Klinische Chemie Christian Lehmann 27. Oktober 2004

Klinische Chemie

Christian Lehmann 27. Oktober 2004

Inhaltsverzeichnis

I Allgemeines 3

II Stowechselerkrankungen 4

1 Phenylketonurie (PKU) 4

1.1 Ursache . . . 4

1.2 Symptome . . . 4

1.3 Der Phenylalanin- / Eiweiÿstowechsel . . . 4

2 Diabetes mellitus 5 2.1 Grundlagen - Stowechsel . . . 5

2.1.1 Die Phosphorfruktokinase . . . 6

2.1.2 Die hormonelle Regulation des Stowechsels . . . 7

2.2 Historischer Hintergrund Diabetes mellitus . . . 7

2.3 Diabetes mellitus als Stowechselstörung . . . 8

2.3.1 Diabetische Stowechselsituation unter Insulinmangel . . 9

2.4 Pathogenese des Typ I-Diabetes mellitus . . . 10

2.5 Pathogenese des Typ II-Diabetes mellitus . . . 10

2.6 Laborparameter des Diabetes mellitus . . . 11

2.6.1 Blutzuckerspiegelkontrolle mit der Hexokinasemethode . . 11

2.6.2 Lipoproteine . . . 12

2.6.3 Gesamtcholesterinbestimmmung . . . 12

2.6.4 Mikroalbumine und Nephropatie . . . 13

2.6.5 Weitere Laborparameter des Diabetes mellitus . . . 13

III Der Analysengang in der klinischen Chemie 14

3.2 Rangfolge der Analysenmethoden . . . 15

3.2.1 Anforderungen an Referenzmethoden . . . 16

3.2.2 Referenzintervalle/-bereiche . . . 16

1

4 Analysenmethoden der Klinischen Chemie 16

4.1 Photometrische Methoden . . . 16

4.1.1 Die NIR-Spektroskopie . . . 17

4.1.2 Luminiszenzspektroskopie . . . 17

4.2 Enzymdiagnostik . . . 18

4.2.1 Enzymnomenklatur . . . 18

4.2.2 Gründe für den Einsatz der Enzymdiagnostik . . . 18

4.2.3 Arbeitsweise von Enzymen . . . 19

4.2.4 Die Bestimmung der Enzymaktivität . . . 19

4.2.5 Aktivitätssteigerung bei Organschäden . . . 19

4.3 Diagnostik an Leber und Galle . . . 20

4.3.1 Der schematische Aufbau der Leber . . . 20

4.3.2 Typische Leberschädigungen . . . 20

4.3.3 Ursachen von Lebererkrankungen . . . 20

Teil I

Allgemeines

Die Klinische Chemie befasst sich in erster Linie mit Körperüssigkeiten und deren Bedeutung für die Erkennung, Dierenzierung und Verlaufskotrolle von Krankheiten. In direktem Zusammenhang damit stehen die sogenannten Labor- parameter. Diese sind messbare Gröÿen, welche als Indikatoren für den Zustand des Organismusses angesehen werden.

In der moderneren Zeit gewinnt die Suche nach neuen Targets zunehmend an Bedeutung. Als Targets bezeichnet man dabei Zielmöleküle, welche mit bestimmten Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Die Kenntnis dieser Moleküle ermöglicht wiederum eine verbesserte Erkennung und Behandlung der untersuchten Krankheit.

Teil II

Stowechselerkrankungen

1 Phenylketonurie (PKU)

1.1 Ursache

Die Phenylketonurie ist eine autosomal-rezessive Stowechselerkrankung (beide Elternteile haben das beschädigte Gen, es bricht jedoch erst beim Kind aus).

Betroen von dieser Störung ist etwa jeder 10.000ste. Bei PKU handelt es sich um einen Defekt im Phenylalaninstowechsel (und damit im Aminosäurestof- fwechsel), weil das entsprechende Gen für den Abbau fehlt / defekt ist.

Abbildung 1: Phenylalanin

1.2 Symptome

PKU führt in erster Linie zu Demenz und Schwachsinn. Begleiterscheinungen sind sowohl eine Hypothyorese (Schilddrüsenunterfunktion), als auch eine sehr helle Pigmentierung des Körpers.

1.3 Der Phenylalanin- / Eiweiÿstowechsel

Abbildung 2: Eiweiÿ-/Phenylalaninstowechsel

Die Reaktionstyp der Transaminierung bezeichnet den Austausch einer Amino- gruppe.

Wie man aus dem Schema leicht ablesen kann eigenen sich als Laborpa- rameter (Indikatoren für eine PKU-Erkrankung) sowohl die Konzentration an

Phenylalanin, als auch die Konzentration des Abbauproduktes Phenylbrenz- traubensäure.

Als weiteren Aspekt der klinischen Chemie sei hier im Zusammenhang mit PKU der Süÿsto Aspartan (Aspartylphenylalaninmethylester, wie er sich z.B.

in Cola light bendet) erwähnt. Ein Patient mit PKU sollte selbstverständlich Speisen und Getränke meiden, welche Süÿstoe dieser Art enthalten, um nicht seinen Phenylalaninspiegel weiter künstlich zu erhöhen.

2 Diabetes mellitus

Diabetes mellitus ist eine Entgleisung des Kohlehydrath- und Fettstowechsels, was in erster Linie schwere Langzeitschäden verursacht. Solche Langzeitschäden treten vor allem an Augen, Herz, Gefäÿen, Nieren und Nervensystem auf. Die Haupttodesursache ist das Nierenversagen.

In Deutschland zählt man etwa 6-7 Millionen Diabetiker (alleine Typ-II), wobei die Dunkelzier erheblich gröÿer sein dürfte. So gab man im Jahre 1998 etwa 31,4 Milliarden DEM für die Behandlung von Diabetikern aus, wovon nur ein sehr kleiner Teil für Medikamente aufgewendet wurde.

2.1 Grundlagen - Stowechsel

Abbildung 3: Überblick Stowechsel

ATP ist die Abkürzung für Adenosintriphosphat, NADPH steht für Nicoti- namidadenosdinicotidphosphat x H₂O. Bei diesem groben Schema bezeichnet man die linke Seite (also den Abbau von Nährstoen und den damit verbunde- nen Energiegewinn) als Katabol, den rechten (also den Aufbau körpereigener Substanzen) als Anabol.

Stowechesel ist ein kompliziertes Netzwerk verschiedener Reaktionen. Die Vorlesung wird sich dabei mit folgenden Teilaspekten auseinandersetzen:

• Grundstrategie des Metabolismus

• Grundmodelle der Regulation

• Stowechselwege und -kontrolle

• Gehirn, Muskel, Niere, Leber

• Hormonelle Regulation

• Spezielle Stowechselsituationen

Abbildung 4: Überblick Energiestowechsel

Es existieren im wesentlichen zwei Typen von Regelungsmechanismen:

• Allosterische Mechanismen

• Kovalente Modikationen (oft Phosphorilierungen und damit Inaktivierung) Die Allosterischen Modikationen beruhen in erster Linie auf der Veränderung der Raumstruktur der betroen Enzyme. Ein Beispiel dafür ist die Andockung des ATP und damit die Drosselung der Glycolyse. Einen solchen Vorgang nen- nt man Endprodukthemmung, weil das Endprodukt die eigentliche Reaktion direkt hemmt.

Mit kovalenten Modikationen durch Phosphorilierungen mit Hilfe von Ke- nasen kann man ein regelrechtes An- und Ausschalten erreichen.

2.1.1 Die Phosphorfruktokinase

Die Phosphorfructokinase steuert durch Regulation der Glycolyse die Geschwindigkeit des Glucose-Abbaus.

Die Regelung im oben gezeigtem Energiestowechsel erfolgt meist alloster- isch und kann an verschiedenen Punkten ansetzen.

BILD SCHEMA Glucose-Abbau

Teilweise existieren verschiedene Enzyme für gleiche oder sehr ähnliche Auf- gaben. So ndet man die Hexokinase im Muskel, die Glucokinase dagegen vornehm- lich in der Leber. Die Gluconeogenase dagegen ist für die Umwandlung von Aminosäuren in Glucose verantwortlich.

BILD SCHEMA

Der Blutzuckerspiegel eines gesunden Menschen liegt etwa zwischen 80 und 100 mg/dl Blut. Dabei ist die Leber für die Homöostase dieses Zuckerspiegels verantwortlich. Die Grenze zum Koma liegt etwa bei 40 mg/dl, welches eine

Schutzfunktion des Körpers darstellt, da er einfach den gröÿten Energiever- braucher des Organismus (das Gehirn) abschaltet, um wenigstens weiter über- leben zu können.

Zwischen den Leberzellen und den Muskelzellen existíert der so genannte CORI-Zyklus, welcher das Wechselspiel zwischen Leber- und Muskelzellen beschreibt.

BILD CORI-Zyklus

Zwischen den Fettzellen und der Leber besteht ein ähnlicher Zyklus, der jedoch keinen bestimmten Namen trägt.

BILD FETTZELLENZYKLUS

Bei der Diabetes mellitus spielen in erster Linie Insulinrezeptoren eine Rolle, welche sich (wie in den Schemen zu erkennen), sowohl an Leber- und Muskel-, als auch an Fettzellen benden.

Fette werden, im Gegensatz zu den anderen, im Darm aufgenommenen, Nährstoen nicht mit dem Blut transportiert, sondern gelangen über das lym- phatische System (in Chylomykronen) zu ihrem Zielort. In diesem Zusammen- hang sind noch die so genannten VLDLs (Very low density Lipoprotein) zu nennen, welche auch als Fetttransporter dienen.

2.1.2 Die hormonelle Regulation des Stowechsels

Bei der hormonellen Regulation des Stowechsels spielt Insulin eine sehr wichtige Rolle. Es ist ein anaboles Hormon, sorgt also dafür, dass speicherbare Stoe ein- lagert werden:

• Glucose wird als Glycogen gespeichert oder in Fette umgewandelt

• Nahrungsfette werden als Depofette in Adipozyten eingelagert

• Aminosäuren werden in Proteine eingebaut

Diese Wirkungen sorgen dafür, dass der Blutzuckerspiegel gesenkt wird.

Die Funktionsweise des Insulins beruht auf der Bindung an entsprechende Insulinrezeptoren, welche an jeder beteiligten Zelle vonrhanden sind. Dies hat zur Folge das eine Information an den Zellkern weitergegeben wird, welcher dann entsprechende Glucosetransporter synthetisieren lässt, bzw. die vorhandenen in die Zellmembran einbaut. Dadurch wird die im Blut vorhanden Glucose in die Zellen aufgenommen und zu den Mitochondrien transportiert, um dort in direkt für die Zelle nutzbare chemische Energie umgewandelt zu werden - es wird also ATP aus ADP synthetisiert.

Die Insulinausschüttung wird durch Sensoren / Rezeptoren gesteuert, welche auf erhöhte Blutzuckerspiegel reagieren. Das sorgt dafür das der Blutzucker- spiegel nicht über einen bestimmten Wert ansteigen kann.

2.2 Historischer Hintergrund Diabetes mellitus

Der Begri des Diabetes mellitus ist uns schon aus der Antike bekannt, in welch- er auch dieser Name des Krankheitsbildes geprägt wurde. So bedeutet Diabetes Harn und mellitus honigüÿ, was darauf hindeutet, dass Glucose durch die Niere ausgeschieden wird. Eine zweite sehr frühe Beobachtung war das Schmelzen von Fleisch und Gliedern zu Harn. Dieses ist damit zu deuten, dass ein Diabetiker

ja keine oder nur sehr wenige Speicher ausbildet und der Harnuss sehr stark erhöht ist.

• 1868: Langerhans ndet Zellhaufen (Inseln) im Pankreas

• 1889: Minkowski erkennt den Zusammenhang zwischen Blutzuckerspiegel und Pankreas

• 1921: Banting und Best beschreiben das Insulin

• 1923: erhalten die beiden den Nobelpreis für diese Arbeit

• 1923: gelingt die erste industrielle Herstellung von Insulin

• 1983: gelingt es Humaninsulin aus Schweineinsulin zu synthetisieren (rekom- binantes Humaninsulin)

• 1996: ndet man das erste, kurz wirksame, Insulinanaloge

• Ende 2004: Verfügbarkeit von inhalativem Insulin geplant

1998 hatte die Welt einen Gesamtverbrauch an Insulin von etwa 5-6 Tonnen pro Jahr. Solche Mengen sind nur durch die neuen gentechnologischen Verfahren denkbar, denn schon zu Beginn der industriellen Herstellung verbrauchte man allein bei Höchst etwa 11 t Schlachttiere (etwa 100.000) pro Tag bei einem weitaus geringeren Insulinbedarf als heute.

Der Begri Diabetes steht im Allgemeinen nur für den Befund des gesteigerten Harnusses. So existiert neben der hier behandelten Form mellitus z.B. die Form des Diabetes insipidus. Bei dieser Krankheit ist der Betroene nicht (mehr) in der Lage das antidiuretische Hormon (gebildet im Hypophysenvorderlap- pen, abgekürzt ADH) im ausreichenden Maÿe zu produzieren. Konsequenz ist, dass der Harn nicht mehr konzentriert werden kann und somit praktisch der Primärharn (Harn vor der Rückresorption) direkt ausgeschieden wird. Resulat ist ein Harnuss von 25-30 Litern pro Tag. Abhilfe schat in diesem Falle die Gabe dieses Hormons mit Hilfe eines Nasensprays.

Ein ähnlicher Eekt, wie bei dieser Krankheit, ist beim Konsum von Alkohol zu bemerken. In diesem Fall hemmt das Ethanol das ADH, weshalb ein stärkerer Harnuss als üblich zu beobachten ist.

2.3 Diabetes mellitus als Stowechselstörung

Durch die allgemeine, anabole Wirkung des Insulins, ist Diabetes mellitus nicht nur, wie fälschlicherweise oft angenommen, eine Störung des Kohlenhydrat-, sondern auch des Fett- und Proteinstowechsels.

Nach WHO (World Health Organisation) teil man Diabetes mellitus in drei Formen auf:

• Typ I: insulinabhängig, klassischer Insulinmangel

• Typ II: zum Teil insulinabhängig, Unterteilung in durch Sekretionsstörung und durch Insulin-Resistenz

• sekundäre Diabetesformen: Pankreas, endokrine (also hormonelle) Störun- gen, Cushing-Syndrom (Cortison), Akromegalie, Phäochromozyten (Adrenalin)

2.3.1 Diabetische Stowechselsituation unter Insulinmangel

Der Kohlenhydratstowechsel ist gehemmt, was eine geringe Glucosever- wertung aufgrund einer:

• Störung des Glucosetransportes in Fett- und Muskelzellen (Glucosetrans- porter, siehe 2.1.2, Seite 7)

• Fehlenden Induktion von Glycolyseenzymen (bzw. nicht gestarteten Gly- colyse)

• Gesteigerten Glycogenolyse (Anzapfen des Glycogenspeichers)

• Herabgesetzten Glycogensynthese

• Gesteigerten Glyconeogenese (Umkehrung der Glycolyse mit Aufbau von Glucose)

Folgen sind eine Hyperglucosämie (erhöter Blutzuckerspiegel) und eine Gluco- surie (Glucose im Harn). Da die Nierenschwelle allerdings für Glucose sehr hoch ist kann man zwischen dem Glucosespiegel im Harn und dem im Blut keinen direkten Zusammenhang herstellen. Die Symptome sind in erster Linie Durst, Polyurie (erhöter Harnuss) und Gewichtsverlust. Der Durst ensteht durch die Ausscheidung von Glucose, wodurch die Elektrolytkonzentration im Primärharn erhöht ist. Aufgrund dessen wird mehr Wasser als üblich durch den Harn aus- geschieden und es entsteht das Durstgefühl.

Der Lipidstowechsel zeichnet sich in dieser Situation durch eine gesteigerte Lipolyse im Fettgewebe aus. Dabei werden die vorhandenen Speicherfette abge- baut und die Konzentration an Glycerin und Fettsäuren im Blut steigt. Gle- ichzeitig ist die Synthese neuer Speicherfette im Fettgewebe entsprechend gehemmt.

Auch die Acetyl-CoA-Carboxylase zeigt eine stark verminderte Aktivität. Da- raus resultiert ein gestörter Acetyl-CoA-Umsatz in der Leber:

• Hohes Angebot an freien Fettsäuren, vermehrte Bildung von Acetyl-CoA (C2-Körper)

• Verminderung des Acetyl-CoA-Umsatzes im Citratzyklus

• Gesteigerte Fettsynthese in der Leber

• Gesteigerte Cholesterolsynthese

• Gesteigerte Ketonkörperbildung (Kondensate von Acetyl-CoA > Körper übersäuert)

• Gesteigerte VLDL-Synthese

Die Folgen sind erhöte Plasmaspiegel an freien Fettsäueren, Glycerol, VLDLs und Ketonkörpern. Die Symptome sind Abmagerung, Atheroskleroseneigung, Metabolische Acidose (Acetessigsäure, pH-Wert sinkt, Diurese gesteigert), os- motische Diurese bis zum Coma diabeticum.

Der Eiweiÿstowechsel zeichnet sich in dieser Stowechselsituation durch eine gesteigerte Proteolyse im Muskel und Leber, einer verminderten Proteinsyn- these und einer gesteigerten Harnstosynthese in der Leber aus. Dadurch entste- hen Symptome wie Abmagerung und Adynamie (krankhafte Muskelschwäche).

2.4 Pathogenese des Typ I-Diabetes mellitus

Kennzeichenend für Typ I-Diabetiker ist eine genetische Prädisposition (Veran- lagung). Zur Ausblidung eines vollen Diabetes mellitus führen mehrere Stufen:

• Umwelteinüsse: Virusinfektion (gehäuft in Herbst und Winter), oft nach Mumps oder einem kongenitalem Rötelinfekt

• Autoimmunreaktion: Bildung von Antikörpern gegen β-Zellen (70-80%, Bildung des Insulins), Insulitis (Entzündung derβ-Zellen) / lymphozytäre Inltration

• Dauerhafter Verlust derβ-Zellen: sind über 80% betroen entstehen Dia- betessymptome

• voll ausgebildeter Diabetes mellitus

Vor allem in der Frühdiagnostik sucht man nach Autoantikörpern und Ketonkör- pern, die erstaunlicherweise in erster Linie beim Typ I gebildet werden.

2.5 Pathogenese des Typ II-Diabetes mellitus

Etwa 90% der Typ II-Diabetis entsteht durch Fettsucht (adipös, mehr als 20%

Körpergewicht ist Fett). Den Mechanismus soll folgendes Scheme verdeutlichen:

SCHEMA ENTSTEHUNG TYP II

Im Endeekt werden in den meisten Fällen die β-Zellen, bei genetischer Disposition, schlichtweg überfordert. Das schlimme ist, dass dieser Typ II erst nach 20-30 Jahren manifest wird.

10-15% Typ II - Diabetiker haben keine Insulinresistenz entwickelt. Ihr Krankheitsbild beruht auf Sekretionsstörungen.

Metabolisches Syndrom BILD METABOLISCHES SYNDROM

Das Metabolische Syndrom ist auch unter Syndrom-x oder Wohlstandssyn- drom bekannt. Vor allem der dritte Namen macht deutlich, das dieses Syndrom hauptsächlich in westlichen Ländern beobachtet wird. Es ist eine extreme Form der Überernährung, welche Kohlenhydrat-, Lipid- und Eiweiÿstowechsel aus dem Gleichgewicht bringt. Die Störung des Kohlenhydratstowechsels führt oft zur Diabetes mellitus, die des Lipidstowechsels dagegen zu Dyslipoproteinämie und Adipositas (Fettsucht). Die Veränderungen im Eiweiÿstowechsel haben in vielen Fällen eine Gicht zur Folge.

Weitere Folgen sind Arteriosklerose und eine Hypertonie (Bluthochdruck), pathogenetisch entscheidend ist jedoch die Insulinresistenz.

2.6 Laborparameter des Diabetes mellitus

Eine wichtige Rolle in der klinischen Chemie bezüglich des Diabetes mellitus spielen:

• Blutzuckespiegelkontrolle

• Bestimmung des Lipidproles (Arterioskleroserisiko):

Gesamtcholesterin

LDL/VLDL, HDL (als Cholesterinfraktionen) Triglyceride

weitere arteriogene Faktoren (Bedeutung für das Krankheitsgeschehen):

∗ Homocystein

∗ Lipoprotein a (LDL abgewandelt)

∗ hsCRP (high sensitive C-reaktives Protein), ein Frühmarker für Arteriosklerose

• Mikroalbumine (kleine Mengen an Albuminen, welche durch die Niere aus- geschieden werden, Anzeichen für die Verschlechterung der Filter in den Glomeruli)

2.6.1 Blutzuckerspiegelkontrolle mit der Hexokinasemethode Weltweit anerkannt ist auch in diesem Falle die Beurteilung des Kapillarblutes nach WHO:

• Normale Glucosetoleranz:

Nüchternblutglucose<120^mg_dl 2 h nach Belastung<120^mg_dl

• Gestörte Glucosetoleranz:

Nüchternblutglucose<120^mg_dl 2 h nach Belastung140−200^mg_dl

• Diabetes mellitus:

Nüchternblutglucose>120^mg_dl 2 h nach Belastung>200^mg_dl BILD BLUTZUCKERSPIEGELKURVEN

Die hier vorgestellte Methode ist eine Referenzmethode, d.h. sie ist eine von Ärztekammern in Präzision und Richtigkeit denierte Methode:

• Glucose+AT P →Glucose-6-P+ADP (unter Katalyse durch die Hex- okinase)

• Glucose-6-P +N ADP → Gluconolacton-6-P +N ADP H +H⁺ (unter Katalyse der Glucose-6-P-Dehydrogenase)

BILD REAKTION MIT STRUKTURFORMELN

Die Spezität dieser Methode beruht nicht auf der 1. Reaktion (die Hex- okinase phosphoriliert alle C6-Körper), sondern an dem spezischen Enzym, welches bei der zweiten Reaktion eingesetzt wird. Diese gängige Methode wird z.B. benutzt, um den Ruheblutzuckerspiegel zu bestimmen. Eine abgewandelte Form dieser Reaktion wird auf so genannten Biosensoren benutzt, welche die Blutzuckerspiegelkontrolle bequem daheim bieten können.

2.6.2 Lipoproteine BILD LIPOPROTEIN

Der Körper benutzt Lipoproteine in erster Linie als Transportvehikel für Lipide, da diese sich nicht in Wasser und damit auch nicht im Blut lösen.

Ihre Aufgabe ist es sozusagen zwischen hydrophil und lipophil zu vermitteln.

Lipoproteine haben aus diesem Grund auÿen Phosphorlipide, welche einen Kopf aus einem Phosphatrest und einen lipophilen Schwanz besitzen. Die lipophilen Gruppen ragen im Protein nach innen und die hydrophieln Phosphatreste nach auÿen. Innen wird das Cholesterol verestert und in das Protein integriert. Apolipopro- teine halten das gesamte Vehikel in Lösung und sind gleichzeitig die Erken- nungsstellen für die Rezeptorerkennung.

2.6.3 Gesamtcholesterinbestimmmung

Bei vielen Verfahren und Messungen in der klinischen Chemie wird nicht der Spiegel direkt gemessen, sondern man benutzt Zwischen- oder Endprodukte chemischer Reaktionen. Oft behilft man sich dabei eines Verfahrens, bei dem am Ende H2O2 entsteht, das jedoch leicht durch andere, im Blut anwesende, Stoe oxidiert werden kann. Ein Sto ist zum Beispiel die Ascorbinsäure. Die Konsequenz ist dabie, das der bestimmte Spiegel kleiner ist als der tatsächliche Wert. Auch die Gesamtcholesterinbestimmung ist ein Verfahren, bei dem am Ende das gebildeteH2O2 gemessen wird.

Zielwerte für Blutlipide:

• Gesamtcholesterin:<180^mg_dl

• LDL-Cholesterin:<100^mg_dl

• HDL-Cholesterin:>45^mg_dl (Gegenspieler des LDL-Cholesterins)

• Triglyceride(nüchtern):<150^mg_dl (tageszeitabhängig)

Die ersten drei Werte kann man als tageszeit-unabhängig ansehen, die Triglyc- eride hängen jedoch sehr davon ab und steigen vor allem nach dem Verzehr fettreicher Kost stark an.

Homocystein BILD Homocysteinstowechselschema

Bei einem Mangel an Vitamin B12 / Folsäure steigt der Homocysteinspiegel stark und führt schnell zu einer ersten Veränderung des Endothels der Blutgefäÿe

2.6.4 Mikroalbumine und Nephropatie

Albumine sind die häugsten Proteine im Blutplasma und dienen in erster Linie der Aufrechterhaltung des osmotischen Druckes und sekundär als En- ergiereserve. Normalerweise werden keine dieser Albumine über die Niere aus- geschieden. Ist jedoch das Filtrationsnetz in den Glumeroli beschädigt können Albumine mit dem Harn ausgeschieden werden. Um solche Nierenschädigungen frühzeitig erkennen und damit behandeln zu können werden oft als Vorsichts- maÿname (bei gefärdeten Personengruppen, wie z.B. Diabetikern) so genannte Mirkoalbumine im Harn bestimmt.

Als Mikroalbumie bezeichnet man eine Symptomatik, bei der langanhaltend eine leicht erhöhte renale Albuminausscheidung auftritt. Man spricht dabei von Konzentrationen zwischen 20 und 200 ^mg_dl im Harn. Dieses Krankheitsbild kann nicht mit normalen Teststreifen auf Eiweiÿe bestimmt werden, da die Konzen- tration dafür viel zu gering ist. Aus diesem Grund war man gezwungen eine neue Methode zu entwickeln um solche Konzentrationen an Albuminen sicher bestimmen zu können.

Bei der Bestimmungsmethode verwendet man ein immunologisches Reak- tionsprinzip. Die Reagenz besteht dabei aus goldmarkierten Albumin-Antikör- pern. Im Handel sind solche Tests z.B. unter dem Namen Micral-Test.

BILD Teststreifen schematisch

Die diagnostische Bedeutung ist sehr groÿ, da man mit diesen sehr früh beginnende Nephropatien (z.B. in Folge einer Diabetes) sicher erkennen und be- handeln kann (Mikroangiopathie). Auch heutzutage ist die häugste Todesur- sache unter Diabetikern das akute Nierenversagen.

2.6.5 Weitere Laborparameter des Diabetes mellitus

Der HbA1c-Wert ist das so genannte Glucosegeächtnis des Köpers und er- möglicht eine Rückverfolgung des Glucosespiegels für etwa 4-6 Wochen. So ist es möglich zu erkennen, ob der Diabetiker richtig eingestellt ist und ob über diesen Zeitraum Hyper- oder Hypoglycämien aufgetreten sind.

Bei diesem Test macht man es sich zu Nutze, das bei hohen Glucosespiegeln ein Teil der Glucose Reaktionen mit Proteinen eingeht. Ein Beispiel für ein solches Reaktionsprodukt wäre das Hb-Hämoglobin, welches bei dieser Messung bestimmt wird. Ein HbA1c-Wert von etwa 8% gilt als physiologisch.

BILD glyciertes Hämoglobin

Die C-Peptidbestimmung ermöglicht die Kontrolle der Insulinsekretion (al- so der Insulinproduktion und Abgabe). Damit ist es möglich gutartige Tumore (Insulinome) nachzuweisen. Auch kann man sehen, ob bei einer festgestellten Insulinüberdosis (als Doping oder in Selbstmordabsicht) Insulin gespritzt oder vom Köper selbst produziert wurde. Man macht sich dabei zu Nutze, dass bei der Biosynthese von Insulin die Vorstufen Präpoinsulin und Proinsulin jeweils ncoh ein C-Petid besitzen, was im letzten Schritt abgespalten und freigesetzt wird. Dieses C-Peptid hat im Köerper eine längere Halbwertszeit.

Teil III

Der Analysengang in der klinischen Chemie

BILD SCHEMA Analysengang

Auf eine Bestimmung eines Wertes in der klinischen Chemie wirken viele, teilweise sehr verschiedene Faktoren. Eine groÿe Teilgruppe sind die biologischen Einuÿgröÿen, welche den beobachteten Organismus betreen (Alter, Geschlecht, Erbfaktoren, Ernährung, körperliche Aktivität, Körperlage, Zirkadiane Rhyth- men, Arzneimittel):

• Alter:

Glucosetoleranz nimmt mit zunehmenden Alter ab (physiologisch höherer Basalwert)

Nierenfunktion ist im Alter stark herabgesetzt (glumerole Analysen- reihe)

• Geschlecht:

Frauen besitzen ab dem etwa 15. Lebensjahr deutlich höhere Choles- terolwerte als Männer

• Ernährung:

spiegelt sich vor allem in stark veränderlichen Parametern wieder Fasten kann z.B. zur Bildung von Ketonkörpern als Energiequelle

führen

• Körperliche Aktivität:

die Kreatinkinase dient zur Umwandlung von ATP in ADP als schneller Energielieferant

bei Bodybildern ndet man häug stark erhöhte Kreatinkinasewerte im Serum, welche jedoch als physiologisch anzusehen sind

• Zirkadiane Rhythmen / Biorhytmen:

spielen in der Diagnostik eine sehr wichtige Rolle

z.B. Häufung von Astmaanfällen nachts zwischen 3 und 4 Uhr (aus- gelöst durch Histaminausschüttung, Bronchien nachts verengt, Corti- solspiegel niedrig), weshalb entsprechende Medikamente im Normal- fall abends verabreicht werden

mehrfache Messung solcher stark schwankenden Werte, um Statistik bemühen zu können

• Arzneimittel:

Dieuretika verursachen Ausscheidung von Elektrolyten, führt zu Hy- pokalämie (niedrigerer Kaliumwert), Insulinausschüttung gehemmt, gestiegene Glucosetoleranz

Cortisolgabe verursacht Erhöhung der Gluconeogenese, was sich in einer Diabetes niederschlagen kann

Cytostatika (Krebsmedikamente) verursachen beim Abbau im Körp- er erhöhte Harnsäurewerte, welche versehentlich als Gichtanzeichen gedeutet werden können

bei Medikamenten zur Behandlung einer HIV-Infektion triit häug das so genannte Lipodystrophiesyndrom (peripherer Fettabbau, zen- trale Fettakkumulation) auf, welcher zu einer Hyperlipidämie und längerfristig zu einer Insulinresistenz führt

3 Messgenauigkeit und Störfaktoren der Mess- methoden

3.1 Präzision und Statistik

Die Präzision einer Messung trit eine Aussage über die Streuung der Messwerte.

Dabei betrachtet man einen Mittelwert (meistens das arithmetische Mittel) und die Gröÿe des Bereiches, in welchem sich die meisten anderen Messwerte (95%) benden.

TABELLE BESPIELMESSWERTE

Bei der Angabe eines Messwertes werden daher immer der Mittelwert, sowie die Standardabweichung s (eventuell zuzüglich systematischer Fehler) angegeben.

Innerhalb+/−s liegen 66% der Messwerte, innerhalb der doppelten dann nahezu alle. Dividiert man Standardabweichung durch Mittlewert erhält man die relat- ice Standardabweichung, bzw. den variationskoezient. Dieser ist (im Gegen- satz zur Standardabweichung) unabhängig vom der Höhe des Messwertes. Für die eizelnen üblichen Methoden sind erlaubte Varianzkoezienten in Tabellen- werken dokumentiert.

3.2 Rangfolge der Analysenmethoden

• Denitive Methoden / Direkte Methoden:

Richtwerte und Genauigkeiten für untergeordnete Methoden häug teuer und aufwendig

nur in sehr sehr wenigen Speziallabors durchführbar

• Referenzmethoden:

Abweichungen vom wahren Wert vernachlässigbar klein für Praxis trotzdem noch zu teuer / aufwändig

siehe auch Abschnitt 3.2.1, Seite 16

• Routinemethoden:

hinreichend zuverlässig

hinreichend praktikabel und billig

3.2.1 Anforderungen an Referenzmethoden

Entscheidend für Referenzmethoden sind in erster Linie ihre denierte Richtigkeit und Präzision, sowie die Transferierbarkeit der Methode. Wichtig ist auch, das alle Störanfälligkeiten des Prinzipes bekannt sind.

Referenzmehtoden dienen nicht direkt zur Messung, ihre Hauptaufgabe ist die Überprüfung von Routinemethoden.

3.2.2 Referenzintervalle/-bereiche

Wichtig für die Beurteilung eines Messwertes in der Klinischen Chemie ist die Denition / Ermittlung von so genannten Referenzbereichen. Dabei handelt es sich um Intervalle, in denen ein Wert noch als normal (physiologisch) betra- chtet werden kann.

Dazu untersucht man eine möglichst homogene Referenzgruppe und ermit- telt Referenzwerte (Werte der Referenzgruppe). Die statistische Auswertung dieser ergibt die so genannte Referenzverteilung, von der man Mittelwert und Standardabweichung bestimmt. Im Referenzinterval sollen sich 95% der Ref- erenzwerte benden, weshalb man den Mittelwert +/−2*Standardabweichung als Referenzinterval deniert.

4 Analysenmethoden der Klinischen Chemie

• Photometrische Methoden:

Absorptionsspektroskopie (Spektralphotometrie) Reektometrie (Trockenchemie)

NIR-Spektrometrie

Luminiszenzspektrometrie (Bioluminiszenz)

• Proteinbindungsmethoden:

EIA: Enzymimmunoassay FIA: Fluoreszenzimmunoassay

FPIA: Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay

• Nucleinsäureanalytik (Forensik):

PCR-Reaktion RFLP-Analyse

4.1 Photometrische Methoden

Oft ist das Lambertsche Gesetz (gilt für monochromatisches Licht und stark verdünnte Lösungen) anwendbar:

• E=∗c∗d

• A=a∗c∗d

wobei d für die Schichtdicke, E für die Extingtion, A für die Absorption, für den Extingstions- und a für den Absorptionskoezienten steht.

Für Fälle, bei denen das Lambertsche Gesetz nicht anwendbar ist, kann man z.B. eine so genannte Ulbricht-Kugel einsetzen:

BILD Ulbrichtkugel

Bei der Ulbrichtkugel handelt es sich um ein Reotron, welches darauf basiert, dass das Streulicht für die Messelektrode gernger wird, sobald eine Probe in die Kugel eingeführt wird.

4.1.1 Die NIR-Spektroskopie

Die NIR-Spektroskopie ist ein relativ junges Verfahren. Man arbeitet bei dieser Methode im so genannten nahen Infrarotbereich, was andeuten soll, dass sich die Wellenlängen des verwendeten Lichtes unweit derer des sichtibaren Lichtes liegen.

In der Zukunft soll es mit dieser Art von Messmethode möglich sein, z.B.

einen Blutzuckerspiegel nicht invasiv zu bestimmen. Das ist möglich, da das nahe Infrarotlicht sehr gut, z.B. Hautstrukturen, durchdringen kann.

4.1.2 Luminiszenzspektroskopie

Die zu Grunde liegende Technik hat man sich bei den Glühwürmchen abgeschaut.

Diese Methode erlaubt es, Stoe bis in dem Femptogrammbereich zu bestim- men.Als Luminiszenz beschreibt man die Lichtemission angeregter Atome oder Moleküle, ohne das sich dabei eine Temeparaturänderung eintritt. Die Anre- gung kann durch Licht (h*f) (Floureszenz), durch radioaktive Strahlung oder durch eine chemische Reaktion erfolgen. Dabei ist das emitierte Licht immer langwelliger und damit energieärmer als z.B. die eregende Strahlung.

Vorraussetzung ist ein luminiszentes System, dem z.B. eine Reaktion En- ergie zuführt.

• Luzif erin+AT P →Lucif erinadenylat→angeregter Komplex(katalysiert durch die Luziferase und Magnesiumionen)

• angeregter Komplex→Oxylucif erin+AM P+P P i+ C O₂+Licht Die Anwendung wird vor allem durch die Empndlichkeit bestimmt. So ermöglicht diese Enzymmarker, welche wie eine Signalleuchte in einer Probe wirken können.

So hat man sie z.B. bei der Auswahl von Wirkstoen gegen Tuberkulose benutzt, welche weltweit mehr Menschenleben kostet als Malaria und Krebs zusammen. Man schätzt, das etwa ein Drittel der gesamten Weltbevölkerung mit Tuberkulose inziert ist. Aus diesem Grund existieren viele verschiedene Formen, welche häug resistent gegen bestimmte Medikamente geworden sind.

So ist es wichtig zu wissen, welches Medikament noch wirksam gegen den vor- liegenden Stamm wirksam ist. Dazu überträgt man das Luciferasegen in den Tuberbakter, wodurch dieser beginnt zu leuchten. Setzt man nun ein Medika- ment zu, welches in der Lage ist die Keime abzutöten, stoppt die Luminiszenz

ebenfalls. Ist die Probe dagegen resistent gegenüber dem eingesetzten Medika- ment, verändert sich die Luminiszenz sehr wenig oder auch überhaupt nicht.

Ein weiterer Anwendungbereich ist das so genannte CK-Screening (CK = Creatinkinase) bei einem Neugeborenen. Eine erhöhte Aktivität der CK deutet dabei auf Muskelerkrankungen hin. Man benutzt folgende Reaktion:

• Creatinphosphat+ADP →Creatin+AT P (katalysiert durch die Cre- atinkinase)

Das bei dieser Reaktion gebildete ATP wird eingesetzt, um die Luminiszenz anzustoÿen.

4.2 Enzymdiagnostik

Unter der Enzymdiagnostik versteht man Methoden der enzymatischen Analyse.

Im folgenden sollen wichtige Messverfahren für diagnostisch wichtige Enzyme und organspezische Enzymdiagnostik besprochen werden.

Man unterscheidet drei Enzymgruppen:

• Membranenzyme

• Zytosolische Enzyme

• Enzyme aus Organellen 4.2.1 Enzymnomenklatur

Jedes heute bekannte Enzym besitzt eine eindeutige Identikationsnummer, welches gleichzeitig seine Funktion klassiziert. Die Creatinkinase ndet man unter EC 2.7.3.2. Ihre Referenzwerte betragen bei Männern:

• <70 U/l bei 25^◦C

• <170 U/l bei 37^◦C

Die EC-Nummer bezeichnet man im Allgemeinen auch als Systemnummer. EC 2.7.3.2 bedeutet dabei:

• Klasse 2: Transferase

• Subklasse 7: Phosphattransferase

• Subsubklasse 3:N H2-Gruppe als Akzeptor

• abschlieÿende 2: Fortlaufende Nummer innerhalb der Subklasse

Entsprechende Werte und Referenzwerte für die Aktivitäten der Enzyme werden bei 37 ^◦C bestimmt.

4.2.2 Gründe für den Einsatz der Enzymdiagnostik

ergeben sich aus der Notwendigkeit einen Krankheitsverlauf zu beobachten (Ther- apieerfolgskontrolle) oder Dierenzdiagnostik anzuwenden. Seit dem 01.04.2003 werde entsprechende Referenzwerte nur ncoh bei 37 ^◦C bestimmt und in den RiliBÄK (Richtlinie der Bundesärztekammer) festgeschrieben.

4.2.3 Arbeitsweise von Enzymen

Um Enzyme vernünftig beurteilen zu können ist es zunächst nötig ihre grundle- gende Arbeitsweise und Gesetzmäÿigkeiten zu kennen.

Bei den folgenden Betrachtungen wird davon ausgegangen, dass die en- zymkatalysierte Reaktion so, oder zumindest so ähnlich abläuft:

• Enzym(E)+Substrat(S)→Enzym−Substratkomplex([ES])→Enzym(E)+

P rodukt(P)

Die Aktivität eines Enzyms wird in Enzymeinheiten (oder englisch Units) gemessen.

Dabei ist 1 U, die Substanzmenge, die 1µmolSubstrat pro Minute unter Stan- dardbedingungen umsetzt. Diese ist weiterhin abhängig von:

• Substratkonzentration

• ph-Wert

Enzyme besitzen in den meisten Fällen eine Michaelis-Menten-Kinetik. Dabei bedeutet eine geringere Michaelis-Menten-Konstante (KM) eine höhere Enzy- maktivität.

4.2.4 Die Bestimmung der Enzymaktivität

Die Bestimmung der Enzymaktivität kann durch einen einfachen Test erfolgen.

Als Beispiel soll die Messreaktion für die Lactatdehydrogenase (LD) erläutert werden:

• P yruvat+N ADH+H⁺*) Lactat+N AD⁺ (katalysiert durch die Lac- tatdehydrogenase)

BILD EXTINGTIONSKURVE

Benden sich in der Lösung Substrat im Überschuss und ausreichend Co- Faktor wird das Enzym voll ausgelastet undvmaxkann bestimmt werden. Hätte man keinen Überschuss an Substrat würde man eine geringe Geschwindigkeit alsvmax annehmen.

Ein weiteres, wichtiges Beispiel ist die Messreaktion für die Aktivität der Creatinkinase:

• Creatinphosphat+ADP *) Creatin+AT P(katalysiert durch die Cre- atinkinase)

• AT P+Glucose *) ADP+Glucose−6−P (erste Hilfreaktion)

• Glucose−6−P+N ADP⁺*) Gluconsaeure−6−P+N ADP H+H⁺ (zweite Hlfsreaktion, katalysiert durch Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase) 4.2.5 Aktivitätssteigerung bei Organschäden

• Leber und Galle: ASAT, ALAT,γ-GT,(GD)GLDH, AP, LDH-5

• Herzmuskel: CK-MB, ASAT, LDH-1

• Skelettmuskel: CK-MM, LDH-3, LDH-4, LDH-5

• Skelettknochen: AP

• Pankreas:α-Amylase, Lipase

4.3 Diagnostik an Leber und Galle

Die Enzymdiagnostik verfolgt drei spezielle Ziele:

• Sitz der Erkrankung:

Bestimmen durch Leitenzyme Dierenzierung durch Isoenzyme

• Stadium der Erkrankung:

akut chronisch

• Schwere der Schädigung

Bei Schäden, bzw. Erkrankungen an Leber und Galle beobachtet man folgende Eekte:

• Zytoplasmatische Enzyme erhöht: ASAT, LDH, ALAT

• Mitochondriale Enzyme erhöht: GD, ASAT

• Gallengangsenzyme Enzyme erhöht: AP,γ-GT

• Sekretorische Enzyme erniedrigt: Cholinesterase 4.3.1 Der schematische Aufbau der Leber BILD SCHEMATISCHER LEBERBAU

Für unsere spezielleren Betrachtung sind vor allem Parenchym, Sinusoidzellen, Itozellen und Kupfersche Sternzellen (Makrophagen) von Bedeutung.

4.3.2 Typische Leberschädigungen

Metabolische Insuzienz: Diese Erkrankung betrit in erste Linie die Al- buminsynthese, Blutgerinnungfaktoren und die Metabolisierung von Fremdstof- fen.

Cholestase: Eine Cholestase ist gekennzeichnet durch Zellschäden und der Störung des Leber-/Galleusses.

Nekrose: Bei einer Nekrose sind gröÿere Bereiche des Parenchyms geschädigt, welche aber noch teilweise regenerierbar sind. Eine Nekrose kann in einer Fibrose (Auslöser der Leberzhirrose) übergehen, wenn das geschädigte Parenchymgewebe nicht regeneriert, sondern durch Bindegewebe ersetzt wird.

4.3.3 Ursachen von Lebererkrankungen

BILD URSACHENSCHEMA LEBERERKRANKUNGEN