Kombinatorische Synthese von amphiphilen
Porphyrinoiden für die Photodynamische
Tumortherapie (PDT)
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem Fachbereich 2 (Biologie/Chemie)
der Universität Bremen
im September 2006 vorgelegt
von
Agnieszka Maria Kozielec
In dankbarer Erinnerung
meinen verstorbenen Großeltern
Klara und Peter Stach
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F.-P. Montforts 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W.-D. Stohrer
Die experimentellen Arbeiten dieser Dissertation wurden im Institut für Organische Chemie der Universität Bremen in der Zeit von Oktober 2003 bis Mai 2006 unter der Anleitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Franz-Peter Montforts durchgeführt.
Herrn Univ.-Prof. Dr. Franz-Peter Montforts gilt mein besonderer Dank für Überlassung des interessanten Themas, die sehr gute Betreuung und für die ausgezeichneten experimentellen Bedingungen.
Herrn Univ.-Prof. Dr. Wolf-Dieter Stohrer danke ich für die Übernahme des zweiten Gutachtens.
Aus der instrumentalanalytischen Abteilung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Dieter Leibfritz gilt mein Dank Herrn Dr. Thomas Dülcks und Frau Dipl.-Ing. Dorit Kemken für die Aufnahme der zahlreichen Massenspektren sowie den Herren Dr. Touraj Shokati und Dipl.-Ing. Johannes Stelten für die Durchführung von NMR-Experimenten und deren Interpretation.
Frau Anngret Lincke danke ich für die Durchführung der HPLC-Analytik.
Für die Bestimmung der Quantenausbeute bei der Singulettsauerstofferzeugung danke ich Frau Dr. Olga Tsaryova aus der Arbeitsgruppe von Herrn Univ.-Prof. Dr. Dieter Wöhrle Die biologisch-medizinischen Untersuchungen wurden im Onkologie-Zentrum in Gleiwitz durchgeführt. Hier bin ich Frau Prof. Dr. Alicja Ratuszna von der Schlesischen Universität in Kattowitz, Herrn Dr. Aleksander Sochanik, Frau Dr. hab. Maria Wideł und Frau Dr.
Agnieszka Szurko zu besonderem Dank verpflichtet.
Mein Dank gilt den ehemaligen sowie den jetzigen Kollegen Frau Dr. Genevieve Adukpo, Herrn Dr. Vladimr Azov, Herrn Dr. Jordi Ceron, Herrn Dipl.-Chem. Jan-Erik Damke, Frau Dr. Daniela Hanke, Herrn Dipl.-Chem. Thorsten Könekamp, Frau Anngret Lincke, Herrn Dr. Stephan Leupold, Frau Ursula Lücking, Herrn Dr. Rene Manski, Frau Dr. Martina Osmers, Frau M. Sc. Barbara Panek-Bryła, Herrn Dr. Klaus Rischka, Frau Dr. Anna Ruiz, Frau Dr. Rosa Saez, Herrn M. Sc. Mauricio Santos, Herrn M. Sc. Tien Doay Duy und Herrn Dr. Touraj Shokati.
Den Herren Dr. Klaus Rischka und Dr. Stephan Leupold danke ich für Korrekturen und Verbesserungen meiner deutschen Sprache bei der Erstellung dieser Arbeit.
Inhaltsverzeichnis
1.
PORPHYRINOIDE
NATURSTOFFE
[,]... 1
2.
DIE
PHOTODYNAMISCHE
TUMORTHERAPIE
(PDT) ... 5
2.1 Allgemeines ... 5
2.2 Photosensibilisatoren ... 5
2.3 Selektivität der Photosensibilisatoren ... 7
2.4 Wirkmechanismen der Photosensibilisatoren ... 7
2.5 Photosensibilisatoren der ersten Generation ... 9
2.6 Photosensibilisatoren der zweiten Generation[, 16c]... 10
2.6.1 Foscan® ... 10 2.6.2 Monoaspartylchlorin e6... 11 2.6.3 Verteporphin®... 11 2.6.4 Zinn-etiopurpurin ... 12 2.6.5 Photochlor ... 12
3.
AUFGABENSTELLUNG ... 13
4.
DURCHFÜHRUNG
DER
SYNTHESEN ... 17
4.1 Synthese von Ethyldeteroporphyrin-IX-dimethylester ... 17
4.1.1 Darstellung des 3/8-Formyl-deuteroporphyirn-IX-dimethylester... 17
4.1.2 Trennung der 3/8-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylestes... 18
4.1.3 Synthese von Cu-Ethylporphyrine ... 20
4.2 Synthese von Acyl-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Bibliotheken ... 22
4.2.1 HPLC-Analyse der Porphyrin-Bibliotheken ... 24
4.3 Synthese der Acyl-ethyl-chlorine ... 27
4.3.1 Chromatographische Analyse der Chloringemische ... 29
4.4 Synthese einer 3-Ethyl-8-pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure... 32
4.4.1 Biologisch- Medizinische Tests... 37
4.5 Synthese eines Heptyl-chlorin ... 39
4.5.1 HPLC-Analyse der Chlorine 41 und 41 ... 40
4.6 Metalloporphyrine ... 41
4.6.1 Synthese von palladiumhaltigen Chlorinen ... 41
4.7 Bestimmung der Quantenausbeute der sensibilisierten Singulettsauerstoff - Bildung ... 43
4.8 Versuche zur Dekomplexierung von Cu-Chlorphyllin ... 44
5.
ZUSAMMENFASSUNG ... 47
6.
EXPERIMENTELLER
TEIL ... 51
6.1 Allgemeine experimentelle Bedingungen ... 51
6.1.1 Instrumentelle Analytik... 51
6.1.2 Chromatographie... 51
6.1.4 Formelbilder und Abkürzungen ... 52
6.2 Synthese von Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester ... 53
6.3 Synthese von Cu-Ethyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester ... 58
6.4 Synthese von Acyl-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Bibliotheken ... 68
6.4.1 Synthese eines 8-Acyl-3-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbnsäure-Gemisches mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ... 68
6.4.2. Synthese eines 8-Acyl-3-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Gemisches mit gerader Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ... 72
6.4.3 Synthese eines 3-Acyl-8-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Gemisches mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ... 76
6.4.4 Synthese eines 3-Acyl-8-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Gemisches mit gerader Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ... 80
6.5 Synthese von Alkyl-Chlorin-dicarbonsäure-Bibliotheken ... 84
6.5.1 Synthese eines 8-Alkyl-3-ethyl-chlorin-dicarbomsäure-Gemisches mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ... 84
6.5.2 Syntheseeines 8-Alkyl-3-ethyl-chlorin-dicarbomsäure-Gemisches mit gerader Anzahl an Kohlenstoffatome in der Seitenkette ... 87
6.5.3 Synthese eines 3-Alkyl-8-ethyl-chlorin-dicarbomsäure-Gemische mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatome in der Seitenkette ... 90
6.5.4 Synthese eines 3-Alkyl-8-ethyl-chlorin-dicarbomsäure-Gemisches mit gerader Anzahl an Kohlenstoffatome in der Seitenkette ... 93
6.6 Synthese von 8-Ethyl-3-petadecyl-chlorin-dicarbnsäure ... 96
6.7 Synthese von 8-Ethyl-3-Heptyl-chlorin-dicarbnsäure ... 105
6.8 Synthese von Pd-8-Ethyl-3-heptyl-chlorin-dicarbnsäure ... 115
6.9. Darstellung von Pd-Chlorin e6-trimethylester 44... 124
6.10 Versuche zur Dekomplexirung von Cu-Chlorphyllin... 125
1. PORPHYRINOIDE NATURSTOFFE
[ , ]1 2Die Natur ist sehr farbenreich. Natürliche Farbstoffe erfüllen z.B. Signalfunktionen, Tarnfunktion oder dienen dazu, das Sonnenlicht effizient zu nutzen. Zur Gruppe der natürlichen Farbstoffe gehören die Porphyrine 1 (griech.: Purpurfarbstoff), die aus vier, durch Methinbrücken miteinander verbundenen Pyrrolringen aufgebaut sind.
NH N N HN NH N N HN NH N N HN NH N N HN 1 2 3 4
Abb.1: Grundgerüste von Porphyrin (1), Chlorin (2), Isobakteriochlorin (3), Bakteriochlorin (4).
Das konjugierte System im Porphyringerüst enthält 22 π-Elektronen von denen 18 entsprechend der Hückel-Regel (4n+2 π-Elektronen) einen cyclisch konjugierten aromatischen Chromophor bilden. Ein wichtiger Vertreter dieser Gruppe ist der rote Blutfarbstoff Hämin 5. Dieser Eisen(II)-haltige Komplex bildet mit dem Protein Globin das Hämoglobin. Hämoglobin ist für den Sauerstofftransport im Körper verantwortlich. Es gibt mehrere Strukturvarianten der Hämine, die unterschiedliche Funktionen in Elektronentransportketten ausüben. N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2H CO2H Fe Cl CH2 CH2 5 Abb. 2: Hämin-chlorid.
N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2H CO2H Fe CH2 CH2 CH3 C H3 C H3 N N N N C H3 CH3 CH3 CO2H CO2H Fe CH2 H O CH3 O H CH3 C H3 C H3 N N N N C H3 CH3 CH3 CO2H CO2H Fe CH2 C H3 CH3 O H S CH3 CH3 S N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2H CO2H Fe Cys Cys CO2H Fe CH3 N N N N CO2H CO2H CO2H HO2C CO2H HO2C HO2C H3C C H3 N N N N CH3 C H3 CO2H CO2H Fe O O CO 2H HO2C H3C OH O N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2H Fe CH2 CH2 N N O Häm a Häm b Häm c Häm d Häm d1 Häm o Sirohäm 6 7 8 9 10 11 12
Durch Reduktion einer Doppelbindung in einem der vier Pyrrolringe des Porphyrins, gelangt man zum Strukturtyp der Chlorine 2. Pflanzen enthalten diesen Strukturtyp als Chlorophylle, den wichtigen Pigmenten der Photosynthese. Es gibt unterschiedliche Chlorophylltypen, die sich durch ihr Substitutionsmuster unterscheiden:
− Chlorophyll a – blaugrün – in Pflanzen, Algen, Cyanobakterien,
− Chlorophyll b – grün – in Grünalgen, Landpflanzen,
− Chlorophyll c – gelbgrün –in Algen,
− Chlorophyll d – in Rotalgen.
Ein weiterer porphyrinoider Farbstoff, der zwei reduzierte Doppelbindungen in gegenüberlegenden Pyrrolringen des Porphyringerüsts aufweist, ist in photosynthetisierenden Bakterien gefunden und deshalb als Bakteriochlorophyll (BChl) 4 bezeichnet worden. Purpurbakterien absorbieren Licht im infraroten Bereich (800 – 900 nm), und nutzen Schwefel- oder organische Verbindungen als Reduktionsequivalenten. Bakteriochlorophylle kann man in folgenden Organismen finden:
− Bakteriochlorophyll a bei Schwefelpurpurbakterien, − Bakteriochlorophyll b bei Schwefelpurpurbakterien, − Bakteriochlorophyll c bei Grünen Schwefelbakterien, − Bakteriochlorophyll d bei Grünen Schwefelbakterien, − Bakteriochlorophyll e bei Grünen Schwefelbakterien, − Bakteriochlorophyll g bei Heliobacteria [3].
N N N N CH3 C H3 CH3 C H2 CH3 O Mg CO2H C H3 CO2CH3 N N N N CH3 C H3 CH2 C H2 CH3 O Mg CO2H CO2CH3 C H3 N N N N CH3 C H3 CH3 O CH3 O Mg CO2CH3 H O O Phytyl H3C N N N N CH3 C H3 CH3 C H2 CH3 O CO2CH3 O O Phytyl Mg N N N N CH3 C H3 CH3 C H2 O H O O O Phytyl Mg CO2CH3 H3C H3C Chlorophyll b Chloropyll a Chlorophyll c1 Chlorophyll c2 Chlorophyll d 14 15 16 17 13
CH3 C H3 N N N N CH3 C H3 CH3 O O O CH3 O O O Phytyl Mg CH3 CH3 C H3 N N N N CH3 C H3 CH3 O O O CH3 O O O Phytyl Mg CH3 CH 3 C H3 N N N N CH3 C H3 CH3 O O O Farnesyl Mg C H3 CH3 O H CH3 C H3 N N N N CH3 C H3 CH3 O O O Farnesyl Mg CH3 O H CH3 C H3 O CH3 O N N N N CH3 C H3 CH3 C H2 O O O Farnesyl Mg BChl a BChl b BChl g BChl d 18 19 21 22 BChl c 20
2. DIE PHOTODYNAMISCHE TUMORTHERAPIE (PDT)
2.1 Allgemeines
Die Photodynamische Tumortherapie (PDT) ist eine viel versprechende minimal invasive Behandlungsmethode in der Onkologie [ ]4. Die PDT wird als Alternative zu anderen Methoden dann eingesetzt, wenn ein Patient entweder zu schwach ist, um chemotherapeutische, chirurgische bzw. radiologische Eingriffe zu verkraften, oder wenn diese bereits versagt haben. Diese Therapie kann auch gemeinsam oder zusätzlich zu anderen Krebsbehandlungen und mehrmals an einem Patient eingesetzt werden [ ]5.
Die photodynamische Behandlung verläuft in zwei Etappen. Zuerst wird ein Photosensibilisator (PS) intravenös injiziert, der sich nach einer gewissen Zeit selektiv in den Krebszellen anreichert. Der PS wandelt nach einer Lichtabsorption molekularen Sauerstoff im Grundzustand in situ in cytotoxischen Singulettsauerstoff um, der mit subzellulären Komponenten wie Proteinen oder Lipiden reagiert und eine Nekrose von Tumoren verursacht[ ]6. Der PDT-Prozess ist nur dann möglich, wenn die drei Faktoren Photosensibilisator, Licht und Sauerstoff zusammenkommen und ihre Wirkung ausüben.
2.2 Photosensibilisatoren
Photosensibilisatoren sind chemische Verbindungen, die nach Absorption eines Lichtquants einen photochemischen/photophysikalischen Prozess auslösen. Die Anregung des Photosensibilisators erfolgt in der PDT durch monochromatisches Laserlicht entsprechender Wellenlänge und ausreichender Intensität, wobei er in den ersten angeregten Singulettzustand übergeht. Danach geht er durch Interystem-Crossing in den Triplettzustand über. Der angeregte Zustand kann in zwei unterschiedlichen Reaktionen weiterreagieren. Er kann direkt mit einem Substrat reagieren und Radikale bilden, die nach der Reaktion mit Sauerstoff Peroxide, Hydroxylradikale, Superoxidanionradikale und andere Produkte bilden (Typ I-Reaktion), oder aber seine Energie auf Sauerstoff im Grundzustand übertragen und zur Bildung von Singulettsauerstoff 1O2 führen (Typ II-Reaktion) [ ]7.
Der Singulettsauerstoff ist wegen der Aufhebung des Spinnverbots hochreaktiv, oxidiert Aminosäuren, Nukleinsäuren, ungesättigte Fettsäuren und Steroide[4b]. 1O2 hat im
biologischen Medium eine kurze Lebenszeit von weniger als 0,04 µs und hat deswegen auch einen kleinen räumlichen Wirkbereich von weniger als 0,02µm [ ]8.
S0 S1 T1 A F Ph ISC ISC IC
A – Absorption, F – Fluoreszenz, P – Phosphoreszenz, S – Singulettzustand, T – Triplettzustand, IC – Internal Conversion, ISC – Intersystem Crossing.
Abb.6: Vereinfachtes Jablonski Diagram [ ]9.
hν + Sens (S0) Sens (S1) Sens (T1)
Sens (1T) 1O2
Typ I Typ II
O2-, H2O2, OH• 1O2 Sens (S0) 3O2
2.3 Selektivität der Photosensibilisatoren
Die Gründe, warum sich Photosensibilisatoren selektiv im Tumorgewebe anreichern, sind noch nicht hinreichend bekannt. Ein wichtiger Schritt zur möglichen Aufklärung besteht im Vergleich von Tumorzellen mit gesunden Zellen. Tumorzellen unterscheiden sich von gesunden Zellen in ihrer Morphologie und Physiologie. Bei Krebszellen ist der natürliche Mechanismus von kontrolliertem Wachstum, Teilung und Zerstörung außer Kraft gesetzt. Krebszellen besitzen die Fähigkeit, auch bei Sauerstoffmangel zu überleben, eine eigene Blutversorgung aufzubauen und sich in fremdem Gewebe anzusiedeln (sog. Metastasierung). Krebszellen unterscheiden sich durch folgende Eigenschaften von gesunden Zellen:
1. durch unkontrolliertes Wachstum und dadurch bedingtes größeres Volumen, 2. durch eine undichte Mikrovasculatur,
3. durch schlechte lymphatische Drainage, 4. durch einen kleineren pH-Wert,
5. sie enthalten große Menge von synthetisiertem Collagen, 6. sie enthalten viele Makrophagen,
7. sie enthalten viele Rezeptoren für Lipoproteine[ ]10.
2.4 Wirkmechanismen der Photosensibilisatoren
Die primären Zielorte der PDT sind Membranen der Zellorganellen. Die Photosensibilisatoren binden zunächst im Bereich der Plasmamembranen, bevor der Transport ins Zellinnere zu den Zielen für die PDT erfolgt, nämlich zu den Mitochondrien, Lysosomen, Plasmamembranen, und Nuklei der Tumorzellen. Die Anreicherungsstelle des Photosensibilisators hängt dabei von seinem Charakter ab. Positiv geladene Moleküle haben eine Tendenz zu Agglomerierung in den Mitochondrien und negativ geladene in den Lysosomen. Lipophile Sensibilisatoren reichern sich in Membranen an. Die wasserlöslichen PS findet man in Lysosomen[8]. Faktoren, wie der Lipid/Wasser Verteilungskoeffizient, das Molekulargewicht und die Ladungsverteilung (symmetrisch/asymmetrisch) beeinflussen die Lokalisierung der Sensibilisatoren. Eine Belichtung, die nicht zur Produktion von 1O2 führt (nicht toxischer
Lichtbestrahlung), bringt oft eine Translokalisation des Photosensibilisators mit sich, z.B. vom Cytoplasma zum Zellkern[ ]11.
Viele Photosensibilisatoren wurden in den Tumorzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie lokalisiert. Z.B. wurde dabei gefunden, dass Chlorin e6 in Lysosomen, monokationische
Porphyrine in Membranen und monomere Porphyrine in Mitochondrien angereichert werden. Sensibilisatoren, die sich in den Mitochondrien anreichern, wie 5-Aminolävulinsäure, verursachen eine Apoptose der Zelle, während Sensibilisatoren, die sich in Plasmamebranen agglomerieren nach Lichtbestrahlung Nekrosen verursachen [ ]12.
Wenige Stunden nach der Bestrahlung kommt es zu Schäden an Zellmembranen, Plasmamembranen, Membranen des Zellkerns, der Mitochondrien, der Lysosomen, des Golgi-Apparates und des endoplasmatischen Retikulums. Mitochondriale Schädigungen führen zur spezifischen Hemmung der oxidativen Phosphorylierung, Hemmung der Elektronentransport-Enzyme und Verminderung des zellulären Adenosintriphosphat-(ATP-) Spiegels. Diese Schäden unterbrechen die Zellteilung.
1. Nukleolus. 2. Zellkern (Nukleus). 3. Ribosomen. 4. Vesikel. 5. Raues Endoplasmatisches Reticulum (ER). 6. Golgi-Apparat. 7. Mikrotubuli. 8. Glattes ER. 9. Mitochondrien. 10. Lysosom. 11. Zytoplasma. 12. Mikrobodies, 13 Centrioll.
Abb.8: Organisation einer typischen eukariotischen Tierzelle [ ]13.
An einen optimalen Sensibilisator werden folgende Ansprüche gestellt[ ]14: − möglichst langwellige Absorption mit hoher molarer Extinktion,
− hohe Quantenausbeute für das „intersystem crossing“ (ca. 80 %) und mäßige Quantenausbeute für Fluoreszenz (ca. 20 %),
− vollständige Bildung von Singulettsauerstoff bei Triplettlöschung − selektive Anreicherung im Tumorgewebe (mindestens 1:10), − geringe Toxizität des Sensibilisators und seiner Metaboliten − kurze Verweilzeit im gesunden Gewebe
− gute Wasserlöslichkeit um Transport ins Zelleninnere zu ermöglichen
Als Photosensibilisatoren, die teilweise diese Bedingungen erfüllen, wurden Verbindungen aus folgenden Substanzklassen verwendet [ ]15:
− Porphyrine − Chlorine − Phthalocyanine − Naphtalocyanine − Texaphyrine
2.5 Photosensibilisatoren der ersten Generation
Hämatoporphyrin und seine Derivate[16]
Der erste Photosensibilisator, der in der Photodynamischen Tumortherapie verwendet wurde, bestand aus Hämatoporphyrin (Hp) 23 im Gemisch mit größtenteils undefinierten Derivaten. Hp wurde erstmalig aus Hämoglobin durch Behandlung mit konzentrierter Schwefelsäure isoliert[ ]17. Hämatoporphyrin kann auch aus Hämin 5 nach Behandlung mit Bromwasserstoff und Essigsäure mit anschließender Aufreinigung mit Wasser gewonnen werden[ ]18. Hp und seine oligomeren Derivaten zeigen eine signifikante Phototoxizität. Zu den Vorteilen dieses Photosensibilisators gehören die Absorption des roten Lichtes (λ = 630 nm) und eine gute Anreicherungskapazität in Tumorzellen. Zu den Nachteilen gehört die niedrige Quantenausbeute bei der Produktion von Singulettsauerstoff [ ]19, die langsame Anreicherung in Tumorzellen innerhalb 48 Stunden nach Injektion und die lange Verweildauer in gesunden Zellen von bis zu drei Monaten, wodurch besonders die Haut lichtempfindlich wird und den Patienten zum Leben in Dunkelheit zwingt. Das Präparat wird in einer Menge von 2 mg/kg des Körpergewichts dosiert. Das Krebsgewebe wird mit Lichtdosen von 150 J/cm2 oder 200 –
300 J/cm2, abhängig vom klinischen Zustand des Patienten bestrahlt. Dieses Mittel kann gut gegen Lungenkrebs eingesetzt werden.
Hämatoporphyrin im Gemisch mir seinen oligomeren Derivaten wird unter verschiedenen Namen verkauft, wie z.B.: Photofrin® in den USA, Photosan in Deutschland, Photocarcinorin in China, Photogem in Russland und Hematodrex in Bulgarien.
NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH3 O H OH CO2H CO2H NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH3 O O CO2H CO2H n = 2-9 23 24
2.6 Photosensibilisatoren der zweiten Generation
[20, 16c]Photosensibilisatoren der zweiten Generation absorbieren längerwellieges Licht als Porphyrine. Zu dieser Gruppe gehören Chlorine, Texaphyrine, Porphycene, Phthalocyanine und Bakteriochlorine. Die Absorptionsmaxima einiger Photosensibilisatoren sind in der Tabelle 1 aufgeführte[ ]21.
Photosensibilisator Wellenlänge das Absorptionsmaximums λmax (nm) Molare Extinktion ε (mol-1 cm-1) Porphyrine 620-640 3 500 Meso-substituierte Porphyrine 650 18 000 Phthalocyanine 700 200 000 Naphthalocyanine 780 350 000 Porphycene 610-650 50 000 Texapyrin-Lu(III) 732 42 000 Chlorine 680 40 000 Bakteriochlorine 780 150 000
Tabelle 1: Absorptionsmaxima und Extinktionskoeffizienten von ausgewählten Photosensibilisatoren.
Wegen der relativ starken Absorption im langwelligen Bereich bei 680 nm eignen sich Chlorine für die PDT besser als Porphyrine. Chlorine wie Foscan® und Chlorin e6 werden
deshalb in der Photodynamischen Tumortherapie verwendet. Zu weiteren Vorteilen der PS der zweiten Generation zählen auch deren bessere Quantenausbeute der Singulettsauerstoff-Produktion.
2.6.1 Foscan®
Foscan® – m-Tetra-hydroxyphenyl-chlorin (m-THPC) 25 wird in Mengen von 0,15 mg/kg Körpergewicht intravenös dosiert. Nach 4 Stunden kann eine Bestrahlung des betroffenen Gewebes mit einer Lichtdosis von 20 J/cm2 stattfinden. Foscan® ist als Photosensibilisator für die Verwendung in niedrigen Dosierungen sehr interessant. Nachteil dieses Medikamentes ist die bis zu 20 Tage dauernde Hautlichtempfindlichkeit des Patienten, die es auslöst.
Die ersten Studien mit m-THPC als Wirkstoff begannen 1990 in der Gynäkologie. Heutzutage wird er gerne gegen Rachenkrebs eingesetzt.
NH N N HN OH O H O H OH Foscan® 25
2.6.2 Monoaspartylchlorin e6
Ein anderer bisher eingesetzter Photosensibilisator aus der Familie der Chlorine ist das Monoaspartylchlorin e6 27. Es besitzt die Eigenschaft, sich schnell in Tumorzellen
anzureichern, so dass bereits vier Stunden nach einer Gabe von 1,65 mg/kg Körpergewicht eine Bestrahlung mit einer Lichtdosis von 100 J/cm2 erfolgen kann. Zu weiteren vorteilhaften
Eigenschaften von Monoaspartylchlorin e6 gehören die Absorption bei 644 nm mit
ε = 40000 mol-1cm-1 und seine gute Wasserlöslichkeit. Außerdem verursacht es nur eine geringe Hautlichtempfindlichkeit. NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH2 CO2H CO2H CO2H N H CO2H CO2H NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH2 CO2H CO2H O Chlorin e6 26 Monoaspartylchorin e6 27 2.6.3 Verteporphin®
Verteporphin® ist ein Chlorinderivat, das durch Diels-Alder-Reaktion aus Protoporphyrin IX, dem metallfreien Chromophor das roten Blutfarbstoff Häm, gewonnen wird. Es absorbiert Licht bei 690 nm mit einer molaren Extinktion von ε = 35000 mol-1cm-1. In seinem Fall beträgt die Quantenausbeute an Singulettsauerstoff 70%. Verteporphin und baut sich schnell ab, so dass es nur zu geringer Lichtempfindlichkeit der Haut kommt. Das Medikament zeigt leider keine selektive Anreicherung in den Tumorzellen, es wird aber zur Behandlung der Makuladegeneration der Retina benutzt.
N HN NH N CH3 CH3 C H3 CH2 CO2H CO2H C H3 O O MeO MeO Verteporphin® 28
2.6.4 Zinn-etiopurpurin
Zinn-etiopurpurin (SnEt2, Purlytin®) ist ein Chlorinderivat, das Zinn als Zentralatom besitzt. Das Absorptionsmaximum dieser Verbindung liegt bei 660 nm mit einer molaren Extinktion von 30300 mol-1cm-1. Das Präparat wird überwiegend zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt. Es wird in einer Dosis von 1,2 mg/kg Körpergewicht verabreicht und reichert sich binnen 24 Stunden in Tumorzellen an. Purlytin® erzeugt Singulettsauerstoff mit einer Quantenausbeute von 60%. Der Nachteil dieses Photosensibilisators ist die lange Verweilzeit in der Haut von 7 bis 14 Tagen.
N N N N SnCl2 CH3 CH3 CH3 C H3 C H3 CH3 CH3 C H3 CO2Et Zinn-etiopurpurin 29 2.6.5 Photochlor
Photochlor ist der Markenname für 3-(1-Hexyloxyethyl)-3-devinylpyropheorbid a (HPPH). Der amphiphile Photosensibilisator absorbiert bei 665 nm mit einer molaren Extinktion von ε = 47500 mol-1cm-1. Er bildet Singulettsauerstoff in einer relativ niedrigen Quantenausbeute von 48%. Photochlor wird intravenös in einer Menge von 3 mg/kg Körpergewicht dosiert. Nach 48 Stunden erfolgt die Bestrahlung mit einer Lichtdosis von 150 J/cm2. Dieses Präparat wird u.a. gegen Lungenkrebs eingesetzt.
N NH N H N CH3 C H3 C H3 CH3 CH3 C H3 O O CO2CH3 CH3 Photochlor 30
3. AUFGABENSTELLUNG
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die kombinatorische Synthese von amphiphilen Porphyrinen und deren weitere Umwandlung in Chlorine, die sich für einen Einsatz als Photosensibilisatoren in der PDT eignen sollten. Die Kombinatorische Synthese gehört zu den wichtigen Methoden der modernen Chemie. Seit den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts hat das Interesse für die Möglichkeiten der Kombinatorischen Synthese einen Paradigmenwechsel in der Wirkstoffchemie, der Katalyseforschung und den Materialwissenschaften eingeläutet. Bis zu Einführung der Kombinatorischen Synthese war Synthesechemie darauf ausgerichtet, gezielt Einzelnverbindungen darzustellen und deren Einsatz als Wirkstoff, Werkstoff und Katalysatoren zu erforschen. Der Nachteil der Strategie besteht darin, zeitaufwändig zahlreiche Verbindungen herzustellen, zu charakterisieren und zu testen.
In der Kombinatorischen Synthese werden zahlreiche Verbindungen ähnlichen Typs in einem einzigen Syntheseverfahren hergestellt und die so erhaltenen Substanzbibliotheken wiederum in einem einzigen Testverfahren (Screening) der Substanzbibliothek Treffer, so genannte Hits ergeben, werden die Treffer identifiziert und charakterisiert und danach durch gezielte Synthese in erforderlichen Mengen verfügbar gemacht[ , 3d]22 .
In Rahmen dieser Dissertation sollten vier Porphyrin-Gemische (Bibliotheken) 32, 33, 35 und 36 und vier Chlorin-Gemische 37, 38, 39 und 40 synthetisiert, charakterisiert und einem ersten „Screening“ unterzogen werden. Durch Parallelsynthese sollten durch Friedel-Crafts-Acylierung Carbonsäuren verschiedener Kettenlängen mit den Porphyrinen 41 und 42 verknüpft werden.
Durch Anreicherung in Liposomen könnten geeignete Einzelverbindungen aus den Substanzbibliotheken selektiert und identifiziert werden und schlussendlich Synthesen für biologische Studien hergestellt werden.
N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 N CH3 Cu NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 R O CO2H CO2H 31 32 33 R = CnH2n+1, n = 2, 4…18; 32 R = CnH2n+1, n = 3, 5…19; 33
N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Cu CH3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 R CH3 O CO2H CO2H 34 35 36 R = CnH2n+1, n = 3, 5…19; 35 R = CnH2n+1, n = 2, 4…18; 36
Abb.11: Zu synthetisierende Substanzbibliotheken 35, 36.
C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC R CO2H CO2H CH3 C H3 NH N N HN CH3 C H3 C H3 CH3 R CO2H CO2H CON(CH3)2 37 38 39 40 R = CnH2n+1, n = 3, 5…19; 37, 39 R = CnH2n+1, n = 2, 4…18; 38, 40 Abb.12: Aus 32, 33, 35 und 36 zu synthetisierende Chlorinbibliotheken 37, 38, 49 und 40.1
Es ist bekannt, dass amphiphile Moleküle, deren hydrophobe und hydrophile Reste sich an der Peripherie des Makrozyklus befinden, eine gute Anreicherung im Tumorgewebe wegen ihrer günstigen Lipid/Wasser-Verteilung zeigen[16c]. Die Verbindungen 41 und 42 erfüllen mit ihren lipophilen Alkylseitenketten und den Propionsäurefunktionen die Bedingung für ein amphiphiles Chlorin. Die Carboxylfunktionen könnten darüber hinaus weiter funktionalisiert werden, um die Hydrophilie dieses Molekülteils zu modifizieren.
C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC CH3 (CH2)13 CH3 CO2H CO2H C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC CH3 CH3 CO2H CO2H 42 41
Abb.13: Amphiphilie Chlorine als Zielstrukturen für einen Einsatz in der PDT.
Eine weitere Modifizierung der Chlorine könnte durch Einbau von Metallzentralatomen z.B. Pd in den Makrotetrazyklus erfolgen, wobei auch vom Chlorophyll abgeleitete Chlorine wie 44 in Betracht gezogen werden sollten.
N Pd N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 C H2 N C H3 N N N CH3 CH3 C H3 Me2NOC CO2H CO2H CH3 CH3 Pd 44 43
Abb.14: Zu synthetisierende Pd-Chlorine 43 und 44.
Das 44 zugrunde liegende metallfreie Chlorin e6 26 sollte aus kommerziell erhältlichem
Kupferchlorophyllin 45 durch Dekomplexierung hergestellt werden. Dadurch würde sich gleichzeitig ein einfaches und preiswertes Darstellungsverfahren für Chlorin e6 26 ergeben.
Ein weiteres Ziel der Arbeit war eine Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Darstellung des Chlorins e6 26 aus dem Cu-Chlorophyllin 45. Der Schwerpunkt der Synthese lag im
Kupferausbau. N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 C H2 Cu CO2Na CO2Na CO2Na CH3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 C H2 CO2H CO2H CO2H CH3 45 26
4. DURCHFÜHRUNG DER SYNTHESEN
4.1 Synthese von Ethyldeteroporphyrin-IX-dimethylester
4.1.1 Darstellung des 3/8-Formyl-deuteroporphyirn-IX-dimethylester
Ausgangprodukt für die Herstellung von Acylchlorinen ist Hämin 5, das sich aus Blut gewinnen lässt. Behandlung von Hämin in einer Resorcinschmelze entfernt die Vinyl-Gruppen. Anschließend wird durch Einleiten von Chlorwasserstoff-Gas in Anwesenheit von Eisen(II)-sulfat in Methanol das zentrale Eisenatom unter gleichzeitiger Veresterung der freien Carbonsäuregruppen ausgebaut[ ]23. Der so erhaltene Deuteroporphyrin-IX-dimethylester 46 wurde mit Kupfer(II)-acetat-monohydrat komplexiert, um eine selektive Formylierung an den Positionen 3 oder 8 mit Orthoameisensäuretrimethylester und Trifluoressigsäure zu gewährleisten. Unter diesen Bedingungen kommt es bevorzugt zu einer Monoformylierung [ ]24. NH N N HN C H 3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 N N N N C H 3 CH3 CH3 C H3 CO2H CO2H Fe Cl CH2 CH2 Cu N N N N C H 3 CH3 CH 3 C H 3 CO2CH3 CO2CH3 H O Cu N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O NH N N HN C H 3 CH3 CH 3 C H 3 CO2CH3 CO2CH3 H O Cu N N N N C H3 CH3 CH 3 C H 3 CO2CH3 CO2CH3 + + c d 5 46 47 48 49 50 51 a b
Schema 1: Darstellung konstitutionsisomerer Formylporphyrine 50 und 51 aus Häminchlorid 5. Reaktionsbedingungen: a) Resorcin, 165oC, 45 min; FeSO4*7H2O, Pyridin,
MeOH, HCl (g), 0oC, 4 h; b) Cu(OAc)
2*H2O, MeOH, CHCl3, Rfl., 3 h; c)
orthoameisensäuretrimethylester, CF3CO2H, 10 min., 20oC; d) CF3CO2H, konz.
4.1.2 Trennung der 3/8-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylestes
Die Trennung der Konstitutionsisomere 48 und 49 erfolgte zunächst mittels MPLC. Die Methode war aufwendig aber notwendig, um reines Cu-8-Formyl-deuteroporphyrin 49 zu erhalten. Mit dem Verfahren konnte man nur verunreinigtes Cu-3-Formyl-deuteroporphyrin 48 gewinnen.
Hierzu wurde eine Säule (270 x 460 mm) verwendet, die mit Matrex Silica 20-45µm 60 Å als Adsorbent gefüllt war. Als Eluent diente Dichlormethan/1,4-Dioxan (97+3) [ ]25 bei einer Flussrate von 10 ml/min. Für eine Trennung wurden 300 mg des Isomerengemisches in 100 ml Laufmittel aufgetragen. Die Trennung dauerte ca. 30 Stunden. Man fraktionierte in 10 ml Fraktionen und prüfte die Zusammensetzung mittels HPLC (LiChrosorb 60 Si, CH2Cl2/Dioxan (98,5+1,5), 1,5 ml/min, UV λ = 405 nm). Pro Trennung erhielt man 50 mg
(17% d.Th.) reines Cu-8-Formylporphyrin.
a) b)
Zeit [min] 5 4 0 Zeit [min] 5 0
Abb.16: HPLC-Chromatogramme von a) Cu-3/8-Formylpoprhyrin, b)
Cu-8-Formylpoprphyrin 49. Bedingungen: LiChrosorb 60 Si, CH2Cl2/Dioxan 98,5+1,51
ml/min.
In einem anderen Verfahren [ ]26 wurden die beiden Konstitutionsisomere 50 und 51 nach dem Kupferausbau mit konzentrierter Schwefelsäure und Trifluoressigsäure auf einer Stufensäule (Durchmesser/Höhe der Stufen: 10 mm, 15 mm, 20 mm, 30 mm, je 100 mm lang) an 200 ml Aluminiumoxid (Akt. III, neutral) mit Dichlormethan als Laufmittel chromatographiert. Die gesamte Trennung dauerte ca. zwölf Stunden, wobei das 3-Isomer zuerst eluiert würde. Die Fraktionen (je 10 ml) wurden mittels DC-Kontrolle auf Aluminiumoxid mit Dichlormethan (doppelt entwickelt) analysiert. Die Konstitutionsisomere haben nur einen kleinen
Unterschied in den Rf-Werten was deren Trennung schwierig macht. Pro Trennung wurden
125 mg Isomerengemisch eingesetzt und 53 mg isomerenreiner 3-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 50 und 24 mg 8-Formyl-deuteroporphyrin-3-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 51 erhalten. In einem dritten Verfahren wurde das Isomerengemisch aus 50/51 mittels MPLC getrennt. Durch diese chromotographische Trennung erhielt man isomerenreines 3-Formyl- 50 und 8-Formyl-deuteroporphyrin 51. Die Trennung erfolgte auf einer Säule (26 x 460 mm) mit Matrex Silica 20-45µm 60 Å und Dichlormethan/1,4-Dioxan (97+3) als Eluent mit einer Flussrate von 3 ml/min. Für eine Trennung wurden 130 mg des Isomerengemisches in 100 ml Laufmittel aufgetragen. Die Trennung dauerte ca. 14 Stunden. Man fraktionierte in 10 ml Fraktionen und prüfte die Zusammensetzung mittels DC-Kontrolle (Aluminiumoxid, Dichlormathan, doppelt entwickelt). Man erhielt pro Trennung 10 mg (7% d.Th.) des 3-Formyl-dueteroporphyrin-IX-dimethylesters und 29 mg (22% d.Th.)
8-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylesters. Die Reinheit der Isomere wurde durch 1 H-NMR-Messung kontrolliert. Im Bereich der chemischen Verschiebung von 9 ppm befinden sich die Wasserstoffsignale der Positionen 3 und 8 der Isomere, die zur Feststellung der Reinheit der Isomere genutzt wurde.
Die Reinheit der Isomere konnte auch HPL-Chromatographisch bestimmt werden.
NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O H NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O H 1.0000 Int egr al 9.1050 (ppm) 8.50 8.55 8.60 8.65 8.70 8.75 8.80 8.85 8.90 8.95 9.00 9.05 9.10 9.15 9.20 9.25 9.30 9.35 9.40 9.45 1.0000 Int egr al 9.0220 (ppm) 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 9.00 9.10 9.20 9.30 9.40 0.1577 1.0000 Int egr al 9.1661 9.1270 (ppm) 8.70 8.75 8.80 8.85 8.90 8.95 9.00 9.05 9.10 9.15 9.20 9.25 9.30 9.35 9.40 9.45
a) 3/8-Formylporphyrin 50/51 b) 3-Formylporphyrin 50 c) 8-Formylporphyrin 51
a)
Zeit [min] 5,30 0
b)
Zeit [min] 6,50 0
Abb.18: HPLC-Chromatogramme von a) 3-Formylpoprhyrin 50, b) 8-Formylpoprphyrin 51. Bedingungen: LiChrosorb 60 Si, CH2Cl2/Dioxan (98,5+1,5) 1ml/min.
Um die beiden Konstitutionsisomere in reiner Form und in größeren Mengen zu erhalten, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Dazu wurde das Isomerengemisch 48 + 49 mehrmals in Dichlormethan/Dioxan (97+3) suspendiert und jeweils anschließend filtriert. Wegen der schlechteren Löslichkeit des Cu-8-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylesters 49 verbleibt dieser jeweils als Feststoff in der Suspension und kann deshalb durch Abfiltrieren in reiner Form gewonnen werden. Das Filtrat, das den angereicherten Cu-3-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester enthielt, verwendete man, um das 3-Isomer weiter aufzureinigen. Dazu wurde das Kupfer mit der bereits erwähnten Methode ausgebaut und das „kupferfreie“ Gemisch der Porphyrine mehrfach in Dichlormethan/Dioxan (97+3) suspendiert und ebenfalls filtriert. In diesem Fall erweist sich 3-Formyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 50 als schwer löslich, was zu einer Aufreinigung des 3-Isomers führte.
4.1.3 Synthese von Cu-Ethylporphyrine
Die Formylgruppen der isomerenreinen Porphyrine 49, 50, 51 wurden mittels Wittig-Reaktion und nachfolgender katalytischer Hydrierung in Ethylsubstituenten umgewandelt. Bei der Wittig-Reaktion ist auf die Menge an Phosphorylid und kurze Reaktionszeiten zu achten, da ansonsten, wie schon früher in unserem Laboratorium beobachtet, auch die Estergruppen mit dem Wittig-Reagenz reagieren [ ]27. Die abschließende Rekomplexierung mit Kupfer diente dazu, den Chromophor für die folgende Acylierungsreaktion vorzubereiten.
NH N H N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O Cu N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 H O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH2 NH N H N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH2 Cu N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH2 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 NH N H N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 Cu N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 Cu 50 51 49 52 53 54 55 56 31 34 a b c a b c a b
Schema 2: Darstellung konstitutionsisomerenreiner Cu-Ethylporphyrine 31 und 34. Bedingungen: a) Ph3P=CH2, 5 min., 0oC; b) Pd(OAc)2, H2, (EtO)3SiH, 15 min.,
4.2 Synthese von
Acyl-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Bibliotheken
Ein Ziel der Arbeit war die Darstellung von amphiphilen Porphyrinen. Um Porphyrine mit hydrophilen und lipophilen Strukturteilen, zu erhalten, wurde zunächst die Variation der Lipophilie ins Auge gefasst. Um einen Photosensibilisator mit optimaler Lipophilie zu erhalten, wurden Porphyrine mit Seitenketten unterschiedlicher Länge synthetisiert. Die Kettenlänge reichte Länge von C2 (Essigsäure) bis C20 (Arachinsäure). Zur besseren
Unterscheidung der Einzelverbindungen in den Bibliotheken mittels HPLC-Analysen wurden Carbonsäuren mit gerader und ungerader Anzahl von Kohlenstoffatomen separat umgesetzt. Der Abstand um jeweils zwei Kohlenstoffeinheiten in den Seitenketten der Einzelverbindungen im Gemisch sorgte für signifikante Unterschiede in deren Retentionszeiten in der HPLC.
Zur Friedel-Crafts-Acylierung von Cu-3-Ethyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 31 und Cu-8-Ethyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 34 wurden jeweils Gemische der Carbonsäuren mit gerader oder ungerader Kettenlänge bei -15oC mit
Chlorameisensäureisobuthylester aktiviert und danach unter Katalyse mit Zinntetrachlorid mit den Makrozyklen umgesetzt. Nach diesem Verfahren wurden folgende vier Gemische 57, 58, 61 und 62 dargestellt (Schema 3 und 4).
Im nächsten Schritt wurde Kupfer mit einem Gemisch aus konzentrierter Schwefelsäure und Trifluoressigsäure ausgebaut. Die Verseifung der Estergruppen erfolgte mit fünf molarer Kaliumhydroxid-Lösung in Tetrahydrofuran. Die Gemische aus den verschiedenen Carbonsäuren 32, 33, 35 und 36 wurden mittels HPLC analysiert.
N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Cu N CH3 N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Cu N CH3 R O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 R O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 R O CO2H CO2H a b c 31 59 60 57 58 32 33 R = CnH2n+1, n = 2, 4…18; für 58, 60,32 R = CnH2n+1, n = 3, 5…19; für 57, 59, 33 Schema 3: Darstellung von 8-Acyl-3-ethyl-porphyrin-Gemischen 32 und 33. Bedingungen:
a)CnH2n+1CO2H, CH2Cl2, Et3N, Chlorameisensäureisobuthylester, -15oC, SnCl4,
N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Cu CH3 N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Cu R CH3 O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 R CH3 O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 R CH3 O CO2H CO2H a b c 34 35 36 61 62 63 64 R = CnH2n+1, n = 3, 5…19; für 61, 63, 35 R = CnH2n+1, n = 2, 4…18; für 62, 64, 36
Schema 4: Darstellung von 8-Acyl-3-ethyl-porphyrin-Gemischen 35 und 36. Bedingungen: a) CnH2n+1CO2H, CH2Cl2, Et3N, Chlorameisensäureisobuthylester, -15oC, SnCl4, 1 h;
4.2.1 HPLC-Analyse der Porphyrin-Bibliotheken a)
Zeit [min] 80 50 30 15 0
b)
Zeit [min] 100 65 45 30 15 0
Abb.19: HPLC-Chromatogramm a) des 8-Acyl-3-ethyl-deuterporphyrin IX dicarbonsäure-Gemisches 32, b) 8-Acyl-3-ethyl-deuterporphyrin-IX-dicarbonsäure-dicarbonsäure-Gemisches 33. Bedingungen: Säule: Li Chrosorb 100 RP-18, Eluent:
Methanol/aq.Tetrabutyl-ammoniumdihydrogen-phosphat Lsg. 2,5 mmol/l, pH 2,5 (95+5), Flussrate: 2 ml/min, Detection: UV λ = 405 nm
a)
Zeit [min] 70 45 30 15 0
b)
Zeit [min] 90 60 30 10 0
Abb.20: HPLC-Chromatogramm a) des Gemisches 36, b) des 3-Acyl-8-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure-Gemisches 35. Bedingungen: Säule: LiChrosorb 100 RP-18, Eluent: Methanol/aq.Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lsg. 2,5 mmol/l, pH 2,5 (95+5), Flussrate: 2 ml/min, Detection: UV λ = 405 nm
0 20 40 60 80 100 120 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Anzahl der C-Atome in der Seitenkette
R e te nt ions z e it [ m in ] 32 33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Anzahl der C-Atome in der Seitenkette
R e te n tio n s ze it [ m in ] 36 35 0 20 40 60 80 100 120 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Anzahl der C-Atome in der Seitenkette
R e te n tio n s z e it [ m in ] 35 33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Anzahl der C-Atome in der Seitenkette
R e te n tio n s ze it [ m in ] 36 32
Abb.21: Diagramme der Retentionszeiten der Porphyrine mit unterschiedlicher Länge der Seitenkette.
Die HPLC Auswertungen zeigen, dass mit der Länge der Seitenketten die Retentionszeiten für die Porphyrine wie erwartet ansteigen. Vergleicht man die Retentionszeiten der 8-Acyl-3-ethyl-deuterporphyrin-IX-dicarbonsäuren mit denen der Konstitutionsisomere 3-Acyl-8-ethyl-deuteroporphyrin-IX-dicarbonsäure, so ergibt sich für die in 8-Position acylierten Konstitutionsisomere eine deutlich höhere Lipophilie, erkennbar an längeren Retentionszeiten.
Das Porphyrin-Gemisch 35 wurde in Wasser gelöst, wobei die gesättigte Lösung eine Konzentration von 0,5 mg/ml erreicht.
4.3 Synthese der Acyl-ethyl-chlorine
Da sich Porphyrine weniger gut als Chlorine für die die PDT eignen, wurden aus den Porphyrin-Bibliotheken Chlorin-Bibliotheken hergestellt. Dazu wurden die Ketofunktionen in 59, 60, 63 und 64 mit Natriumborhydrid reduziert (Schema 5 und 6) [ ]28. Die erhaltenen Alkoholgemische 65, 66, 71 und 72 ermöglichten deren Überführung in Chlorine mittels Amidacetal-Claisen-Umlagerung[ ]29.
Die primär gebildeten Chlorine 67, 68, 73 und 74 mit einer im Verlauf der Umlagerung erzeugten exozyklischen Doppelbindung wurden katalytisch hydriert, um die labile Doppelbindungsstruktur zu beseitigen. Diese Reduktion wurde mit Triethoxysilan und Palladium(II)-acetat in THF/Wasser [ ]30 unter einer Wasserstoffatmosphäre durchgeführt. In der Reaktion entstehen cis/trans–Diastereomere mit einem größeren Anteil an cis-Isomeren. Das Isomerenverhältnis lässt sich zugunsten der trans-Isomere durch Äquilibrierungsverfahren ändern, in dem die Gemische in entgastem Methanol in Gegenwart von p-TsOH mehrere Stunden erhitzt werden[ ]31.
Die Gemische 69, 70, 75 und 76 wurden in THF gelöst und mit 5 molarer wässriger KOH-Lösung versetzt. Nach 23 Stunden Erhitzen wurden die Chlorine als Dicarbonsäuren erhalten. Die vier Gemische 37, 38, 39 und 40 wurden mittels HPLC analysiert.
NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 R O CO2CH3 CO2CH3 NH N N HN CH3 C H3 C H3 CH3 CON(CH3)2 R CO2CH3 CO2CH3 C H3 R NH N N HN CH3 C H3 C H3 CH3 CON(CH3)2 CO2CH3 CO2CH3 C H3 N N N N CH3 C H3 C H3 CH3 CON(CH3)2 R CO2H CO2H C H3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 R OH CO2CH3 CO2CH3 59 60 65 66 67 68 69 70 37 38 a b c e R = CnH2n+1; n = 3, 5, …,19; für 59, 65, 67, 69, 37 R = CnH2n+1; n = 2, 4, …,18; für 60, 66, 68, 70, 38 Schema 5: Synthese der Chlorin-Bibliotheken 37, 38. Bedingungen: a) CH2Cl2, NaBH4 in
MeOH, 1 h; b) o-Xylol, N,N–Dimethylacetamid–dimethylacetal, 3 h, 160°C; c) THF, Pd(II)-acetat, H2O, Triethoxysilan, 15 min., RT; d) THF, 5M KOH, 23 h,
N N H NH N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 R O C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC R CO2H CO2H CH3 N HN NH N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 R O H C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC R CH3 CO2CH3 CO2CH3 C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC R CH3 CO2CH3 CO2CH3 63 64 71 72 73 74 75 76 39 40 R = CnH2n+1; n = 3, 5, …,19; für 63, 71, 73, 75, 39 R = CnH2n+1; n = 2, 4, …,18; für 64, 72, 74, 76, 40
Schema 6: Synthese der Chlorin-Bibliotheken 39 und 40. Bedingungen: a) CH2Cl2, NaBH4
in MeOH, 1 h; b) o-Xylol*, N,N–Dimethylacetamid–dimethylacetal, 3 h, 160°C; c) THF, Pd(II)-acetat, H2O, Triethoxysilan, 15 min., RT; d) THF, 5M KOH, 23
4.3.1 Chromatographische Analyse der Chloringemische
Da die Zuordnung der Chlorinpeaks wegen des komlexen HPLC-Chromatogramms schwierig war, wurden die Peaks durch interne Standarisierung kalibriert. Hierzu wurde für die Friedel-Crafts-Acylierung Capronsäure [CH3-(CH2)6-CO2H] in zehnfach höherer Konzentration als
die anderen Säuren eingesetzt. Dadurch erhielt man für die entsprechende Chlorinkomponente im HPLC einen Peak deutlicher Intensität.
Standard
Zeit [min] 80 60 40 20 10 0
Abb.22: HPLC-Chromatogramm des Chlorin-Gemisches 37. Bedingungen: Säule: LiChrosorb 100 RP-18, Eluent: Methanol/aq.Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lsg. 2,5 mmol/l, pH 2,5 (95+5), Flussrate: 2 ml/min, Detection: UV λ = 405 nm.
a)
Zeit [min.] 80 60 40 20 10 0
b)
Zeit [min] 80 60 40 20 10 0
Abb.23: HPLC-Chromatogramm a) des Chloringemisches 40, b) des Chloringemisches 38. Bedingungen: Säule: LiChrosorb 100 RP-18, Eluent: Methanol/ aq.Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lsg. 2,5 mmol/l, pH 2,5 (95+5), Flussrate: 2 ml/min, Detection: UV λ = 405 nm.
Zeit [min] 75 50 30 20 10 0
Abb.24: HPLC-Chromatogramm des Chlorin-Gemisches 39. Bedingungen: Säule: LiChrosorb 100 RP-18, Eluent: Methanol/aq.Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lsg. 2,5 mmol/l, pH 2,5 (95+5), Flussrate: 2 ml/min, Detection: UV λ = 405 nm. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Anzahl der C-Atomen in der Seitenkette
R ten ti o n sz ei t [ m in ] 37 38 0 10 20 30 40 50 60 70 80 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Anzahl der C-Atomen in der Seitenkette
R e te nt ions z e it [ m in ] 37 39
Abb.25: Retentionszeiten in Abhängigkeit von der Kettenlänge verschiedener
Acylchlorincarbonsäuren 37 - 39.
Die HPLC-Chromatogramme zeigen anhand der Retentionszeiten (Abbildung 25), dass mit zunehmender Kettenlänge die Chlorine wie erwartet lipophiler werden. Genauso wie bei Porphyrin-Gemischen sind die 3-Alkyl-Derivate 39 stärker lipophil als die Konsitutiononsisomere 37.
4.4 Synthese einer 3-Ethyl-8-pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure
Für biologisch-medizinische Untersuchungen sollte gezielt ein Chlorin als Einzelverbindung synthetisiert werden. Man hätte damit auch die Möglichkeit, ein präparatives Herstellungsverfahren für identifizierte Einzelverbindungen aus den untersuchten Substanzbibliotheken zu erproben. Dazu wurde ein Chlorin mit 15 Kohlenstoffatomen in der Seitenkette ausgewählt. Als Ausgangsprodukt wurde Cu-8-Ethyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 34 verwendet. Die Friedel-Crafts-Acylierung wurde mit Pentadecansäure und Zinntetrachlorid als Katalysator durchgeführt und dabei das Porphyrin 77 erhalten. Im nächsten Syntheseschritt wurde dekomplexiert und danach mit Natrimborhydrid zum Alkohol 79 reduziert. Um eine Reduktion der Estergruppen zu vermeiden, war eine Kontrolle der Reaktionszeit zu beachten. NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 R CH3 O H C H3 N HN NH N CH3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 C H3 CH3 R Me2NOC C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC R CH3 N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 Cu CO2CH3 CO2CH3 CH3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 R O C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC R CH3 CO2H CO2H N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 Cu CO2CH3 CO2CH3 CH3 R O a b c e 34 78 79 80 81 41 77 d f R = (CH2)13CH3 Schema 7: Synthese des Pentadecyl-chlorins 41. Bedingungen: a) Pentadecansäuren,
CH2Cl2, Et3N, Chlorameisensäureisobutylester, -15oC, SnCl4, 1 h, b)
CF3CO2H, konz. H2SO4, 1 h, CH2N2, 30 min.; c) CH2Cl2, NaBH4 in MeOH,
1 h; d) o-Xylol, N,N–dimethylacetamid–dimethylacetal, 3 h, 160°C; e) THF, Pd(II)-acetat, H2O, Triethoxysilan, 15 min., RT; f) THF, 5M KOH, 23 h, Rfl.
Im nächsten Schritt erfolgte die Amidacetal-Claisen-Umlagerung zum Chlorin 93, dessen exozyklische Doppelbindung mit Palladium(II)-acetat und Triethoxysilan in THF/Wasser unter einer Wasserstoffatmosphäre reduziert wurde.
Die gebildeten cis/trans-Diastereomere 81 ließen sich voneinander trennen. Dazu chromatographierte man das Gemisch so langsam wie möglich über Kieselgel mit Dichlormethan/Etylacetat (19+1). Zuerst wurde das cis-Isomer eluiert. Die Reinheit der Isomere wurde mittels HPLC-Analyse bestimmt (Abbildung 26). Da die Trennung der beiden Isomere aufwändig ist, wurden diese als Gemisch in den weiteren Reaktionen eingesetzt. a)
Zeit [min] 2 0
b)
Zeit [min] 2,30 0
Abb.26: HPLC-Chromatogramm a) cis-Chlorin 81a; b) trans-Chlorin 81b. Bedingungen: Li Chrosorb 60 Si, CH2Cl2/EtOAc (92,5+7,5), 1 ml/min. UV λ = 405 nm,
Die Isomere sind, wie bereits früher in ähnlichen Fällen gezeigt, durch einen Vergleich der Fragmentierungsmuster der Chlorine im Massenspektrum zu unterscheiden [ ]32. Im beiden Fällen entstehen [M+H]+-Ionen und [M+H–87]+-Ionen. Für das cis–Isomer ist die Fragmentierung um 87 Masseneinheiten sehr schwach. Für das trans–Isomer beobachtete man eine starke Fragmentierung. Bei der Fragmentierung handelt sich um einen Verlust der Essigsäureamid – Seitenkette[14] über eine McLafferty-Umlagerung mit dem zur Acetamid-Seitenkette sterisch günstig stehenden allylischen H-Atom im trans-Isomer. Im cis-Isomer entfallen die stereostrukturellen Voraussehungen für eine McLafferty-Umlagerung.
-CH3CON(CH3)2 N C H3 (H3C)2N O H R H -CH3CON(CH3)2 N H C H3 R N H C H3 R N H C H3 (H3C)2N O H R + + [M + H] [M + H - 87] + + [M + H - 87]+ [M + H]+
a) C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC R CH3 81 a b) C H3 N N H N H N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC CH3 R 81 b R = (CH2)13CH3 Abb.28: Elektronenstoss-MS-Spektren des a) cis-Isomers; b) trans-Isomers.
Für den Einsatz in biologisch-medizinichen Versuchen wurde das Gemisch der diastereomeren Chlorindiester 81a/b zum Diastereomerengemisch der Carbonsäure 41 hydrolysiert. Die HPLC-Analyse der Pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure 41 zeigt ein Verhältnis von 2:1 zugunsten des cis-Diastereomer.
cis
trans
Zeit [min] 47 43 0
Abb.29: HPLC-Chromatogramm der Pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure 41. Bedingungen: Säule: LiChrosorb 100 RP-18, Eluent: Methanol/ aq.Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lsg. 2,5 mmol/l, pH 2,5 (95+5), Flussrate: 2 ml/min, Detection: UV λ = 405 nm.
4.4.1 Biologisch- Medizinische Tests
Im Rahmen einer Kooperation mit dem Onkologie-Zentrum in Gleiwitz und der Schlesischen Universität in Kattowitz wurden Untersuchungen durchgeführt, die feststellen sollten, ob sich das Pentadecylchlorin 41 in Tumorzellen anreichert. Dafür wurden Lungenkrebszellen (LLC) verwendet.
Vorbereitete Liposomenkomplexe, die das Chlorin 41 enthielten, wurden zu den präparierten Zellen gegeben und zwei, vier oder zwölf Stunden inkubiert. Danach wurden mittels Konfokalmikroskopie [Konfokalmikroskop LSM 510 (Firma Carl Zeiss GmbH)] die makierte Krebszellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff - CellTracker Green CMFDA [5-Chlormetylofluorescein-diacetat, λAbs = 492 nm, λF = 517 nm, (Firma Molecular Probes)]
untersucht. Die Bestrahlung der Proben erfolgte bei λ = 488 nm und λ = 543, wobei sich die Chlorine in den Zellen durch eine rote Fluoreszenz zeigen.
Durch Tests wurde nachgewiesen, dass sich das Pentadecyl-chlorin in Tumorzellen anreichert.
Foto- und Zytotoxizität der Pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure
Im diesem Experiment wurden Liposomenkomplexe, die das Chlorin 41 in Konzentrationen von 1, 2, 5, 10 µM enthielten, den Lungenkrebszellen (LLC) gegeben und zwei, vier oder zwölf Stunden inkubiert. Die so präparierten Zellen wurden mit langwelligem Licht (ab 650 nm) 8 Minuten lang bestrahlt. Nach 24 Stunden wurde die Überlebensrate der Krebszellen durch die MTS-Methode ermittelt. Das beste Resultat lieferten Liposomenkomplexe mit dem Chlorin 41 in einer Konzentration von 0,5 µM in der Tumorzelle, nach zwölf Stunden Inkubationszeit. Hierbei kam es bereits in wenigen Minuten nach der Bestrahlung zu ersten Schädigungen der Tumorzellen, nach 24 Stunden waren ca. 95% der Tumorzellen zerstört.
2 µM nach 2 h Inkubation
5 µM nach 4 h Inkubation
10 µM nach 12 h Inkubation
Abb.30: Konfokalmikroskopische Aufnahmen der Tumorzellen nach unterschiedlichen Applikationszeiten und Konzentrationen des Chlorins 41.
4.5 Synthese eines Heptyl-chlorin
Analog zum Chlorin 41 wurde ein Chlorin 42 mit Heptylseitenkette [ ]33 dargestellt, das wiederum für biologisch-medizinische Studien verwendet werden sollte und als Ausgangsprodukt zur Herstellung wasserlöslicher Chlorine dienen sollte. Aus patentrechtlichen Gründen konnte die Darstellung der wasserlöslichen Chlorine nicht in die Dissertation aufgenommen werden.
N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 Cu CO2CH3 CO2CH3 CH3 N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 Cu CO2CH3 CO2CH3 CH3 CH3 O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 CH3 O C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC CH3 CH3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 CH3 O H C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC CH3 CH3 C H3 N HN NH N CH3 CH3 C H3 Me2NOC CH3 CH3 CO2H CO2H 86 42 a b c d e f 34 82 83 84 85
Schema 8: Synthese des 3-Ethyl-8-heptyl-chlorins 42. Bedingungen: a) Heptansäure-anhydrid, CH2Cl2, Et3N, Chlorameisensäureisobutylester, -15oC, SnCl4, 1
h, b) CF3CO2H, konz. H2SO4, 1 h, CH2N2, 30 min; c) CH2Cl2, NaBH4 in
MeOH, 1 h; d) o-Xylol*, N,N–Dimethylacetamid–dimethylacetal, 3 h, 160°C; e) THF, Pd(II)-acetat, H2O, Triethoxysilan, 15 min., RT; f) THF,
4.5.1 HPLC-Analyse der Chlorine 41 und 41
Pentadecylchlorin 41 und Heptylchlorin 42 wurden mittels HPLC analysiert. Für die Analyse verwendete man eine RP-18 Säule und Methanol mit Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat-Lösung (2,5 mM/L pH = 7,5) als Laufmittel. Die beiden Chlorine haben aufgrund der unterschiedlichen Längen ihrer Alkylkette unterschiedliche Retentionszeiten.
Name des Chlorins 8-Ethyl-3-heptyl- chlorin 41
8-Ethyl-3-pentadecyl-chlorin 42 tR [min] cis/23 und trans/23,3 cis/43 und trans/47
Tabelle 3: Retentionszeiten der Chlorine 41 und 42.
trans
cis
trans
cis
a) b)
Zeit [min] 23 0 Zeit [min] 47 43 0
Abb.31: HPLC-Chromatogramme von a) Heptyl-chlorin-dicarbonsäure 41, b) Pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure 42. Bedingungen: Li Chrosorb 100 RP-18, Metahnol/aq. Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lösung 2,5 mmol/l pH = 7,5; 1 ml/min. Das Pentadecylchlorin 41 hat eine größere Retentionszeit als das Heptylchlorin 42 bedingt durch die Seitenkettenlänge. Durch Variation der Polarität der Seitenketten lässt sich die gewünschte Löslichkeit der Chlorine einstellen.
4.6 Metalloporphyrine
Veränderungen im Substitutionsmuster des Porphyingrundgerüstes beeinflussen die photophysikalischen Eigenschaften des Chromophores nur marginal. Einen größeren Einfluss auf Stabilität und photophysikalische Eigenschaften des Chromophores haben Zentralmetallatome. Für die PDT sind Metalle interessant, die unbesetzte oder voll besetzte d-Orbitale z.B. Al(III) oder Zn(II) besitzen [ ]34.
4.6.1 Synthese von palladiumhaltigen Chlorinen
Für einen Einsatz in der PDT soll ein Photosensibilisator Licht im langwelligen Bereich (600 – 700 nm) mit einer hohen molaren Extinktion absorbieren. Ein zweites wichtiges Kriterium ist die vollständige Bildung von Singulettsauerstoff. Es ist literaturbekannt[34, ]35, dass das Palladium-bakteriopheophorbid 87 die Singulettsauerstoff-Bildung in organischen
Lösungsmitteln mit etwa 100% Quantenausbeute ermöglicht.
C H3 CH3 N Pd N N N CH3 HO2C O H3CO2C C H3 C H3 O CH3 87 Palladium-bakteriopheophorbid
Ausgehend von 8-Ethyl-deuteroporphyrin-IX-dimethylester 56 wurde ein Palladium-chlorin 43 hergestellt (Schema 9). Im ersten Schritt wurde das Palladium eingebaut [ ]36, um die Acylierung mit Heptansäureanhydrid zu ermöglichen. Im Anschluß wurde mit Natriumborhydrid reduziert. Am erhaltenen Porphyrin 89 wurde die Acetamid-Claisen-Umlagerung durchgeführt und zuletzt die Estergruppen verseift.
N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Pd CH3 N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Pd CH3 CH3 O NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Pd N CH3 CH3 O H C H3 N N N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC CH3 N CH3 N C H3 N N N CH3 CH3 C H3 Me2NOC CO2H CO2H CH3 CH3 C H3 N N N CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 Me2NOC CH3 N CH3 Pd Pd Pd 88 89 56 90 91 43 a b c d 92 c
Schema 9: Darstellung von Pd-8-Ethyl-3-heptylchlorin-dicarbonsäure 43.
Bedingungen: a) PdCl2, MeCN, 16 h, Rfl.. b) Heptansäureanhydrid, CH2Cl2,
Et3N, Chlorameisensäureisobutylester, -15oC, SnCl4, 1 h. c) CH2Cl2, NaBH4
MeOH, 1 h. d) o-Xylol, N,N–Dimethylacetamid–dimethylacetal, 3 h, 160°C. e) THF, Pd(II)-acetat, H2O, Triethoxysilan, 15 min., RT. f) THF, 5M KOH,
Auch in Chlorin e6-trimethylester 93 wurde Palladium eingebaut und so Pd-Chlorin e6 -trimethylester 44 erhalten. NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 C H2 CO2CH3 N Pd N N N C H3 CH3 CH3 C H3 CO2CH3 CO2CH3 CO2CH3 CH3 C H2 93 44 a
Schema 10: Darstellung von Pd-Chlorin e6-trimethylester 44. Bedingungen: a) PdCl2, MeCN,
16 h, Rfl..
4.7 Bestimmung der Quantenausbeute der sensibilisierten
Singulettsauerstoff - Bildung
[37]Die Singulettsauerstoff-Quantenausbeute wurde nach der DPBF–Methode für das Pentadecachlorin 41 und Palladium Chlorin e6 44 ermittelt. Als Referenzprobe wurde Chlorin
e6 26 verwendet, dessen Quantenausbeute der Singulettsauerstoff-Bildung bekannt ist.
Verbindung Chlorin e6 26 Pd-Chlorin e6
-trimethylester 44
Pentadecyl-chlorin-dicarbonsäure 41
Ermittelter Wert 0,6 ± 0,04 ~1 0,83 ± 0,02
Lit. Wert [ ]38 0,66 - -
4.8 Versuche zur Dekomplexierung von Cu-Chlorphyllin
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Chlorin e6 26, wobei als
Ausgangsprodukt Kupfer-Chlorophyllin 45 dienen sollte, da es sehr preiswert kommerziell verfügbar ist. Man verwendet es als Farbstoff für Nahrungs- und Genussmittel.
Gewöhnlich wird als Ausgangsprodukt für die Darstellung von Chlorin e6 Pheophorbid
benutzt, das wiederum aus Chlorophyll gewonnen wird, das im Cyanobakterium Spirulina- maxima erhalten ist [ ]39. Das Verfahren verläuft in mehreren Schritten. Die Synthese von Chlorin e6 aus Cu-Chlorophyllin würde die Herstellung erheblich vereinfachen. Um das
gewünschte Chlorin e6 zu erhalten, sollte nach Reinigung kommerziellen Cu-Chlorophyllins
aus dem Edukt 45 das Kupfer entfernt werden.
N N N N C H3 CH3 CH3 C H3 C H2 Cu CO2Na CO2Na CO2Na CH3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 C H3 C H2 CO2H CO2H CO2H CH3 45 26
Schema 11: Geplante Darstellung von Chlorine e6
Die HPLC-Analyse von kommerziell erhältlichem Kupfer-chlorophyllin zeigt einen hohen Anteil an Verunreinigungen, die durch Chromotographie entfernen werden. Die Reinheit des Cu-Chlorophyllin wurde mittels HPLC überprüft.
a)
Zeit [min] 15 10 5 0
b)
Zeit [min] 15 10 5 0
Abb.32: HPLC-Chromatograme von a) Chlorphylin 45 vor der Chromatographie, b) Cu-Chlorphylin nach der Chromatographie. Bedingungen: LiChrosorb 100 RP-18, Metahnol/aq. Tetrabutylammonium-dihydrogenphosphat Lösung 2,5 mmol/l pH 2,2; 1 ml/min.
Im nächsten Schritt sollte die Dekomplexierung erfolgen. In der Literatur ist beschrieben, dass der Kupferausbau aus Chlorinen mit Hilfe von Chlorwasserstoff in Dichlormethan [39] oder mit 1,2-Ethandithiol in Gegenwart von Trifluoressigsäure [ ]40 möglich sei, was aber im vorliegenden Fall nicht fehlschlug.
Für weitere Versuche zur Entfernung des Kupfers, wurde Cu-Chlorin e6 94 mit Diazomethan
zum entsprechenden Trimethylester umgesetzt und anschließend die 3-Vinylgruppe katalytisch hydriert. Der reduzierte Cu-Chlorin e6-trimethylester 96 wurde in
Trifluoressigsäure gelöst und anschließend 25 Minuten lang Schwefelwasserstoff-Gas eingeleitet [ ]41. Nach 24 Stunden Rühren unter einer Inertgasatmosphäre wurde ein kupferfreies Produkt erhalten, dessen Massenspektrum ein Dimer von 97 ist.
CO2H N N N N C H3 CH3 CH3 CH3 CH2 CO2H Cu CO2H C H3 N N N N C H3 CH3 CH3 CH3 CH2 Cu CO2CH3 CO2CH3 CO2CH3 C H3 N N N N C H3 CH3 CH3 CH3 CH3 Cu CO2CH3 CO2CH3 CO2CH3 C H3 NH N N HN C H3 CH3 CH3 CH3 CH3 CO2CH3 CO2CH3 CO2CH3 C H3 94 95 96 97 a b c 2
Schema 12: Versuche zur Darstellung von hydriertem Chlorin e6-trimethylester 97.
Bedingungen: a) CF3CO2H, konz. H2SO4, 1 h, CH2N2, 30 min; b) THF,
Pd(II)-acetat, H2O, Triethoxysilan, 15 min., RT; c) CF3CO2H, H2S (g), 24 h, RT.
Eine Strukturaufklärung des Dimers war aus Zeitgründen im Rahmen der Doktorarbeit nich mehr möglich.
