Joachim Borgwardt
Klassische Serologie in der modernen Labordiagnostik
• Klassische serologische Untersuchungen: Definition und Bedeutung
• Serologische Untersuchungsmethoden: Übersicht und Anwendung (SSA/RBT, SLA, HAH, IDT, MAR, KBR, SNT….)
Einführungs-Vortrag,
● Diagnose-Handbuch, Entscheidung der Komm. 2003/422/EG vom 26.05.2003
● Gesetz zur Vorbeugung vor und Bekämpfung von Tierseuchen (TierGesG) vom 22.05.2013 (BGBl. I S. 1324, 3942) in Kraft ab 1. Mai 2014 (§ 45, TierGesG)
● Methodensammlung des Friedrich-Löffler-Institutes (FLI), auf der Grundlage von § 27 des TierGesG (ehem. § 4 TierSG), Stand Januar 2014
● VO über anzeigepflichtigen Tierseuchen (TierSeuchAnzV) i. d. Fassg. der Bekanntm.
vom 19. Juli 2011 (BGBl. I S. 1404)
● VO über meldepflichtige Tierkrankheiten (TKrMeldpflV) i. d. Fassg. der Bekanntm.
vom 11. Februar 2011 (BGBl. I S. 252)
● Liste der zugelassenen Mittel nach § 11 TierGesG (ehem. § 17 c TierSG)
● Bundesmaßnahmekatalog-Tierseuchen
Rechtsgrundlagen zur Anwendung serologischer Testmethoden
Die serologische Untersuchung ist eine zielgerichtete labordiagnostische Tätigkeit zur qualitativen und
quantitativen Bestimmung von definierten immunologischen Reaktionspartnern in flüssigen
biologischen Systemen.
Serologische Untersuchung
zielgerichtet:
zielorientiert, selektiv, ich muss vorher festlegen welche Methode ich nutze.
labordiagnostisch:
Invitro-Immuntest, Tätigkeit unter standardisierten Bedingungen, Qualitätsmanagement.
definiert:
konkret, Art des Suchziels, ich muss vorher entscheiden nach was ich suche.
immunologische Reaktionspartner (Ag, Ab):
Ag: Krankheitserreger und immunogene körperfremde Stoffe mit der Fähigkeit der Auslösung einer Immunanreaktion (Antigene, Antikörper, Proteine, Moleküle, u.a.).
Ab: Humorale und zelluläre körpereigene, spezifische Abwehrsysteme mit der
Fähigkeit der Erkennung, Markierung und Inaktivierung von Krankheitserregern und immunogenen körperfremden Stoffen.
Diese Reaktionen sind in vitro möglich und
somit als serologische Testsysteme diagnostisch
nutzbar.
in vivo Reaktionen
Spezifischer Antigen – Antikörper –
Kontakt Testbasis
Die Kinetik, Quantität und Wirkung der Ig-Klassen sind bei einer Infektion
tierartlich, erregerspezifisch und individuell sehr verschieden, allgemein kann aber folgendes gelten:
lg M: Ist bei einer Infektion zuerst nachweisbar, ist auch an unspezifischen und paraspezifischen Reaktionen beteiligt, Ig M persistiert länger als lg G1.
Ig D: Bestandteil der B-Lymphozytenmembran, bindet und aktiviert Basophile und Mastzellen, sehr kurzlebig.
lg G1: Sind die häufigsten lg nach einer Infektion, Ig G1 treten etwas später als Ig M in Erscheinung, persistieren meist während einer Infektion, sind bei Rindern Haupt-lg in der Milch und im Serum, können die SLA blockieren und
verursachen im MRT oft statt einer Ringbildung eine Agglutination.
lg G 2: Tritt zusammen mit lg G1 oder etwas später auf, kann konzentrations- abhängig Prozonen verursachen.
---
lg A: Ist als letzte lg-Klasse im spezifischen Infektionsverlauf nachweisbar,
permanent präsent als lokaler Schutz auf Schleimhäuten und im Eutergewebe.
Ig E: An Mastzellen und Granulozyten gebundene, IG mit Hauptbedeutung für die spezifische parasitäre Abwehr und für allergische Reaktionen, sehr langlebig.
In der serologischen Brucellose-Diagnostik hauptsächlich erfasste Immunglobulin-Klassen (nach: W.J.B. Morgan, 1982)
SSA/RBT KBR SLA MRT/ABR
lg M (+) + + +
lg G 1 + (+) (+) (+)
lg G 2 - - + -
lg A - - + -
Antikörper nach Wirkung (???) - agglutinierende
- präzipitierende - opsonierende
- komplementaktivierende - sezernierende
- neutralisierende -.
-..
-…
Antikörper nach Bauart (???) - Monomer (IgD, IgE, IgG) - Dimer (IgA)
- Pentamer (IgM)
Antikörper nach Herstellung (???) - monoklonale
- rekombinante - polyklonale
Antikörper nach
Wirksamwerden (???) - Ig M
- Ig G1 - Ig G2 - Ig A - Ig E - Ig D Möglichkeiten von Antikörpereinteilungen
Nr.
AMS Name der Krankheit HAD IDT DIFT IIFT NT SNT KBR IBlot IPox HA HAH SLA RBT
2 Afrik. Pferdepest x x x
3 Afrik. Schweinepest x x x
5 Anst. Blutarmut d. Pferde x
6 Anst. Blutarmut d. Lachse x x
8 Aujeszky KH x x x
9 Aviäre Influenza x x
12 Beschälseuche d. Pferde x x
14 BHV-1 x x
15 BSE x
16 BVD x x x
17 Brucellose x x x
19 Chlamydiose x x
21 Bovine Leukose x
23 Epiz. Hämorrh. D. Hirsche x
24 Equine Virus Arteritis x x
30 IHN, VHS x x x x x
31 Koi-Herpes-Inf- x
Auszug aus: Amtliche Methodensammlung des FLI, Stand Januar 2014
Anzahl der aufgeführten klassischen serologischen Methoden = 37
Nr.
AMS Name der Krankheit HAD IDT DIFT IIFT NT SNT KBR IBlot IPox HA HAH SLA RBT
33 Lungenseuche d. Rd. x x
34 MKS x
36 Newcastle Krankheit x x
40 Pferdeencephalomyelitis x x x
41 Pockenseuche der Sf+Zg x
42 Q-Fieber x
44 Rifttal-Fieber x x x x
45 Rotz x x
46 Orthopox-Infektion x
48 Schweinepest (KSP) x x x x
49 Stomat. Vesicularis x
50 Taura-Syndrom x
51 Tollwut x x
52 Toxoplasmose x
56 Tularämie x
58 Vesicul. Schw.-KH (SVD) x
61 West-Nil-Virus x x
62 Yellowhead Disease x
63 Zecken-übertragb. KH x x
Auszug aus: Amtliche Methodensammlung des FLI, Stand Januar 2014
Anzahl der aufgeführten klassischen serologischen Methoden = 30
- Sensitivität und Spezifität - Objektivität und Robustheit - Validität und Reliabilität
- Positive und negative Prädiktion - Prävalenz und Inzidens
- Affinität und Avidität - Korrelationskoeffizient
Begriffe der klassischen mikrobiologischen Testheorie (KTT) als Grundlage von Testbewertungen
Krankheit / Goldstandard
ja nein
Test- ergebnis
positiv a b a+b
negativ c d c+d
a+c b+d
Sensitivität = a/(a+c) Spezifität = d/(d+b)
Möglichkeit von Testvergleichen
Einsatzm ö glichkeiten sensitiver und spezifischer Tests in der Serologie
Anwendung sensitiver Tests, falls
• kein spezifisch Antikörper-positiver Fall übersehen werden soll
• spezifisch Antikörper-positive Fälle ausgeschlossen werden sollen
• Ausschluss-Tests „negatives Ergebnis gesucht, Rule-Out“
• Screening-Tests, Überwachungsuntersuchungen
• Testsituation mit mehrheitlich geringer spezifischer Seroprävalenz Anwendung spezifischer Tests, falls
• kein spezifisch Antikörper-negativer Fall übersehen werden soll
• positive und verdächtige Fälle bestätigt / überprüft werden sollen
• Such-Tests „positives Ergebnis gesucht, Rule-In“
• Bestätigungs-Tests, Verlaufsuntersuchungen, Impfkontrollen
• Testsituation mit mehrheitlich hoher spezifischer Seroprävalenz
Serologische Testmethoden -IDT / AGPT / AGID
-SNT
-SLA / MAR -SSA / RBT -HA / HAH -KBR
- HAD
-DIFT / IIFT - ã-IFT
- ELISA - IPoxT - IBlot - u.a.
Brauchen wir denn ü berhaupt noch die klassische Virologie/Serologie ?
(DIFT, IDT, SNT, SLA, SSA, HAH, KBR, usw.)
Ja
• Untersuchungen mit reduziertem Labor
• Referenzmethode – Goldstandard
• Impf- und Infektiositätsnachweise
• Differenzierung von Biotypen/Phänotypen
• Basisdiagnostik bei neuen Erkrankungen
Methode: Immundiffusionstest oder Agargelpr ä zipitationstest (IDT/AGPT/AGID)
• Antigen und Antikörper diffundieren dreidimensional in einem Agarmedium, Möglichkeit der qualitativen und semiquantitativen Testinterpretation.
• Lineare Immundiffusion (n. Oudin), radiale Immundiffusion (n. Mancini) und Doppelimmundiffusion (n. Ochterlony).
• In der Aquivalenzzone bilden sich lichtstreuende Präzipitationsringe oder -linien aus Antigen-Antikörper-Komplexen.
• Die Präzipitationsreaktion ist steuerbar und wird beeinflußt von der Konzentration und dem Volumen der Reaktionspartner sowie durch die Dichte des zu durchdringenden Agarmediums.
• Der Ouchterlony-Assay ist eine wechselseitig nutzbare Diffusionsmethode, bei der beispielsweise Antikörper in ein Loch in der Mitte eines Agarose-Gels
pipettiert werden und verschiedene Löcher mit Antigen-Lösungen kreisförmig herum angeordnet sind (Rosette). Mit diesem Test lässt sich anhand der
Präzipitationslinien zeigen, ob ein Antikörper verschiedene Antigene erkennt bzw. ob verschiedene Antigene ganz oder teilweise identisch sind.
• AGID-Anwendungsbeispiele in der serologischen Labordiagnostik:
AK-Detektion gegen Celo, IBD, Marek, EIA, BLV, CAE/MV, Riftal-Fieber.
Quelle: http://Laborwissen.de/wiki (2014)
n. Mancini
n. Ochterlony
Methode: Serumneutralisationstest (SNT)
• Die Neutralisation von Viren wird in der Serologie zur Bestimmung neutralisierender Antikörper verwendet. Es werden Virusstämme mit typischen zytopathischen Effekten verwendet, sodass die positiven und negativen Reaktionen an den Zellkulturen mikroskopisch direkt ablesbar sind.
• Bei Viren ohne ablesbaren CpE kann eine Virusvermehrung oder -neutralisation mittels anschließender Immunfluoreszenz nachgewiesen werden.
• Zur Bestimmung des Antikörpertiters wird das zu testende Serum titriert bis keine Neutralisationswirkung des Testvirus auf den Zellkulturen feststellbar ist.
• Der Serumneutralisationstest ist ein apparativ, organisatorisch und vom know how ein sehr aufwändiges Testverfahren.
• Die Zellkulturen erfordern für die tägliche Laborarbeit ein viel höheres Maß an Arbeitsaufwand und Erfahrung als die Nutzung vorgefertigter Test-Kits.
• Die Spezifität der SNT-Reaktion wird jedoch von keinem anderen automatisierten Immunassay (z.B. Ab-ELISA) erreicht, der SNT wird oft als Referenztest oder
„Goldstandard“ für die Diagnostik und für Qualitätskontrolle verwendet.
• SNT-Anwendung in der serologischen Labordiagnostik:
AK-Detektion gegen BHV-1, BVD, PI-3, KSP, AK, SVD, EAV, EHV-1, EHV-4,
Quelle: Dr. Schirrmeier, FLI Insel Riems (2012), SNT von BHK 21-ct Zelle mit SBV BH80
Quelle: Dr. Schirrmeier, FLI Insel Riems (2012), IIFT von BHK 21-BRS5 Zelle mit SBV BH80
Methode: Serumlangsamagglutination (SLA) und Mikroagglutination (MAR)
• Die SLA/MAR werden in der Serologie zur Bestimmung agglutinierender, polymerer, bakterielle und parasitäre Antikörper verwendet. Zur Anwendung kommen attenuierte Mikrobensuspensionen bzw. genormte, lebende Stämme.
• Zur Bestimmung des Antikörpertiters wird das zu testende Serum titriert bis keine spezifische Agglutinationswirkung der Reaktionspartner nachweisbar ist, die Tests sind visuell (direkt, mikroskopisch, optisch/digital) ablesbar.
• Bei Testmethoden mit schwer- oder nicht ablesbarer Agglutination wird die Testreaktion mittels Anfärbung (Safranin, Neutralrot) sichtbar gemacht.
• Die SLA wird zusammen mit KBR und RBT hauptsächlich bei der Brucellose- Diagnostik angewandt, sie ist mittels Automatisierung massentauglich.
• Die MAR ist Standardmethode bei der serologischen Leptospirose-Diagnostik, diese Methode erfordert ein erhöhtes Maß an Arbeitsorganisation, Labortechnik und Erfahrung (Stammhaltung, Dunkelfeldmikroskopie).
• SNT/MAR-Anwendungsbeispiele in der serologischen Labordiagnostik:
AK-Detektion gegen Brucella ssp., Tularämie, Rotz, BHV-1, Leptospira ssp.
Quelle: www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm(2014)
Quelle: LAVES, Niedersachsen (2014)
Dunkelfeld- mikroskopie
1:500
1:100 1:360
Serumlangsamagglutination (SLA, Brucellose)
Literaturhinweise zur klassischen Serologie
• Mayr, A. et al, Virologische Arbeitsmethoden, Band 2, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1977
• Jawetz E., Melnick J.L. & Adelberg E.A.. (1973). Medizinische Mikrobiologie.
Berlin: Springer Verlag.
• Thomas, L. (1992). Labor und Diagnose. Hamburg: Medizinische Verlagsgesellschaft.
• Deutsche Norm: Serodiagnostik von Infektionskrankheiten. DIN 58 969, Teil 10, Ausgabe Juli 1989; Beuth Verlag GmbH, Burggrafenstraße 6, Berlin
• Laborheft Serologie im Bayerischen Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit
• www.infektionsnetz.at (2914)
• www.biokurs.de/Skripten/12/bs12-53.htm (2014)
• www.Laborwissen.de/wiki (2014)
