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Auswirkungen pathovaskuläre Prozesse wie Diabetes mellitus und arterieller Hypertonie auf die experimentelle Arteriogenese im Tiermodell der "Zucker Diabetic Fatty" (ZDF) Ratte

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Academic year: 2022

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und

dem Herzzentrum des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

Auswirkungen pathovaskulärer Prozesse wie Diabetes mellitus und arterieller Hypertonie auf die experimentelle Arteriogenese im Tiermodell der ,,Zucker Diabetic Fatty“

(ZDF) Ratte

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tiermedizinische Hochschule Hannover

Vorgelegt von Wibke Becker

aus Unna

Hannover 2005

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. B. Schröder Prof. Dr. T. Meinertz

1.Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder 2.Gutachter: Prof. Dr. H. J. Hedrich

Tag der mündlichen Prüfung: 07. Juni 2005

(3)

Für meine Eltern

(4)
(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 5

2.1 Diabetische Kardiopathie 5

2.1.1 Diabetische Makroangiopathie 5

2.1.2 Akuter Myokardinfarkt 8

2.1.3 Therapiemöglichkeiten arterieller Verschlusskrankheiten 9

2.2 Gefäßwachstum 9

2.2.1 Vaskulogenese 10

2.2.2 Angiogenese 10

2.2.3 Arteriogenese 12

2.3 Gefäßwachstumsstimulation 17

2.3.1 Fibroblasten Wachstumsfaktor 19

2.3.2 Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 19

2.3.3 Stickstoffmonoxid 21

2.3.4 Monocyte Chemoattractant Protein-1 22

2.4 Fragestellung 23

3 Material und Methoden 24

3.1 Tiermodell 24

3.2 Tiere und deren Haltungsbedingungen 29

3.3 Gruppenzusammensetzung 30

3.4 Untersuchungen 31

3.4.1 Körpermasse 31

3.4.2 Blutuntersuchungen 32

3.4.3 Blutdruckmessungen 33

3.4.4 Herzfrequenzmessungen 35

3.5 Behandlung der Tiere 35

3.5.1 Verwendete Substanzen 36

3.5.2 Füllung der osmotischen Minipumpen 36

3.6 Operation der Tiere 37

3.6.1 Narkose 37

(6)

3.6.2 Induktion der Arteriogenese 38

3.6.3 Implantation der MCP-1/ PBS-Pumpen 38

3.6.4 Implantation der BrdU-Minipumpen 38

3.6.5 Induktion der Hypertonie 39

3.7 Enduntersuchung nach siebentägiger Behandlung 40 3.7.1 Radiologische Darstellung der Kollateralarterien 40 3.7.2 Histologische Darstellung der Kollateralarterien 41

3.7.3 Immunhistologische Aufarbeitung 42

3.7.4 Messung der kollateralen Konduktanz 45

3.8 Statistik 48

4 Ergebnisse 49

4.1 Zell-Proliferation 49

4.1.1 Auswirkung des Diabetes mellitus (T2DM) 50

4.1.2 Auswirkung der arteriellen Hypertonie 52

4.1.3 Auswirkungen des Diabetes mellitus (T2DM)

und der arteriellen Hypertonie 53

4.1.4 Effekt der MCP-1 Behandlung im gesunden Tier 54 4.1.5 Effekt der MCP-1 Behandlung im diabetischen Tier (T2DM) 55 4.1.6 Effekt der MCP-1 Behandlung im hypertensiven Tier 56 4.1.7 Effekt der MCP-1 Behandlung im diabetischen (T2DM)

und hypertensiven Tier 57

4.2 Anzahl der sichtbaren Kollateralgefäße 57

4.2.1 Auswirkung des Diabetes mellitus (T2DM) 58

4.2.2 Effekt der MCP-1 Behandlung im gesunden Tier 59 4.2.3 Effekt der MCP-1 Behandlung im diabetischen Tier (T2DM) 61

4.3 Kollaterale Konduktanz 63

4.3.1 Auswirkung des Diabetes mellitus (T2DM) 63

4.3.2 Auswirkung der arteriellen Hypertonie 64

4.4 Makrophagenquantifizierung 65

4.4.1 Auswirkung des Diabetes mellitus (T2DM) 65

4.4.2 Auswirkung der arteriellen Hypertonie 67

(7)

4.4.3 Auswirkungen des Diabetes mellitus (T2DM)

und der arteriellen Hypertonie 68

4.4.4 Effekt der MCP-1 Behandlung im gesunden Tier (T2DM) 71 4.4.5 Effekt der MCP-1 Behandlung im diabetischen Tier (T2DM) 73 4.4.6 Effekt der MCP-1 Behandlung im hypertensiven Tier 74 4.4.7 Effekt der MCP-1 Behandlung im diabetischen (T2DM)

und hypertensiven Tier 74

5 Diskussion 75

5.1 Untersuchungen zur Anzahl der sichtbaren Kollateralarterien 76 5.2 Untersuchungen zur Anzahl der perivaskulären Makrophagen 77

5.3 Effekte der MCP-1 Behandlung 79

5.4 Untersuchungen zur kollateralen Konduktanz unter diabetischen

Bedingungen 81

5.5 Kollateralwachstum und begleitende Makrophagenakkumulation unter

hypertensiven Bedingungen 82

5.6 Schlussbetrachtung und Ausblicke 83

6 Zusammenfassung 85

7 Summary 87

8 Literaturverzeichnis 89

(8)

Abkürzungsverzeichnis

α alpha

Abb. Abbildung

ACE angiotensin converting enzyme AGE advanced glycation end product Aqua dest. destilliertes Wasser

β beta

BrdU bromodeoxyuridine bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

ca. circa

CCR2 Cys-chemokin-Rezeptor 2 CHF Congestive heart failure

cm Zentimeter

CSF colony stimulating factor CWS circumferential wall stress CCL2 Chemokin (C-C motif) ligand-2

CRDH Cohen Rosenthal Diabetic Hypertensive rat

CK Goto-Kakizaki Ratte

dl Deziliter

DNA Desoxyribonukleinsäure

Drt Diabetes Research and Training Center EPC endothelial progenitor cells

et al. ”et alii”

Fa. Firma

FGF fibroblast growth factor FSS fluid shear stress

g Gramm

Gmi Genetic Models Incorporated

h hour (Stunde)

HbA1c glykolisiertes Hämoglobin 1c HDL ,,high density lipoprotein“

Hg Quecksilber

HIF hypoxia inductable factor ICAM intercellular adhesion molecule IDDM Insulin dependent diabetes mellitus

IE Internationale Einheit

i.p. intraperitoneal

Jcr Dr. J. C. Russel

Kap. Kapitel

kDa kilo Dalton

kg Kilogramm

KHK koronare Herzerkrankung

l Liter

LDL ,,low density lipoprotein”

(9)

µ mikro

Mcc Dr. Sylvia A. Mc Cune

MCP-1 monocyte chemoattractant protein

min Minute

mind. mindestens

mg Milligramm

µg Mikrogramm

ml Milliliter

mm Millimeter

mmol Millimol

Mw Mittelwert

n Anzahl der in einem Versuch verwendeten Tiere N Veterinary Recources Branch, University of Alberta

NaCl Natriumchlorid

NO Stickstoffmonoxid (nitric oxide)

NIDDM Non insulin dependent diabetes mellitus

O2 Sauerstoff

OGTT oraler Glukosetoleranztest

p Irrtumswahrscheinlichkeit/Signifikanz

P Druck

PBS phosphate buffered saline

pH pondus hydrogenii

PTCA percutane transluminale Angioplastie

s Sekunde

s.c. subcutan

s.o. siehe oben

SD standard deviation (Standardabweichung) SHHF Spontaneously hypertensive heart failure rat TA Takeda Chemical Industries, Japan

Tab. Tabelle

TF tissue factor

TGF-β transforming growth factor β TNF tumor necrosis factor

T2DM Diabetes mellitus Typ 2

V Volumen

VCAM vascular adhesione molecule VEGF vascular endothelial growth factor

vs. versus

WDF Wistar diabetic fatty rat zdf rat zucker diabetic fatty rat

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1 Einleitung

Die normale physiologische Funktion der Organe und der Gewebe ist von einer adäquaten Blutversorgung abhängig. Stenosierende Prozesse der Magistralarterien, wie z.B. infolge der Arteriosklerose, können akut oder langfristig die Vitalität einzelner Organe und damit des gesamten Organismus gefährden.

Die gegenwärtigen therapeutischen Optionen von Herz- und Gefäßkrankheiten sehen überwiegend eine chirurgische Intervention an Magistralgefäßen als Methode der Wahl vor. Die Nachteile der gängigen revaskularisierenden Techniken und hohe Restenoseraten haben den Anlass zur Entwicklung von neuen Konzepten in der Therapie okkludierender Durchblutungsstörungen infolge der Atherosklerose gegeben.

Eine solche Alternative ist die Nutzung eines körpereigenen Mechanismus. Durch Weiterentwicklung präexistenter arteriolärer Anastomosen zu Kollateralarterien kann die Ischämie in einer betroffenen Region bis zu einem gewissen Grad kompensiert werden. Dieser Vorgang wird als Arteriogenese bezeichnet (ITO et al. 1997). Unter klinischen, wie auch experimentellen Bedingungen wurde nachgewiesen, dass Kollateralarterienwachstum potentiell in der Lage ist, die Blutversorgung nach arteriellen Verschlüssen im Herz-, Nieren- oder Gehirngefäßsystem, sowie nach peripheren Verschlüssen tatsächlich zu kompensieren (HANSEN 1989, HABIB et al. 1991, SASAYAMA u. FUJITA 1992, SCHAPER u. ITO 1996, ITO et al. 1997, ARRAS et al. 1998, FLEISCH et al. 1999).

Frühere Arbeiten zeigten eine Akkumulation von Makrophagen um das proliferierende Kollateralgefäß und eine Korrelation zwischen der Anzahl dieser perivaskulären Makrophagen mit der Gefäßwachstumsrate und der Blutflussrate (POLVERINI et al. 1977, ITO et al. 1997, ARRAS et al. 1998, HEIL et al. 2002). Die Herkunft der Makrophagen ist umstritten. Entweder reagieren im Blut zirkulierende Monozyten auf chemotaktische Stimuli und migrieren (SCHAPER u. ITO 1996) oder die Makrophagen entstehen lokal aus aktivierten Gewebszellen (KHMELEWSKI et al. 2004).

Die Arteriogenese wird vermutlich durch die veränderten Flussverhältnisse (,,shear stress“/,,fluid stress“) nach der Okklusion und die plötzlich auf das Gefäßendothel wirkenden veränderten Scherkräfte ausgelöst (SCHAPER u. ITO 1996). Das Kollateralgefäßwachstum lässt sich durch Zytokine beeinflussen. Einer der potentesten Stimulatoren der Arteriogenese ist das Protein MCP-1 (CCL2). MCP-1 wird vom Endothel produziert und wirkt aktivierend und anlockend auf Monozyten. Die Reaktion wird über den monocytären CCR2-Rezeptor vermittelt.

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Wie aus klinischen Studien und Experimenten bekannt ist, gehören Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Hypercholesterinämie und Dyslipoproteinämie zu den potentesten kardiovaskulären Risikofaktoren, die die Arterioskleroseentstehung forcieren. Dabei bestehen Hinweise, dass diese Risikofaktoren und die erhöhte Morbidität und Mortalität des Typ II Diabetikers Herz- und Gefäßkrankheiten zu entwickeln, mit einer verminderten Fähigkeit Kollateralarterien und somit vaskuläre Umgehungskreisläufe auszubilden, zusammenhängen (ABACI et al. 1999). Die Auswirkungen der arteriellen Hypertonie auf die funktionelle Arteriogenese sind bisher unbekannt. Frühere Versuche zeigten eine rarifizierte Kapillarisierung der Muskulatur im spontan hypertensiven Tiermodell. Diese Erkenntnisse wurden als eine verminderte Angiogenese in hypertensiven Tieren und Menschen interpretiert (SUNITA SRIVASTAVA 2003).

Als Erklärungsversuch wurde wiederholt eine Verminderung der Funktion und Anzahl von Makrophagen unter pathologischen Bedingungen vermutet. Eine Quantifizierung dieser Zellfraktion hat bisher nicht stattgefunden. Untersuchungen zur Wirkung des potentesten angiogenen Wachstumsfaktors VEGF auf diabetische Zellen hat eine gänzlich reduzierte Chemotaxis und Funktion der diabetischen Makrophagen bewiesen. Daher wurde auf einen Signaltransduktionsdefekt zwischen Zytokinrezeptor und dem Zytoskelett der diabetischen Zellen geschlossen. Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, dass eine Behandlung mit arteriogenen Wachstumsfaktoren im diabetischen Individuum keine nützlichen Auswirkungen auf die Kollateralzikulation erzielen könnte (WALTENBERGER et al. 2000, WALTENBERGER 2001).

Die grundlegenden molekularen Mechanismen der Endothelaktivierung und selektiven Makrophagenakkumulation sind bislang in Gesunden wie in diabetischen Zellen nahezu ungeklärt.

Aktuell beschäftigen sich Studien mit der Rolle von angiogenen und arteriogenen Wachstumsfaktoren vor allem im Zusammenhang mit diabetischen mikrovaskulären Erkrankungen.

Die Untersuchungsziele führten in zwei entgegengesetzte Richtungen (DUH u. AIELLO 1999). Der solitäre Einsatz von Wachstumfaktor-Antagonisten wird zur Behandlung microvaskulärer Komplikationen wie diabetischer Retinopathie und Glomerulopathie eingesetzt, während Wachstumsfaktor-Agonisten in der Therapie macrovaskulärer Erkrankungen wie koronaren und peripheren Verschlusskrankheiten von Nutzen sein könnten. Außerdem ist bekannt, dass viele der proangiogenen und arteriogenen Faktoren ebenfalls proarteriosklerotisch und prothrombotisch wirken. Folglich liegt es nahe, dass eine proarteriogene Behandlung arteriosklerotische Prozesse

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gerade stimulieren könnte und antiarteriosklerotische Maßnahmen die Arteriogenese wiederum abschwächen würden (SCHAPER u. SCHOLZ 2003).

Gerade diabetische Patienten (T2DM) sind prädisponiert für die Entwicklung einer Arterioskleropathie. Dieser Begriff verknüpft die komplizierten pathologischen Zusammenhänge des metabolischen Syndroms und der diabetischen Mikroangiopathie (HAYDEN u. TYAGI 2004).

Die bisherigen Erfolge in der Anwendung von Zytokinen als alternative Therapie in der Behandlung okkludierender Durchblutungsstörungen stimmten hoffnungsvoll. Jedoch lassen sich die in gesunden Organismen gewonnenen Erkenntnisse nicht ohne weiteres auf vorbelastete Risikogruppen übertragen. Im Falle des Diabetes mellitus Typ II steht die Arteriogeneseforschung vor einem paradoxen Problem und vielen offenen Fragen. In der aktuellen Arbeit sollten daher die Auswirkungen der pathovaskulären Risikofaktoren Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie auf die Arteriogenese aufgeschlüsselt werden. In einem speziellen Tiermodell bestand die Möglichkeit diese vergesellschafteten Risikofaktoren alleine und in Kombination zu betrachten. Außerdem interessierte die zelluläre Antwort der Makrophagen auf das arteriogene Protein MCP-1 unter diesen pathovaskulären Bedingungen.

Zu diesem Zweck werden Ratten mit dem für Menschen typischen Gefäßrisikoprofil (Diabetes mellitus Typ II, Adipositas, Hypercholesterinämie, Dyslipoproteinämie) untersucht und mit entsprechenden syngenen Kontrolltieren verglichen.

Ein renin abhängiger arterieller Bluthochdruck wurde durch das 2K1C Hypertensionsmodell nach Goldblatt chirurgisch induziert und das Kollateralwachstum operativ durch einen unilateralen Verschluss der Arteria femoralis ausgelöst. Die arteriogene Substanz MCP-1 (bzw. die Kontrollösung PBS) wurde über eine osmotische Minipumpe infundiert. Das Ausmaß des Kollateralarterienwachstums und seine Funktion sollten anschließend durch vier verschiedene Methoden beurteilt werden:

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1. Anfertigung von dreidimensionalen post mortem Angiographien und Auszählung der sichtbaren Kollateralarterien unter dem Stereomikroskop.

2. Bestimmung des proliferativen Index nach Infusion des Tymidinanalogons BrdU und Anfertigung von histologischen Präparaten.

3. Identifizierung und Quantifizierung der perivaskulären Makrophagen durch ED2- Antikörperfärbung im histologischen Präparat.

4. Bestimmung der kollateralen Konduktanz durch hämodynamische Messungen am anästhesierten Tier mittels Doppler-Flowprobe und arteriellen Kathetern bei maximaler Vasodilatation. Alle Untersuchungen erfolgten sieben Tage nach Femoralarterienokklusion.

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2 Literaturübersicht

2.1 Diabetische Kardiopathie

Der Diabetes mellitus gehört zu den weitverbreitetsten Stoffwechselerkrankungen in den westlichen Industrienationen. Die Prävalenz steigt weiter aufgrund einer stetig älter werdenden Bevölkerungsstruktur, die auch durch eine Zunahme von Adipositas und Immobilität charakterisiert ist. Dabei stellen die kardiovaskulären Erkrankungen im Hinblick auf die endotheliale Dysfunktion und Atheroskleroseenstehung die prognostisch wesentlichen Komplikationen des Diabetikers dar (FEENER u. KING 1997, HAFFNER 1998). Von kardiologischer Seite kann sich eine diabetische Kardiopathie auf unterschiedlichen funktionellen und strukturellen Ebenen des Herzens manifestieren. Dabei sind Störungen der Mikro- und Makrozirkulation (Angiopathie), der Ventrikelfunktion (Kardiomyopathie) und des intrakardialen Erregungsbildungs- und- leitungssystem (autonome Neuropathie) zu unterscheiden.

2.1.1 Diabetische Makro-Angiopathie

Die Morbidität und Mortalität diabetischer Patienten hängt maßgeblich von der Entwicklung okkludierender Prozesse ab, die zu einer Obstruktion der arteriellen Strombahn führen. Häufig sind arterielle Verschlußkrankheiten an den Herzkranzgefäßen (koronare Herzkrankheit) und an den Gliedmaßen (periphere arterielle Verschlußkrankheit). Die Entwicklung einer Arteriosklerose ist mit einem zwei-bis fünffach erhöhten Risiko für das Auftreten eines Myokardinfarktes verbunden.

Die diabetesbedingte koronare Herzerkrankung (KHK) erlangt eine zunehmende Bedeutung in der kardiologischen Praxis. Rund 33% der insulinpflichtigen Diabetiker versterben bereits im 4.-5.

Lebensjahrzehnt an den Folgen einer KHK. Insgesamt stellt die KHK mit 75% die Haupttodesursache aller Diabetiker dar (GRUNDY et al. 2002).

In zahlreichen epidemiologischen Studien wurde der Verlauf der diabetischen Herzerkrankung im Hinblick auf die klassischen Risikofaktoren wie Nikotinabusus, Hypertonie und Dyslipoproteinämie untersucht und der Zusammenhang mit zusätzlichen prädisponierenden Faktoren wie Übergewicht, physischer Inaktivität und Fehlernährung hergestellt. Insgesamt korreliert die Mortalität der kardiovaskulären Erkrankungen sehr eng mit der Anzahl der

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Risikofaktoren. Bei Diabetikern ist dieser Zusammenhang sehr viel stärker ausgeprägt als bei Nicht- Diabetikern.

Bei der Diabetes mellitus bedingten Arteriosklerose liegt bereits eine funktionelle Störung des Endothels vor. Diese endotheliale Dysfunktion gilt als initialer kausaler Faktor, der zur Entwicklung von arteriosklerotischen Läsionen beiträgt und durch den traditionelle vaskuläre Risikofaktoren wie arterielle Hypertonie, LDL-Cholesterinämie, Rauchen sowie eine Insulinresistenz intensiviert werden.

Die endotheliale Dysfunktion beruht auf einem Verlust der antithrombotischen und antiinflammatorischen Potenz sowie auf der mangelnden Reaktionsfähigkeit auf vasodilatatorische Stimuli (JANIAK et al. 2002). Einer der wichtigsten gefäßabhängigen Effekte von Insulin ist die Steigerung der endothelialen Stickstoffmomoxid-(NO) Produktion. Eine ungestörte NO-Produktion ist entscheidend für die Regulation der Gefäßdilatation und -konstriktion sowie der Inhibierung von Entzündungszelladhäsion, der Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen, der Thrombozytenadhäsion und der Aktivierung der intrinsischen Koagulationskaskade.

Bei der Insulinresistenz, wie auch bei den anderen vaskulären Risikofaktoren liegt eine reduzierte endotheliale NO-Bioverfügbarkeit vor (TSCHÖPE u. SCHULTHEISS 2003). Dabei kommt es aufgrund einer glukoseinduzierten posttranslationalen Modifikation der NO-Synthase zu einer verminderten NO-Bildung, andererseits auch zu einer beschleunigten NO-Inaktivierung. Letztere beruht auf einer gesteigerten Reaktion mit Sauerstoffradikalen. Bei dieser Reaktion entsteht als Produkt zelltoxisches Peroxynitrit. Damit kommt es zur Zunahme des oxidativen Stresses, was im Sinne eines Circulus vitiosus zu einer weiteren Schädigung der Endothelfunktion führt (DE VRIESE et al. 2000).

Lange bestehende hohe Glukosekonzentrationen führen zu einer Glykierung von Eiweißen, den sogenannten AGEs (Advanced glycation end products). Dabei werden zunächst in einem noch reversiblen Schritt Schiffsche Basen und dann Amadori-Produkte gebildet. Durch Aggregation dieser Amadori-Produkte kommte es zur Bildung von AGE. Diese können nach Stimulation spezifischer AGE-Rezeptoren (RAGE) die Bildung von Wachstumsfaktoren (IGF), d. h. Zytokinen wie MCP-1, Interleukin-6/1β, Tumornekrosefaktor α, Insulin-like growth Factor (IGF), Vascular Adhesion Molekule (VCAM) u.a. aktivieren, und führen zu einer vermehrten Freisetzung von Sauerstoffradikalen. Außerdem führt eine Glykierung von Proteinen zu einer Hemmung der physiologischen Prozesse und damit zu einem beschleunigten Funktionsverlust und

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Alterungsprozeß der Zellen, insbesondere betroffen sind Endothelzellen (MERAJI et al. 1987, TESFAMARIAM et al. 1990, WILLIAMSON et al. 1990).

Vom Fettgewebe werden ebenfalls die zuvor genannten Zytokine und Adhäsionsmoleküle freigesetzt. Diese verursachen oxidativen Streß und stimulieren endotheliale Wachstumsfaktoren, die wiederum eine Mediahypertrophie bedingen können. Erhöhte Plasminogenaktivatorinhibitor I- und Fibrinogenplasmaspiegel, sowie erhöhte thrombozytäre Glykoprotein-IIa/IIIb-Expression charakterisieren einen prothrombotischen Status, der sowohl die endotheliale Dysfunktion mitbedingt als auch durch die Freisetzung von Wachstumsfaktoren direkt atherogen wirkt.

Insgesamt erhöhen der intrazelluläre Redoxzustand des Diabetikers, oxidiertes LDL, nichtenzymatisch gebildete glykosidierte Endprodukte, zytokinbedingte Endzündungsreaktionen und das Vorliegen einer Koagulopathie den oxidativen Streß und tragen so zur verminderten Endothelfunktion bei. Im weiteren Verlauf begünstigen mechanische Scherkräfte, sowie die immunologisch, inflammatorisch und hämostaseologischen Dysregulationen eine Permeabilitätstörung des Endothels, so dass aktivierte immunkompetente Zellen (Monozyten/Makrophagen) in die Intima eindringen und die Bildung von atherosklerotischen Plaques initiieren können (ROESEN et al. 2001).

Arterielle Hypertonie

Die arterielle Hypertonie gehört zu den häufigsten Erkrankungen des Menschen und ist ein unabhängiger Risikofaktor für die Entstehung einer KHK, eines Apoplex und einer chronischen Herz- und Niereninsuffizienz. Die Prävalenz einer Hypertonie bei Diabetikern ist deutlich erhöht und hängt von zusätzlichen Faktoren ab, zu denen Übergewicht, Insulinresistenz und Hyperinsulinämie gehören (COOPER et al. 2001)

Ein Bluthochdruck wirkt sich in erster Linie auf diejenigen Organe aus, die ihn mittelbar erzeugen oder die ihm unmittelbar ausgesetzt sind. Somit sind das Herz und die großen Gefäße ganz besonders betroffen. Vasokonstriktoren wie Angiotensin II, Katecholamine und Endothelin beeinflussen die Gefäße und wirken auf die Muskelzellen der Gefäßwand als Wachstumsfaktoren.

Folglich hypertrophiert die Gefäßwand und kann das vasokonstriktorische Signal effektiver beantworten (TUTTLE et al. 2002). Dieser dauerhaften Druckerhöhung sind aber die kleineren peripheren Gefäße mit schwächerer Wandstruktur nicht gewachsen. Die glatten Muskelzellen sind in der Media üblicherweise spiralförmig angeordnet, so dass sie eine normale Druckbelastung in

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eine Zugbelastung überführen können. Wird dieser normale intravasale Druck überschritten, so werden die gegenläufigen Muskelzellspiralen gestreckt und die Gefäße länger, was sich makroskopisch in einer Schlängelung der Gefäße äußert. Daraus resultiert eine reine Druckbelastung auf die Gefäßwand, die von den Mediamyozyten aufgefangen werden muß. Es kommt zunächst zu einer hypertonen Arteriosklerose der mittelgroßen Gefäße, später auch zu einer Arteriolosklerose (TUTTLE et al. 2002).

Hypercholesterinämie und diabetische Dyslipoproteinämie

Bei Diabetikern liegen häufig zwei unterschiedliche Lipidstörungen vor. Erhöhte LDL- Cholesterinwerte und Dyslipidämie, die durch erniedrigte HDL-Spiegel und eine Hypertriglyceridämie charakterisiert wird, können die Atherogenese und eine Koronarplaqueinstabilität fördern. Der Blutfluß durch Kollateralgefäße ist unter pathologischen metabolischen Konditionen wie Diabetes mellitus und Hyperlipidämie wesentlich vermindert (JANIAK et al. 2002). Hypercholesterinämie bewirkt zusammen mit hohen MCP-1 Plasma- Spiegeln eine verstärkte Expression von ICAM-1 und VCAM-2 (NAMIKI et al. 2002) und wirkt initiierend auf arteriogene Endotheladhäsionen.

2.1.2 Akuter Myokardinfarkt

Der Myokardinfarkt ist Folge einer Myokardischämie, die durch Unterbrechung der Koronardurchblutung zur Ausbildung einer Gewebsnekrose führt. Ursache ist meist ein thrombotischer Koronararterienverschluß als Folge einer KHK.

Diabetiker machen etwa 30% aller Krankenhauspatienten mit einem akuten Herzinfarkt aus. Dabei ist für einen Diabetiker die Krankenhaus- und die Langzeitmortalität doppelt so hoch wie die von Nicht- Diabetikern (GRUNDY et al. 2002). Dies ist durch das Zusammentreffen mehrerer Umstände begründet. Zum einen nehmen Diabetiker Angina-pectoris-Beschwerden aufgrund der meist auch vorliegenden Neuropathie kaum war, zum anderen werden Begleitsymptome wie Dyspnoe, Übelkeit, Erbrechen und Schweißausbrüche als Blutzuckerfehleinstellung interpretiert.

Außerdem erhöht die sympathovagale Dysbalance des Diabetikers das arrhytmogene Risiko. Die Hyperkoagulabilität und eine reduzierte Fibrinolyse verstärken das Thromboserisiko am verletzten Endothel und am rupturierten Plaque. Somit bleibt das Reinfarktrisiko auch nach Thrombolysetherapie erhöht. Dazu kommt, dass die linksventrikuläre Funktion diabetischer

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2.1.3 Therapiemöglichkeiten arterieller Verschlusskrankheiten

Grundsätzlich unterscheidet sich die Therapie des Diabetikers mit einer akuten Verschlusskrankheit nicht von der des Nichtdiabetikers und besteht aus der schnellstmöglichen Wiederherstellung der myokardialen Perfusion. Dieses kann entweder medikamentös oder chirurgisch geschehen (Lysetherapie, Thrombozytenaggregationshemmung, PTCA/Stent, Bypassoperation).

Das Hauptaugenmerk liegt dabei in der Durchführung einer Akutintervention, wie der percutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA). Jedoch werden sechs bis zwölf Monate nach PTCA trotz Einführung von Stentimplantationen Restenoseraten von 40-60% und Gefäßverschlüssen beobachtet. Dabei hat sich thrombozytäre Hyperreaktivität als wichtigster Prädiktor für die Restenose erwiesen (TSCHOEPE et al. 1997). Das Neun-Jahresmortalitätsrisiko von Diabetikern nach PTCA liegt bei knapp 40%, bei Nichtdiabetikern bei 18% (STEIN et al. 1995, VAN BELLE et al. 1997).

Neben diesen chirurgischen Maßnahmen wird verstärkt an Nutzungsmöglichkeiten einer biologischen Revaskularisierung geforscht. Ein Ansatzpunkt für eine solche Therapiemöglichkeit wäre die Nutzung alternativer präexistenter Gefäßanastomosen (RENTROP et al. 1989, WALTENBERGER 2001). Tatsächlich führt die Kollateralentstehung zu einer Kompensation des Gefäßverschlusses in vielen Patienten (RENTROP et al. 1989). Meistens ist diese Kompensation jedoch unzureichend. Das Ziel wäre mittels der Anwendung von Zytokinen die therapeutische Arteriogenese während der Ischämie zu stimulieren und somit die reduzierte Sauerstoffversorgung ausreichend zu kompensieren.

2.2 Gefäßwachstum

Die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen und der Abtransport von Metaboliten sind essentiell für das Überleben und die Funktion sämtlicher Körperzellen. Aufgrund der Tatsache, dass Sauerstoff aus dem Blut ins Gewebe per Diffusion transportiert wird, haben fast alle Körperzellen (Ausnahme Knorpel) eine Distanz zum nächsten Blutgefäß von nur 100 bis 150 µm. Grundsätzlich werden drei Arten des Gefäßwachstums unterschieden.

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2.2.1 Vaskulogenese

Die früheste embryonale Bildung von Blutgefäßen aus sich differenzierenden endothelialen Vorläuferzelle (Angioblasten) wird als Vaskulogenese bezeichnet. Pränatal führt die Vaskulogenese zur Formation der Blutgefäße während der Embryogenese. Dabei differenzieren sich mesenchymale Zellen zunächst zu Hämangioblasten. Diese hochinvasiven Angioblasten migrieren in verschiedene Teile des Embryos, aggregieren und bilden den vaskulären Primärplexus. Während eines Umbauprozesses differenzieren sich die inneren Zellen dieses Plexus zu hämatopoetischen Vorläuferzellen und die äußeren zu primitiven Endothelzellen. Aus diesen gehen die ersten primitiven Blutgefäße hervor und bilden ein komplexes Netzwerk aus miteinander kommunizierenden Blutgefäßen (CARMELIET 2000).

Auch im Knochenmark des Erwachsenen befinden sich endotheliale Progenitorzellen, die sich unter ischämischen Bedingungen zu Endothelzellen differenzieren (ASAHARA u. ISNER 2002, MURAYAMA u. ASAHARA 2002). Diabetische EPCs zeigen unter kulturellen Bedingungen eine drastisch geminderte Proliferationsrate und verminderte Bindungsfähigkeit an aktivierte Endothelzellen (TEPPER et al. 2002).

2.2.2 Angiogenese

Die Angiogenese ist die am besten beschriebene Form des Gefäßwachstums (AUGUSTIN 2003).

Der Begriff Angiogenese beschreibt das Wachstum bereits existierender Kapillaren zu einem neuen Gefäßnetzwerk. Dabei wird zwischen sprossender und nichtsprossender Angiogenese unterschieden. Sprossende Angiogenese bezeichnet den Prozeß der Gefäßbildung aus vorhandenen Gefäßen, bei der Endothelzellen ihre umgebende Basalmembran abbauen, in das umgebende Gewebe invadieren, auf den angiogenen Reiz gerichtet migrieren und proliferieren und nachfolgend selbst wieder neue kapilläre Schleifen und anastomisierende Netzwerke bilden, in denen arteriovenös gerichteter Blutfluß einsetzt. Nichtsprossende Angiogenese (Intussizeption) bezeichnet demgegenüber den Prozeß der Längsspaltung eines Gefäßes, der ebenfalls zur Bildung sehr komplexer Gefäßnetzwerke führen kann. Dabei werden Gefäße nur auf Kapillarniveau, also mit einem Durchmesser von fünf bis acht Mikrometern gebildet (DVORAK et al. 1999). Allen neu entstandenen Kapillarschläuchen ist gemeinsam, dass sie keine glatten Muskelzellen in der Gefäßwand aufweisen. Aus diesem Grund sind die ausgesprossten Kapillaren auch vermehrt

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rupturgefährdet. Die Gefäßnetze können aber ausreifen, indem Wandzellen (Perizyten und glatte Muskelzellen) rekrutiert werden, um die Gefäße zu stabilisieren.

Ischämie und die damit verbundene Hypoxie sind die Hauptstimulantien der Angiogenese (CARMELIET 2000, HELISCH u. SCHAPER 2000). Der Abfall des lokalen Sauerstoffpartialdruckes stimuliert die Zellen in der betroffenen Region zur Synthese von Transkriptionsfaktoren, wie dem hypoxia inductible factor (HIF), der die Zellen wiederum zur vermehrten Synthese von endothelialen Überlebens- und Wachstumsfaktoren anregt (WANG u.

SEMENZA 1993). Der Sauerstoffmangel führt zur lokalen Gewebezerstörung und damit zur Anlockung von inflammatorischen Entzündungszellen, wie z. B. Mononzyten und Makrophagen (SCHAPER u. SCHOLZ 2003).

Durch Angiogenese kann jedoch keine ausreichende Kompensation der Minderdurchblutung nach Stenose bzw. Okklusion einer Magistralarterie erreicht werden. Um funktionell eine Arterie zu ersetzen, würde es einer sehr viel höheren Anzahl an Kapillaren bedürfen. Außerdem ist der Gefäßwiderstand in den zuführenden Arterien viel niedriger als im nachfolgenden Kapillarbett und würde in einem Maße ansteigen, dass die Pumpleistung des Herzens übersteigt (SCHAPER u.

SCHOLZ 2003). Durch eine therapeutische Stimulation der Angiogenese kann eine Erhöhung des Blutflusses um den Faktor 1,5 bis 1,7 erreicht werden, was jedoch nicht ausreicht um eine arterielle Stenose/Okklusion zu kompensieren. Außerdem findet Kapillarwachstum nur in ischämischen Regionen statt, in unter Umständen großer Distanz zum arteriellen Verschluß. Am Ort des Verschlusses bildet sich wiederum eine Kollateralzirkulation ohne Ischämie und Kapillarsprossung (ITO et al. 1997, SCHOLZ et al. 2002). Nach Verschluß der Femoralarterie wird die Blut- und Sauerstoffversorgung der distalen Gliedmaße erheblich eingeschränkt. Die Kollateralarterien befinden sich dennoch in der normoxischen Oberschenkelmuskelatur (SCHOLZ et al. 2002).

Sprossende Kapillaren sind außerdem nicht in der Lage glatte Muskelzellen zu rekrutieren, ohne diese ist aber die Bildung neuer Arterien unmöglich.

Unterschieden wird zum einen die physiologische Angiogenese, die z.B. bei der Wundheilung, der Perfusion und Reoxidierung der Wundränder dient, und zum anderen die pathologische Angiogenese, welche einen destruktiven Charakter besitzt und bei Erkrankungen wie der diabetischen Mikroangiopathie, Malignomen und anderen Tumoren zur Gewebskapillarisierung und Gewebs-, bzw. Plaqueinstabilität führt (CARMELIET 2003).

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Angiogene Faktoren spielen eine Schlüsselrolle in der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Komplikationen. Hyperglykämie, Zytokine, AGEs, oxidativer Stress und Ischämie führen zu einer verstärkten Wachstumsfaktorexpression. Als Konsequenz bildet sich eine pathologische Neovaskularisation und erhöhte Zellpermabilität. Diese Vorgänge führen zur Erblindung im Falle der diabetischen Retinopathie und sind maßgebend an der diabetischen Nephro- und Neuropathie beteiligt. Andererseits kann Kapillarwachstum während makrovaskulärer Komplikationen zur Bildung von kapillären Umgehungskreisläufen beitragen. Es erscheint paradox, dass im Gegensatz zur diabetischen Retinopathie die Angiogenese im diabetischen Patienten vermindert sein soll (DUH u. AIELLO 1999, ALESSANDRI et al. 2004). Die Rarifizierung der muskulären Kapillaren und Arteriolen in hypertensiven Tieren und Menschen wird ebenfalls als Ausdruck einer verminderten Angiogenese interpretiert (SUNITA SRIVASTAVA 2003).

2.2.3 Arteriogenese

Der menschliche Organismus ist in der Lage, bei Gefäßverschlüssen oder –stenosen eigene Umgehungskreisläufe zu bilden, die sogenannten Kollateralkreisläufe. Dieser Prozeß ist mit ,,physiologischen Bypässen“ vergleichbar.

Bereits vorhandene Kollateralen, meist Arteriolen-Arteriolen-Anostomosen mit einem Durchmesser von dreißig bis fünfzig Mikrometern (SCHOLZ et al. 2000), können sich zu großen Kollateralgefäßen entwickeln, die funktionell kleinen Arterien entsprechen. Die Arteriolen erweitern sich auf das 25-fache ihres ursprünglichen Durchmessers (CAI et al. 2001) durch Vermehrung ihrer glatten Muskelzellschichten und somit Neubildung der Tunica intima (SCHAPER u. ITO 1996). Dieser Vorgang wird Arteriogenese genannt. Große Kollateralgefäße sind potentiell in der Lage, arterielle Stenosen und Verschlüsse zu kompensieren. Der Begriff der Arteriogenese ist deutlich von dem der Angiogenese abzugrenzen. Er wurde von Schaper und Ito et al eingeführt, um thematische Verwechselungen zu vermeiden (ITO et al. 1997).

Die Auswirkungen des Diabetes mellitus gelten als stärkste Inhibitoren des Kollateralarterienwachstums (WALTENBERGER 2001).

Hypothetischer Mechanismus

Eine progressive Stenose oder ein akuter Verschluß führen zu einem Druckabfall in den poststenotischen Gefäßen. Wenn prä- und poststenotische Regionen über präexistierende Arteriolen

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verbunden sind, entwickeln sich drastische Veränderungen in den Flussverhältnissen innerhalb der Kollateralgefäße und der peripheren Umgebung. Die Schubspannung wird stark erhöht und damit auch die auf das Endothel wirkenden Scherkräfte (,,FSS“, fluid shear stress; ,,CWS“ circumferential wall stress). CWS ist direkt proportional zum intravasalen Blutdruck und indirekt proportional zur peripheren Gewebsdichte. Die in der Media vorhandenen umgebendenden glatten Muskelzellen variieren in ihrer Größe abhängig vom Blutdruck. Der FSS verhält sich proportional zur Blutflussgeschwindigkeit und hängt vom Gefäßradius ab. Die Endothelzellen wandeln diesen mechanischen Einfluss in ein biochemisches Signal um und reagieren ihrerseits mit einer gesteigerten Stoffwechselaktivität. Dabei kommt es zu einer erhöhten Synthese von vasoaktiven Substanzen wie NO, Prostacyclinen, Metalloproteinasen und Wachstumsfaktoren (FGF, TGF-β), sowie Veränderungen der Form und Enzymkinetik der Zellen (KHAN u. SHEETZ 1997). Der genaue Mechanismus, wie die mechanische Deformationen der Zellmembran zum Zellkern transferiert und in die Proteinbiosynthese umgesetzt werden, verbleibt bisher weitgehend ungeklärt.

Man geht davon aus, dass diese Prozesse die Arteriogenese initiieren (GLAGOV et al. 1988, SCHAPER u. ITO 1996, UNTHANK et al. 1996, FATH et al. 1998, CARMELIET 2000, VAN ROYEN et al. 2001, LEHOUX et al. 2002, RESNICK et al. 2003).

Die Schubspannung ist, wie bereits erwähnt, abhängig von der Flußgeschwindigkeit und umgekehrt proportional zur vierten Potenz des Gefäßradius. Weiterhin hängt die Schubspannung von der Blutviskosität ab. Letztendlich lässt sich folgende Formel aufstellen:

FSS= v/ r4 x Viskosität x Re

R stellt dabei die sogenannte ,,Reynolds“-Zahl dar, die wiederrum von der Art des Flusses und vom Vorhandensein von Turbulenzen abhängt. Übertragen auf die Parameter Blutdruck, Gefäßradius und Blutfluß steigt mit Zunahme des Arterienlumens der Blutfluß; sinkt die Schubspannung erfolgt eine Abnahme der Arteriogenese. Erhöhung des Blutflusses bedeutet mehr Schubspannung und eine vermehrte Initiation der Arteriogenese, bzw. je größer der Gefäßdurchmesser und je geringer der Widerstand, umso höher ist der Blutfluß (BUSCHMANN et al. 2003).

Das Kollateralgefäßwachstum besteht aus zwei Phasen. Diese sind aber nur bedingt voneinander abgrenzbar und verlaufen zeitlich parallel. Der Prozeß der Arteriogenese beginnt in der ersten Woche nach Okklusion mit einer schnellen proliferativen Phase mit überwiegend expansiven Wachstum. Histologisch überwiegen inflammatorische Entzündungszellen. Es folgt eine

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langsamere zweite Phase mit longitudinalem Wachstum. Das Kollateralgefäß nimmt eine typische korkenzieherartige Form im mittleren Segment an (HERZOG et al. 2002). Die spiralige Gefäßform bremst die Blutflussgeschwindigkeit und führt zu einem Energieverlust der auf das Endothel wirkenden Scherkräfte. Vermutlich stellt diese Gewundenheit einen limitierenden Faktor der Arteriogenese dar (SCHAPER u. SCHOLZ 2003).

Proliferation

Der mechanische Einfluß, inform von Shear Stress muß von den Endothelzellen der Arterien in ein biochemisches Signal umgewandelt werden. Chronisch erhöhter Shear Stress aktiviert und öffnet Chlorid-Kanäle in der endothelialen Zellmembran und führt zu einer Volumenzunahme und Anschwellung der Zellen (NILIUS et al. 1996). Die Zell-zu-Zell-Verbindungen in der Arteriolengefäßwand dilatieren, werden überstreckt und sogar beschädigt. Plasmaproteine und Erythrozyten treten durch die geschädigten Gefäßwände in die extrazelluläre Matrix ein. Dieses lockt Entzündungszellen wie vor allem Monozyten an (ARRAS et al. 1998). Die Endothelzellen werden durch die erhöhte Schubspannung aktiviert und zur Proliferation angeregt. Unter diesen Bedingungen vollenden sie ihren Zellteilungszyklus innerhalb von 22 Stunden (SCHAPER u. ITO 1996).

Es wird davon ausgegangen, dass das aktivierte Endothel wie ein Anziehungspunkt (chemoattractant) auf im Blut zirkulierende Monozyten wirkt. Das Anlocken von Monozyten wird über bestimmte, vom aktivierten Endothel gebildete Zytokine vermittelt (ARRAS et al. 1998, HELISCH u. WARE 2000, HOEFER et al. 2004). Hierzu zählen vor allem das MCP-1 (monocyte chemoattractant protein), VEGF-A, bFGF, der TGF-β (transforming growth factor-β), und der GM- CSF (granulozyte-macrophage-colony stimulating factor).

Die Rolle der Makrophagen im Arteriogeneseprozeß wurde erstmals an Kollateralarterien im Hundemodell erforscht (SCHAPER u. PASYK 1976). Die aktivierten Makrophagen synthetisieren ebenfalls forciert Wachstumsfaktoren und Zytokine, wie MCP-1, fibroblast growth factor (FGF), in geringeren Umfang tumor necrosis factor α (TNF α) und -β (TNF β), Interleukin-8 und Adhäsionsmoleküle, wie ICAM-1 (intercellular adhesione molecule)/Mac-1 und VCAM-1 (vascular adhesion molekule), an die der ICAM-1 (intercellular adhesione molecule)/Mac-1 Rezeptor 1 binden kann (HOEFER et al. 2004), sowie zahlreiche weitere Faktoren, die keine Bedeutung für die Arteriogenese haben. Die Bedeutung der perivaskulären Makrophagen belegen Versuche, in denen

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intravenöse Infusion von anti-ICAM-1 Antikörpern die Monozyten-Akkumulation an wachsenden Arteriolen verhindert oder nach medikamentöser Zerstörung aller Monozyten/Makrophagen eine Infusion von VEGF und PLGF völlig wirkungslos bleibt (PIPP et al. 2003). Die Herkunft der Makrophagen ist umstritten. Bisher wurde angenommen, dass im Blut zirkulierende Monozyten auf chemotaktische Stimuli reagieren und um das proliferierende Kollateralgefäß akkumulieren (SCHAPER u. ITO 1996). Aktuelle Arbeiten zeigen jedoch, dass Makrophagen aus lokalen aktivierten Gewebszellen entstehen und proliferieren (Khemelevski u. Ito et al. 2004).

Die Fähigkeit zur Ausbildung einer Kollateralzirkulation scheint beim Diabetes mellitus Patienten beeinträchtigt zu sein (ABACI et al. 1999). Ebensowenig reagieren diabetische Monozyten auf eine VEGF-A-induzierte Stimulation. Vermutlich besteht ein Signaltransduktionsdefekt zwischen dem VEGFR-1/Flt-1 Rezeptor und dem Zytoskelett der Zelle. Diese Ergebnisse gelten als Erklärung und prognostische Relevanz für eine erhöhte Morbidität und Mortalität diabetischer Patienten, Herz- und Gefäßkrankheiten zu entwickeln (WALTENBERGER 2001). Hypertonie bewirkt eine verminderte Kollateralarterienfunktion im mesenterialen Darmischämiemodell. Spontan hypertensive Ratten zeigen eine Lumenverringerung der Kollateralarterien im histologischen Schnitt und einen gleichzeitigen Anstieg von mesenterialen Endothelzellen (TUTTLE et al. 2002).

Neointima

Glatte Muskelzellen migrieren in die Intima, nachdem sie die Lamina elastica interna passiert haben. In der Intima beginnt ihre Proliferation. Sie sind im Wesentlichen an der Bildung der Neointima beteiligt. Dabei ordnen sich die migrierten glatten Muskelzellen in einer longitudinalen und einer helikalen Richtung an. Es handelt sich dabei zumeist um kaum differenziete Zellen, die wenig von ihrer eigentlichen Struktur besitzen, z.B. verfügen sie kaum über kontraktile Filamente.

Ihre Funktion liegt in der Synthese von Substanzen für eine neue extrazelluläre Matrix, z.B.

Kollagen und Elastin und letztendlich die neue Lamina elastica interna (SCHAPER u. ITO 1996, UNTHANK et al. 1996)

Remodeling von Arteriolen in Kollateralarterien

Der ersten inflammatorischen Phase der Arteriogenese schließt sich ein langsamerer Festigungsprozeß der Arterien an, der beinahe bis zum Erreichen der endgültgen Wandstruktur und des Durchmessers führt: das Remodeling.

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Der Begriff Remodeling (vaskulärer Umbauprozeß) ist definiert als jeglicher andauernder Änderungsprozeß in Aufbau und Zusammensetzung des adulten Blutgefäßnetzwerks. Dadurch werden Anpassungs- und Reparaturvorgänge möglich. Andererseits trägt fehlgeleiteter Gefäßumbau zur pathologischen Entwicklung von Atherosklerose und anderen Gefäßverschlußkrankheiten sowie restenosierenden Prozessen bei (GALIS u. KHATRI 2002). Mit einer Steigerung des ursprünglichen Durchmessers um den Faktor 25 und einer Zunahme der Gewebsmasse um den Faktor 50 ist die Arteriogenese das beeindruckenste Beispiel für Remodeling (SCHAPER u. ITO 1996).

Glatte Muskelzellen synthetisieren eine neue Lamina elastica interna (Neointima). Die Proliferation von glatten Muskelzellen und Endothel alleine kann aber kein Gefäßwachstum erreichen.

Vergrößerte Arteriolen und Arteriolen im Umbau benötigen Platz. Dieser kann durch Weichen des umgebenden Gewebes zur Verfügung gestellt werden. Daher findet parallel ein kontrollierter Abbau des älteren, kleineren Gefäßes statt, was von einem Abbau der umgebenden extrazellulären Matrix begleitet wird.

Ein Remodeling-Prozeß findet also nur dort statt, wo die das Gefäß umgebende Grundsubstanz aus Kollagen und Elastin durch Proteasen (sogenannte Matrix-Metalloproteasen, z.B.MMP-1, MMP-9) aufgelöst wird (GALIS u. KHATRI 2002). Die glatten Muskelzellen erlangen somit Freiraum, um in die Intima zu gelangen und dort apoptotische Muskelzellen der alten Intima zu ersetzten.

Proliferierende Intimazellen entwickeln eine höhere mitotische Aktivität als die in der Media verbliebenen glatten Muskelzellen und büßen ihre kontraktilen Elemente zugunsten des proteinsyntheseaktiven endoplasmatischen Retikulums und freien Ribosomen ein (SCHOLZ et al.

2000, SCHOLZ et al. 2002).

Hypoxie ist im Gegensatz zur Angiogenese kein Stimulator, da Kollateralgefäße in normooxämischen Geweben entstehen (ITO et al. 1997, EPSTEIN et al. 2001, SCHAPER u.

SCHOLZ 2003). Kollateralwachstum ist zudem von Entzündungszellen (v.a. Makrophagen) abhängig. Angiogenese dagegen kann von Entzündungszellen induziert werden, aber auch in entzündungsfreier Umgebung stattfinden.

Mittlerweile ist generell akzeptiert, dass durch rekrutierte präexistierende Kollateralgefäße einer Gewebeischämie vorgebeugt werden kann und somit Infarkten sowie schädlichen Effekten nach atherosklerotischen Verschlüsse und anderen Gefäßstenosen protektiv vorgebeugt wird (WERNER

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et al. 2001). Für die Koronarzirkulation im Einzelnen konnte gezeigt werden, dass sie den Schweregrad des beschädigten Herzmuskels im Falle eines Infarktes verkleinert und damit letztendlich auch die Mortalität senkt (KLEPZIG et al. 1991). Arteriogenese ist höchstwahrscheinlich die einzige Art des Gefäßwachstums, welche potentiell in der Lage wäre, arterielle Gefäße zu ersetzen (SCHAPER u. SCHOLZ 2003). Die biologische Wichtigkeit von Kollateralgefäßen wurde jedoch in den letzten Jahrzehnten zunehmend kontrovers diskutiert.

Im Vergleich zwischen den Vorgängen der Arteriogenese und Arteriosklerose wird der Remodelingsprozeß als ein positiver und ein negativen Wachstumsvorgang betrachtet (SCHAPER u. SCHOLZ 2003). Der entscheidene Unterschied besteht in der Größenzunahme der Kollateralarterien und Abnahme des Gefäßdurchmessers bei der Arteriosklerose. Die inflammatorischen Abläufe, wie Makrophagen-Akkumulation, Hochregulierung von MCP-1, Adhäsionsmolekülen, Metalloproteinasen, Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen, sowie Formation einer Neointima sind weitgehend identisch und im atherosklerotischen Mausmodell nachgewiesen.

Der diabetische Patient ist prädisponiert für die Ausbildung von vaskulären Erkrankungen, die jüngst als Arterioskleropathie bezeichnet wurden. Dieser Begriff verknüpft die pathologischen Zusammenhänge des metabolischen Syndroms und der diabetischen Mikroangiopathie. Das metabolische Syndrom charakterisiert ein Quartett aus Adipositas, Bluthochdruck, Dyslipoproteinämie (relativ erhöhte Bluttriglyceridwerte und erniedrigte high density lipoproteins;

HLDs) und Glukoseintoleranz. Arterioscleropathie ist die Folge der metabolischen Endothelschädigung bei paradoxer diabetischer Vaskularisation, wobei die Angiogenese im atherosklerotischen Plaque induziert und die Kollateralarterienentwicklung gehemmt wird (HAYDEN u. TYAGI 2004).

2.3 Gefäßwachstumsstimulation

So unterschiedlich die Arten des Gefäßwachstums, so unterschiedlich sind auch die Arten der Stimulation und Inhibition. Grundsätzlich kann das Gefäßwachstum über zahlreiche sogenannte Wachstumsfaktoren oder über verschiedene Chemokine stimuliert werden. Die Forschung auf dem Gebiet des Gefäßwachstums entwickelte sich vor allem in den achtziger Jahren, als die ersten

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genetisch hergestellten Wachstumsfaktoren kommerziell erhältlich waren (BUSCHMANN et al.

2003).

Diese Substanzen werden eingeteilt nach ihrer positiven Wirkung auf die Angiogenese, die Arteriogenese oder nach der stimulierenden Wirkung auf beide Prozesse. Grundsätzlich gilt:

Angiogene Faktoren induzieren eher die Proliferation von Endothelzellen, arteriogene Faktoren eher die Proliferation von glatten Muskelzellen. Für verschiedene Wachstumsfaktoren konnte der signifikante Anstieg des kollateralen Blutflusses im Tiermodell gezeigt werden. Folglich kann Kollateralwachstum therapeutisch stimuliert werden.

Das große Potential der Gentherapie ist auch für die kardiovaskulären Erkrankungen entdeckt worden. Im Jahr 1994 wurden die ersten klinischen Studien am Menschen durchgeführt. Zunächst konzentrierte man sich auf die Behandlung peripherer arterieller Verschlusskrankheiten (pAVK) mit dem Wachstumsfaktor VEGF. Seitdem sind viele weitere angiogene Wachstumsfaktoren in klinischen Studien zur Behandlung der pAVK getestet worden. Seit 1997 macht man sich das VEGF-Gen auch in der Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen zunutze. Hierdurch konnte eine Besserung der klinischen Symptome erreicht werden (RIVARD et al. 1998).

Inzwischen beschäftigen sich aktuelle Studien mit der Rolle von angiogenen und arteriogenen Wachstumsfaktoren im Zusammenhang mit diabetischen mikro- und makrovaskulären Erkrankungen. Dabei führen die Untersuchungsziele in zwei entgegengesetzte Richtungen (DUH u.

AIELLO 1999). Der Einsatz von Wachstumfaktor-Antagonisten wird zur Behandlung mikrovaskulärer Komplikationen aufgrund pathologischer Gefäßsprossung und endothelialer Dysfunktion eingesetzt, wohingegen sich Wachstumsfaktor-Agonisten in der Therapie makrovaskulärer Erkrankungen wie koronaren und peripheren Verschlusskrankheiten bewährt haben. Theoretisch schließt sich die zeitgleiche Anwendung der Zytokintherapie, aufgrund der Gefahr bisher nicht erkannte Komplikation als Nebenwirkung zu forcieren, aus.

Außerdem ist bekannt, dass viele der proangiogenen und arteriogenen Faktoren ebenfalls proarteriosklerotisch und -thrombotisch wirken. Folglich liegt es nahe, dass eine proarteriogene Behandlung arteriosklerotische Prozesse gerade stimulieren könnte und antiarteriosklerotische Maßnahmen die Arteriogenese wiederum abschwächen (SCHAPER u. SCHOLZ 2003).

Es wurden bis heute mehr als zwanzig Stimulatoren und zwanzig Inhibitoren der Angiogenese und Arteriogenese identifiziert. Die wichtigsten werden im Folgenden beschrieben.

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2.3.1 Fibroblasten Wachstumsfaktor

Die 1982 entdeckten Fibroblasten Wachstumsfaktoren sind Polypeptide und gehören in die unübersichtliche Klasse der Zytokine. ABRAHAMS et al. (1986) konnten FGF isolieren, reinigen, klonieren und sequenzieren. In provozierten Ischämie-Tiermodellen sind zahlreiche angiogen und arteriogen wirkende Moleküle identifiziert worden. Die meisten haben die Stimulierung von Endothelzellen und/oder glatten Muskelzellen zum Ziel wie die Familien des fibroblast growth factors (FGF) und des vascular endothelial growth factors (VEGF). Beide Faktoren verursachen eine NO-vermittelte Vasodilatation. Der saure Fibroblasten Wachstumsfaktor (acidic FGF, aFGF, FGF-1) und der basische Fibroblasten Wachstumsfaktor ( basic FGF, bFGF, FGF-2) sind die am besten charakterisierten Mitglieder (HELISCH u. SCHAPER 2000). In früheren Studien konnte sowohl am Rattenhinterlauf als auch am Hundeherzen gezeigt werden, dass eine interarterielle Infusion von bFGF signifikant den Kollateralfluß nach arterieller Okklusion steigert (YANAGISAWA-MIWA et al. 1992, YANG et al. 1996). Diese Wirkung des angiogenen Wachstumsfaktors ließ sich in spontan hypertensiven Ratten reproduzieren (SUNITA SRIVASTAVA 2003).

2.3.2 Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor

Die am besten charakterisierte Familie angiogener Wachstumsfaktoren umfasst die Gruppe der VEGFs (Vascular endothelial growth factors). Die kritische Bedeutung der Moleküle dieser Familie für die Prozesse der endothelialen Differenzierung und Angiogenese wurden eindeutig durch die Charakterisierung deletionsmutanter Mäuse nachgewiesen: Der Verlust nur eines VEGF-Allels ist nicht mit dem Leben vereinbar und führt zur frühembryonalen Letalität (CARMELIET et al. 1996).

Die Wachstumsfaktorfamilie umfasst die Moleküle VEGF-A, B, C und D. Die weitgehend vaskulär-selektive Funktion dieser Moleküle ist durch die begrenzte Expression der VEGF- Rezeptoren auf Gefäßwandzellen (Endothelwandzellen auf Blut-und Lymphgefäßen) begründet (VEGFR-1, VGFR-2, VGFR-3). VEGF-A ist einer der potentesten Stimulatoren der Angiogenese und vermittelt seine Wirkung primär über VEGFR-2, d. h. die Aktivierung von VEGFR-2 steuert das Wachstum von Blutgefäßen. Im Gegensatz dazu reguliert die Aktivierung von VEGFR-3 das Wachstum von Lymphgefäßen reguliert (FERRARA 1999).

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Nach Femoralarterienokklusion und siebentägiger kontinuierlicher Infusion von VEGF-A wurde eine Zunahme des Blutflusses festgestellt, welche ca. einer sechzigprozentigen Zunahme nach MCP-1 Infusion darstellt. Dieser Effekt ist auf die Monozyten anlockende Wirkung des VEGF-A zurückzuführen (PIPP et al. 2003).

Trotz seiner zentralen Bedeutung für die Prozesse der Angiogenese muß VEGF in Kooperation mit anderen Faktoren wirken, um ein funktionsfähiges und ausgereiftes Gefäßbett heranwachsen zu lassen. Erwähnenswert sind die Angiopoietine (Ang-1, Ang-2, Ang-3, Ang-4). Diese wurden als Liganden der endothelialen Rezeptortyrosinkinase Tie-2 identifiziert. Knockout-Versuche in Mäusen wiesen darauf hin, dass die Angiopoitine eine kritische Rolle für die Remodellierung und Ausreifung wachsender Gefäßnetze haben. Ang-1 aktiviert Tie-2 und wirkt damit als Überlebensfaktor für Endothelzellen. Außerdem vermittelt es die Gefäßausreifung, indem es die Rekrutierung von Wandzellen (Perizyten und glatten Muskelzellen) steuert. Der Kontakt mit Wandzellen ist ein entscheidender Schritt der Gefäßausreifung, der dazu beiträgt, dass Endothelzellen ausdifferenzieren und von der Aktivität von Überlebensfaktoren unabhängig werden (KUWANO et al. 2001). Ang-2 funktioniert als funktioneller Antagonist von Ang-1, indem es Tie-2 bindet, ohne den Rezeptor zu aktivieren. Tatsächlich wird Ang-2 fast ausschließlich von Endothelzellen selbst gebildet. Ang-2 ermöglicht auf diese Weise die Responsivität des Gefäßbettes gegenüber angiogenen Wachstumsfaktoren und möglicherweise auch anderen gefäßreaktiven Zytokinen, indem es die Endothelzellen für die Aktivierung durch Wachstumsfaktoren wie VEGF empfänglich macht (SCOTT et al. 2002).

Plazentärer Wachstumsfaktor

Die PLGFs (Placenta Growth Factor) sind VEGFs-verwandte Moleküle (PLGF-1 und PLGF-2), die ausschließlich an VEGFR-1 binden. PLGF ist nicht erforderlich für die embryonale Angiogenese, sowie für die physiologische Angiogenese in den weiblichen Reproduktionsorganen. Es scheint aber einer große Bedeutung bei pathologischer Angiogenese, wie der Tumorangiogenese und der Regeneration nach Gewebsischämie zu haben (AUTIERO et al. 2003, PIPP et al. 2003).

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2.2.3 Stickstoffmonoxid

NO ist ein endothelialer Überlebensfaktor, der in der Lage ist, Zellapoptose zu inhibieren und Proliferation/Migration von Endothelzellen durch Vasodilatation zu fördern.

Vom Endothelium sezerniertes NO ist ein komplexer Mediator der Angiogenese und vor allem beim Diabetiker (s. Kapitel 1.1.1.) an Prozessen der Arteriogenese und Arteriosklerose beteiligt.

VEGF ist ein Stimulator der NO-Produktion in Endothelzellen. Experimente mit Inhibitoren der NO-Synthese, zeigen eine abgeschwächte Arteriogenese sowie periphere Vasokonstruktion und erhöhten Blutdruck (YANG et al. 2002).

2.2.4. Monocyte Chemoattractant Protein-1/ Chemokine (C-C motif) ligand 2

Das MCP-1 Protein wurde 1986 identifiziert und ist ein aus 76 Aminosäuren aufgebautes, 8,6 kDa schweres Chemokin aus der Familie der Cys-Cys Chemokine. Die MCP-Gruppe schließt fünf Mitglieder ein: MCP-1-5. MCP-1 zeigt die stärksten stimulierenden Eigenschaften auf die Arteriogenese.

MCP-1 spielt in mehreren pathologischen vaskulären, entzündlichen, prokoagulatorischen und malignen Prozessen eine wichtige Rolle. MCP-1 wird konstitutiv oder nach Induktion durch auf das Endothel wirkende Scherkräfte, oxidativen Stess, Zytokine oder Wachstumsfaktoren produziert. An der Synthese sind verschiedene Zellarten beteiligt (Monozyten/Makrophagen, vaskuläre glatte Muskelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten, Keratinozyten, Synovialzellen, Pneumozyten, Mesangialzellen, Astrozyten). Erhöhte Werte von MCP-1 mRNA wurden in Menschen und Tieren mit Arteriosklerose und arterieller Hypertonie beobachtet; assoziiert mit einer Hypercholesterinämie addieren sich diese Effekte. MCP-1 ist ein potenter chemotaktischer Faktor für Monozyten, die Bindung an diese Zellen erfolgt durch den CCR-2 Rezeptor. In Versuchen mit Mausmodellen, denen dieser Rezeptor fehlt, wird jegliches Kollateralarterienwachstum unterbunden (HEIL et al. 2004). Gleichzeitig kann durch MCP-1 Infusion in den proximal ligierten Femoralarterienstumpf die Anzahl der sichtbaren Kollateralarterien signifikant erhöht werden (ITO et al. 1997).

Es wurde gezeigt, dass MCP-1 zur Teilung von Intima- und Mediazellen in der Kollateralarterienwand führt und morphologische Veränderungen initiiert. Die Kollateralarterien

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werden im Angiogramm als korkenzieherförmige Strukturen sichtbar (HERZOG et al. 2002).

Zudem konnte durch Blockade der endothelialen Bindungsstellen für Monozyten mit ICAM- Antikörpern eine Verlangsamung der Arteriogenese erreicht werden.

MCP-1 wirkt im Zusammenhang mit Hypercholesterinämie forcierend auf die Plaqueentwicklung und Arteriosklerose. Der Zusammenhang besteht in einer Überexpression des MCP-1-CCR2 Rezeptors (NAMIKI et al. 2002). Die akkumulierenden Gewebsmakrophagen phagozytieren große Mengen an Lipiden und entwickeln sich zu kurzlebigen Schaumzellen (HAN et al. 1999). Im Gegensatz zu CCR2 defizienten aber hypercholesterinämischen Tieren fördert die zusätzliche Gabe von MCP-1 die Lipideinlagerung in atherosklerotischen Plaques in den Gefäßen (ROQUE et al.

2002). In klinischen Studien am Menschen wurde der Zusammenhang zwischen frühen Restenoseraten nach Angioplastie, entzündlichen Veränderungen in der Arterienwand und der zentralen Rolle von MCP-1 und seines CCR-2 Rezeptors belegt. Der MCP-1 Plasmaspiegel bei Patienten mit einer Restenose war 48 Stunden und 6 Monate nach Stentimplantation deutlich erhöht. Die Wirkung von MCP-1 in hyperlipidämischen Mäusen und hypercholesterinämischen Watanabe-Kaninchen steigert Blutflüsse nach unilateraler Femoralarterienokklusion noch zwei Monate nach dieser Behandlung signifikant. Als Nebeneffekt wurden jedoch forciertes Fortschreiten der arteriosklerotischen Plaqueentwicklung in der Aorta, sowie Veränderungen der zellulären Plaquezusammensetzung und eine vermehrter Rupturgefahr festgestellt (VAN ROYEN et al. 2003, VAN ROYEN et al. 2003).

Des Weiteren wird die Beteiligung von MCP-1 an mehreren inflammatorischen Prozessen wie Asthma bronchiale, Arthritis, Glomerulonephritis/diabetische Nephropathie und mehreren autoimmunen Prozessen diskutiert.

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2.4 Fragestellung

Diabetische und hypertensive Patienten leiden unter einem erheblichen Risiko an koronaren und peripheren Verschlusskrankheiten zu erkranken.

In der aktuellen Arbeit sollen die Auswirkungen dieser Risikofaktoren alleine und in Kombination, sowie die Rolle der Makrophagen unter diesen pathologischen Bedingungen auf die Arteriogenese untersucht werden.

Im Einzelnen wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:

I. Haben pathovaskuläre Prozesse wie Diabetes mellitus und arterielle Hypertonie alleine und in Kombination eine Auswirkung auf die Arteriogenese. Verglichen wurden:

1. die kollaterale Konduktanz,

2. der Proliferationsindex der perivaskulärer Zellen des Kollateralgefäßes, 3. die Anzahl sichtbarer Kollateralarterien,

4. die Makrophagenanzahl um das Kollateralgefäß.

II. In welchem Ausmaß modifiziert eine tatsächliche Rekrutierung oder Aktivierung von Makrophagen durch das chemoattraktive Protein MCP-1 den Einfluß pathovaskulärer Prozesse wie Diabetes mellitus und arterieller Hypertonie auf die Arteriogenese.

Verglichen wurden:

1. der Proliferationsindex der perivaskulärer Zellen des Kollateralgefäßes, 2. die Anzahl sichtbarer Kollateralarterien,

3. die Makrophagenanzahl um das Kollateralgefäß.

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3 Material und Methoden

3.1 Tiermodell

Für die Durchführung der Studie wurden Ratten eingesetzt. Die Umsetzung der angewandten Methoden erforderte eine realistische Körpergröße von dem verwendeten Versuchstier, um letztendlich eine möglichst geringe Streuung der Resultate zu erreichen. Die Induktion der Arteriogenese durch unilaterale Femoralarterienligatur, sowie die Anfertigung von post-mortem Angiographien und die histologische Aufarbeitung von Kollateralarteriengewebe ist in der Ratte methodisch etabliert (HERZOG et al. 2002, KHMEHLEWSKI et al. 2004).

Von den verschiedenen Rattenstämmen, die in der Stoffwechselforschung Verwendung finden, eignet sich die männliche ZDF-Ratte (ZDF/Crl-Leprfa/Leprfa) sehr gut für das Modell des Typ II Diabetes mellitus (Tab. 1) (IKEDA et al. 1981, GREENHOUSE et al. 1990, KAVA et al. 1990, OTHO et al. 1990, PETERSON et al. 1990, MCCUNE et al. 1990, COHEN et al. 1993, VILLAR- PALASI und FARESE 1994, PHILLIPS et al. 1996). Um den Einfluß eines arteriellen Hypertonus alleine sowie in Kombination zu untersuchen, wurde dieser chirurgisch durch die ,,2 Nieren, 1 Clip Methode“(2K1C) nach Goldblatt induziert (TOBIAN et al. 1969, LUCAS u. FLOYER 1974).

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Tab.1: Vergleich einiger T2DM Rattenstämme mit verschiedenen Krankheitssymptomen. Das ,,+/-

„-Zeichen bedeutet, dass die Reaktion abhängig vom Alter und der Ernährung variiert, während das ,,-„-Zeichen für keine signifikante Reaktion steht.

ZDF = ZDF/Crl-Leprfa; Spontane Mutation des Leptin-Rezeptor (Leprfa) Gens, Inzucht von ,,Zucker diabetic fatty“ Ratten mit hohem diabetischen Potential;

SHHF = SHHF/MccCrl-Leprcp/fa; Rückkreuzung des corpulent (cp)-Gens aus dem ursprünglichen SHR/N-Leprcp/fa Stamm und der SHR/N-Ratte (alle Genotypen entwickeln CHF mit 10-20 Monaten);

WDF/ WKY = WDF/Ta-Leprfa / WKY/NDrt-Leprcp/fa; Rückkreuzung des (Leprfa) Gens aus der heterozgoten Leprfa /+ Zucker Ratte und der WKY Ratte, alle männliche Tiere entwickeln T2DM;

WKY/N-Leprcp/fa; Rückkreuzung des (cp)-Gens aus der SHR/N- Leprcp/fa und der WKY/N Ratte;

CRDH = Kreuzung zwischen CD Ratte und SH Ratte, Selektion der Kriterien Blutdruck und Blut- Glukosespiegel, Inzucht;

CK = Auszucht Wistar Ratten Stamm ; Selektion auf hohe Blut-Glukose-Spiegel und geringe Glukose Toleranz

ZS(F1) = Crl:ZSF1-Leprfa/Leprcp; Hybrid-kreuzung zwischen einer weiblichen ZDF- und einer männlichen SHHF-Ratte;

Stamm

Kennzeichen

ZDF male

ZDF female

SHHF male

WDF/

WKY male

CRDH CK ZS obese male Insulinresistenz +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++

Hyperinsulinämie +++ -/++ +++++ +++ ++++ ++ +++++

NIDDM +++++ -/+++++ +++ ++++ +++ +++ -/++++

Hyperglykämie +++++ -/+++++ +++ +++ ++++ ++++ - Bluthochdruck ++ -/++ +++++ - +++++ - ++++

Fettsucht ++++ +++ +++ +++ - - +++++

Chron. Herzinsuffizienz - - +++++ - - - +++

Hypertrigyceridämie ++++ ++++ +++ + - - +++++

Hypercholesterinämie ++++ ++++ +++ - - - +++++

(36)

Die homozygote männliche ZDF-Ratte (Zucker diabetic fatty rat, Crl-Leprfa/Leprfa) ist ein etabliertes Modell des Typ II-Diabetes des Menschen (PETERSON et al. 1990, TOKUYAMA et al.

1995, SLIEKER et al. 1992). Die allesamt männlichen Ratten stammten aus der Zucht von Gmi Tm aus Indianapolis, USA (jetzt Charles River, Wilmington, USA). Nach der Säugeperiode (bis zur vierten Lebenswoche) schreiten die Tiere schnell von einem prädiabetischen Stadium der Hyperinsulinämie mit Euglykämie über zu einem hyperglykämischen Insulinmangelstadium mit einem offenen Diabetes (ca. zwölfte Lebenswoche). Neben Adipositas, Hyperlipidämie und leichtem Hypertonus entwickelt die männliche ZDF-Ratte eine zunehmende Hyperglykämie aufgrund der peripheren Glukosetoleranz und folgender Insulinresistenz. Im Alter von sieben Wochen ist der Glukosegehalt im Blut auf über 175 mg/dl angestiegen und ab der zwölften Lebenswoche werden Werte von über 600 mg/dl erreicht. Später auftretende Nephropathien und Neuropathien bewirken dann meist den Tod der Tiere im Alter von einem Jahr (CLARK et al.

1983).

Die ZDF-Ratte wurde durch Inzucht aus dem Stamm der Zucker Ratten (fa/fa) herausgezüchtet. Die fa-Mutation trat um 1960 bei Kreuzungstieren des Merck-Stammes M mit einem Sherman- Rattenstamm am Labaratory of Comparative Pathology in Massachusetts spontan auf. Das Ehepaar Zucker beschrieb diese Tiere 1961 und züchtete aus dem ursprünglichen Hybridstamm einen Rattenstamm, der Träger des fa-Gens war (ZUCKER 1965). Dieser Tierstamm wird heute nach den Erstbeschreibern als Zucker-Ratte oder 13M bezeichnet. Die Mutation beruht auf einer Veränderung am Leptin-Rezeptor (Leprfa), die autosomal rezessiv vererbt wird und bei den homozygoten Tieren zur Ausbildung einer Fettleibigkeit führt. Dabei findet eine Hypertrophie und eine Hyperplasie des Fettgewebes statt, denn im Gegensatz zu anderen Tieren sind diese Ratten in der Lage, die Zahl ihrer Fettzellen im fortgeschrittenen Alter noch zu vermehren.

Bei den Zucker (fa/fa) Ratten war es aber auch immer wieder zu einer phänotypischen Ausprägung von stark übergewichtigen männlichen Ratten mit hohem Fettanteil, sehr hohem Glukosespiegel und einer gestörten Glukosetoleranz gekommen. Diese, ausschließlich männliche Tiere betreffende Spontanmutation, wurde mit normalgewichtigen Ratten (+/fa) gepaart, die ein hohes diabetisches Potential in sich trugen. Es handelte sich dabei fast ausschließlich um Bruder x Schwester Inzucht.

Schon ab der zweiten Generation konnte ein konstanter Phänotyp herausgezüchtet werden. Der Diabetes mellitus ist bei diesen Rattenstämmen (ZDF Ratte) monogenetisch determiniert und wird

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