Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell

(1)

Aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchung von

Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms

im Rattenmodell

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die

Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Kerstin Kleinschmidt

aus Paderborn

Hannover 2006

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. phil. nat. Stephan Steinlechner

Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2006

Fördernde Institutionen: International Neuroscience Institute Hannover (INI) GmbH

Internationale Stiftung Neurobionik Hannover Bundesministerium für Bildung und

Forschung (BMBF)

(3)

Meiner großartigen Familie

gewidmet

(4)

(5)

Abkürzungsverzeichnis

AGM-1470 Fumagillinanalogon CSF Zerebrospinalflüssigkeit Ak Antikörper DMEM Dulbecco´s Modified Eagle AP anterior-posterior Medium

zu Bregma DMSO Dimethylsulfoxid Aqua dest. destilliertes Wasser DNA Desoxyribonucleinacid Ba Barium DV dorso-ventral zu Bregma bFGF basic Fibroblast EBNA Human Fetal Kidney Cells Growth Factor ECB Endostatin CellBeads^® BHS Blut-Hirn-Schranke EGFR Epidermal Growth Factor

BHSC Baby Hamster Receptor

Kidney Cells EIA enzymatischer

Bm Bregma -1 mm mitte/ Immunoassay

Implantationskoordinate EMSC Endostatin sezernierende mitte mesenchymale

Bo Bregma -1 oben/ Stammzellen

Implantationskoordinate EN Endostatin und

oben Tiernummer

BSA Bovines Serum Albumin eNOS endotheliale

BT4Ca Gliomzelllinie aus BDIX- Stickstoffoxidsynthasen

Ratten ES Embryonale Stammzellen

Bu Bregma -1 mm unten/ EtOH Ethanol Implantationskoordinate FDA Federal Drug

unten Administration

Ca Kalzium Fm größte Fläche mitte

CB CellBead^® Fo größte Fläche oben

CBs CellBeads Fu größte Fläche unten

CO2 Kohlenstoffdioxid G Guluronsäure

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ga gauge KDR/Flk-1 Kinase Insert Domaine GBM Glioblastoma multiforme Receptor/Fetal Liver GCB Goldpartikel enthaltende Kinase

CellBeads^® kg Kilogramm

GFAP Glial Fibrillary Acidic KGW Körpergewicht Protein KH2PO4 Kaliumdihydrogen- GLP Good Laboratory Practise phosphat

GLUTs Glutaminasen LCB leere CellBeads^®

GZ Gliomzellen LM latero-medial zu Bregma

HCl Salzsäure M Mannuronsäure

H.E. Hämatoxylin-Eosin- µ Mikro

Färbung m molar

HIF-1 hypoxia-inducable-factor-1 MCP-1 Monocyte Chemoattractant

hMSC humane mesenchymale Protein-1

Stammzellen MEZ Mitteleuropäische Zeit H2O2 Wasserstoffperoxid Mg Magnesium

hTERT humane Telomerase MHC Major Histocompatibility Reverse Transkriptase Complex

i.c.v. intrazerebroventrikulär MHH Medizinische Hochschule

i.c. intrakraniell Hannover

IgE Immunglobulin E Min. Minute

IHC Immunhistochemie MRI Magnet Resonance

IL Interleukin Imaging

i. p. intraperitoneal MSC Mesenchymale JPEG Joint Photographic Expert Stammzellen

Group MtOH Methanol

kD Kilo Dalton

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Na2HPO4 Dinatriumhydrogen- TRS Target Retrieval Solution phosphat U/Min. Umdrehungen pro Minute NaCl Kochsalz VEGF Vascular Endothelial

O2 Sauerstoff Growth Factor

OT Objektträger Vol Volumen

p Piko vWF von-Willebrand-Faktor

PBS Phosphate Buffered Saline Ztm zentrales Tierlaboratorium PDGF Platelet-Derived Growth der MHH

Factor ZZ Zellzahl

PFA Paraformaldehyd PKB Proteinkinase B PP Polypropylen r² Pearssonscher

Korrelationskoeffizient ROI Region of Interest

RT Raumtemperatur

s.c. subkutan

SCB Stammzell CellBeads^® SD Standardabweichung Sek. Sekunde

SEM Standardfehler

SPIO superparamagnetische Eisenoxide

SYBR Cyaninfluoreszenzfarbstoff SZ Stammzellen

TIFF Target Image File Format TIMP-1 Matrixmetalloproteinase-1

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht... 3

2.1 Glioblastoma multiforme... 3

2.1.1 Einführung ... 3

2.1.2 Histologie... 5

2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen... 6

2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik... 7

2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen... 8

2.1.6 Neue Behandlungsansätze ... 10

2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze ... 11

2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell ... 14

2.3 Angiogenese ... 16

2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme ... 17

2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese ... 19

2.4 Endostatin ... 21

2.4.2 Wirkungen ... 23

2.4.3 Therapeutischer Einsatz... 27

2.5 Mikrokapseln zur intrazerebralen Gliomtherapie ... 29

2.5.2 Verkapselungsmaterial: Alginat ... 33

2.5.3 Biokompatibilität ... 35

2.5.4 Therapeutischer Einsatz... 37

2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit... 39

3 Untersuchungsgut und Methoden ... 41

3.1 Tiere ... 41

3.1.1 Herkunft... 41

3.1.2 Haltung und Fütterung... 41

3.1.3 Narkose und Analgesie ... 42

3.2 Implantate: CellBeads^®... 43

3.2.2 Verkapselungstechnologie ... 45

(9)

3.3 Gliomzelllinie BT4Ca... 46

3.3.2 Syngenität ... 46

3.4 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen ... 47

3.4.1 Etablierung des Models ... 47

3.4.1.1 Tumorzellinokulation ... 47

3.4.1.2 CellBead^®Implantationen ... 48

3.4.1.3 Zweizeitige Operation ... 49

3.4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des Endostatins ... 50

3.4.2.1 Gruppe I: Kontrollgruppe Gliom (BT4Ca)... 50

3.4.2.2 Gruppe II: Gliom (BT4Ca) und leere CellBeads^® (LCB)... 51

3.4.2.3 Gruppe III: Gliom (BT4Ca) und Endostatin CellBeads^® (ECB)... 51

3.4.2.4 Gruppe IV: Gliom (BT4Ca) und Stammzell CellBeads^® (SCB) ... 51

3.5 Versuchsdurchführung ... 53

3.5.1 Zellkultur... 53

3.5.1.1 Kultivierung der Gliomzellen ... 54

3.5.1.2 Kryokonservierung der Gliomzellen ... 55

3.5.1.3 Auftauen der Gliomzellen... 56

3.5.1.4 Vitalzellzählung ... 56

3.5.2 Behandlung der Gliomzellen vor der Implantation... 57

3.5.3 Behandlung der CellBeads^® vor der Implantation ... 59

3.5.4 Stereotaktische Implantationstechnik ... 60

3.5.4.1 Stereotaktische Implantation der Gliomzellen ... 62

3.5.4.2 Stereotaktische Implantation der CellBeads^®... 63

3.6 Neuropathologische Untersuchungen ... 65

3.6.1 Transkardiale Perfusionsfixierung ... 66

3.6.2 Nachfixierung ... 67

3.6.3 Kryobehandlung ... 67

3.6.4 Gefrierschnitte ... 68

3.6.5 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)... 70

3.6.6 Immunhistochemische Färbungen (IHC) ... 71

3.6.6.1 Von-Willebrand-Faktor (vWF) ... 73

3.6.6.2 Endostatin... 73

3.6.7 Mikroskopische Auswertung... 74

3.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) zur Etablierung des Modells ... 75

3.6.7.2 Immunhistologischer Nachweis des Endostatins ... 75

3.6.7.3 Immunhistologie zur Untersuchung der Tumorvaskularisierung ... 76

3.6.7.4 H.E.-Färbung zur Untersuchung der Tumorgrößen ... 77

3.7 Statistische Auswertung ... 79

(10)

4 Ergebnisse ... 81

4.1 Entwicklung des Versuchsmodells ... 81

4.1.1.1 Kultivierung ... 81

4.1.1.2 Vitalzellzahl ... 81

4.1.2 Experimentelles Glioblastom ... 82

4.1.2.1 Bildtafel 1 ... 85

4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads^®.. 86

4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation ... 88

4.1.4.1 Bildtafel 2 ... 90

4.2 Untersuchung der Wirksamkeit ... 91

4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate... 91

4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads^®... 91

4.2.2.1 Bildtafel 3 ... 93

4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung... 94

4.2.3.1 Bildtafel 4 ... 99

4.2.4 Untersuchung der Tumorvolumina ... 104

4.2.4.1 Bildtafel 5 ... 105

4.2.5 Korrelation zwischen Tumorvolumen und Blutgefäßdichte... 107

5 Diskussion ... 109

5.1 Diskussion der Methodik... 109

5.1.1 Tierexperimentelles Modell... 109

5.1.1.1 Gliomzelllinie BT4Ca... 109

5.1.1.2 Histologie des Tumors ... 110

5.1.1.3 Intrazerebroventrikuläre Implantation der CellBeads^®... 111

5.1.1.4 Biokompatibilität der implantierten CellBeads^®... 112

5.1.2 Untersuchungsmethoden ... 113

5.1.2.1 Immunhistologische Untersuchung der Endostatinfreisetzung ... 113

5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung der Endostatin CellBeads^®... 114

5.2 Diskussion der Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchung... 118

5.2.1 Endostatinfreisetzung aus den CellBeads^®... 118

5.2.2 Wirksamkeit der Endostatin sezernierenden CellBeads^®... 119

5.2.2.1 Immunhistologisch dargestellte Blutgefäßdichte ... 120

5.2.2.2 Tumorvolumina und Korrelation mit der Blutgefäßdichte ... 123

5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung ... 127

(11)

6 Zusammenfassung... 130

7 Summary ... 132

8 Literaturverzeichnis ... 134

9 Anhang ... 164

9.1 Bezugsquellen... 164

9.1.1 Versuchstiere ... 164

9.1.2 Allgemeiner Bedarf und OP-Bedarf ... 164

9.1.3 Verbrauchsmaterialien Zellkultur ... 166

9.1.4 Verbrauchsmaterialien Histologie und Immunhistologie ... 167

9.1.5 Geräte und Software ... 169

9.2 Reagenzien ... 172

9.2.1 Färbungen ... 172

9.2.2 Perfusionsfixierung ... 172

9.3 Färbeprotokolle ... 174

9.3.1 Färbeprotokoll Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 174

9.3.2 Färbeprotokoll Immunhistologie ... 175

9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung ... 176

9.5 Statistik ... 180

9.5.1 Vaskularisierungsdichte... 180

9.5.2 Tumorgrößen... 191

9.5.3 Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Tumorvolumina ... 193

9.6 Danksagung ... 195

(12)

(13)

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Tumorerkrankungen stellen nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste Todesursache dar. Etwa 27% der Bevölkerung sterben infolge neoplastischer Entartungen. 1-2% der beim Menschen auftretenden Tumoren sind Neoplasien des Zentralnervensystems und zirka 15 bis 30% davon sind Glioblastome. Das Glioblastoma multiforme ist ein auf die proliferative Entartung von Gliazellen zurückzuführender Gehirntumor. Es nimmt innerhalb weniger Wochen enorme Ausmaße an und führt über die mit seinem das gesunde Gehirngewebe verdrängenden Wachstum einhergehenden neurologischen Symptome zum Tod.

Nach Diagnosestellung liegt die mittlere Überlebenszeit bei 12 bis 15 Monaten. Da das Glioblastom infiltrierend wächst, ist eine chirurgische Resektion des kompletten Tumorgewebes in der Regel nicht möglich und es kommt fast immer zur Ausbildung eines Rezidivs. Sowohl Zytostatikagaben und Immuntherapien als auch strahlentherapeutische Interventionen führen bestenfalls zu einer Verlangsamung des Glioblastomwachstums, so dass die Prognose trotz der Anwendung aller klinisch genutzten kurativen Behandlungsoptionen als infaust zu beurteilen ist.

Die Proliferation der Gliomzellen geht mit einer tumorinduzierten kapillaren Blutgefäßneubildung einher. Das Größenwachstum des Glioblastoma multiforme ist dabei auf Grund des gesteigerten Sauerstoff- und Nährstoffumsatzes von der Neoangiogenese abhängig (FOLKMAN 1990). Endostatin ist ein 22kD großes endogenes Protein, das über noch nicht restlos geklärte Mechanismen selektiv gegen die neovaskuläre Endothelzellproliferation wirkt (OU-YANG et al. 2006). Seine antiangiogene Potenz und sein selektiver und somit im Vergleich zu anderen Tumortherapien nahezu nebenwirkungsfreier Effekt machen Endostatin zu einem geeigneten Glioblastomtherapeutikum. Da Endostatin eine kurze Halbwertszeit von unter 12 Stunden hat und zudem die Blut-Hirn-Schranke den Zielort gegen das Kreislaufsystem abschirmt, ist eine systemische Applikation des Wirkstoffs nicht geeignet, um ausreichend hohe Dosen innerhalb des Gehirns zu erzielen (BJERKVIG et al. 2003).

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2 1 Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen sind mittels eines einfachen Eingriffs aus dem Knochenmark zu gewinnen und lassen sich gentechnisch so modifizieren, dass sie dauerhaft Endostatin sezernieren. Die Verkapselung solcher Wirkstoff produzierender Zellen mit einer für Nährstoffe, Sauerstoff und Endostatin durchlässigen, aber gegen die Bestandteile des Empfängerimmunsystems abschirmenden Alginatmatrix ermöglicht die intrazerebrale Applikation (MARKUSEN et al. 2006). Diese „Bioreaktoren“ ermöglichen die anhaltende Produktion von Endostatin direkt am Zielort. Die verkapselten Stammzellen weisen dabei trotz erhaltener Vitalität und Sekretionsleistung eine stark eingeschränkte Proliferationsrate mit 1 bis 2 Zellteilungen nach der Verkapselung auf. Von READ et al. (2001) und in einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit (BARTSCH 2005) konnte gezeigt werden, dass die zirka 600 µm großen Mikrokapseln nach tierexperimenteller intrazerebraler Implantation von xenogenen Zellen gut biokompatibel waren und keine Abstoßungsreaktionen der Empfängertiere aufwiesen. In dieser Arbeit sollte die Endostatinfreisetzung nach intrazerebroventrikulärer Implantation solcher vitale, sekretionsaktive Stammzellen enthaltender Alginatkapseln im Rattenmodell gezeigt werden. Zudem sollte die Wirksamkeit der als CellBeads^® bezeichneten, von der Firma CellMed AG (Alzenau, Deutschland) hergestellten Mikrokapseln auf ein experimentelles Glioblastom untersucht werden. Dabei sollten als Voraussetzung für die klinische Anwendung unter den Bedingungen der Good Laboratory Practice (GLP) die Auswirkungen auf die intratumorale Vaskularisierungsdichte und das Tumorwachstum quantifiziert werden.

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2 Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht

2.1 Glioblastoma multiforme 2.1.1 Einführung

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der am häufigsten vorkommenden und gleichzeitig am aggressivsten wachsenden Tumoren des Gehirns. Es nimmt seinen Ursprung in den Gliazellen. Die derzeitige Klassifizierung durch die World Health Organisation (WHO) führt das GBM als ein Grad IV Gliom auf (KLEIHUES et al.

2002). Nach der WHO-Klassifikation werden die Hirntumoren unterteilt nach ihren jeweiligen Ursprungszellen und die Gliome somit in Astrozytome, Oligodendrogliome und Mischtumoren eingeteilt. Darüber hinaus wird der histologische Malignitätsgrad zur Klassifizierung herangezogen, wobei „low-grade“- (Malignitätsgrad I und II) von

„high-grade“-Tumoren (Malignitätsgrad III und IV) unterschieden werden (WIESTLER u. SCHMIDT 1998).

Tabelle 1 Einteilung der high-grade Tumoren nach WHO

Malignitätsgrad Gliatumoren WHO-Klassifikation

III IV

Anaplastisches Astrozytom +

Astrozytäre

Tumoren Glioblastoma multiforme +

Oligodendrogliome Anaplastisches Oligodendrogliom + Mischgliome Anaplastisches Oligoastrozytom +

Nach der Einteilung der Tumorarten von KERNOHAN u. SAYRE (1952) werden Astrozytome, Ependymome und Oligodendrogliome in einer 4-Punkte-Skala entsprechend ihrer Malignität klassifiziert (NATAF et al. 2005).

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4 2 Literaturübersicht

Dabei stellen Astrozytome vom Grad 3 und 4, auch als Glioblastoma multiforme bezeichnet, etwa 50% aller Gliome dar. Etwa 1-2% aller beim Menschen vorkommenden Neoplasien sind Tumoren des Zentralnervensystems (ZNS).

Die neuroektodermalen Tumoren, insbesondere die Glioblastome, bilden hierbei noch vor den Angiomen und den Meningiomen die größte Gruppe mit einem Anteil von 15-30% aller Tumoren im Gehirn.

Glioblastome zeichnen sich durch ihr schnelles Wachstum aus. Sie infiltrieren diffus in benachbarte Strukturen, so dass eine komplette chirurgische Resektion in der Regel nicht gelingen kann, sondern Resttumorgewebe im Gehirn verbleibt (DHAYAT u. GUGGEMOS 1999/2000). Häufig nehmen sie enorme Ausmaße an, bevor Symptome auftreten. Zu den ersten klinischen Symptomen gehören starke, meist nicht medikamentös zu beeinflussende Kopfschmerzen, Sehstörungen, epileptische Anfälle, Lähmungserscheinungen, Sprachstörungen, Bewusstseinseintrübung, Beeinträchtigungen des Erinnerungsvermögens und der Sensorik sowie Persönlichkeitsveränderungen (BRUCE et al. 2005).

Hochmaligne Gliome und diffus intrinsische Ponsgliome haben eine infauste Prognose (JOHANNESEN et al. 2002). Die mittlere Überlebenszeit nach der Diagnosestellung beträgt trotz intensiver chirurgischer, radio- und chemotherapeutischer Interventionen derzeit selten mehr als 12 bis 15 Monate und nur 8-12% der Betroffenen überleben bis zu zwei Jahren oder länger (KIOI et al.

2006).

Die Inzidenz der Glioblastome liegt bei etwa 1 bis 3 Krankheitsfällen pro 100.000 Einwohner, dies entspricht etwa 4000 bis 5000 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland. 60% der primären Glioblastome treten bei Erwachsenen älter als 50 Jahre auf (BRUCE et al. 2005). In einer klinischen Studie von 1976 lag der Anteil der betroffenen Kinder bei 8,8% (DOHRMANN et al.1976).

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2.1.2 Histologie

Die Histogenese der Glioblastome nimmt ihren Ursprung in den Gliazellen. Die Gesamtheit der Gliazelle mit ihren das Stützgewebe bildenden Ausläufern wird als Glion bezeichnet. Zu den Gliazellen zählen verschiedene Zelltypen mit verschiedenen physiologischen Aufgaben im Zentralnervensystem. Astrozyten übernehmen Stütz- und Versorgungsfunktionen, die Mikroglia ist Bestandteil des Abwehrsystems, Zellen der Oligodendroglia bilden die Markscheiden im zentralen Nervensystem und Schwannsche Zellen umscheiden die peripheren Nervenfasern.

Astrozyten sind neben den Endothelzellen die Zellen des Zentralnervensystems, die unter physiologischen Umständen zur Proliferation befähigt sind. Der Zellumsatz liegt dann bei weniger als 1%. Neuere Arbeiten weisen daraufhin, dass auch andere nicht neoplastisch entartete Zelltypen des ZNS, insbesondere Neurone zur Neogenese in der Lage sind (YAMASHITA et al. 2006, WRIGHT et al. 2006). Kommt es zu einer Störung der regulären Proliferations- und Apoptosemechanismen, kann es zur tumorösen Entartung von Astrozyten oder Zellen der Oligodendroglia kommen, die dann Grundlage für ein Astrozytom, Oligodendrogliom oder einen Mischtumor als Endstadium dieser Veränderung darstellen. Der Anteil der proliferierenden und damit die Wachstumsrate des Tumors bestimmenden Gliomzellen beträgt etwa 15 bis 30%.

Trotz einer hohen Zellverlustrate von 10 bis 80% verdoppelt sich das Tumorvolumen alle 40 bis 50 Tage (HOSHINO 1984). Das Glioblastoma multiforme stellt sich makroskopisch vielfältig mit Nekrosebezirken, stark vaskularisierten Bereichen und mit teilweise großen durch Einblutungen hervorgerufenen Kavernen dar. Typisch ist die glasige, weiche, teilweise zerfließende Textur. Am häufigsten zeigen sich zerebello-medullär gelegene Gliome im frontotemporalen Bereich, die sich bei Diagnosestellung oft schon über den die Gehirnhälften verbindenden Balken hinaus bis in die andere Hemisphäre ausgedehnt haben (Schmetterlingsgliom).Histologisch stellt sich das Glioblastom im entdifferenzierten Zustand mit einem weitgehend pleomorphen Zellbild dar, welches durch zahlreiche Mitosen, aber auch funktionale Zellen gekennzeichnet ist.

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Zudem zeigen sich perifokal ödematisierte Strukturen und nekrotische Bereiche werden von solchen mit deutlich erhöhter Zelldichte - so genannten Pseudopalisaden - umgeben.

Dazu kommen Gefäßneubildungen, die durch ihre vermehrte Anzahl, abnorme Größe und auftretende glomeruläre Strukturen gekennzeichnet sind (WAGGENER et al. 1976). Die Blutgefäße innerhalb eines Glioblastoms weisen eine endotheliale Hyperplasie von bis zu zehn Endothelzellen in einem Gefäßquerschnitt auf, sind gewunden und zum Teil fenestriert (BREM et al. 1972).

2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen

Wie GREENE u. HARVEY 1964 bereits zeigten, kommt es in der Regel nicht zur Entstehung tumorferner Metastasen, da abgeschwemmte Gliomzellen nicht an den Gefäßendothelien haften, in andere Gewebe einwandern und auch nicht proliferationsfähig anwachsen können.

Die Vaskularisierungsdichte und Morphologie der Tumorblutgefäße sind Malignitätskriterien zur Abgrenzung zwischen Gliomen der Grade III und IV nach WHO und stellen außerdem ein entscheidendes prognostisches Kriterium dar (LEON et al. 1996). So dient die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die sich aus Kapillarendothel, Basalmembran und Oberflächenmembranen der Astrozytenausläufer zusammensetzt, in physiologischer Weise als Stoffwechselbarriere, die passiv nur von niedermolekularen lipophilen Substanzen passiert werden kann. Bei pathologischen Veränderungen wie Fieber, durch Bakterientoxine, aber auch durch den Einfluss von Neoplasien kann es zu einer erhöhten Permeabilität und in Folge dessen zur Ödembildung kommen. Die korrelierend mit dem Glioblastoma multiforme neugebildeten Blutgefäße weisen Strukturveränderungen auf, die mit einer Störung der BHS einhergehen.

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Sie weisen eine geringere Dichte ihres Zellverbandes mit aufgelockerten Tight Junctions und einer veränderten Transporterproteinexpression auf, die wiederum auf die Wirkung des vermehrt freigesetzten "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) zurückgeführt wird (ESSER et al. 1998). Aus der vermehrten Durchlässigkeit der Gefäße, der damit einhergehenden Ödematisierung und dem gleichzeitig innerhalb des knöchernen Schädels zunehmenden Tumorvolumen resultiert eine Steigerung des Gehirndrucks. Die damit einhergehende Kopfschmerzsymptomatik wird vom Patienten meist zuerst wahrgenommenen.

2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik

Die Definition hochgradiger Gliome basiert auf histologischen Kriterien. Klinisch erfolgt diese Klassifizierung anhand von Probebiopsien oder reseziertem Tumorgewebe. Neben der astrozytären oder oligodendrogliären Differenzierung der Tumorzellen werden vor allem die Merkmale der Malignität beurteilt: zelluläre Anaplasie, mitotische und apoptotische Figuren, hohe Zelldichte, Blutgefäßneubildung und -struktur sowie Anzahl und Ausdehnung von intratumoralen Nekrosen (KLEIHUES u. SOBIN 2000). Die Zellen des Glioblastoma multiforme stellen sich als anaplastische, wenig differenzierte, runde oder pleomorphe Zellen mit teilweise mehreren meist atypischen Zellkernen dar (REARDON u. WEN 2006).

Klinisch werden Gliome in erster Linie radiomorphologisch mittels Computertomographie (CT) und Magnetresonaztomographie (MRT) klassifiziert, da gerade bei Hirnstammgliomen die Morbidität in Folge von Resektionen hoch und außerdem die prognostische Relevanz der Histomorphologie gering ist. Hierbei werden typische diffuse intrinsische Ponsgliome, typische Mittelhirngliome, dorsal exophytische zerebello-medulläre Gliome und untypische Hirnstammgliome unterschieden.

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Zur Planung des therapeutischen Vorgehens und der Beurteilung der prognostischen Aussichten nach einer operativen Tumorentfernung oder -reduktion werden vor allem die Ausdehnung und Lokalisation der Neoplasien in CT und MRT dargestellt und bewertet.

Neue molekularbiologische und immunhistologische Möglichkeiten der Diagnostik erlauben die Darstellung von durch die Tumorzellen exprimierten Proteinen, die nicht nur als Proliferations-, sondern auch als Identifikationsmerkmale nutzbar sind (FACOETTI et al. 2006).

2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen

Derzeit beschränkt sich die Therapie auf ein massives palliatives Vorgehen mit einer chirurgischen Tumorresektion, der eine Strahlen- und/ oder Chemotherapie folgen.

Die komplette Resektion des Tumors ist auf Grund seines diffus-infiltrativen Wachstums in der Regel ausgeschlossen, so dass der Operationserfolg auf die Tumorreduktion beschränkt bleibt (BELLO et al. 2002). KIRSCH et al. (2000a) beschrieben, dass das Glioblastom Metastasen hemmende Proteine sezerniert und es durch die operative Reduktion des Primärtumors auf Grund des Wegfalls dieser Proliferation hemmenden Wirkung zu einer Erhöhung der Rezidivrate kommen kann.

MAUFFREY (2006) zeigte aber, dass die radikale Operation direkt im Anschluss an die Diagnosestellung die einzig wirksame Therapie ist. Sie führt eindeutig zu einer Lebenszeitverlängerung bei im Gegensatz zur systemischen Chemo- therapeutikagabe weitgehend erhaltener Lebensqualität. Dennoch birgt der Eingriff Risiken wie körperliche und geistige Einbußen mit einer bei der Resektion von Stammhirngliomen hohen Mortalität und auf Grund der sehr hohen Rezidivrate einer mittleren Überlebenszeit von nur 12 bis 15 Monaten (BARKER et al. 1998, RAINOV et al. 2006)

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STEWART ermittelte 2002 im Rahmen eines Reviews über die generelle systemische Verabreichung von Chemotherapeutika bei Glioblastoma multiforme Patienten eine Verlängerung der mittleren Überlebenszeit von 2 Monaten. BOIARDI et al. (1999) stellten anhand einer klinischen Studie fest, dass die Überlebenszeit bei lokal behandelten Glioblastompatienten mit 21 Monaten im Vergleich zu 15 Monaten bei ausschließlich systemisch mittels Chemotherapeutika (Cisplatinum) behandelten Patienten verlängert war. ANDERSEN et al. (2006) beschrieben zudem, dass auch eine radiotherapeutische Behandlung lediglich mit einer Verlangsamung des Krankheitsprozesses verbunden war, das Tumorvolumen aber stetig weiter zunahm.

Trotz zahlreicher Therapieansätze hat es nach DEORAH et al. (2006) seit den achtziger Jahren durch die Anwendung der bis heute klinisch eingesetzten Behandlungsmethoden keine signifikante Steigerung in den Überlebensraten bei Glioblastompatienten gegeben.

Auf Grund dessen befassen sich aktuelle Untersuchungen mit dem Einsatz neuer Therapien wie zum Beispiel der Immuntherapie, Radioimmuntherapie oder der Beeinflussung der Neovaskularisierung (Antiangiogenese), insbesondere unter dem Gesichtspunkt der Entwicklung lokaler Applikationsmöglichkeiten.

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2.1.6 Neue Behandlungsansätze

Einen neuen therapeutischen Ansatz zeigen Methoden aus dem Bereich der Nanotechnologie und der Mikroverkapselung auf. Hier sind viele verschiedene Möglichkeiten der Bekämpfung von Gehirntumoren in der Entwicklung, zu denen sowohl lokale Immuno- und Radiotherapie, der Einsatz von Neuronen generierenden Zellen als auch der von „Medikamentenpumpen“ gehört. Vorteil all dieser Behandlungsansätze ist, dass sie direkt am Zielort in hohen Dosen wirken (DUNN u.

BLACK 2003). Dabei kommen minimal invasiv implantierbare Mikrokapseln und so genannte „Bioreaktoren“ zum Einsatz. Diese enthalten verkapselte Wirkstoffe oder Wirkstoff sezernierende Zellen und lassen so eine genaue und sichere Applikation von therapeutischen Substanzen selbst an schwer zugänglichen Orten wie dem operativ kaum erreichbaren Hirnstammgliom zu. BRANNON-PEPPAS u.

BLANCHETTE (2004) beschrieben mehrere Studien aus den vergangenen fünf Jahren, die aufzeigten, dass diese als Medikamententransporter genutzten Implantate die Applikation eines breiten Wirkstoffspektrums ermöglichten, das von Chemotherapeutika über Angiogenesehemmer bis hin zu Radio- und Immuntherapeutika reichte.

Die hohe Vaskularisierungsdichte des Tumors ist ein therapeutisch genutzter Angriffspunkt. Ziel ist, die Versorgung des Tumors mit Nährstoffen und Sauerstoff zu unterbinden, indem man antiangiogenetisch auf ihn einwirkt.

Die Folgen sind sowohl eine Tumorreduktion als auch eine langfristige Wachstumshemmung (SON et al. 2006). Gerade im letzten Jahrzehnt wurden viele antiangiogenetisch wirkende Proteine und ihre Wirkung auf das Wachstum von Neoplasien untersucht. Im experimentellen Einsatz und teilweise auch bereits in der klinischen Erprobungsphase sind Endothelzellen supprimierende Proteine wie zum Beispiel Angiostatin, Endostatin, Avicine, Interleukin-12, Flavopiridol und Interferon alpha. Ziel ist die minimal invasive Applikation direkt in den Tumor, um sowohl die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen als auch den Verlust durch Metabolisierung zu minimieren (BRANNON-PEPPAS u. BLANCHETTE 2004).

(23)

Bei der Anwendung des Gamma-Knifes, das auch als „Strahlenskalpell“ bezeichnet wird und im Jahre 1968 von LEKSEL erstmalig eingesetzt wurde, werden mittels γ- Strahlung sowohl die Tumorzellen selbst als auch die Endothelzellen der sie versorgenden Gefäße dauerhaft geschädigt. Die Nebenwirkungen sind auf Grund der bei einer Abweichung von nur 0,3 mm sehr hohen Präzision, mit der man auf die neoplastischen Gewebe einwirken kann, gering. HSIEH et al. (2005) zeigten in einer Retrospektivstudie über 5 Jahre eine allgemeine verlängerte mittlere Überlebenszeit von 16,7 Monaten bei mittels Gamma-Knife strahlentherapierten Patienten, die neben der direkten Tumorzellschädigung ebenfalls auf die Zerstörung proliferierender Blutgefäße und die Unterversorgung der Gliomzellen zurückgeführt wird.

2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze

Tumoren des zentralen Nervensystems sind beim Hund nicht so selten, wie lange Zeit angenommen, bei der Katze treten sie häufig auf. Wie beim Menschen sind die Folgen für das betroffene Tier unabhängig vom Malignitätsgrad der Neoplasie auf Grund der Verdrängung funktionellen Gehirngewebes drastisch (NOLTE u. NOLTE 2001). Nach HEIDNER et al. (1991) liegen die mittleren Überlebenszeiten nach der Diagnosestellung ohne Behandlung oder nur mit symptomatischer Therapie bei einer Woche, nach der Tumorresektion bei 3 Wochen. Intrakranielle Neoplasien treten beim Hund häufiger auf als beim Menschen (LIPSITZ et al. 2003). So sind es beim Hund im Jahr 14,5 Fälle pro 100.000 im Vergleich zu 4-5 Fällen beim Menschen (STOICA et al. 2004). Das GBM ist weltweit bei Hunden sehr selten und tritt bei Katzen etwas häufiger auf. Besonders häufig sind brachycephale Rassen betroffen mit einer Rassedisposition für Boston Terrier, Englische Bulldoggen und insbesondere Boxer. Die Inzidenz ist bei über 6 Jahre alten Hunden erhöht. Einen geschlechtsspezifischen Einfluss gibt es nicht (OBERMAIER et al. 1995, STOICA et al. 2004).

(24)

Die caninen glialen Tumoren sind den humanen sowohl morphologisch als auch immunhistologisch sehr ähnlich und ebenfalls hauptsächlich in den Gehirnhemispheren, dem Thalamus, dem Hypothalamus und dem Stammhirn lokalisiert (STOICA et al. 2004). Sie zeigen ebenfalls eine erhöhte Zelldichte und Vaskularisierung, Pleomorphismus, Zellkernpolygonie, mitotische Aktivität und die Bildung von Nekrosen umgebenden Pseudopalisaden (LIPSITZ et al. 2003). Die Vergleichbarkeit von Gliomen im Hund und im Menschen macht die klinischen Erfahrungen und Retrospektiverkenntnisse aus der Veterinärmedizin zum einen wichtig für die Humanmedizin, zum anderen ermöglicht diese die Anwendung von für den Menschen entwickelten Medikamenten auch beim Hund (SNYDER et al. 2006).

Auch die mit schnell wachsenden Gehirntumoren einhergehenden Symptome bei Hund und Katze ähneln denen des Menschen. So beschrieben LIPSITZ et al. (2003) bei fünf Hunden mit GBM Ataxien bis hin zur Tetraparese, Kopfschiefhaltung, Nystagmus und Benommenheit. Vier der fünf Tiere zeigten zudem einen Drang nach rechts, der sich in im Kreisgehen und einer Kopf-rechts-Haltung äußerte. Ähnliche Symptome beschrieben STOICA et al. 2004 und HIGGINS et al. 2001 für Astrozytome und granuläre ZNS Tumoren bei Hunden. DICKINSON et al. (2000) erhoben diese neurologischen Befunde ergänzt durch eine reduzierte optische Antwort auf eine Drohreaktion bei zwei Katzen mit Oligodendrogliomen.

Grundsätzlich sind die therapeutischen Probleme bei der Behandlung glialer Tumoren der Haustiere die gleichen wie in der Humanmedizin. Auch in der Veterinärmedizin gibt es Ansätze zur chemotherapeutischen Behandlung von Gliomen, wobei die meisten Berichte über Lomustin vorliegen. Die Resultate waren jedoch nicht zufrieden stellend und es waren keine Verlängerungen der Überlebenszeiten zu ermitteln (DOBSEN et al. 2003).

Die Diagnosestellung erfolgt beim Kleintier wie beim Menschen anhand der Darstellung mittels Computertomographie (CT) oder Magnetic Resonance Imaging (MRI). Eine Differenzierung der verschiedenen Gehirntumoren ist aber so aufgrund der allegorischen Ähnlichkeit vieler Gehirntumoren in der Regel nicht möglich (KRAFT et al. 1997, FUCHS et al. 2003).

(25)

Die prognostische und damit therapieentscheidende Bedeutung des Malignitätsgrades ist aber gerade bei intrakraniellen Neoplasien wie dem GBM aus klinischer Sicht immens. Eine diagnostische Option stellt die Färbung und lichtmikroskopische Darstellung von Zellausstrichen nach stereotaktisch platzierter Nadelbiopsie dar (FERNANDEZ et al. 1997). So stellten VERNAU et al. (2001) dar, dass sich das canine Glioblastom anhand seiner glomerulären Blutgefäßformation sowie anhand einer vermehrten Karyomegalie gut von den besser differenzierten Astrozytomen unterscheiden lässt. STOICA et al. (2004) entwickelten zudem immunhistochemische Untersuchungsmethoden zur Spezifizierung von Tumorbiopsien. So konnten sie in 84% der untersuchten Tiere positive Immunreaktionen des sauren Gliafaserproteins (GFAP, Glial fibrillary acidic protein) nachweisen. Außerdem konnten sie zeigen, dass sowohl das Tumorsupressorgen p53 als auch der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) reduziert waren.

NOLTE et al. konnten 2005 eine verbesserte MRI Darstellung intrakranieller Tumoren und ihrer Demarkation durch die Anwendung von superparamagnetischen Eisenoxiden (SPIO) als Kontrastmedien belegen.

Die singuläre Strahlentherapie von Gliomen bei Haustieren führt zu vergleichbaren Erfolgen wie die Tumorresektion. BREARLY et al. fanden 1999 in einer Studie mittlere Überlebenszeiten von 40 Wochen nach alleiniger Strahlentherapie und von 44 Wochen nach einer Kombination von Tumorresektion und Bestrahlung heraus.

Eine andere Studie (HEIDNER et al. 1991) ergab nur mittlere Überlebenszeiten von 20 Wochen nach strahlentherapeutischer Intervention. Im Vergleich zu den Therapieerfolgen beim Menschen sind die Verlängerungen der Überlebenszeit nach Behandlung beim Hund von einer auf bis zu 44 Wochen gravierend. Da aber in die zum Hund vorliegenden Retrospektivstudien nicht nur das Glioblastoma multiforme, sondern auch andere gliale Tumoren eingegangen sind, sind diese Daten nur bedingt vergleichbar.

(26)

2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell

Für ein geeignetes Tiermodell zur Induktion eines reproduzierbaren Tumors gibt es diverse Ansätze. Dabei wurden Gliomzellen, die zuvor in vitro kultiviert worden waren, als Zellsuspensionen oder auch zusammenhängende in vivo oder in vitro gezüchtete Tumorgewebe transplantiert. Besonderes Augenmerk liegt auf den Variablen wie der verwendeten Tierart, der Tumorzelllinie, der Menge der implantierten Gliomzellen, der Inokulationslokalisation sowie dem Behandlungsbeginn und der Applikationsmethodik der angewendeten Therapeutika.

IWADATE et al. (2005) injizierten Ratten 10⁵Gliomzellen der Zelllinie 9L 4 mm posterior und 3 mm lateral zur Kreuzungsstelle der Sutura interfrontalis und der Sutura sagittalis (Bregma) nach Bohrlochtrepanation mittels einer Mikroliterspritze mit einer 25-gauge Nadel direkt in das Parenchym der rechten Hemisphäre und starteten die folgende Behandlung per Injektion an denselben Koordinaten, nachdem der Tumor drei Tage gewachsen war.

In einem anderen Modell wurden Mäusen 5 x 10⁴ U87 Gliomzellen nach Schädeltrepanation intraparenchymal injiziert und acht Tage nach der Tumorinokulation mit einer intraperitonealen Endostatininjektion begonnen (SCHMIDT et al. 2004).

Für eine MRI (magnetic resonance imaging) Studie wurden Ratten C6-Gliomzellen intrakraniell implantiert (BEAUCHESNE et al. 2003). BEUTLER et al. (1999) verwendeten ebenfalls C6-Gliomzellen, implantierten diese aber subkutan in den Nacken von Ratten sowie auch von Mäusen, um ein Glioblastommodell zu entwickeln.

TSENG et al. (2004) implantierten Fischer-Ratten 10⁵ RT-2-Tumorzellen, in 10 µl Phosphatpuffer (PBS) suspendiert, subkutan in die rechte Flanke und starteten die Behandlung direkt im Anschluss beziehungsweise nach fünf Tagen, um ein Modell mit variablen Tumorgrößen zu entwerfen.

(27)

YANG et al. (2005) entwickelten ein reproduzierbares Tumormodell, indem sie die Zelllinie F98 aus CD-Fischerratten gewannen, nachdem sie diese mit N-ethyl-N- Nitroseharnstoff behandelt hatten, um die Entartung der Zellen auszulösen. Nach der in vitro Kultivierung der gewonnenen Zellen wurden jeweils 10³, 10⁴ und 10⁵ dieser zu CD-Fischer-Ratten syngenen Zellen stereotaktisch in den rechten Nucleus caudatus implantiert. DRUCKREY u. LANDSCHUTZ (1971) generierten auf dieselbe Weise zu BDIX-Ratten syngene BT4C-Gliomzellen. Die Syngenität dieser Zelllinie zu BDIX-Ratten wurde durch die Typisierung der MHC-Komplexe überprüft (BEUTLER et al. 1999).

Die Glioblastomzelllinie BT4C wurde häufig verwendet, um ein reproduzierbares Glioblastom in Ratten hervorzurufen. Sie wurden zur Entwicklung eines Gehirntumormodells erfolgreich per Injektionem nach Schädeltrepanation intraparenchymal beziehungsweise in das Corpus Callosum von weiblichen BDIX- Ratten implantiert (LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003).

READ et al. (2001a) injizierten mittels einer Mikroliterspritze 8 x 10³ BT4C Gliomzellen intraparenchymal in die rechte Gehirnhemisphäre. Gleichzeitig implantierten sie an derselben Stelle Endostatin produzierende „Bioreaktoren“, um deren Wirksamkeit zu untersuchen. In einer anderen Arbeit wurden C6-Gliomzellen verwendet, die als zusammenhängende Zellsphäroide auf Alginat nach der Gehirnpräparation direkt auf den Gehirnhemisphären platziert wurden (READ et al.

2001b).

(28)

2.3 Angiogenese 2.3.1 Einführung

Unter Angiogenese wird die von bereits bestehenden Gefäßen ausgehende kapillare Einsprossung in das umgebende Gewebe als Folge der Proliferation, Differenzierung und Migration von Endothelzellen verstanden. Diese Vorgänge sind im Körper streng reguliert und bewegen sich in einer feinen Balance (PEROULIS et al. 2002).

Im gesunden adulten Organismus überwiegen die die Gefäßbildung hemmenden Botenstoffe gegenüber der Konzentration der Aktivatoren. Bei einem proliferierenden Glioblastom ist dieses Gleichgewicht zu Gunsten der Angiogeneseförderer verschoben (O`REILLY et al. 1997). So synthetisieren Glioblastomzellen fünfzigmal mehr Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) als Zellen eines geringergradigen Astrozytoms (PLATE et al. 1993). Hinzu kommt, dass der Rezeptor für VEGF, KDR/Flk-1, der von Endothelzellen in gesundem Gehirngewebe regulär nicht exprimiert wird, von Tumorzellen in hohem Maße synthetisiert wird (PLATE et al.

1992). Ohne einen auslösenden Reiz haben Endothelzellen eine Teilungsrate von nur 0,01%, was bedeutet, dass sich eine Endothelzelle bei Durchlaufen eines normalen Zellzyklus nur ca. alle drei Jahre teilt. Erhöhte Teilungsraten findet man beispielsweise während der Reproduktionszyklen, der Schwangerschaft, bei Wundheilungsprozessen, im Zusammenhang mit der Retinopathia diabetica und beim Wachstum von Tumoren (ENGERMANN et al. 1967; HOBSON u. DENEKAMP 1984).

(29)

2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme

Bis zu einer Größe von 2 mm³ werden die sich teilenden Gliomzellen durch Diffusion aus der Umgebung und den Liquorfluß ausreichend versorgt. Proliferieren sie darüber hinaus, ist das Wachstum von da an angiogeneseabhängig. Sobald die morphologische Tumorbildung einmal begonnen hat, ist jede Zunahme der Zellpopulation auf die Zubildung von Blutgefäßen angewiesen (FOLKMAN 1990), wobei dann jede weitere Endothelzelle nach DHANABAI et al. (1999) rechnerisch das Wachstum von 50 bis 100 Gliomzellen ermöglicht. Diese Abhängigkeit des Tumorwachstums von der Entstehung neuer Blutgefäße wird auch durch die Abläufe bei der Bildung von Tumormetastasen verdeutlicht. Häufig können Fernmetastasen erst Monate oder Jahre nach der Operation des Primärtumors auftreten („tumor dormancy“). Vermutlich hängt dies damit zusammen, dass zwischen der Entstehung einer Mikrometastase und der Ausbildung von Kapillaren, die Voraussetzung für einen klinisch relevanten Tumorprogress ist, eine längere zeitliche Verzögerung liegt („angiogenic switch“) (HOSSFELD et al. 2001).

Das Ausmaß der Blutgefäßneubildungen und das Auftreten hypoxischer Bereiche sind direkt mit der Malignität und vor allem der schlechteren Prognose eines Tumors assoziiert. Die Untersuchung der Tumorvaskularisation ist eine Möglichkeit zur Abschätzung des Dysplasiegrades von Tumoren.

Werden Tumorzellen hypoxischem Stress ausgesetzt, so wird Hypoxia-Inducable- Factor-1 (HIF-1) aktiviert, der die Transkription verschiedener Gene promotet. Es werden Proteine sezerniert, die sich fördernd auf die Neovaskularisierung auswirken, darunter Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Glutaminasen (GLUTs) und glykolytische Enzyme (PLATE et al. 1992). Unter normalen Sauerstoffbedingungen und in gesundem Gewebe wird HIF-1 durch einen Proteasekomplex unterdrückt und es finden keine angiogenetischen Prozesse statt (LUO et al. 2006).

(30)

WESSELING et al. (1997) zeigten auf, dass in Glioblastomen ein Circulus vituosus entsteht. Die Versorgung mit Blutgefäßen ist nicht nur Bedingung für die Tumorproliferation. Eine erhöhte Vaskularisierungsdichte und die damit einhergehende Interaktion zwischen Gliomzellen und Endothelzellen sowie die erhöhte Nährstoffversorgung treiben die Gliomzellproliferation zudem voran. Diese Gliomzellen wiederum rekrutieren durch die HIF-1 Ausschüttung neue Blutgefäße.

LUSE zeigte bereits 1960 mittels Elektronenmikroskopie, dass sich auch der endotheliale Aufbau der Gefäßstrukturen im gesunden Gehirngewebe von denen diverser Gehirntumoren deutlich unterschied. So war sowohl die allgemeine Gefäßform anders strukturiert, wobei die Astrozytenendfüße durch Gliomzellen ersetzt waren, als auch eine vermehrte Extrazellularmatrix mit doppelter Basalmembran zu finden. Nachfolgende Studien zeigten ein verdünntes Endothel sowie vermehrte Vesikel und Fenestrierungen (HIRANO u. MATSUI 1975). Der kapillare Aufbau in einem Glioblastom ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

(31)

E

P

GZ EZM

EZM AE

BM

B A

L

L fE

P

Abbildung 1 Physiologische Struktur von Kapillaren (A) und Kapillaren im Glioblastom (B) modifiziert nach FISCHMANN (2004) Die Astrozytenendfüße (AE) sind im Tumor durch Gliomzellen (GZ) ersetzt. Die Extrazellulärmatrix (EZM) ist vermehrt und weist eine Trennung der Basalmembranen (BM) auf. Das Endothel (E) der Tumorgefäße ist schmal und fenestriert (fE). (L)= Lumen, (P)= Perizyt

2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese

Die Inhibition der Angiogenese bietet einen Ansatz zur Behandlung von Tumoren, Diabetes bedingter Nephropathie, Arthritis und Psoriasis, wohingegen die Stimulation der Angiogenese beispielsweise zur Therapie von Erkrankungen der Herzkranzgefäße, Herzversagen und bei Gewebeverletzungen eingesetzt wird (PANDYA et al. 2006).

Aus der direkten Beziehung zwischen Prognose des GBM und seiner Vaskularisierung ergibt sich die Hemmung der Blutgefäßneubildung als therapeutischer Ansatz zu seiner Behandlung.

(32)

Alle Angiogenesehemmer wirken, anders als beispielsweise Chemotherapeutika, fokussiert auf ihr Ziel, so dass sie aktiv gegen den Tumor, aber nicht toxisch gegenüber Zellen des gesunden Gewebes sind (FOLKMAN 2006).

Die bislang am besten untersuchten endogenen Angiogenesefaktoren sind endotheliale Wachstumsfaktoren wie VEGF, "Fibroblast Growth Factor" (FGF),

"Platelet-Derived Growth Factor" (PDGF), Angiogenin, Interleukin-8 (IL-8) und Proteine aus der Familie der Matrixmetalloproteinasen. Es werden ständig weitere an der Angiogenese beteiligte Faktoren und ihre Rezeptoren untersucht und damit einhergehend auch immer mehr antiangiogenetisch wirksame Moleküle. Dazu gehören vor allem die endogenen Faktoren Angiostatin, Endostatin, Thrombospondin-1 und -2, und chemische Verbindungen wie das Fumagillinanalogon AGM-1470 oder Inhibitoren der Matrixmetalloproteinasen wie TIMP-1 (KUNZ u. HARTMANN 2002).

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Medikamenten entwickelt, die spezifisch bestimmte Schritte der Neoangiogenese blockieren sollten. Die Angiogeneseinhibitoren, die zurzeit klinisch getestet werden, lassen sich in vier Klassen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen aufteilen (HOSSFELD et al.

2001):

1) Matrixmetalloprotease-Inhibitoren 2) Inhibitoren für Endothelzellen

3) Inhibitoren der pro-angiogenetischen Faktoren 4) Integrinantagonisten

Derzeit sind 28 endogene Angiogeneseinhibitoren bekannt, wobei Endostatin der erste ist, der als Fragment der Extrazellulärmatrix identifiziert wurde. Die ersten Angiogeneseinhibitoren sind von der Food and Drug Administration (FDA) in den USA und 28 Nationen für die Tumortherapie zugelassen worden (FOLKMAN 2006).

Für Endostatin gibt es noch keine Zulassung in den USA und in Europa. Einen Überblick gibt die Tabelle 2.

(33)

2 Literaturübersicht 21 Tabelle 2 Von der FDA zugelassene Angiogeneseinhibitoren

Angiogenesis inhibitors approved by the FDA in the U.S. and in 28 other countries including endostatin (China) and Macugen (U.S. and Brazil)

Date approved Drug Place Disease

December 2003 Thalidomide Australia Multiple myeloma

February 2004 Avastin U.S. (FDA) Colorectal cancer

November 2004 Tarceva U.S. (FDA) Lung cancer

December 2004 Avastin Switzerland Colorectal cancer

December 2004 Macugen U.S. (FDA) Macular degeneration

January 2005 Avastin European Union (25 countries) Colorectal cancer September 2005 Endostatin (Endostar) China (SFDA) Lung cancer

aus: FOLKMAN (2006) 2.4 Endostatin

2.4.1 Einführung

Die Struktur des antiangiogenen Peptids Endostatin entsteht als Spaltprodukt der C- terminalen, als „Non-Collagenous“ bezeichneten Domäne des Kollagen XVIII.

Ähnlich wie für Kollagen XVIII selbst (REHN et al. 1996) sind für Endostatin verschiedene Varianten mit unterschiedlichen N-Termini und Längen beschrieben worden (SASAKI et al. 1998). Zudem bestehen Unterschiede zwischen humanem Endostatin und dem anderer Spezies. Die humanen Endostatinformen sind zum Beispiel 12 Aminosäuren kürzer beziehungsweise 4, 9 und 14 Aminosäuren länger als die murinen Endostatine (STÄNDKER et al. 1997, FELBOR et al. 2000). Aus dieser Beobachtung lässt sich schließen, dass an unterschiedlichen Produktionsorten und in verschiedenen Geweben wahrscheinlich unterschiedliche Endostatinformen hergestellt werden, die eventuell differierende antiangiogenetische Potenz haben. Die Genkarten für humanes Endostatin (COL18A1) als Spaltprodukt von Kollagen, Typ XVIII, alpha 1, die Ratte (Rattus norvegicus, Col18a1; collagen, type XVIII, alpha 1), Mausendostatin (Mus musculus, Col18a1; procollagen, type XVIII, alpha 1), Hühnerendostatin (Gallus gallus, COL18A1; collagen, type XVIII, alpha 1), den Zebrafisch (Danio rerio, AJ494837), die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster, CG331711; CG33171-PE, isoform E) und den Hund (Canis lupus f.

familiaris, LOC4747781, similar to Collagen alpha 1(XV) chain precursor) liegen vor.

(34)

Für die Katze wurden das entsprechende Gen und Protein noch nicht beschrieben.

Die Sequenzhomologie zwischen humanem und caninem Endostatin beträgt 83.76%

auf Nukleinsäureebene beziehungsweise 82.27% auf Aminosäureebene (WEIZMANN 2006). KAMSTOCK et al. (2006) infundierten Hunden mit Weichteilsarkomen canine Endostatin DNA, um seine Tumor supprimierende Wirkung zu untersuchen. Es wird vor allem in lymphoidem, konnektivem und epithelialem Gewebe, der Nebenniere, dem Pankreas und der Niere sezerniert.

(MARNEROS, A. G. u. B. R. OLSEN 2005). Die strukturellen Unterschiede ermöglichen eine Antikörper vermittelte Differenzierung und damit den immunhistologischen Nachweis speziesverschiedener Endostatine (LI, et al. 2005).

So verwendeten ROSSMEISL et al. (2002) einen polyklonalen Kaninchen Antikörper gegen rekombinantes canines Endostatin in einem enzymatischen Immunoassay (EIA) zur Detektion der Endostatinkonzentration im Serum von an malignen Neoplasien erkrankten Hunden.

Endostatin entsteht, indem es durch Pankreas-Elastase und Cathepsin L proteolytisch aus der Non-Collagenous 1-Domäne des Kollagen XVIII, welches als Gerüsteiweiß hauptsächlich in perivaskulären Membranen zu finden ist, abgespaltet wird (WEN et al. 1999, FELBOR et al. 2000). Das entstehende Peptid ist 22 kD schwer. In Abbildung 2 ist Kollagen mit seiner Endostatinendung schematisch dargestellt.

Über die Halbwertszeit von Endostatin sind in der Literatur unterschiedliche Angaben zu finden. So findet sich bei JOKI et al. (2000) die Angabe, nach 7 Stunden sei die Hälfte des Proteins abgebaut. BJERKVIG et al. (2003) sprechen von 10,7 Stunden.

(35)

Abbildung 2 Schematische Darstellung der Endostatinsynthese aus Kollagen XVIII

Cathepsin L und Pankreas-Elastase spalten Endostatin aus der Non- Collagenous Domäne-1 des Kollagen XVIII proteolytisch ab.

2.4.2 Wirkungen

Nach wie vor ist der antiangiogene Wirkungsmechanismus des Endostatins nicht vollständig geklärt. Es wirkt sich auf ein sehr breites Spektrum an Angriffspunkten im Zusammenhang mit der Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose von neovaskulären Endothelzellen aus. Außerdem beeinflusst es sowohl die Verbindung zwischen den Endothelzellen und der umgebenden Matrix als auch den zytoskelettären Aufbau der Zellen selbst (DIXELIUS et al. 2002; KEEZER et al.

2003). KIM et al. zeigten 2002 auf, dass Endostatin an KDR/Flk-1, den Rezeptor des VEGFs, bindet. Durch diese Bindung interagiert es mit der Signaltransduktion des VEGF, indem es die VEGF induzierte Phosphorylierung der Kinase (Erk1/2) reduziert und somit die nachfolgenden Angiogenese induzierenden intrazellulären Schritte blockiert (PETERSEN et al. 2005, GETMANOVA et al. 2006).

Zusätzlich interagiert es mit den a5- und aV-Integrinen und die daraus folgende Angiogenese hemmende Wirkung besteht eventuell in einem sich negativ auf die Endothelzellproliferation auswirkenden antiadhäsiven Mechanismus (REHN et al.

2001, SUDHAKAR et al. 2003).

Non- Collagenous Domäne-1

Endostatin --Elastase Pankreas

Proteolyse Cathepsin L Cathepsin L

Proteolyse Kollagen XVIII

Non-Collagenous-Domäne-1 Pankreas Elastase

(36)

Nach DHANABEI et al. (1999) hat Endostatin zudem eine damit einhergehende Endothelzell-Apoptose fördernde Wirkung, für die die verminderte Expression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-XI verantwortlich gemacht wird.

Außerdem bindet Endostatin an Heparin und auch an Heparansulfate. Für den endothelzellaktivierenden Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) dienen Heparansulfate als Korezeptoren. Daraus folgernd wurde eine kompetitive Hemmung der Wachstumsfaktor-Korezeptoren durch Endostatin diskutiert (SASAKI et al. 1999).

Weiterhin ist Glypikan, ein Proteoglycan der Zellmembranen und Migrationsvermittler, als Heparinase sensibler Rezeptor für Endostatin beschrieben worden. Durch die Bindung von Endostatin vermittelt er eine antiapoptotische Signalkaskade (HAGIHARA et al. 2001, KARUMANCHI et al. 2001).

Endostatin moduliert zudem sowohl die Expression als auch die Präsentation von Plasminogen-Aktivatoren und auch deren Inhibitoren auf der Oberfläche von Endothelzellen (WICKSTRÖM et al. 2001).

Da Endostatin die katalytische Aktivität der Matrixmetalloproteinasen 1 und 2 reguliert, könnte es auch über die veränderte proteolytische Potenz der Endothelzellen selber antiangiogene Wirkung haben (KIM et al. 2000). Hinzu kommt, dass Endostatin sowie auch Angiostatin den intrazellulären Kalziumgehalt der Endothelzellen erhöhen und auf diese Weise die Signalkaskaden angiogener Faktoren beeinträchtigen können (JIANG et al. 2001).

Caspase-8 ist ein zentrales Apoptose auslösendes Protein. Die Proteinkinase-B (PKB) wirkt regulierend auf diesen Apoptosemechanismus. Endostatin wiederum blockiert die PKB und hebt somit die zellschützende Wirkung auf (SKURK et al., 2004, KANG et al. 2006).

VEGF wirkt auf endotheliale Stickstoffoxidsynthasen (eNOS), die wiederum eine Zellmigration induzieren, indem es Serotonin 1177 phosphoryliert. Endostatin führt zu einer Dephosphorylierung an Serotonin 1177 und wirkt so der VEGF vermittelten Endothelzellaktivierung entgegen (URBICH et al. 2002).

(37)

Morphologisch zeigt sich die Wirkung von Endostatin auf die Struktur von Tumorblutgefäßen, wobei sowohl die Gefäßdichte als auch der Durchmesser der einzelnen Gefäße verringert wird, was dann zu einer Beeinträchtigung der funktionellen Gefäßversorgung führt (BJERKVIG et al. 2003).

Vorteil der antiproliferativen Wirkung des Endostatins ist, dass es ausschließlich auf neovaskuläre Endothelzellen abzielt (OU-YANG et al. 2006) und so eine weitgehend nebenwirkungsfreie Therapie möglich macht, da bereits ausgereifte Gefäße nicht beeinträchtigt werden. Einen Überblick verschafft Abbildung 3 auf Seite 26.

(38)

Erk 1/2

Abbildung 3 Schematisierte Darstellung der Wirkungsweise von Endostatin Endostatin antagonisiert die Neoangiogenese in Tumoren (A) Es blockiert die Bindung von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) an seinen Rezeptor KDR/Flk-1 (B), wirkt Apoptose fördernd in dem es den PKB (Proteinkinase B) (E) und den Bcl-2 und Bcl-XI (C) vermittelten Zellschutz aufhebt. Durch Blockade des Korezeptors Heparansulfat (D) verhindert es die Endothelzellaktivierung durch bFGF (basic Fibroblast Growth Factor). Es verhindert die Phosphorylierung an Serotonin1177 und so die eNOS (endotheliale Stickstoffoxidsynthase vermittelte Zellmigration (F). Bild A aus: http://www.cancerchoices.com/7facts-angiogenesis.htm (08/2006)

(39)

2.4.3 Therapeutischer Einsatz

ABDOLLAHI et al. (2003) zeigten den antiproliferativen Effekt von Endostatin auf humane Endothelzellen in vitro. Endostatin wirkte sich vermindernd auf die Überlebensrate des Endothelzellklons (clonogenic survival) aus, steigerte die Apoptoserate, reduzierte die Migrations- und Invasionsrate sowie die Bildung von strukturierten Blutgefäßen. Weiterhin wurde im Tierversuch gezeigt, dass das Tumorwachstum nach täglicher subkutaner (s.c.) Endostatingabe verzögert war.

Versuche in Mäusen mit humanen Glioblastomimplantaten, denen sowohl Gene für einen VEGF-Rezeptor als auch ein Angiostatin-Endostatin-Fusionsgen transferiert wurden, zeigten sowohl eine deutliche Tumorreduktion als auch eine Abnahme in der Vaskularisierungsdichte und verlängerte Überlebenszeiten (OHLFEST et al. 2005).

Zur Gentransfektion wurde ein so genanntes „sleeping-beauty“-Transposon verwendet, welches während der G1-Phase des Zellzyklus mitsamt der zu transferierenden Sequenzen selbständig in die DNA eindringt.

Die starke Vaskularisierung von Tumoren geht mit einer Suppression der endothelialen Adhäsionsmoleküle einher, aus der eine reduzierte Interaktion zwischen Leukozyten und Blutgefäßwänden folgt. Die daraus folgende Anergie der Endothelzellen gegenüber vielen Immunotherapien und Anti-Tumor-Vakzinationen wurde durch die gleichzeitige Gabe von Endostatin umgangen und es wurden vermehrte Leukozyteninteraktionen als Reaktion auf die primären Therapeutika gezeigt (DIRKX et al. 2006).

Synthetisch hergestellte Endostatinfragmente wurden in einem Endometriose- Mausmodell untersucht und es zeigte sich eine deutliche Abnahme der endometrialen Läsionen ohne eine Unterdrückung des normalen Zyklus und ohne einhergehende toxische Wirkungen (BECKER et al. 2006a).

(40)

Anhand eines Mausmodells untersuchten SUZAKI et al. (2005) den therapeutischen Einsatz von Endostatin zur Behandlung von Asthma. Die Behandlung mit Endostatin verminderte die durch Ovalbumin erhöhte Ansprechbarkeit der Atemwege, die pulmonale allergische Inflammation und die Produktion spezifischer IgE-Antikörper sowie Entzündungsmediatoren.

Ein Kolontumormodell in der Ratte zeigte hingegen zwar verlängerte Überlebenszeiten der oral mit Endostatin behandelten Tiere, aber keine signifikante Tumorreduktion oder Verringerung der Metastasierungsrate der Primärtumoren (LI u.

LI 2005).

LI et al. (2006) untersuchten die Tumor supprimierende Wirkung von Endostatin auf das nasopharyngeale Karzinom, indem sie ein Adenovirus als Träger des Endostatingens verwendeten. Sie konnten sowohl in der Zellkultur als auch in vivo einen Tumorzellrückgang aufzeigen.

Zur Therapie renaler Strukturveränderungen, die mit dem Diabetes mellitus Typ 1 einhergehen, wurde Endostatin an einem murinen Nephropathiemodell untersucht.

Es zeigten sich deutlich geringere Hyperplasien der glomerulären Strukturen und eine generelle Verringerung der Läsionen der Nieren im Vergleich zur Kontrollgruppe (ICHINOSE et al. 2005).

In einem Glioblastommodell konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Infusion von Endostatin wesentlich effektiver war als eine systemische (intraperitoneale) Applikation. Während die systemische Therapie mit Endostatin kaum einen Effekt hatte, konnte bei lokaler Infusion von 10-fach niedrigeren Mengen an Endostatin eine Hemmung des Tumorwachstums von ca. 75% erreicht werden (SCHMIDT et al.

2004). FOLKMAN (2006) sprach von der Ebnung des Weges für die Angiogenesehemmer in die klinische Anwendung nach drei Jahrzehnten Forschungsarbeit durch die Entwicklung lokaler Applikationsmethoden.

(41)

2.5 Mikrokapseln zur intrazerebralen Gliomtherapie 2.5.1 Einführung

Die systemische Behandlung von Neoplasien im Gehirn mittels antitumoröser Wirkstoffe wie Chemotherapeutika oder antiangiogener Proteine wird auf Grund der Abschirmung des Gehirns durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) erschwert. Ihre geringe passive Permeabilität und das hoch selektive Transportsystem wirkten beim Einsatz therapeutischer Moleküle zur Behandlung zerebraler Erkrankungen stark limitierend (BOBO et al. 1994, EMERICH u. SALZBERG 2001). Hinzu kommt, dass Wirkstoffe nach systemischer Applikation und Überwinden der BHS einen großen interstitiellen, parenchymalen Druck überwinden müssen, um die Tumorzellen zu erreichen (KIRSCH et al. 2000b). In Konzentrationen, die bei systemischer Behandlung verabreicht werden müssten, um eine ausreichend hohe Dosis am Zielort zu erreichen, wäre mit erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen (JAIN 1991, MEYERS et al. 1992).

Um eine auf antiangiogenen Mechanismen beruhende Gliom supprimierende Wirkung zu erzielen, bedarf es hoher Konzentrationen eines potenten Angiogeneseinhibitors über einen langen Zeitraum am Zielort (FOLKMAN 1995).

Bedingt durch die nur kurze biologische Halbwertszeit von Endostatin, die Barrierefunktion der BHS sowie durch den verminderten Blutfluss innerhalb der zentralen Tumorregionen ist die Applikationsform von wesentlicher Bedeutung. Eine systemische Glioblastombehandlung ist dem zu Folge nur sehr begrenzt möglich und es wird vermehrt nach Optionen für die lokale Wirkstoffverabreichung gesucht.

SIPOS u. BREM (2000) beschrieben das GBM für die Anwendung direkt lokaler Therapien als sehr gut geeignet, da die Metastasierungsrate gering ist und die Tumoren an nur einer Lokalisationsstelle verbleiben.

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Um die BHS wirkungsvoll zu umgehen, war ein Lösungsansatz die direkte zerebrale Injektion von Wirkstoffen in den Tumor, das umgebende Gewebe oder in das Liquorsystem mittels Medikamentenpumpen. Hierbei zeigten sich aber sowohl die Dosierung als auch die Stabilität der Proteine problematisch.

Hinzu kamen entzündliche Gewebsreaktionen sowie Infektionen des Gehirns als Reaktion auf die sich dauerhaft im Gewebe befindenden Anteile der Apparaturen (TSENG u. AEBISCHER 2000).

Um diese Probleme zu überwinden, haben verschiedene auf lokalen Applikationsmethoden basierende Ansätze experimentelle Anwendung gefunden, dabei kamen gentherapeutische Vektoren (GRISCELLI et al. 1998, MA et al. 2002), aber auch auf Zellen basierende Transplantate (JOKI et al. 2001, READ et al. 2001) zum Einsatz. Verschiedene Projekte zur lokalen Tumorbehandlung unter Anwendung von Angiostatin oder Endostatin haben eine signifikante Inhibition des Tumorwachstums aufgezeigt (TANAKA et al. 1998, DE BOUARD et al. 2002). Es wurde mit zwei verschiedenen Implantatmodellen gearbeitet, zum einen mit Makrokapseln wie zum Beispiel Hohlfaserkapseln und Diffusionskammern und zum anderen mit Mikrokapseln. Die Implantation von Makrokapseln führte zu sowohl chirurgischen Problemen auf Grund ihrer Größe als auch zu starken Abwehrreaktionen bei den Empfängern. Hinzu kamen durch lange Diffusionsstrecken bedingte Nekrotisierungen des implantierten Gewebes und das Versagen der Implantate (KUHTREIBER et al. 1999). Unter Mikrokapseln versteht man die Einbettung von Zellen in eine auf Hydrogelen, zum Beispiel Alginat, basierende Matrix.

Mikrokapseln haben ein sehr viel vorteilhafteres Oberflächen-Volumen-Verhältnis, erlauben eine definierte Bestimmung ihrer Permeabilität und garantieren so eine ausreichende Versorgung der von ihnen beinhalteten Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff. Ebenso können von den implantierten Zellen sezernierte Proteine durch die Alginathülle dauerhaft und definiert in das umliegende Gewebe diffundieren.

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Die für die Bestandteile des Immunsystems nicht durchdringbare Hülle schützt zudem die Implantate vor der Immunabwehr des Wirtes, so dass auch xenogene Transplantationen ohne Wirtsabstoßung möglich sind. Die geringe Größe der Mikrokapseln, die unter 1000 µm Durchmesser liegt, ermöglicht außerdem die minimalinvasive Implantation gleich mehrerer Kapseln selbst in kleinste Räume wie zum Beispiel die Muskulatur oder das Gehirnparenchym.

Auf Grund ihres Aufbaus aus lebenden, dauerhaft Wirkstoff sezernierenden Zellen in einer umgebenden permeablen Matrix werden diese Kapseln auch als „Bioreaktoren“

bezeichnet.

Neben verkapselten Gewebeanteilen wie pankreatischen Inselzellen, die zur Behandlung von Diabetes mellitus Typ 1 transplantiert wurden, kamen bisher 3 Kategorien von Zellen zum Einsatz (EMERICH u. SALZBERG 2001):

Postmitotische Zellen wie adrenerge chromaffine Zellen wurden zur chronischen Schmerzbehandlung eingesetzt (BUCHSER et al. 1997). Außerdem wurden immortalisierte Zellen, zum Beispiel Dopamin sezernierende PC12-Zellen, zur Therapie der Parkinsonerkrankung verwendet (AEBISCHER et al. 1991).

Einen neuen Ansatz stellt die Verwendung gentechnisch so modifizierter Zellen dar, dass sie ein bestimmtes Protein gezielt sezernieren („cell engineering“). Hier spricht man auch von somatischer ex vivo Gentherapie, die im Unterschied zur in vivo Gentherapie, bei der genetisches Material direkt in das Patientengewebe transplantiert wird, eine genetische Insertion der Zellen in vitro und eine nachfolgende Verkapselung vor der Implantation in den Patienten beinhaltet.

Hierfür werden in der Regel modifizierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) verwendet. Stammzellen sind am Anfang der Entwicklung stehende, nicht ausdifferenzierte und noch zur Autoreproduktion befähigte Zellgruppen, die je nach Gewebezugehörigkeit unterschieden werden in embryonale (ES), germinale, hämatopoetische, somatische, epitheliale und mesenchymale Stammzellen (MSC).

Nach ihren Eigenschaften werden sie in pluripotente Zellen, zu denen die ES gehören, multipotente Zellen wie die MSC und in unipotente Zellen, zu denen auch die hämatopoetischen Stammzellen gehören, eingeteilt.

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Humane mesenchymale Stammzellen sind undifferenzierte Vorläuferzellen, die zur Rekonstruktion von Geweben mesenchymalen Ursprungs eingesetzt werden können und die das Muttergewebe von Binde- und Stützgewebe, glatter Muskulatur sowie von Skelett- und Herzmuskel darstellen. Sie sind durch ihre fibroblastenartige Morphologie, adhärentes Wachstum und ihr Potenzial, in Adipozyten, Osteoblasten, Myozyten und Chondrozyten zu differenzieren, gekennzeichnet.

MSC können durch einen einfachen chirurgischen Eingriff gewonnen werden. Hierbei wird der Beckenkamm des Spenders punktiert und Knochenmark entnommen. Nach einem von FRIDENSHTEIN (1982) etablierten Verfahren können hMSC aus Knochenmarkaspiraten isoliert und expandiert werden. Dazu werden die mononukleären Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und die mesenchymalen Stammzellen über Plastikadhärenz selektioniert, indem die mobilen hämatopoetischen Stammzellen durch mehrmaliges Entfernen des Kulturmediums herunter gewaschen werden. (AURICH et al. 2006).

Durch Genmodifizierung verändert lassen sich hMSC zur Behandlung von Gehirngewebsschädigungen wie zum Beispiel bei Hirninfarkten oder Schädel-Hirn- Traumata und auch zur Bekämpfung hirneigener Neoplasien einsetzen. So zeigten sie eine deutliche inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Gliomzellen, die durch die Genmodifikation bedingte Sekretion therapeutischer Zytokine noch gesteigert wurde (HAMADA et al. 2005).

Werden hMSC durch die humane Telomerase reverse Transkriptase (hTERT), welche der bestimmende Faktor der enzymatischen Aktivität der humanen Telomerasen ist, modifiziert, so erreicht man eine „sanfte“ Immortalisierung der Zellen. Es entsteht eine permanente Zelllinie, ohne dass diese eine onkologische und damit unkontrollierbare Proliferationsaktivität entwickeln. Auf diese Weise wurde eine Zelllinie mit weitgehend normalen Zellverhältnissen geschaffen, deren Proliferation nach der Verkapselung mit Alginat nach ein bis zwei Zellteilungen zum Erliegen kommt. Diese hTERT-MSC sind unendlich klonierbar und überlebensfähig ohne in einer Alginatmatrix durch anhaltende Proliferation die Integrität der Kapsel zu zerstören. (HORIKAWA u. BARRETT 2003).

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Die in dieser Arbeit verwendeten, mit der hTERT versehenen hMSC waren morphologisch identisch mit den primären hMSC und exprimierten Oberflächenantigene, einschließlich CD105, CD 73 und CD166. Die hTERT-MSC zeigten in vitro eine ähnliche Teilungsrate wie unveränderte mesenchymale Stammzellen und teilten sich bis zu einer Proliferationsdichte von über 80 Verdoppelungen der Population (KOBUNE et al. 2003).

2.5.2 Verkapselungsmaterial: Alginat

Ein ideales Glioblastomtherapeutikum muss prädiktiv im Hinblick auf das Tumoransprechen und gleichzeitig nicht toxisch für das gesunde Gehirngewebe sein (HOFER et al. 2002). Dementsprechend musste ein Implantat entwickelt werden, welches eine kontinuierliche, lokale, hoch konzentrierte Wirkstofffreisetzung garantierte, ohne zu Abstoßungsreaktionen oder Entzündungen zu führen. Um die Ausgangsbasis für eine solche Applikationsform zu schaffen, sind in den letzten Jahren eine große Anzahl von Mikrokapseln aus den verschiedensten Materialien (Alginat, Agar, Agarose und synthetischen Polymeren) entwickelt und getestet worden (DULIEU et al. 1999).

Alginat ist ein wasserlösliches Salz der Alginsäure, welches als natürliches Polysaccharid aus marinen Braunalgen, wie Laminaria, Ecklonia, Macrocystis, Lessonia, Ascophylum und Durvillea extrahiert wird. Es besteht aus zwei Uronsäuren, β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G), die über 1,4 Bindungen verknüpft sind. Der strukturelle Polymeraufbau wird durch drei Sequenzblöcke bestimmt, die entweder homopolymer als M-M- oder G-G-Blöcke oder heteropolymer als M-G-Blöcke vorliegen. Werden dem Alginat mono- oder divalente Kationen zugesetzt, so kommt es zu Quervernetzungen der Polymere. Bei der Verwendung divalenter Kationen außer Magnesium (Mg²⁺) bildet sich ein dreidimensionales Netzwerk (GIUNCHEDI et al. 2000). Eine Darstellung des strukturellen Aufbaus ist in der Abbildung 4 einzusehen.