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Stimulation des Herzens mit fokussiertem Ultraschall

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Academic year: 2022

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Direktor Prof. Dr. med. H. Drexler

Stimulation des Herzens mit fokussiertem Ultraschall

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin vorgelegt von Jens Pirr aus Bersenbrück

Gefördert vom Innovationswettbewerb Medizintechnologie des BMBF Förderkennzeichen: O1EZ0202

Hannover, 2007

(2)

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 10.04.2007

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. med. Bitter Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. M. Niehaus Referent: Prof. Dr. med. Jörg Bleck Korreferent: Prof. Dr. med. Claus Bossaller

Tag der mündlichen Prüfung: 10.04.2007

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Hermann Haller Prof. Dr. Klaus Otto Prof Dr. Rainer Nustede

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Meinen Eltern gewidmet

(4)

Mein besonderer Dank gilt:

• Herrn Professor Dr. med. M. Niehaus für die freundliche Überlassung des Themas und die engagierte Förderung dieser Arbeit.

• Herrn Professor Dr. rer. nat. O. Eick für die Unterstützung bei den Laborarbeiten.

• Herrn Dr. med. G. Klein für die kritische Beratung bei Fragestellungen aller Art.

• Meinen Eltern, Manfred und Doris Pirr, für die liebevolle, uneingeschränkte Unterstützung in 29 Jahren.

• Mein größter Dank gilt meiner Lebensgefährtin Sabine Baeßler, die mich stets motivieren konnte, viel Geduld mit mir aufgebracht hat und mein Leben so bereichert.

• Meinen Freunden Julia Donnerberg und Dr. med. J. Dingemann

• Herrn Professor Dr. med. H. Drexler für die Förderung der Promotion

(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 08

1.1 Fragestellung 08

1.2 Historie der Ultraschalltechnologie 11

1.3 Historie der Schrittmachertechnologie 15

2 Material und Methoden 21

2.1 Vorversuch im Akutexperiment 21

2.1.1 Material 21

2.1.1.1 Technisches Material für die Ultraschallstimulation 21

2.1.1.1.1 Technische Daten 22

2.1.2 Methoden 25

2.2 Beating heart-Modell modifiziert nach Langendorff 26

2.2.1 Material 26

2.2.1.1 System 26

2.2.1.2 Schweineherz-Präparate 27

2.2.1.3 Aufbau der Perfusionsapparatur 27

2.2.1.3.1 Blutkreislauf 29

2.2.1.3.2 Dialysatkreislauf 30

2.2.1.3.3 Wärmekreislauf 30

2.2.1.4 Komponenten 31

(6)

2.2.1.5 Verwendete Lösungen 32

2.2.1.5.1 Dialysat 33

2.2.1.5.2 Kardioplegielösung 33

2.2.1.5.3 Natriumcitratlösung 34

2.2.1.6 Chemische Substanzen 34

2.2.1.7 Blutgasanalyse und Oxymetrie 35

2.2.1.8 Atraumatische Messung des Gewebs-pO2 im Myokard 35

2.2.1.9 Defibrillator und Schrittmacher 36

2.2.1.10 Equipment für die EKG-Messung 37

2.2.2 Methoden 38

2.2.2.1 Vorbereitung der Perfusionslösung 38

2.2.2.2 Organpräparation 38

2.2.2.3 Monitoring 43

2.2.2.4 Ultraschallstimulation 44

2.2.2.5 Temperaturmessungen 44

2.2.2.6 Datenanalyse 45

3 Ergebnisse 46

3.1 Ergebnisse des Akutexperiments in vivo 46

3.2 Ergebnisse des Beating-heart-Versuchsaufbaus (in-vitro) 47

3.2.1 Relevante Laborparameter 52

3.2.2 Tabellarische Darstellung der notwendigen Applikationen und 55 Organparameter

3.2.3 Ergebnis der Temperaturmessungen 59

(7)

3.2.4 Makroskopische und histologische Untersuchung 67

3.2.4.1 Makroskopische Analyse 67

3.2.4.2 Mikroskopische Analyse 67

4 Diskussion 73

4.1. Stimulation mit fokussierten Ultraschallpulsen 74

4.2 Temperatureffekte 76

4.3. Effekte auf die feingewebliche Struktur des Myokards 78

4.4 Limitationen 79

4.5 Ausblick 80

5 Zusammenfassung 82

6 Anhang 84

7 Literaturverzeichnis 88

(8)

1 Einleitung

1.1 Fragestellung

Dass Muskelzellen elektrisch erregbar sind, wurde erstmals im späten achtzehnten Jahrhundert beschrieben. So zeigte Luigi Galvini im Jahr 1790, dass sich das Bein eines toten Frosches durch elektrische Stimulation zur Kontraktion anregen lässt und veröffentlichte diese Beobachtung in seiner Arbeit „De viribus electricitatis in motu musculari“ (Abb.1). Diese Entdeckung stellt bis heute die Grundlage für die Entwicklung von elektrischen Stimulationsgeräten für das Herz dar.

Abb. 1: Deckblatt der Dissertation Luigi Galvanis „De viribus electricitatis in motu musculari“

(9)

Abb. 2: Luigi Galvini regt ein Froschbein zur Kontraktion an (1790) Aus: De Viribus Electricitatis in Motu Musculari Commentarius

1957 wurde der erste mobile batteriebetriebene Herzschrittmacher vorgestellt. 1960 implantierte man den ersten permanenten Herzschrittmacher.

Seither wurde diese Technologie ständig verbessert, so dass die Implantation eines Herzschrittmachers heute die Therapie der Wahl bei rezidivierenden symptomatischen Bradyarrythmien (langsame Herzfrequenz <50/min mit Schwindel oder Synkopen) darstellt.

Moderne Schrittmachersysteme (Abb.5, S. 15) bestehen aus einem Gehäuse, welches die Schrittmacherelektronik und die Batterie enthält, sowie einer Schrittmacherelektrode, die meist über die Vena subclavia in das rechte Herz vorgeschoben und dort je nach Indikation in das Vorhofmyokard geschraubt oder im Apex des rechten Ventrikels dauerhaft verankert wird (Abb.3, S. 9 sowie Abb.9, S.

19). Über diese Elektrode kann bei Bedarf oder in regelmäßigen Abständen ein elektrischer Impuls abgegeben werden, welcher zu einer Depolarisation und Kontraktion des Arbeitsmyokards führt.

(10)

Neben der permanenten Stimulation kann in bestimmten Situationen eine notfallmäßige Stimulationstherapie erforderlich werden. Hierzu ist die Anlage einer passageren Schrittmachersonde vonnöten, was vor allem außerhalb entsprechend ausgerüsteter klinischer Einrichtungen schwierig sein kann. Eine externe Stimulation ist aufgrund der erheblichen Schmerzen durch die Stimulationsimpulse nur unter Narkose möglich.

Neben der elektrischen Stimulation kann das Myokard auch durch mechanische Reize zur Kontraktion angeregt werden. So zeigten Dalecki et al. 1993 [1], dass durch die Applikation von fokussierten Ultraschallpulsen am Herzen des Frosches regelmäßige ventrikuläre Extrasystolen induziert werden können. Die Stimulation eines Säugetierherzens mit Ultraschallpulsen wurde bislang noch nicht beschrieben.

Da Schallwellen im Gegensatz zur elektrischen Energie an jede beliebige Lokalisation des Körpers fokussiert werden können, erscheint eine Stimulation des Herzens von außen mittels Ultraschall denkbar. Daher untersucht diese Arbeit die Effekte von hochintensiven Ultraschallpulsen auf das Herz als eine potentiell neue Methode für kontaktfreie und nichtinvasive kardiale Stimulation.

Abb. 3: Schemazeichnung der Schrittmacher- und Elektrodenlage Aus: Internetportal der U.S.

National library of medicine

(11)

1.2 Historie der Ultraschall-Technologie

Obwohl der Ultraschall bereits im frühen neunzehnten Jahrhundert entdeckt wurde, hat seine Verwendung in der Medizin eine vergleichsweise kurze Geschichte.

Die ursprüngliche Nutzung beschränkte sich als SONAR (Sound Navigation And Ranging) fast ausschließlich auf militärische Anwendungen. Bereits im Jahre 1877 beschrieb J. W. Strutt die Grundlagen, auf denen die heutige Ultraschalltechnologie basiert [2].

Vorläufer der SONAR-Forschung gehen zurück bis in das Jahr 1838. Damals versuchte Bonnycastle, den Grund des Ozeans per Schall zu vermessen, um damit die Verlegung von Telegraphenverbindungen und die Schiffsnavigation zu erleichtern [3].

Die medizinische Fachwelt wurde erstmals Ende der 30er Jahre des 20.

Jahrhunderts auf den Ultraschall aufmerksam. Die Brüder Karl Theodor und Friederich Dussik verwendeten Ultraschall in der Neuropathologie [4 ,5]. Sie setzten einen 1,5 MHz –Transmitter ein, um sogenannte „Hyperphonogramme“, Areale verminderter Schalldurchlässigkeit, darzustellen. Aufgrund der von Dussik entdeckten unterschiedlichen Schalleigenschaften von tumorösem und gesundem Gewebe formulierten sie die Hypothese, dass man mittels Ultraschall Hirntumore diagnostizieren kann. Diese Theorie wurde 1952 von Guttner widerlegt, der zeigen konnte, dass die von den Dussiks entdeckten Schallunterschiede auf wechselnde Knochendichten und nicht auf tumoröses Gewebe zurückzuführen waren [6]. 1944 Lynn und Putnam untersuchten 1944 die Nebenwirkungen von Ultraschallapplikation auf das Gehirn [7] und konnten erhebliche Effekte von temporärer Blindheit bis hin zum Tod der Versuchstiere zeigen. Die zerstörende Wirkung von intensivem

(12)

Ultraschall wurde in dieser Zeit noch von anderen Autoren beschrieben, so dass Ultraschall als neurodiagnostisches Instrument untauglich erschien [5].

Ludwig et al. berichteten erstmals über den diagnostischen Nutzen der Impuls-Echo- Technik zur Differenzierung unterschiedlicher Gewebetypen [8]. Mit dieser Technik gelang es erstmals, Gallensteine, die in Muskelgewebe und in die Gallenblase von Hunden implantiert wurden, nachzuweisen.

Ab 1951 verwendeten Wild et al. den Ultraschall erstmals zur Differenzierung zwischen mechanischem und paralytischem Ileus [9]. Später ließ sich dann auch die Dicke der Darmwand und deren dreischichtiger Wandaufbau mit Ultraschall darstellen. Aus seinen Versuchsergebnissen formulierte Wild die These, dass malignes Gewebe echogener sein muß als benignes Gewebe und äußerte die Vermutung, dass es möglich sein müsste, gastrointestinale Tumore von definierter Größe durch Dichtewechsel und fehlendes physiologisches Bewegungsmuster zu identifizieren [10]. Für diesen Nachweis kam eine A-Mode-Darstellung (siehe Anhang) mit einen 15 MHz-Schallkopf zur Anwendung.

Später entwickelte Wild eine Ultraschall-Scanning-Methode, mit der Patientinnen auf Brustkrebs untersucht werden konnten [11]. Mit demselben Gerät gelang es später, einen Hirntumor in einem Pathologieexzidat eines Patienten nach einer Kraniotomie zu identifizieren.

Howry fokussierte sich im Gegensatz zu Wild, der sich auf die klinische Anwendung des Ultraschalls konzentrierte, mehr auf die Verbesserung der vorhandenen Technologie [12]. 1949 gelang ihm in Zusammenarbeit mit dem Ingenieur Bliss die Konstruktion des ersten B-Mode-Scanners (siehe Anhang. In den folgenden Jahren entwickelte Howry mehrere Ultraschallscanner, die jedoch alle noch groß und unhandlich waren [13].

(13)

Parallel zu Howry arbeitete Ian Donald in England mit einem handelsüblichen Ultraschalldetektor, wie er damals zur Materialprüfung verwendet wurde. Mit diesem Gerät untersuchte er Organe in der Pathologie und war in der Lage, Fibrome von ovarialen Zysten zu differenzieren [14]. Später entwickelte er mit J. McVicar und T.

Brown den ersten Kontaktscanner (siehe Anhang: contact compound scanner).

Donald veröffentlichte 1958 den wegweisenden Artikel „Investigation of Abdominal Masses by Pulsed Ultrasound“, in welchem er den Fall einer 64jährigen Patientin mit abdominellen Schmerzen, Gewichtsverlust und Verdacht auf Aszites beschrieb, bei der mit konventionellen Untersuchungsmethoden die Diagnose eines fortgeschrittenen Magenkarzinoms gestellt wurde. Mit seinem Ultraschallgerät entdeckte er eine zystenähnliche Struktur, die sich nach anschließender Exzision als benigne muzinöse ovarielle Zyste erwies [15].

In den Folgejahren entdeckte Donald noch viele Verbesserungen der Ultraschalltechnik, z.B. ist er der Erstbeschreiber des biparietalen Durchmessers von Feten, der noch heute als ein Index für das fetale Wachstum verwendet wird [16].

Leksell et al. verwendeten die so verbesserten Geräte, um bei Patienten mit Schädelverletzungen epidurale Hämatome nachzuweisen [17]. Bis zur Einführung der Computertomographie in den 70er Jahren stellte diese ultraschall-basierte Mittellinien-Enzephalographie die Standarddiagnostik für Patienten mit Schädel-Hirn- Traumata dar.

Bedeutende Ergebnisse auf dem Gebiet der Echokardiographie lieferten in den frühen 50er Jahren Inge Edler und Carl Hellmuth Hertz. Hertz konnte mit einem schon oben beschriebenen Ultraschallgerät zur Metallprüfung in Kontakt mit seiner Thoraxwand Phänomene beobachten, die in Amplitude und Weite mit seiner Herzfrequenz übereinstimmten [18]. Spätere Forschungen auf diesem Gebiet führten 1967 zum ersten zweidimensionalen Echtzeit–Herzbild–Wiedergabegerät (real-time-

(14)

cardiac-imaging-machine) von Hertz und Asberg[19]. Zur selben Zeit gelangen Edler und Lindström die ersten simultanen M-Mode und intrakardialen Doppler-Aufnahmen [20].

In den 60er Jahren bestand der limitierende Faktor der Ultraschalltechnologie in der langsamen und aufwendigen Bildaufbaurate sowie in der mangelhaften Bildauflösung. Dies änderte sich entscheidend 1976 mit der Einführung von digitalen Scannern. Diese waren in der Lage, stabile, reproduzierbare und einfach zu interpretierende Bilder zu erzeugen und waren damit den herkömmlichen Kathodenstrahl-oszilloskopen oder analogen Scannern überlegen [21].

Ein bedeutender Wendepunkt war die Entwicklung des automatisch erneuerten sonographischen Bildes, der Echtzeit-Bildwiedergabe.

Das erste kommerziell vertriebene Echtzeit-Bildwiedergabe-Ultraschallgerät war das VIDOSON (Siemens Medical System, Iselin, NY). Dieses Gerät wurde 1966 von Hoffmann und 1968 von Hollander zur differenzierteren Darstellung der weiblichen Beckenstrukturen verwendet [22].

Abb. 4: Echtzeit-Bildwiedergabe mittels des VIDOSONs, entwickelt vom Ingineur Richard Soldner.

Aus: SIEMENS Pressearchiv

(15)

Die Entwicklung des VIDOSONs begünstigte weitere technologische Fortschritte wie z.B. den linearen und phased-array Transducer [23] (siehe Anhang „Array“). In den 70er und 80er Jahren führten vielfache Verfeinerungen und Variationen von bekannten Transducerformen zu einer weiteren Verbesserung der Ultraschallbildwiedergabe.

Die Ultraschalltechnologie avancierte zum führenden Diagnostiktool bei Brust-, Gallengang-, Pankreas-, und Schilddrüsenerkrankungen. Als frühe Pioniere auf diesem Gebiet gelten Leopold und Doust, Kobayashi, Wagai, Cole-Beuglet und Stuber [24, 25, 26, 27, 28, 29].

Friday führte Ultraschall zur Lokalisation von intraabdominellen Abzessen ein, Goldberg benutzte ihn 1970 zur früheren Erkennung von Aszites [30, 31]

Mitte der 80er Jahre stellten viele Studien den Nutzen der Ultrasonographie zur Bewertung von Thorax, Retroperitoneum und diverser intraabdominaler Organe heraus [32, 33, 34].

Zusammenfassend kann man festhalten, dass die Einführung des Ultraschalls in die Diagnostik eine der innovativsten Entwicklungen in der Medizinitechnologie des vergangenen Jahrhunderts darstellt.

1.3 Historie der Schrittmachertechnologie

Ebenso wie der Ultraschall bildet auch die Schrittmachertherapie des Herzens heutzutage einen festen Bestandteil des medizinischen Alltags. Die Implantation eines Schrittmachers stellt heute die Therapie der Wahl bei symptomatischen Bradykardien dar. Sie ist ein Routineeingriff, der die Lebensqualität und Mortalität der Patienten immens verbessert. Die Schrittmachertherapie hat in den frühen 60er

(16)

Jahren Einzug in den klinischen Alltag gehalten und niemand hätte es seinerzeit für möglich gehalten, dass inzwischen weltweit pro Jahr ca. 350.000 Schrittmacher implantiert werden. Heutzutage stehen hochmoderne, voll integrierte multisensorielle, computerprogrammierbare Schrittmacher zur Verfügung, die nicht mehr als 25 Gramm wiegen. Steroidbeschichtete Elektroden sowie die Verwendung von Lithium- Ionen-Batterien heben die Lebenserwartung eines heute implantierten permanenten Schrittmachers auf bis zu zehn Jahre an.

Die ersten Versuche, die Schlagfrequenz eines menschlichen Herzens mit elektrischen Impulsen zu erhöhen, datieren zurück in die Mitte des 18. Jahrhunderts.

Charles Kite beschreibt in seinem Essay on the Recovery of the Apparently Dead aus dem Jahre 1788 bereits eine spezielle „Elektrisiermaschine“ für Reanimationszwecke [35]. In diesem berichtet er über einen selbstkonstruierten Apparat, mit dem ihm die erfolgreiche Wiederbelebung eines Patienten gelungen sein soll.

Ende des späten 19. Jahrhunderts verfasste J. A. MacWilliam ein erstes Kompendium über die theoretischen Möglichkeiten der kardialen Elektrostimulation [36].

In den 20er und 30er Jahren des letzten Jahrhunderts gelang erstmals die Umsetzung dieser Theorien in eine effektive Therapie. Unabhängig voneinander entwickelten Lidwill, Australien und Hyman externe kardiale Schrittmacher für den

Abb. 5: Moderner Schrittmacher der Firma Guidant INSIGNIA Ultra DR, Dual Chamber, Modell 1290 Aus: www.guidant.com

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klinischen Gebrauch. 1929 stellte Lidwill seine mit Wechselstrom betriebene Apparatur dem Publikum vor. Es war ihm gelungen, ein totgeborenes Kind erfolgreich wiederzubeleben und so beschrieb er die erste erfolgreiche Herzschrittmachertherapie der Welt. [37,38] Hyman stellte 1932 den Prototypen eines Schrittmachers vor [39].

Im Gegensatz zu Lidwills Maschine, die mit Netzstrom betrieben wurde und das Einbringen einer Nadel im Ventrikel benötigte, wurde Hymans Gerät mit einer Handkurbel angetrieben und übertrug die Stimulationsimpulse über eine Nadelelektrode. Weder Lidwill noch Hyman fanden Hersteller für ihre Erfindung.

In den 50er Jahren entwickelte P. Zoll einen externen Schrittmacher für akute AV- Blockierungen, welcher im Gegensatz zu den beschriebenen Vorgängermodellen mittels Klebeelektroden mit dem Thorax verbunden wurde. Im November 1952 berichtete er über die erfolgreiche Wiederbelebung eines 65jährigen Patienten mithilfe dieses externen Stimulators [40,41].

Abb.6: (Hymans Schrittmacher, Nachbau).

Aus: Naspe.org

Abb.7: Zolls Schrittmacher

Aus: Indian Pacing Electrophysiol. J. 2002;2(1):2

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All diese ersten Schrittmachersysteme waren jedoch äußerst unhandlich. Zudem führte die externe Schrittmacherstimulation zu schweren Hautverbrennungen.

Lillehei und Bakken entwickelten 1957 den ersten tragbaren, batteriebetriebenen Schrittmacher [42]. Dieser war wesentlich handlicher als die bislang verfügbaren Geräte und war mit myokardialen Elektroden ausgerüstet, die in einem operativen Eingriff implantiert werden konnten. Dadurch ließen sich die Nebenwirkungen einer transthorakalen Stimulation (Verbrennungen) durch die thorakalen Haut-Elektroden vermeiden.

1958 gelang es Senning und Elmqvist, einem Patienten mit AV-Block den ersten implantierbaren Schrittmacher einzusetzen [43]. Dieses Gerät enthielt einen Transistor und wurde mit einer wiederaufladbaren Nickel-Cadmium-Batterie betrieben, allerdings funktionierte es nur drei Stunden. Die Weiterentwicklung dieses Gerätes stimulierte das Herz des Patienten für acht Tage. Im gleichen Jahr wurde von W. Chardack und W. Greatbatch ebenfalls ein implantierbarer Schrittmacher entwickelt, der 1960 erstmals implantiert wurde [44]. Dieses Gerät enthielt als entscheidende Neuerung eine bipolare Elektrode („Hunter-Roth“-Elektrode), die aus einem Paar rostfreier Stahlpins mit einer Silikonumhüllung bestand.

Abb.8: Chardacks und Greatbachs Schrittmacher.

Aus: “Pacemakers – A journey through the years”, Tarun Mittal, All India Institute of Medical Sciences, Ansari Nagar, New Delhi-110029

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Chardack entwickelte eine myokardiale Elektrode mit einer Platin/Iridium-Spiralfeder [45] und S. Furman war erstmals in der Lage, die Elektroden transvenös in Lokalanästhesie einzubringen, was die bisher notwendige Thorakotomie überflüssig machte [46]. Später ersetzte der integrierte Schaltkreis den Transistor und wurde wiederum vom Mikroprozessor ersetzt. Jede Neuerung bedeutete eine Verkleinerung der Schrittmacher und die Implementierung zusätzlicher Funktionen.

Verbesserungen der Energiequelle von der Zink/Quecksilber-Batterie zu wiederaufladbaren Nickel/Cadmium-Systemen bis hin zu den heute gebräuchlichen Lithium-Batterien haben die Lebenserwartung und Sicherheit der Schrittmacher immer weiter verbessert [47]. Nathan ersetzte den asynchronen Schrittmacher, der während der frühen 60er Jahre gebräuchlich war, durch vorhofsynchron stimulierende Geräte [48, 49], was zu einem physiologischen Erregungsablauf beitrug. Parsonnet begann 1965 mit den klinischen Studien mit einem „stand by“- Schrittmacher, und im darauffolgendem Jahr entwickelten Goetz, Donato und Harken in Zusammenarbeit mit dem Elektroingenieur Berkovits einen implantierbaren Bedarfs- oder „stand by“- Schrittmacher. Dieses Gerät, das nur in Aktion trat, wenn der Eigenschlag ausblieb, arbeitete wesentlich energiesparender und wurde daher bevorzugt eingesetzt. Fest im Myokard verankerte Elektroden, entwickelt in den 70er Jahren, machten die Schrittmacherstimulation sicherer, zuverlässiger und effektiver.

Zu Beginn der 80er Jahre wurden wichtige Neuentdeckungen, wie der Zwei- Kammer-Schrittmacher, mit dem es möglich war, im rechten Ventrikel und im Vorhof zu stimulieren, eingeführt. Eine weitere Neuerung stellten die „Rate-Responsive“- Schrittmacher dar, diese passten die Herzfrequenz automatisch den jeweiligen Belastungsanforderungen des Patienten an. Heutzutage stehen hochmoderne multisensorielle, computerprogrammierbare Schrittmacher zur Verfügung, die nicht mehr als 25 Gramm wiegen. Steroidbeschichtete Elektroden sowie die Verwendung

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von Lithium-Ionen-Batterien heben die Lebenserwartung eines heute implantierten permanenten Schrittmachers auf bis zu 10 Jahre an. Trotz der relativ kurzen Entwicklungsgeschichte der Schrittmacher haben wenige Entwicklungen in der Medizin einen ähnlichen Siegeszug erlebt und geholfen, die Lebensqualität von Millionen Patienten zu verbessern.

Abb. 9: Externer und interner Schrittmacher mit Elektrodenlage in situ

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2. Material und Methoden

2.1. Vorversuch

2.1.1 Material

2.1.1.1 Ultraschallequipment

An den Niederfrequenzverstärker (Ultrasonic power generator type MFLG, elektrische Leistung 750 W) waren zwei speziell angefertigte Ultraschalltransducer (Meinhardt Ultraschalltechnik, Leipzig, Deutschland) konnektierbar. Der initial verwendete Ultraschalltransducer war konkav geformt. Dieser Transducer wurde mit einer verstärkten Resonanzfrequenz von 820 kHz betrieben, generiert von einem Frequenzgenerator und getriggert von einem modifizierten Pulsgenerator (Medtronic Model 5328, modifiziert, Abb.12). Der äußere Durchmesser des Transducers betrug 75 mm mit einer schallrelevanten Fläche von 32 mm im Durchmesser, der Fokus befand sich in einer Entfernung von 35 mm (Abb.10). Der zweite Transducer besaß einen Aussendurchmesser von 62 mm, eine Schallgenerierungsfläche von 42 mm, der Fokus befand sich in 70 mm Entfernung (Abb.11).

(22)

Ultraschallwandler E/805/FS

Abb.10: 75 mm Außendurchmesser, 32 mm Schallgenerierungsfläche, Linsenform, 820 KHz, für Fokus bei 35 mm Entfernung.

Ultraschallwandler E/805/T

Abb.11: 62 mm Außendurchmesser, 42 mm Schallgenerierungsfläche, Linsenform, 850 kHz, für Fokus in 70 mm Entfernung.

(23)

Abb.12: Technisches Material für die Ultraschallstimulation

2.1.1.1.1 Technische Daten:

Elektrischer Niederfrequenzverstärker

(Ultrasonic power generator type MFLG), 220/230 Volt/50-60Hz, Frequenzbereich 0,5-10MHz, ansteuerbar über den Sinusgenerator.

Sinus-Generator HM8032 (Abb. 12)

Frequenzbereich: 20Hz-20MHz, unterteilt in 6 dekad. Stufen, variable Einstellung 10:1, bereichsüberlappend. Klirrfaktor: 20Hz-500kHz max. 0,2%, 500kHZ-1MHz max.1%, 1MHz-20MHz max. 2,5%, Ausgangsspannung: 1,5Veff an 50 , Innenwiderstand: 600 und 50 , Amplitudenschwankungen: 20Hz-2MHz max.

±0,2dB, 2MHz-20MHz max. ±0,5dB, Amplitudenstabilität: 0,12% (4Std) Betriebsbedingungen: +10°C bis +40°C, max. relative Luftfeuchtigkeit: 80%,

Transducer

Verstärker MFLG

Sinus-Generator HM 8032

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ausgestattet mit drei individuell anwählbaren Dämpfungsstufen zu je 20dB (Attenuator), Gehäusemaße: Breite 135, Höhe 68, Tiefe 228mm, Gewicht ca. 650g.

Universal-Takt-Generator UTG 100

Spannungsversorgung: 9V bis 15V DC über 3,5mm Klinkenbuchse oder 9V Batterie (Akku), Zeiten: 1ms bis 9,99 sek. für Puls und Pause getrennt einstellbar, Anzahl: 1 bis 99 Zyklen oder kontinuierliche Ausgabe, Triggereingang: CMOS/TTL-kompatibel, Ausgang 1: CMOS/TTL-Pegel, Ausgang 2: Open-Kollektor (max 40V/100mA).

Ultraschallwandler E/805/T (Abb. 6)

ausgerüstet mit planem high-performance Ultraschalltransmitter, Gesamtdurchmesser: 75mm, Höhe: 50mm, Gewicht: 920g, Material: V4A, Titan Temperatur-Festigkeit: -10°bis 90°C, Maximal erreichbare Intensität: 400W/cm² Standard-Frequenz: 850kHz, einstellbare Frequenzen: 1.580kHz, (planer Transducer 2. 856 kHz ohne Focus ), 3.1128kHz.

Ultraschallwandler E/805/FS (Abb. 5)

bestückt mit Hochleistungs-Fokusschwinger, Durchmesser 32/0, 820; 2,6MHz, allseitig geschlossen in druckfestem Edelstahlgehäuse, Durchmesser 75/0 mit Flanschanschluß, Normung auf DIN 60.

Vorlaufstrecke SONOPAD-Gelkissen, Schalldämpfung: 0.53dB/cm MHz.

(25)

2.1.2 Methodik

2.1.2.1 Versuchsaufbau

Der tierexperimentelle Vorversuch fand nach Genehmigung durch die Bezirksregierung Hannover (Tierversuchsnummer 02-530) im Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule Hannover statt. Wegen der Übertragbarkeit der Versuchsergebnisse auf den Menschen wurden weibliche Minipigs mit einem Gewicht von 30+/-2kg als Versuchstiere verwandt. Das Versuchstier wurde für die gesamte Versuchsdauer in Intubationsnarkose anästhesiert. Die Prämedikation erfolgte mit einer intramuskulären Gabe von Zoletil (Tiletamin/Zolazepam) 4mg. Nach 10 Minuten wurde eine Braunüle in die Ohrrandvene gelegt, die Narkotisierung erfolgte mit Propofol in der Dosierung 4mg/kg. Die Aufrechterhaltung der Narkose wurde durch eine kontinuierliche Beatmung mit einem Sauerstoff-Lachgas- Trägergemisch im Verhältnis 1:1 sowie Isofluran in einer anfänglichen Konzentration von 2,5 vol% gewährleistet, die weitere Steuerung erfolgte nach Narkosetiefe.

Zusätzliche Analgesie erfolgte durch fraktionierte Fentanylgaben (0,05mg/30min).

Es erfolgte in Rückenlage die Eröffnung des Thoraxes durch eine mediale Sternotomie sowie die Entfernung des Perikards. Anschließend erfolgte nach sorgfältiger Blutstillung die Auffüllung des Mediastinums mit steriler 0,9%- Natriumchloridlösung als Vorlaufstrecke für den Ultraschall. Es wurden ein planarer und ein fokussierter Ultraschalltransducer verwendet (Abb. 10 u. 11) Diese wurden im eröffneten Thorax so positioniert, dass der Apex des Herzens im Fokus der Schallabgabefläche lag (Abb. 13). Nach diesen Vorbereitungen erfolgte die Abgabe von Ultraschallstimuli definierter Frequenz und Intensität unter kontinuierlicher Aufzeichnung eines 6-Kanal-EKGs. Die Tötung der Versuchstiere erfolgte nach

(26)

Beendigung der Experimente durch eine intravenöse Gabe von Eutha 77 (Pentobarbitalum natricum) in gewichtsadaptierter Dosierung.

2.2. Beating heart-Modell modifiziert nach Langendorff

2.2.1 Material

2.2.1.1 System

Der für die In-vitro-Versuche verwendete Versuchsaufbau basierte auf einem Beating heart-Modell für Herzen bis 500g, eines im Rahmen des Programms

„Ersatzmethoden zum Tierversuch“, Teilprojekt 1: Entwicklung von Organperfusionskreisläufen; Forschungsvorhaben: 0311021, vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Projektes [50].

Als Versuchstiere wurden weibliche Hausschweine (deutsche Landrassenhybriden), verwendet, die aus der Lehr- und Versuchsanstalt für Tierzucht und Tierhaltung e.V., 14828 Teltow stammten. Es wurden Tiere im Alter zwischen 5 – 8 Monaten verwendet, Gewicht 85+/-15kg. Die Herzen, die in toto entnommen wurden, wogen

Abb. 13: Schema des Aufbaus des tierexperi- mentellen Vorversuchs

Versuchsorgan, Perikard entfernt

Ultraschalltransducer, Fokus auf den Apex des Versuchsorgans ausgerichtet

(27)

392 +/- 38 g. Die Tötung der Versuchstiere und Entnahme des Herzens erfolgte im örtlichen Schlachtbetrieb.

2.2.1.2 Schweineherz-Präparate

Die Wahl eines Schweinemodells liegt in der hohen anatomischen und physiologischen Kongruenz zum menschlichen Herzen begründet. So weist das Erregungsleitungssystem des Schweineherzens hohe Übereinstimmung mit dem des menschlichen Herzens auf. Darüber hinaus weisen Schweineherzen zu einem hohen Prozentsatz, wie das menschliche Herz, einen indifferenten oder balancierten Versorgungstyp ohne Versorgungsdominanz einer bestimmten Koronararterie auf [51]. Es bestehen, wie beim Menschen, nur eine geringe Anzahl interkoronarer Anastomosen. Außerdem sind Schweineherzen in Gewicht und Grösse mit dem menschlichen Herz vergleichbar.

Da es sich bei allen verwandten Schweinen um reine Schlachttiere handelte, waren die sonst üblichen Genehmigungsverfahren bei Experimenten mit Säugetieren nicht erforderlich.

(28)

2.2.1.3 Aufbau der Perfusionsapparatur

Abb. 14: Perfusionsaufbau zur normothermen Hämoperfusion isolierter Schweineherzen

Der verwendete Laboraufbau ist schematisch in Abbildung 13 dargestellt. Er entspricht dem nach Baeyer modifiziertem Langendorff-Aufbau [52], welcher im Rahmen des BMBF-Förderprogramms „Ersatzmethoden zum Tierversuch“, Teilprojekt 1: Entwicklung von Organperfusionskreisläufen; Forschungsvorhaben:

0311021, entwickelt wurde.

Grundlegendes Prinzip ist die permanente Oxygenierung und Dialyse des Perfusionsblutes durch ein Dialysemodul und eine Kontrolle der Ultrafiltration durch eine kontinuierliche Wägung des Blutreservoirs, gespeist vom passiv aus dem Herzen abfliessenden Perfusat.

Dialyse- modul Luftfalle

Rollenpumpe2

Rollenpumpe 1

Dialysat

Begasung

Kreiselpumpe

Waage

p T

p

p

T p p

=Temperaturkontrolle

=Druckkontrolle EDV

T T

T p

p

p

(29)

Dieser extrakorporale Perfusionskreislauf setzte sich aus drei kombinerten Teilkreisläufen zusammen: 1. Blutkreislauf

2. Dialysatkreislauf 3. Wärmekreislauf

2.2.1.3.1 Blutkreislauf:

Als Perfusat wurde mit Krebs-Henseleit-Lösung verdünntes Vollblut verwendet (Zusammensetzung: 120mM NaCl, 5 mM KCl, 2mM MgSO4, 1,2mM NaHCO3, 10mM Glucose, 0,25mM CaCl2 ).

Der Blutkreislauf war aufgeteilt in einen arteriellen und einen venösen Schenkel. Der arterielle Schenkel bestand aus dem das Dialysemodul verlassende Perfusat, welches über die Rollenpumpe 2 (Abb. 7), verbunden mit den Koronarkathetern in das Herz gelangte. Der venöse Schenkel wurde aus dem passiv aus dem Herzen abfliessenden venösen Blut gespeist und transportiert es über die Rollenpumpe 1 in ein Dialysemodul. Es handelte sich hierbei um einen handelsüblichen Kapillardialysator, der in diesem Perfusionsaufbau das Verbindungsglied zwischen Blut- und Dialysatkreislauf darstellt. Durch dieses Dialysemodul wurde der Gas- und Wärmeaustausch sowie die Entfernung der im venösen Blut enthaltenen dialysepflichtigen Substanzen gewährleistet, so dass das Perfusat wieder arterialisiert und oxygeniert dem Herzen zugeführt werden konnte. Zur blasenfreien Perfusion passierte das Blut nach der Rollenpumpe 2 eine zwischengeschaltete Luftfalle.

Das passiv aus dem Herzen abfliessende Blut wurde in einem Blutreservoir aufgefangen, das auf einer Waage platziert ist. Das Gewicht des Perfusats wurde kontinuierlich gemessen und eventuelle Abweichungen von einem vorher festgelegten Sollwert werden von der angeschlossenen EDV-Einheit registriert.

(30)

Diese reguliert in diesem Fall über eine Änderung der Drehzahl der Rollenpumpe 1 die Ultrafiltration im Dialysemodul und verhindert auf diese Weise Flüssigkeitsverschiebungen innerhalb des Systems.

Die Perfusion des Herzens wird flussgesteuert über die Drehzahl der Rollenpumpe 2 reguliert, wobei der Perfusionsdruck das Produkt aus Perfusionsfluss und Organwiderstand darstellt.

2.2.1.3.2 Dialysatkreislauf:

Das Dialysat befindet sich in einem offenen Reservoir. Es wird durch eine Kreiselpumpe mit einem Fluss von 5 l/min durch das Dialysemodul befördert und durch einen abführenden Schlauch wieder dem Reservoir zugeführt.

Über zwei an das Dialysatreservoir angeschlossene Gasausströmer war eine CO2-, sowie eine O2-Anreicherung möglich.

2.2.1.3.3 Wärmekreislauf:

In dem unter 2.1.1.3.2 beschriebenen Dialysatreservoir befindet sich ein Heizstab, der eine Temperatur von 38°C aufrecht erhält. Der Wärmekreislauf ist ebenfalls mit dem Blutreservoir verbunden und verhindert auf diese Weise eine zu starke Abkühlung des Perfusats nach der Organpassage. Es findet eine kontinuierliche Temperaturmessung im arteriellen Schenkel, im Blutreservoir und im Dialysatreservoir statt.

(31)

2.2.1.4 Komponenten

Perfusionssystem, bestehend aus :

pH- Messer: Greisinger, Regenstauf, Deutschland ( Kat.Nr.: GMH 3530 )

Interfacekonverter: Greisinger, Regenstauf, Deutschland ( Kat.Nr.: GRS 3100 )

Sauerstoffflow-Messer: Novodirect, Kehl/Rhein, Deutschland ( Kat.Nr.: A74035 )

CO2- Flowmesser: Novodirect, Kehl/Rhein, Deutschland ( Kat.Nr.: A74035 )

pH / pt 1000-Elektrode: Novodirect, Kehl/Rhein, Deutschland ( Kat.Nr.: A86402 )

Waage, Modellreihe Basic lite BL: SARTORIUS, Göttingen, Deutschland ( Kat.Nr.: BL6 )

Dateninterface: SARTORIUS, Göttingen, Deutschland ( Kat.Nr.: BL6 )

Thermostat: HAAKE, Karlsruhe, Deutschland ( Kat.Nr.: 525-1851 )

Interface card (PCMCIA): National Instruments, München, Deutschland ( Kat.Nr.: 777385- 01 )

Rollenpumpen: Watson- Marlow, Düsseldorf, Deutschland ( Kat.Nr.: 505 AutoDrive 220 9RPM/501RL ) Zenrifugenpumpe: EHEIM Modell 1250 ( Kat.Nr.: 1250 21 993 ) Teflonschläuche mit Dreiwegehahn Mediport Biotechnik, Berlin, Deutschland

(32)

PC mit serieller Schnittstelle ONFLY, Berlin, Deutschland

Dialysatreservoir: Mediport Biotechnik, Berlin, Deutschland Kontrolleinheit: Mediport Biotechnik, Berlin, Deutschland Datensampler: Mediport Biotechnik, Berlin, Deutschland Datenerfassungssoftware: Mediport Biotechnik, Berlin, Deutschland

INFUS blood line: Baxter S.A. Maurepas, Frankreich Dialysemodul: Fresenius, Bad Homburg, Deutschland

( Kat.Nr.: Hemoflow F7, low flux )

Blutgasanalyse und Oximetrie: ABL555, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark OSM3, Radiometer, Kopenhagen, Dänemark

2.2.1.5 Verwendete Lösungen

2.2.1.5.1 Dialysat

Als Grundlage für das Dialysat im Perfusionsaufbau und zur Hämodilution wurde eine modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung (Zusammensetzung: 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgSO4, 1,2 mM NaHCO3, 10 mM Glucose, 0,25 mM CaCl2 ) verwendet.

Dieser wurden Insulin (Konzentration 10 IE/l, Insuman® Rapid 40 IE/ml, Hoechst Marion Roussel, 65926 Frankfurt) und Glucose (Konzentration 11,2 mMol/l, D(+)- Glucose, Merck, Darmstadt) zugesetzt [53]. In der frühen Phase der Reperfusion war das Herz der Gefahr von Reperfusionsschäden ausgesetzt, das Substratangebot in Form von Kohlenhydraten konnte in dieser Phase Schädigungen durch Energiemangel verhindern oder zumindest abschwächen [54].

(33)

2.2.1.5.2 Kardioplegielösung für den Transport der Herzen

Der Krebs-Henseleit-Lösung wurden neben Glukose, Insulin und Heparin auch 2,3- Butanedione-Monoxime (BDM) zugesetzt. Aufgrund seiner Fähigkeit zur Chelatbildung reduziert es freie Calciumionen und senkt somit die Gefahr von Reperfusionsschäden [55, 56]. Durch die perimortale Ischämie steht dem Myokard nur wenig ATP zur Aufrechterhaltung des Zellstoffwechsels zur Verfügung. In der Folge kommt es zu einer intrazellulären Akkumulation von Natrium- und Calciumionen. Zu Beginn der Ischämiebedingungen sind die Calciumpumpen des sarkoplasmatischen Retikulums noch in der Lage, Calcium in das Sarkoplasmatische Retikulum zu transportieren. Dieser Vorgang erschöpft sich jedoch bei andauernder Akkumulation von Calciumionen im Zytosol. Es resultieren Ca2+-Ströme zwischen Zytosol und Sarkoplasmatischem Retikulum, sogenannte Calcium-Oszillationen, die zwar keinen Einfluß mehr auf die intrazelluläre Calciumkonzentration haben, jedoch für die in der frühen Phase der Reperfusion auftretenden Hyperkontraktur verantwortlich gemacht werden [57]. Die Störung des Ionengleichgewichts resultiert in der Folge auch in einer erhöhten intrazellulären Osmolarität mit nachfolgender osmotischer Zellschwellung, wobei ebenfalls das Sarkolemm beschädigt werden kann und die Fragilität der Zellmembran ansteigt.

Der Zusatz von 2,3- Butanedione-Monoxime (BDM) soll eben diesen bekannten Effekt abschwächen.

Die Kardioplegielösung wurde am jeweiligen Versuchstag frisch angesetzt, mit medizinischem Sauerstoff für 10 Minuten begast und anschließend bis zum Gebrauch im Kühlschrank bei 4-8°C bzw. für den Einsatz auf dem Schlachthof auf Eis gekühlt.

(34)

2.2.1.5.3 Natriumcitratlösung

Zur initialen Antikoagulation des gewonnenen autologen Vollblutes wurde ein Tag vor der Versuchsdurchführung eine 3,2%ige Natriumcitratlösung angesetzt. Die Antikoagulation wurde hierbei durch Bindung des Calciums an das Citrat gewährleistet.

2.2.1.6 Chemische Substanzen

Sodiumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt, Deutschland Potassiumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt, Deutschland

D(+) – Glucose Serva, Heidelberg, Deutschland(Kat.Nr.22700) Potassiumchlorid Merck, Darmstadt, Deutschland

Magnesiumsulfatheptahydrat Merck, Darmstadt, Deutschland Calciumchloriddihydrat Merck, Darmstadt, Deutschland InsumanRapid 40 I.E./ml Aventis, Frankfurt, Deutschland Heparin- Natrium- 25000 ratiopharm GmbH, Ulm, Deutschland ratiopharm Injektionslösung

Sodiumhydrogencarbonat 8.4% B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland

2,3 Butanedione Monoxime Sigma Kat.nr.: B-0753

Tri-Sodiumcitratdihydrat Merck, Darmstadt, Deutschland

Rinderalbumin Fraktion V Serva, Heidelberg, Deutschland(Kat.Nr11930) Natriumhydrogencarbonat B.Braun Melsungen AG, Melsungen,

8,4% Infusionslösung Deutschland

Artenerol 25 ml Hoechst AG, Frankfurt am Main, Deutschland

(35)

Calcium Eifelfango 20% Eifelfango Chem.-Pharm. Werke, Bad Neuen- Ahr, Deutschland

2.2.1.7 Blutgasanalyse und Oxymetrie

Die Blutgasanalyse der in fixen Abständen entnommenen arteriellen und venösen Blutproben wurde mittels ABLTM505 (Firma Radiometer Kopenhagen, Dänemark) durchgeführt, die Oximetrie mittels OSMTM3 (Firma Radiometer Kopenhagen, Dänemark) durchgeführt. Eine Verbindung dieser beiden Geräte erlaubte die gleichzeitige Messung folgender Parameter: pH-Wert, CO2- und O2-Partialdruck, Gesamthämoglobinkonzentration, Sauerstoffsättigung, Carboxyhämoglobin und Methämoglobin [58].

2.2.1.8 Atraumatische Messung des Gewebs-pO2 im Myokard

Die Messung des Sauerstoffpartialdrucks im Gewebe (intramyokardialer Sauerstoffdruck = mPO2) erfolgte mittels eines LICOX-CMP®-Systems (LICOX- CMP® Tissue Oxygen Pressure and Temperature Monitor, GMS, 24247 Kiel- Melsungen). Hierfür wurde eine flexible Mikroelektrode bestehend aus Polyethylen (LICOX® REF CC1 Revoxode, GMS, 24247 Kiel-Melsungen) mit einer atraumatischen Hohlnadel in das Myokard eingebracht [59,60,61,62,63]. Die Messelektrode wies eine sauerstoffsensitive Oberfläche von 7mm² bei einem Durchmesser von 500µm auf und war dadurch deutlich atraumatischer als herkömmliche Verfahren. Die Signale dieser Elektrode wurden kontinuierlich registriert und im angeschlossenen EDV-System in Sauerstoffpartialdruckwerte umgerechnet.

(36)

Tabelle: Techn. Spezifikationen der LICOX®-REVOXODE Technische Spezifikationen

Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messungen:

Messzeit 0,3h-12h

Empfindlichkeitsfehler < 5%

Null-PO2-Fehler < 0,5 mmHg Messzeit 12h-120h

Empfindlichkeitsfehler < 10%

Null-PO2-Fehler < 1 mmHg Polarographische Charakteristik der Revoxode:

Gold-Kathode Silber-Anode

Polarisation 795

„Stirring-Artefact“ <4%

Empfindlichkeit 35°C ~2,2 nA/mmHg mPO2

Temperaturkoeffizient der Empfindlichkeit ~4,4% / °C

Null-Strom < 1nA

Reaktionszeit T90/35°C ~ 60s

2.2.1.9 Defibrillator und Schrittmacher

Um das Kammerflimmern des Herzens nach Anschluss an das Perfusionssystem in einen physiologischen Sinusrhythmus zu konvertieren, wurde ein Defibrillator mit Löffelelektroden (Abb. 14, DC-Defibrillator, Fa. Marquette Hellige, 70839 Gerlingen) verwendet. Die Energie für die Defibrillation betrug zwischen 20 und 50 Joule. Der Defibrillator enthielt einen integrierten Herzschrittmacher (Demand-Schrittmacher, Marquette Heilige, 70839 Gerlingen). Mit diesem konnte bei einer Eigenfrequenz des Herzens von weniger als 50 bpm das Herz mit einer Impulsamplitude von 0,1-40 mA extern stimuliert werden. Die Überwachung der Herzfrequenz, Perfusionsdruck und Druckverhältnisse im linken Ventrikel wurde durch ein OP-Monitor-System (Modell 66S, Hewlett-Packard) gewährleistet.

(37)

2.2.1.10 Equipment für die EKG-Messung

12- Kanal- EKG „Corina“, Marquette Heilige, Göttingen EKG- Software Cardiosoft V4.1, Marquette, Freiburg Perfusionsreservoir mit inte- Mediport Biotechnik

grierten EKG- Elektroden

Abb. 15: DC-Defibrillator mit Löffelelektroden, Fa. Marquette Heilige, 70839 Gerlingen

Abb. 16

Spezielle EKG-Elektroden waren an der Wand eines modifizierten Blutbehälters (Breite 14cm, Tiefe 14cm, Höhe 40cm) befestigt, so dass ein 12- Kanal EKG abgeleitet werden konnte. Das EKG wurde kontinuierlich durch ein angeschlossenes Computersystem überwacht, das Aufzeichnung und Wiedergabe von EKG- Sequenzen gewährleistete.

PC-Anschluß

Integrierte EKG- Elektroden

(38)

2.2.2 Methoden

2.2.2.1 Vorbereitung der Perfusionslösung

Autologes Blut wurde aus der Vena cava superior entnommen und in einem rostfreien Stahlbehälter, der 50 ml 3,8%ige Sodiumcitratlösung enthielt, gesammelt.

Das Blut wurde auf Eis in 1l – Plastikflaschen mit 10.000 I.E. Heparin transportiert.

Um eine Hämoglobinkonzentration von 8,0 +/- 0, 5 g/dl aufrechtzuerhalten, wurde das Vollblut mit Dialysat angereichert mit 4,0% Rinderalbumin, verdünnt.

2.2.2.2 Organpräparation

Die Tiere wurden im Schlachthof per Elektroschock nach den Richtlinien des europäischen Tierschutzgesetzes anästhesiert, an den Hinterläufen aufgehangen und durch Ausbluten über die Vena cava superior getötet. Das austretende Blut wurde aufgefangen und für das weitere Experiment verwandt. Nach Ausbluten über die obere Hohlvene (Abb. 17) wurde das Tier in Rückenlage gebracht und der Thorax paramedian inzisiert, der Herzbeutel eröffnet und das Herz mittels Durchtrennung der großen Gefäße (Aorta, Venae cavae, Truncus pulmonalis und Venae pulmonalis) an der Herzbasis entnommen (Abb. 18, 19, 20). Insgesamt wurde eine warme Ischämiezeit von unter fünf Minuten angestrebt. Die Koronararterien der verwendeten Herzen wurden umgehend mit kardiopleger Lösung (4°C) perfundiert und das Herz anschließend für den Transport in einen mit kalter Kardioplegielösung gefüllten Kunststoffbeutel eingebracht und auf Eis in einem Thermobehälter gelagert.

Die weitere Präparation fand im Labor statt. Die Arteria pulmonalis wurde von der Aorta separiert und auf 2-3cm Länge gekürzt, verbleibende Reste des Perikards

(39)

wurden entfernt. Die Koronarien (Arteria coronaria dextra, interventrikularer und circumflexer Anteil der Arteria coronaria sinistra) wurden mit Koronarkathetern, bestehend aus einem Teflonschlauch verbunden mit einem Drei-Wege-Hahn, perfundiert mit kardiopleger Lösung, katheterisiert und nach der Fixierung mit circa 200ml kardiopleger Lösung antegrad gespült.

Drei Minuten vor Anschluss an den Perfusionskreislauf wurde das Herz bei Raumtemperatur in das Dialysat eingetaucht und jede Koronararterie mit 50ml Dialysat gespült. Anschliessend wurde das Herz im Perfusionssystem fixiert und die Koronarien an den Hämoperfusatkreislauf angeschlossen.

Die Hämoperfusion wurde zur Reduzierung von Reperfusionsschäden mit zunächst geringen Perfusionsfluss bis zum Erreichen eines mittleren Perfusionsdruckes von 50mmHg gestartet und das Herz elektrisch extern stimuliert. Sobald das Herz einen stabilen regelmässigen Rhythmus aufwies, wurde der koronare Blutfluss in der ersten Stunde der Perfusion angehoben, um eine Organdurchblutung von 60-120ml pro Minute und 100g Organgewicht und einen koronaren Perfusionsdruck von zwischen 70-80mmHg aufrechtzuerhalten. Diese 60-90minütige Adaptionsphase war zur Gewährleistung stabiler Perfusionsbedingungen und EKG-Aufzeichnungen notwendig. Alle relevanten Parameter (Hämodynamik, Gase des Hämoperfusats, Elektrolyte) wurden im jeweiligen Referenzbereich gehalten.

(40)

Abb. 17: Phase des Ausblutens

Abb.18: Thoraxinzision

( Hinweis: Die Photographien wurden zu Demonstrationszwecken am gebrühten Tier gemacht )

(41)

Abb. 19: Thorax eröffnet, Perikard geschlossen

Abb. 20: eröffnetes Perikard

(42)

Abb. 21 : Organpräparation im Labor

Abb. 22: Positionierung des Herzens im Versuchsaufbau blutgefüllter EKG-Behälter

Versuchsorgan Koronarperfusionssystem

(43)

2.2.2.3. Monitoring

Während der Perfusion wurden der koronare Blutfluss, der koronare Perfusionsdruck, der Anteil des Perfusats am zirkulierenden Gesamtvolumen sowie die Temperatur des Dialysats bestimmt und bei Bedarf angepasst.

Vor Beginn der Perfusion und während der Experimente wurden Blutgasanalysen des Hämoperfusats und des Dialysats sowie eine Oximetrie des Hämoperfusats durchgeführt und alle 30 Minuten wiederholt.

Im Labor wurden die Koronararterien an einen Perfusionskreislauf angeschlossen, der das Organ, welches sich in einem Blutbad befand, mit Substrat und adäquaten Gaskonzentrationen versorgte. Gasaustausch und Elimination metabolischer Endprodukte wurde durch ein parallel geschaltetes Dialysesystem gewährleistet. Die Stabilität des gesamten Systems wurde anhand der Hämodynamik, insbesondere der Parameter Perfusionsfluss und Perfusionsdruck [64] sowie anhand der halbstündig durchgeführten Blutgasanalysen überwacht. Des weiteren erfolgte eine Beurteilung durch allgemeine Parametern der mechanischen Herzfunktion wie der Herzfrequenz und dem Organwiderstand. Das Hauptaugenmerk bei den Blutgasanalysen lag auf dem Kaliumwert des Dialysats, welcher durch halbstündliche Blutgasanalysen im physiologischen Bereich zwischen 3,5 und 5,5mmol/l gehalten wurde sowie den weiteren Elektrolytwerten (siehe S. 52ff, Graphik 27-33).

Es wurde ein speziell für die Versuche angefertigter Behälter für das Herz (Abb. 16) verwendet, an dessen Wand EKG-Elektroden befestigt waren, so dass ein 12-Kanal EKG abgeleitet werden konnte. Das EKG wurde kontinuierlich durch ein angeschlossenes Computersystem überwacht, welches Aufzeichnung und Wiedergabe von EKG-Sequenzen gewährleistete.

(44)

2.2.2.4 Ultraschallstimulation

Der Apex der Versuchsorgane wurde im Fokus des Transducers, der sich am Boden des blutgefüllten Behälters befand, positioniert (Abb.21). Das Herz wurde mit Ultraschallpulsen von unterschiedlicher Impulsbreite (5, 10, 20, 30 ms) und Stimulationsfrequenz (400, 416, 420, 440 und 540 ms) sowie mit einer elektrischen Leistung des Verstärkers von 750 W beschallt, währenddessen wurde das EKG kontinuierlich überwacht.

Bei Auftreten von Veränderungen des Rhythmus wurde das EKG für weitere Auswertungen gespeichert. Zuletzt wurde das im Schallfokus liegende Areal makroskopisch inspiziert und anschließend histologisch untersucht.

2.2.2.5 Temperaturmessungen

An einem der untersuchten Herzen wurde während der Ultraschallapplikation ein Temperaturmonitoring durchgeführt. Hierzu wurden fokussierte Ultraschallpulse mit definierter Stimulationsfrequenz auf den Apex des Versuchsorgans appliziert.

Parallel wurde die Temperatur im Fokus durch eine Thermocouple-Nadel gemessen.

Hierzu wurde das Herz für eine Minute mit der maximalen Energie von 750W (doppelte Energie, die im Stimulationsprotokoll appliziert wurde) beschallt. Die Impulsbreite wurde von 5-40ms in 5ms-Schritten gesteigert, die applizierten Stimulationsintervalle betrugen 100, 200, 300, 400 und 500ms.

(45)

2.2.2.6 Datenanalyse/Statistik

Die Anzahl der ventrikulären Extrasystolen und deren jeweilige Zykluslänge innerhalb einer Stimulationssequenz wurden in den EKG-Aufzeichnungen bestimmt. Für jede Extrasystole wurde der Quotient aus Stimulationsfrequenz der abgegebenen Ultraschallpulse und der Zykluslänge der Extrasystolen errechnet. Die Eigenfrequenz der Herzen vor Auftreten von ventrikulären Extrasystolen wurde dokumentiert. Die Werte wurden als Mittelwert +/- Standardabweichung angegeben.

(46)

3. Ergebnisse

3.1 Ergebnisse des Akutexperiments in vivo

Das in-vivo-Experiment fand in den Tierlaboratorien der Medizinischen Hochschule Hannover statt. Die Operationszeit betrug 3 Stunden. In dieser Zeit wurden, wie unter 2.1.2.1 beschrieben, Ultraschallpulse definierter Frequenz auf den Apex des Versuchsorgans appliziert. Bei Frequenzen von 580kHz, 856kHz und 1128kHz, Pulsweiten von 5-65ms und einer angelegten Stimulationsfrequenz von 100/Min (=600ms) zeigten sich im abgeleiteten EKG keine Effekte auf den Herzrhythmus. In den initialen Versuchen wurde keine Vorlaufstrecke verwandt und der Herz- Schallkopfabstand betrug 3cm. Auch unter Verwendung einer Vorlaufstrecke zeigten sich bei einer Frequenz von 1128kHz, Pulsweiten von 5-65ms, einem angelegten Stimulationsintervall von 100/Min (=600ms) und einem Herz-Schallkopfabstand von 6cm keine Effekte auf den Herzrhythmus. Bei einer Ultraschallfrequenz von 856kHz, einer Pulsweite von 5-10ms, einer Stimulationsfrequenz von 133/Min (=450ms) und einer Erhöhung der Leistung des Niederfrequenz(NF)-Verstärkers zeigten sich im EKG klar erkennbare monomorphe ventrikuläre Extrasystolen. Es wurde hierbei mit einer Vorlaufstrecke (Sonopad Gelkissen) gearbeitet und der Herz- Schallkopfabstand betrug 6cm. Anschließend zeigte sich eine deutliche thermische Schädigung in der Vorlaufstrecke.

In der zweiten Versuchsreihe mit einer Ultraschallfrequenz von 1128kHz, einer Impulsbreite von 5-10ms, einer Stimulationsfrequenz von 133/Min (=450ms) sowie Erhöhung der Leistung des NF-Verstärkers zeigten sich im EKG ebenfalls klar erkennbare monomorphe ventrikuläre Extrasystolen. Auch diese Versuchsreihe wurde mit einem Sonopad-Gelkissen als Vorlaufstrecke sowie einem Herz-

(47)

Schallkopfabstand von 6cm durchgeführt. Es zeigten sich erneut Wärmeschäden an der Vorlaufstrecke. Nach Wechsel auf einen fokussierten Ultraschalltransducer mit einer Frequenz von 846kHz, einer Pulsweite von 5-10ms, einer Stimulationsintervall von 133/Min (=450ms) und Erhöhung der Leistung konnten im EKG keine sichtbaren Reaktionen verzeichnet werden. Auch hierbei wurde eine Vorlaufstrecke sowie ein Herz-Schallkopfabstand von 6cm verwandt. Aufgrund von Lufteinschlüssen in der Schalllaufstrecke kam es zu einem Defekt am verwandten Schallkopf (Blasenwurf der Polyethylenbeschichtung).

Zusammengefaßt zeigte sich, dass fokussierte Ultraschallimpulse im in-vivo-Versuch unter bestimmten Bedingungen vereinzelt monomorphe ventrikuläre Extrasystolen induzieren können. Zur genaueren Evaluation und für eine bessere Reproduzierbarkeit wurde in den weiterführenden Experimenten ein modifiziertes Langendorff-System als in-vitro-Modell verwendet.

3.2 Ergebnisse des Beating-heart-Versuchsaufbaus (in-vitro)

Die Eröffnung des Thorax der Versuchstiere dauerte 20+/-5 Sekunden, die weitere Präparation und Entnahme des Versuchsorgans im Mittel drei Minuten. Vom Zeitpunkt der Entnahme der Schweineherzen bis hin zum Transport der Versuchsorgane unter Organtransplantationsbedingungen (siehe 2.3.1.5.2 Kardioplegielösung für den Transport der Herzen) in das Labor vergingen 1,5 Stunden +/- 15 Minuten. Die weitere Präparation der Versuchsorgane (siehe 2.1.2.2.

Organpräparation) nahm eine Zeitspanne von 15-30 Minuten in Anspruch.

Es schloss sich eine Adaptionsphase von einer Stunde mit einem kontinuierlich steigenden Perfusionsfluss von anfänglich 50ml*min-1*100g Organgewicht bis hin zum Referenzbereich von 60-120ml*min-1*100g Organgewicht an, der

(48)

Referenzbereich des Perfusionsdruckes betrug 80-120mmHg [64]. Nach Auswaschen der Kardioplegielösung konvertierte die initiale Asystolie der Versuchsorgane in feines Kammerflimmern, welches durch elektrische Defibrillationen in einem Bereich zwischen 20-50Joule in einen Sinusrhythmus konvertiert wurde.

Nach Stabilisierung der Hämodynamik wurden Stimulationsversuche begonnen.

Insgesamt belief sich das Zeitfenster für die Experimente im Mittel auf 3(+/-0,5) Stunden. In dieser Zeit wurden fokussierte Ultraschallpulse von definierter Frequenz und Intensität auf den Apex des Versuchsorgans appliziert.

Dabei wurden ab einer Impulsbreiten (siehe Anhang) von ≥20ms (siehe EKG-Abb. I und II S. 50) reproduzierbar Serien von ventrikulären Extrasystolen beobachtet.

Im einzelnen aufgeschlüsselt und im Anschluss anhand von Ausschnitten der aufgezeichneten Elektrokardiogramme aus den Experimenten aufgezeigt, wurden Schrittmacherpulslängen von 400, 416, 420, 440 und 540ms gewählt und der Apex des Versuchsorgans beschallt. Die Schallabgabe erfolgte nur bei stabilem Sinusrhythmus oberhalb der Spontanfrequenz, um eine effektive Stimulation sicher nachweisen zu können.

Unter der Ultraschallabgabe wurde kontinuierlich das EKG während der gesamten Zeitdauer aufgezeichnet. Insgesamt wurden so 28 Runs mit 123 ventrikulären Extrasystolen (Tab.1), mit einer durchschnittlichen Gesamtzahl von 4,3 +/-2,8 (2-12) monomorphen ventrikulären Extrasystolen pro Zyklus erfasst. Der Quotient aus programmiertem Stimulationsintervall des Stimulationsapparates und beobachteter Zykluslänge der ventrikulären Extrasystolen im EKG betrug insgesamt 1,00 +/- 0,03.

Es handelt sich somit um durch den fokussierten Ultraschall induzierte monomorphe ventrikuläre Extrasystolen. Die lineare Abhängigkeit zwischen applizierter

(49)

Ultraschallzykluslänge und Zykluslänge der beobachteten ventrikulären Extrasystolen ist in Abb. 25 in graphischer Form dargestellt.

Wie in Abb. 24 (EKG-Beispiel II, S. 50) dargestellt, wurde die Aktivität des Sinusknotens des Herzens (Zykluslänge der Spontanaktionen: 560ms) durch die Ultraschallstimulation nicht verändert. Die P-Welle (markiert mit blauem Pfeil) lässt sich in der gesamten Aufzeichnung „durchzirkeln“. Deutlich sind monomorphe Kammerextrasystolen mit einer Zykluslänge von 420ms zu erkennen. Somit besteht eine VA-Dissoziation, was den ventrikulären Ursprung dieser Extrasystolen beweist.

Dieser Effekt war reproduzierbar und ließ sich auch bei einer Zykluslänge von 440ms (siehe Abb. 23, EKG-Beispiel I) nachweisen.

Tab. 1: Durchschnittliche Zykluslänge pro Schrittmacherpulslänge in Millisekunden Stimulations-

intervall [ms] Zykluslänge

der VES [ms] Anzahl der

Runs Anzahl der

PVC’s Sinusrhythmus vor PVC -Serie [ms]

400 402 ± 12 11 73 602 ± 71

416 419 ± 16 3 7 1020 ± 85

420 422 ± 7 10 31 742 ± 272

440 439 ± 8 1 5 540

540 538 ± 5 3 8 1032

(50)

Abb. 23: EKG-Beispiel I, VES mit einer Frequenz von 440ms

Abb. X EKG-Beispiel II

(Abb. 24, EKG-Beispiel II, VES

Abb. 24: EKG-Beispiel II, VES mit einer Frequenz von 420ms Die P-Welle läuft mit einer

Frequenz von 560ms durch, unabh. von der Stimulation des Ventrikelmyokards mit 420ms.

Es besteht ein AV-Block.

Die P-Welle läuft durch, unabh. von der Stimu- lation des Ventrikel- myokards mit 440ms.

Es besteht ein AV-Block.

Die P-Welle läuft mit einer Frequenz von 560ms durch, unabh. von der Stimulation des Ventrikelmyokards mit 420ms.

Es besteht ein AV-Block.

(51)

Abb. 25: Abhängigkeit der Zykluslänge der VES von der Stimulationsfrequenz

Abb. 26: Änderung der Eigenfrequenz unter der Ultraschallapplikation

350 400 450 500 550 600

350 400 450 500 550

Stimulationsfrequenz (ms)

VES Zykluslänge (ms)

0 200 400 600 800 1000

0 100 200 300 400 500

Stimulationsfrequenz (ms)

VES Zykluslänge (ms) • Eigen-frequenz vor

Ultraschall- applikation

(52)

3.2.1. Relevante Laborparameter

Im Anschluß eine graphische Übersicht der während der Experimente erhobenen laborchemischen Kontrollparameter.

Abb. 27

Abb. 28

Arteriell:

---

Dialysat:

---

pH-Wert

7 7,2 7,4 7,6 7,8 8

pH

pO2

0 100 200 300 400 500 600 700

pO2 (mmHg)

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´ 270´

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´ 270´

(53)

Abb. 29

Abb. 30

Abb. 31 Kalium

0 12 3 45 6 7 89 10

Zeit (min.)

Kalium (mmol/l)

pCO2

0 10 20 30 40 50 60 70 80

pCO2 (mmHg)

Hb

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Hb (g/dl)

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´ 270´

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´ 270´

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´

Zeit (min)

(54)

Abb. 32

Abb. 33 Natrium

120 130 140 150 160 170 180 190 200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Zeit

Natrium (mmol/l)

Calcium

0 1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Zeit

Calcium (mmol/l)

Arteriell:

---

Dialysat:

---

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´

base 0´ 10´ 30´ 60´ 90´ 120´ 150´ 180´ 210´ 240´

(55)

3.2.2 Tabellarische Darstellung der Organparameter

3.2.2.1. Übersicht der Parameter von Herz 1

Lokalzeit 12:00 12:10 12:30 13:00 13:30 14:00 14:30

Applikationen 0 10 30 60 90 120 150

Calcium Braun 20% (ml) Dial 10 10 5

NaHCO³ 8,4% (ml) Dial 5 5

Arterenol ® 1:100 (ml) art 2

Elektr. Defibrillation (50J) 3 3 10 13

Lokalzeit 15:00 15:30 16:00 16:30 17:00 17:30 18:00 Applikationen 180 210 240 270 300 330 360 Calcium Braun 20% (ml) Dial 10 10 5

NaHCO³ 8,4% (ml) Dial 5 5

Arterenol ® 1:100 (ml) art 2

Elektr. Defibrillation (50J) 3 3 10 13

Applikationen gesamt

Calcium Braun 20% (ml) Dial 25 NaHCO³ 8,4% (ml) Dial 10 Arterenol ® 1:100 (ml) art 2 Elektr. Defibrillation (50J) 32

Ischämie

warme Ischämiezeit 03:20 min kalte Ischämiezeit 03:06 Std

Organgewicht

prä-experimentell [g] 497 post-experimentell [g] 612

Perfusat und Dialysat Blutvolumen (ml) 1269 Dilution mit Dialysat (ml) 731 Dialysat Volumen (ml) 3000

BSA [g] 293

Insuman Rapid (µl) 183 Tab.2

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