eperythrozoon mit diversen anderen Blutparasiten bei anämischen Schafen festgestellt (BURROUGHS 1988). Listeriose beim Schaf wird nachweislich von E.ovis beeinflusst (GRONSTOL u. OVERAS 1980), die Ko-Infektion mit Trypanosoma vivax

beeinträchtigte keinen der beiden Parasiten bei dieser Tierart (ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 c). Hämonchose könnte einen additiven Effekt auf der Eperythrozoon-Infektion haben (LITTLEJOHNS 1960).

2.8.4 Diagnostik

Während der akuten Phase der Eperythrozoonose können die Erreger in hoher Zahl

lichtmikroskopisch im peripheren Blutausstrich nachgewiesen werden (LITTLEJOHNS 1960;

OVERAS 1969; SHERIFF 1972).

Ein Routine PCR-Test zum Nachweis von M. ovis bei kleinen Wiederkäuern ist bisher nicht entwickelt worden (persönliche Mitteilung Prof. Dr. M. Ganter), obwohl phylogenetische Zuordnung basierend auf Gensequenzen stattfand (NEIMARK et al. 2004).

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1977), ein ELISA (LANG et al. 1986, 1987) und indirekter Immunfluoreszenzassays

(ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 a; HUNG u. LLOYD 1985; NICHOLLS u. VEALE 1986 a) beschrieben.

2.8.5 Therapie und Prävention

Der Einsatz von Oxytetrazyklin und Chlortetrazyklin führt zu einer deutlichen Reduzierung der Bakteriämie, eine vollständige Eliminierung der Erreger ist aber nicht zu erreichen (NEITZ 1968; BURROUGHS 1988; GANTER et al. 1993). Gleiche Ergebnisse für Arsenderivate wurden schon von NEITZ (1937, 1968) und LITTLEJOHNS (1960) veröffentlicht. Mit

Imidocarb dipropionat wurde beim Schaf eine schnelle Reduktion, aber auch keine vollständige Elimination der Infektion erreicht. Die Nebenwirkungen schienen in dieser Studie rassebedingt zu sein (HUNG 1986). Mittels einer hochdosierten, intravenösen Spirotrypan Verabreichung erreichte SHERIFF (1973) eine Eliminierung des Erregers bei Schafen. Beim Einsatz dieses Sulfur-enthaltenden Arsenderivates traten aber gravierende Nebenwirkungen auf und zu dieser Zeit war eine PCR-Kontrolle der Tiere noch nicht möglich.

Es wird empfohlen, in infizierten Beständen bei der Anwendung von chirurgischen Instrumentarien und Scherköpfen nach jedem Tier eine Reinigung und Desinfektion

durchzuführen. Trägertiere sollten aus der Herde entfernt werden. Als Futtersupplementation kommen Eisen- und Kupfersalze im Betracht (GANTER et al. 1993). Auch Ekto- und

Endoparasitenkontrolle kommt große Bedeutung zu (BURROUGHS 1988).

2.8.6 Bedeutung

In der extensiven Nutztierhaltung in Ländern wie Australien, Neuseeland und Süd-Afrika, können hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen große ökonomische Produktionsverluste verursachen. Beim Schaf stehen hier Gewichtsverluste, ikterische Karkassen, verringerte Produktion von Wolle, verringerte Ausdauer und Mortalität im Vordergrund. Zudem werden hämotrophen Mykoplasmen eine bedeutende Rolle im Rahmen des sogenannten „Ill-thrift“

Syndroms zugeschrieben, wobei in einer Herde mehrere Tieren chronisch erkranken mit

rezidivierendem Fieber und Anämie (HARBUTT 1969 b; SUTTON u. JOLLY 1973; DADDOW 1979 a; ARCHER u. LITTLEJOHNS 1984; BURROUGHS 1988; KABAY et al. 1992;

LITTLEJOHNS 1992).

2.9 Hämotrophe Mykoplasmen bei der Katze 2.9.1 Symptome

In der akuten Phase einer M. haemofelis-Infektion werden Fieber, Anämie, Lethargie und Anorexie als wichtigste Symptome festgestellt (MESSICK 2004). Zudem sind teilweise Gewichtsverlust, Schwäche, Synkope, Exitus, Tachypnoe, Tachykardie, Splenomegalie, Herznebengeräusche, Ikterus, Hypothermie, Lymphadenopathie oder Pika vorhanden

(MESSICK 2003; SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). Candidatus M. haemominitum scheint weniger pathogen zu sein, und es werden bei infizierten Katzen nur minimale klinische

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Faktoren scheinen das Erscheinungsbild bei Candidatus M. turicensis-Infektionen zu bestimmen (WILLI et al. 2007 b). Neben Unterschieden in Virulenz könnten auch dosis-abhängige Effekte (WESTFALL et al. 2001) oder individuelle Empfindlichkeit der Tiere (WILLI et al. 2007 b) eine Rolle spielen.

Chronisch latente Infektionen werden typischerweise bei nicht splenektomierten, immunkompetenten Tieren beobachtet (MESSICK 2004).

Bei der Katze scheint der Ernst der Symptome mit der Quantität des nachgewiesenen DNAs der hämotrophen Mykoplasmen korreliert (COOPER et al. 1999; LOBETTI u. TASKER 2004;

TASKER et al. 2004 a). In verschiedenen Studien konnte diese Korrelation aber nicht bestätigt werden (TASKER et al. 2003 b; WILLI et al. 2006 c). Grundsätzlich ist die Anwesenheit eines Pathogens notwendig, aber dies alleine wäre unzureichend, Krankheit auszulösen (SACHSE 2003). In vielen molekular epidemiologischen Studien wurde dieses Prinzip auch für hämotrophe Mykoplasmen bestätigt, und es wurde keine Korrelation zwischen positivem hämotrophen Mykoplasmen-Status und hämatologischen Veränderungen festgestellt (TASKER et al. 2003 a;

ISHAK et al. 2006; GUIMARAES et al. 2007 a; JUST u. PFISTER 2007; SYKES et al. 2007 a;

WENGI et al. 2008).

2.9.2 Pathologie

Systematische Sektionsbilder und histopathologische Untersuchungen an von hämotrophe Mykoplasmen-infizierten Katzen wurden in der Literatur nicht gefunden.

Seit der Entwickelung molekular genetischer Nachweismethoden wurden hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei Hauskatzen und wilden Feliden weltweit beschrieben.

Tabelle 2.5 zeigt eine Übersicht rezent publizierter Nachweishäufigkeiten von hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen bei Katzen. Auf Grund von Unterschieden in den untersuchten Katzenpopulationen und zum Teil auch in der angewendeten PCR Methode ist ein direkter Vergleich der Zahlen nicht immer möglich.

In der Studie von WILLI et al. (2006 b) werden die Proben der Untersuchungen von LOBETTI und TASKER (2004), TASKER et al. (2003 a) und TASKER et al. (2004 a) nochmal analysiert und es wurde spezifisch auch nach Candidatus M. turicensis gesucht (Tabelle 2.5).

In einer japanischen Studie wurden 21 Haemobartonellose-verdächtige Hauskatzen auf M.

haemofelis mittels PCR untersucht. Bei 18 der Tiere war das Ergebnis positiv und wurde zytologisch im peripheren Blutausstrich bestätigt. Dieses PCR Verfahren ermöglichte es, zwischen den wichtigsten M. haemofelis-Stämmen zu differenzieren. Vier Katzen (22%) waren mit dem California Stamm, 12 (67%) mit dem Ohio Stamm, und 2 (11%) mit beiden Stämmen infiziert (WATANABE et al. 2003).