Landesamt für Verbraucherschutz

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Diagnostik der Aviären Influenza im Landesamt für Verbraucherschutz

Sachsen-Anhalt

Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt Jennifer Bernau

11. November 2015

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• Familie Orthomyxoviridae

• Genus Influenzavirus A

• Subtypeinteilung nach Oberflächenproteinen Hämagglutinin und Neuraminidase

• bedeutender Krankheitserreger bei Vögeln, Schwein, Pferd, marinen Säugern, Mensch, (Hund)

• Reservoir: wildlebende Wasservögel, v.a. Enten

• große Unterschiede in der Virulenz

Das Virus

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• behüllt, pleomorph, Ø 80 – 120 nm

• segmentiertes RNA- Genom (8 Segmente), einzelsträngig,

negative Polarität

• Größe Genom 10 -15 kbp

• hohe genetische Variabilität

(„Antigenic Drift“), Reassortment möglich („Antigenic Shift“)

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Das Virus

11. November 2015

Bild: LAV, FB4, Dez. 41

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• antigenetisch einheitliche Nukleokapsid- und

Matrixproteine

• aber verschiedene

Oberflächenglykoproteine

• 16 Hämagglutinin (HA)-Proteine

• 9 Neuraminidase (NA)- Proteine

Relevante Bestandteile für Diagnostik

aus: The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus

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• HA-Protein (H-Subtyp)

• Aufgaben

- Adsorption der Viren auf Oberfläche der Wirtszellen

- Agglutination von Erythrozyten

• Unterschiede der Subtypen in

Aminosäuresequenz, Spaltbarkeit durch zelluläre Proteasen, Rezeptorspezifität und in Erkennung durch Antikörper

• Pathotypen: hochpathogen (HPAIV) und

niedrigpathogen (LPAIV) bisher nur bei Subtypen H5 und H7

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Relevante Bestandteile für Diagnostik

11. November 2015

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• NA-Protein (N-Subtyp)

• für Virusfreisetzung aus Zellen relevant

• neutralisierende Antikörper

Relevante Bestandteile für Diagnostik

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• EU- Vorschriften

• Richtlinie 2005/94/EG vom 20.12.2005 mit

Gemeinschaftsmaßnahmen zur Bekämpfung der Geflügelpest und zur Aufhebung der Richtlinie 92/40/EWG

• Entscheidung 2006/437/EG über die Genehmigung eines Handbuchs zur Diagnose der Aviären Influenza gemäß der Richtlinie 2005/94/EG des Rates

• Beschluss 2010/367/EU vom 25. Juni 2010 über die Durchführung der Programme zur Überwachung von Geflügel und Wildvögeln auf aviäre Influenza durch die Mitgliedstaaten

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Rechtsgrundlagen

11. November 2015

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• Bundesvorschriften

• Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen in der Fassung der Bekanntmachung vom 19. Juli 2011 (BGBl. I S. 1404), die zuletzt durch Artikel 6 der Verordnung vom 29. Dezember 2014 (BGBl. I S. 2481) geändert worden ist

• Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest und die Newcastle-Krankheit (Geflügelpest-Verordnung) vom 18.10.2007 (BGBl. I S. 2348)

Rechtsgrundlagen

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Untersuchungsschema

übernommen und angepasst aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand 18.3.2015

* IVPI erforderlich, sofern infektionsbegleitende Erkrankungen und Todesfälle auftreten

* * Entwicklung von Hoffmann et al., 2007

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Dauer der Untersuchungen

Methodik Dauer

PCR generischer Influenzanachweis 1 Tag PCR Subtypisierung (H5, H7) 1 Tag

Virusanzucht 14-21 Tage

Antikörpernachweis (auch Monitoring) 1 Tag

angepasst und ergänzt nach: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap. Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand 18.3.2015

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• Material

• mind. Trachea in Influenzamedium für molekularbiologische Untersuchungen

• für Anzüchtung zusätzlich: Lunge, Luftsäcke, Darm, Milz, Niere, Hirngewebe, Leber, Herz

• Befunde

• kein pathognomonisches Sektionsbild

• Hämorrhagien auf Serosen (Abb. 1), im Drüsenmagen und anderen Organen

• Pankreasveränderungen (Abb. 2)

• bei Legetieren hämorrhagische

Eierstockentzündung und Dotterperitonitis

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Sektion

11. November 2015

aus: Amtliche Sammlung von Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von

Untersuchungsmaterial tierischen Ursprungs im Hinblick auf anzeigepflichtige Tierseuchen, Kap.

Geflügelpest (Aviäre Influenza), Stand 18.3.2015

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Direkter Erregernachweis – Probenmaterial

Tupfer Trachea

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Direkter Erregernachweis

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• real-time Reverse Transkriptase PCR

• Stufe 1: Amplifikation eines Fragments des Matrix-, (Nukleokapsid- oder PB1-) Gens

• Nutzung von zugelassenen Testkits

• Stufe 2: subtypspezifischer Nachweis von H5 oder H7 im positiven Fall

• Nutzung von PCR aus OIE-Referenzlabor

Direkter Erregernachweis – RT-qPCR

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Direkter Erregernachweis

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Virusisolierung

aus: Begleittext zu den Lehrveranstaltungen Allgemeine Virologie und

Infektionsdiagnostischer Kursus 10. Auflage

Herausgegeben vom Zentrum für Infektionsmedizin Institut für Virologie

• Inkubation 5 – 7 Tage bei 37 – 37,8 °C

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Virusisolierung

11. November 2015

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Hämagglutinationstest

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Serologische Identifizierung

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Serologische Identifizierung -HAH

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Serologische

Identifizierung -HAH

11. November 2015

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Serologische Identifizierung - ELISA

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Exkurs: Pathotypisierung

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Monitoringprogramme

• serologisches Hausgeflügel- und virologisches Wildvogelmonitoring

• kontinuierliche Überwachung

• um Gefährdung von Hausgeflügelbeständen zu vermeiden

• zur Risikoabschätzung hinsichtlich des Eintrages von AIV

• zur Aufklärung der Epidemiologie aviärer Influenzavirusinfektionen

• seit 2004 seitens EU verpflichtend

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Monitoringprogramme - Hausgeflügel

11. November 2015

• serologisches Screening

• 700 Serum-Proben in 2015 zu untersuchen

• Verfügung vom 24.6.2015 (LVwA, AZ 203.a-42261/AI) Geflügelart Gesamtzahl

Betriebe

Probenzahl/

Betrieb

Methode

Huhn 20 10 ELISA

Pute 20 10 ELISA

Ente 10 20 ELISA

Gans 4 20 ELISA

Sonstige 2 10 ELISA

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Monitoringprogramme - Hausgeflügel

Positive Befunde der letzten 5 Jahre

Jahr Geflügelart ELISA HAH (H5/H7) Bemerkung

2010 - - - -

2011 Huhn 1/10 pos. neg. -

Huhn 1/20 pos. neg. -

Wachtel 7/15 pos. alle 7 H7 pos. Bestätigung durch FLI

2012 Huhn 1/10 pos. neg. -

Ente 5/20 pos. neg. -

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Monitoringprogramme - Hausgeflügel

11. November 2015

Jahr Geflügelart ELISA HAH (H5/H7) Bemerkung

2013 Pute 10/10 pos. neg. 2/20 Tupfern M-PCR-

pos., FLI H9 pos.

Laufenten 4/10 pos. 3 H5 pos. 20 Tupfer neg.

Ente 12/18 pos. neg. -

Ente 13/20 pos. 13 H5 pos. Bestätigung durch FLI, 40 Tupfer neg.

2014 - - - -

2015 Ente/Gans 8/10 pos. 1 H5 pos. Bestätigung durch FLI, 1/40 Tupfern verd.

Zoovögel 2/10 pos. H5/ H7 pos. kein Material für FLI, Tupfer neg.

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Monitoringprogramme - Wildvögel

• passiv

• seit 2009 ausschließlich passiv

• in Sachsen-Anhalt werden jährlich moribunde oder bereits verendet aufgefundene Wildvögel

eingesendet

• Virusnachweis mittels RT-qPCR

• Ziel: 120 Proben aus den 5 Risikoarealen

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Monitoringprogramme - Wildvögel

11. November 2015

• aktiv

• in Sachsen-Anhalt zwischen 25.11.2014 und 31.1.2015 (Erlass 65.4-42262/1)

• erforderlich, da z.B. H5N8 mit inapparentem Verlauf in Wildvogelpopulation

• Ziel: 400 kombinierte Oropharyngeal-/Kloaken- Tupfer von bejagten Wildvögeln (v.a. Enten,

Gänse, Schwäne, Kraniche usw.), vorzugsweise in Risikogebieten (Rast von Wildvögeln, Brutgebiete, Aufenthaltsgebiete)

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Monitoringprogramme - Wildvögel

EU-Wildvogelrastgebiete Risikoareale (10 km - Puffer) Risikoareal-tangierte Gemeinden

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Monitoringprogramme - Wildvögel

• Ergebnisse der letzten 5 Jahre, passiv

• 2010: 226 Tiere, alle neg.

• 2014: 34 Tiere, davon im Dez. 1 Wildente (Aken, LK ABI) H5N8 HPAI

• 2015: bisher 27 Tiere

• Ergebnisse aktiv

• 267 untersuchte Wildvögel

• 31.12.2014 → 2 gesund erlegte Stockenten (Groß Schwechten, LK SDL) H5N8 HPAI

• Januar → 3 Graugänse M-PCR pos., H5/H7 neg.

11. November 2015

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• Entnahme nach Diagnosehandbuch AI (Entscheidung 2006/437/EG)

• für Erregernachweis

• mind. 5 kranke/ tote Vögel, falls vorhanden

• mind. 20 Luftröhren-/Oropharynxabstriche und 20 Kloakenabstriche

– in TSBH mind. 40 kombinierte Luftröhren-/Kloakenabstriche – Kloakenabstriche ausreichend mit Fäzes bedeckt

• für Antikörpernachweis

• mind. 20 Blutproben, bei kleineren Beständen von allen Tieren

• OHNE Gerinnungshemmer, Vollblut

Standardprobensatz

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• Abstriche

• auf 4°C gekühlt, nicht gefroren (wenn innerhalb von 24 Std. im Labor)

• in Transportmedium

– kommerziell erhältlich (z.B. Virocult- Tupfer) ODER – antibiotika- und proteinhaltig ODER

– mindestens phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) pH 7 – 7,4

• vollständig von Medium bedeckt

• Fäkalmaterial von anderen Proben getrennt

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Probentransport

11. November 2015

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• Probenverpackung nach Kategorie B (UN 3373) gemäß ADR

• Verantwortung für die sachgerechte Klassifizierung und ordnungsgemäße Kennzeichnung und Verpackung des Probematerials trägt der Einsender

• Merkblatt auf

http://www.verbraucherschutz.sachsen-

anhalt.de/veterinaermedizin/formularemerkblaetter /transport-und-verpackung

Probentransport

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• 3 Verpackungsbestandteile

• 1. Primärverpackung enthält Probe und ist dicht

– Röhrchen gegen Auslaufen und vor Bruch sichern, ggf.

saugfähiges Material dazwischen

– mehr als 10 Proben sortiert in Ständern/ Kartons (diese

gelten nicht als

Sekundärverpackung)

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Probentransport

11. November 2015

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• 2. Sekundärverpackung enthält ein oder mehrere Primärgefäße

– flüssige Proben auslaufsicher (zweites Kunststoffgefäß oder Plastikbeutel)

– → saugfähiges Material

Probentransport

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• 3. Außenverpackung

– ausreichend feste Qualität, starr, mind.

10 x 10 cm oder Transportkisten – Kennzeichnung (s.Bild)

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Probentransport

11. November 2015

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Probentransport - Begleitscheine

• erforderliche Angaben

• Tierhalter mit Adresse

• Einsender mit Adresse

• Telefon-/ Faxnummer mit Vorwahl

• Untersuchungsmaterial

• Entnahmedatum

• Untersuchungsanlass/ gewünschte Untersuchungen

• Vorbericht

• MUSS dem Probematerial eindeutig zuzuordnen und verschmutzungssicher daran befestigt sein!

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Probentransport - Begleitscheine

11. November 2015

http://www.verbraucherschutz.sachsen-

anhalt.de/veterinaermedizin/formularemerkblaetter/

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Probentransport - Begleitscheine

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Fragen?

11. November 2015

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Landesamt für Verbraucherschutz

Diagnostik der Aviären Influenza im Landesamt für Verbraucherschutz

Sachsen-Anhalt

Das Virus

Das Virus

Relevante Bestandteile für Diagnostik

Relevante Bestandteile für Diagnostik

Relevante Bestandteile für Diagnostik

Rechtsgrundlagen

Rechtsgrundlagen

Untersuchungsschema

Dauer der Untersuchungen

Sektion

Direkter Erregernachweis – Probenmaterial

Direkter Erregernachweis

Direkter Erregernachweis – RT-qPCR

Direkter Erregernachweis

Virusisolierung

Virusisolierung

Hämagglutinationstest

Serologische Identifizierung

Serologische Identifizierung -HAH

Serologische

Identifizierung -HAH

Serologische Identifizierung - ELISA

Exkurs: Pathotypisierung

Monitoringprogramme

Monitoringprogramme - Hausgeflügel

Monitoringprogramme - Hausgeflügel

Monitoringprogramme - Hausgeflügel

Monitoringprogramme - Wildvögel

Monitoringprogramme - Wildvögel

Monitoringprogramme - Wildvögel

Monitoringprogramme - Wildvögel

Standardprobensatz

Probentransport

Probentransport

Probentransport

Probentransport

Probentransport

Probentransport - Begleitscheine

Probentransport - Begleitscheine

Probentransport - Begleitscheine

Fragen?

VIELEN DANK FÜR DIE

AUFMERKSAMKEIT!