MASTAZYME Anti-ENA Combi 4

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MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4

Enzymimmunoassay zur qualitativen Bestimmung von Autoantikörpern gegen SS-A, SS-B, Sm und Sm/RNP in Serum und Plasma

Enzyme immunoassay for the qualitative determination of antibodies to SS-A, SS-B, Sm and Sm/RNP in serum and plasma

Test immunoenzymatique pour la détection qualitative des anticorps dirigés spécifiquement contre SS-A, SS-B, Sm et Sm/RNP dans le sérum et le plasma humain

Gebrauchsinformation / Instructions for Use / Notice Technique

Nur zur in-vitro Diagnostik / For in vitro diagnostic use only / Usage in vitro uniquement

Deutsch: Seiten 03–09 English: Pages 11–16 Français: Pages 17–23

MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 REF 733020 4 x 24 Tests

Lagerung / Storage / Conservation: 2–8 °C

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Erläuterungen zu den auf den Etiketten verwendeten graphischen Symbolen:

Explanations of abbreviations and icons used on labels:

Explications des abréviations et icônes sur les étiquettes:

STRIPS Mikrotiterstreifen Microtiter strips Films pour microplaque

CONTR + Positive Kontrolle Positive control Contrôle positif

CONTR - Negative Kontrolle Negative control Contrôle négatif

CAL CO Cut-off Kalibrator Cut-off Calibrator Calibrateur Seuil

CONJ HRP-Konjugat HRP conjugate Conjugué

DIL Probendiluent Sample diluent Diluant d’ échantillon

SUBS TMB-Substrat TMB substrate TMB substrat

STOP Stopp-Lösung Stopping solution Solution d'arrêt

WASH Waschpuffer Washing buffer Solution de lavage

LOT ^Charge ^Batch ^Lot

Gebrauchsinformation beachten

Read instructions for use Lire la notice d’utilisation

Wichtige Hinweise beachten

Important notes Remarques importantes

Verfallsdatum Expiry Date Date de péremption

Lagerung bei Storage Conservation

Reagenzien nicht zur Wieder- benutzung geeignet

Reagents not reusable

Ne pas réutiliser les réactifs

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Inhalt Seite

1. Einleitung 4

2. Testprinzip und Verwendungszweck 5

3. Packungsinhalt 6

4. Zusätzlich benötigte Materialien 6

5. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 7

6. Lagerung und Stabilität 7

7. Probengewinnung und -handhabung 7

8. Testdurchführung 8

9. Auswertung und Interpretation 9

10. Testcharakteristika 9

11. Literatur 9

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1. Einleitung

Im Allgemeinen wird die Bezeichnung „ENA“ (extrahierbare nukleäre Antigene) als Unterteilung der ANA (Anti-nukleäre Antikörper) gewählt. Unter ENA wird eine Gruppe autoimmunreaktiver Proteine zusammengefasst, die sich durch biochemische Methoden aus dem Zellkern isolieren lassen. Die ENA-Proteine sind mittlerweile eindeutig charakterisiert. Ihre klinische Relevanz und ihre Rolle in der Pathogenese diverser Autoimmunerkrankungen wird teilweise recht gut verstanden. Für viele Krank- heitssymptome und/oder -formen ist nicht nur ein spezifischer Autoantikörper kennzeichnend, sondern es lassen sich immer wieder auch patientenspezifische Autoantikörpermuster finden. Die nach- stehende Tabelle ist eine Zusammenstellung wichtiger ENA-Proteine und deren klinischer Bedeutung für die Diagnose einer Autoimmunerkrankung. Eine Tabelle kann allerdings in dieser Form nicht voll- ständig sein und ist auch nicht als Diagnoseschema verwendbar.

SS-A (Ro) SS-B (La) Sm Sm/RNP Scl-70 Jo-1 Systemischer Lupus

erythematosus (SLE)

< 30 % 15 % > 30 % (M) > 35 % Lupus Nephritis > 50 % < 10 %

Medikamenten-induzierter Lupus

> 30 %

Sjögren-Syndrom > 40 % > 40 %

Neonataler SLE > 30 %

ANA negativer SLE > 60 %

MCTD/ Sharp Syndrom > 85 %

Systemische Sklerodermie < 30 % > 65 % (M)

Polymyositis 10–30 % 20–90 % (M)

Antikörper gegen Autoantigene, die mit „M” gekennzeichnet sind, werden als Schlüsselkriterium für die entsprechende Erkrankung angesehen.

SS-A Antigen

SS-A („soluble substance A“) – auch als Ro (Robert) bezeichnet – ist ein Ribonucleoproteinkomplex, bestehend aus mindestens 4 kurzkettigen RNA-Molekülen und 2 Proteinen mit 60 kDa und 52 kDa Molekulargewicht. Der SS-A-Komplex weist eine hohe Homologie zu dem Calcium-bindenden Protein Calreticulin auf, von dem es molekular allerdings verschieden ist. Bei SS-A handelt es sich um ein funktionell konserviertes Protein, Isolate aus verschiedenen Species binden Anti-SS-A-Autoanti- körper. Fast alle Anti-SS-A-Seren erkennen mehrere Domänen des nativen 60 kDa Proteins.

Klinische Relevanz

Ein Zusammenhang zwischen dem Nachweis von Anti-SS-A-Antikörpern und Erkrankungen aus dem Lupus-Formenkreis sowie dem des Sjögren-Syndroms gilt als gesichert. Die prozentuale Häufung des Anti-SS-A konzentriert sich beim SLE auf die Verbindung mit Hautsymptomen und bei SLE- Schwangerschaften auf den neonatalen Lupus mit dem Risiko kongenitaler kardialer Reizleitungsstö- rungen. Gleichzeitige Expression von Anti-SS-A und Anti-SS-B weist beim SLE auf eine milde Ver- laufsform hin. Bei sogenannten „ANA-negativen“-Lupusformen oder subakut cutanem Lupus ist Anti-SS-A oft als einziger ENA-Autoantikörper nachweisbar. Die Konzentration der Anti-SS-A und der Anti-dsDNA-Autoantikörper korreliert beim SLE häufig mit der Krankheitsaktivität.

Anti-SS-A-/Anti-SS-B-Autoantikörper sind oft zusammen und mit hoher Inzidenz beim Sjögren- Syndrom nachweisbar; die Titer erreichen teilweise sehr hohe Werte. Niedrigere prozentuale Häufig- keitswerte werden für die Sklerodermie und Mischgewebskollagenosen beschrieben.

Mit entsprechenden Konjugaten lassen sich Autoantikörper der Klassen IgG, IgM und IgA nachwei- sen, wobei nach dem derzeitigen Wissensstand nur dem IgG klinische und diagnostische Bedeutung zukommt.

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SS-B Antigen

Das SS-B-Antigen („soluble substance B“) – auch La (Lane) genannt – ist trotz ähnlicher Bezeichnung und klinischer Relevanz biochemisch nicht mit dem SS-A-Protein verwandt. SS-B ist ein rund 47 kDa großes Phosphoprotein, welches verschiedene RNAs (tRNA, rRNA) binden kann. Es wurden auch Komplexe mit SS-A-spezifischen RNA-Molekülen beschrieben. Physiologisch scheint SS-B an der Regulation der RNA-Polymerase III und an RNA-Transportvorgängen zwischen Cytoplasma und Zell- kern beteiligt zu sein. ATPase-Aktivität und die Eigenschaft zur Trennung von DNA/RNA-Hybriden bestätigen diese Beobachtung.

Klinische Relevanz

Autoantikörper gegen SS-B treten fast ausschließlich in Verbindung mit Anti-SS-A auf. Sie werden nur beim Sjögren-Syndrom und dem SLE nachgewiesen. Anti-SS-B ist bei gleichzeitigem Vorliegen von Anti-SS-A-Antikörpern ein Hinweis auf eine milde Verlaufsform des SLE. Anti-SS-B allein wird indes fast nur bei Frühformen des Sjögren-Syndroms nachgewiesen. Neben SS-A liegen auch SS-B- Antigene auf Herzmuskelfasern. Die Bindung von Anti-SS-A und/oder Anti-SS-B kann in der Schwan- gerschaft die Ursache kongenitaler kardialer Reizleitungsstörungen beim Neugeborenen sein.

Sm und snRNP Antigen

Das Sm-Antigen (Smith) wird von mindestens 9 verschiedenen Polypeptiden gebildet und ist physiologisch zusammen mit den nRNP-Proteinen an Spleißprozessen im Zellkern beteiligt. snRNAs binden an den Core-Komplex des Sm, welches aus mehreren definierten Proteinen B/B’, D und E besteht.

Als Bindungsdomäne für Antikörper wurden die Proteine B und D charakterisiert. Das im MASTAZYME™ Anti-Sm verwendete Antigen ist RNP-frei!

Das Sm/RNP-Antigen enthält neben dem Sm-Part auch verschiedene snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles), die zusammen mit den Proteinen B/B’, D, E, F oder G und einer mRNA zum Splicosom gehören. Antikörper gegen Sm binden fast immer auch an Sm/RNP. Gegen RNP gerichtete Antikörper erkennen eine Domäne, die von der Sm-spezifischen verschieden ist, aber zum selben Proteinkomplex gehört.

Klinische Relevanz

Gegen Sm gerichtete Autoantikörper können als Marker für einen HLA-DR4-assoziierten SLE gewer- tet werden, seltener sind sie auch ein Hinweis auf eine zugrunde liegende Bindegewebserkrankung.

Sm-Antikörper werden zwar nur bei etwa 35 % der SLE-Erkrankungen nachgewiesen, die Spezifität des Nachweises ist aber sehr hoch. Eine Korrelation der Antikörpertiter mit der Aktivität der Erkran- kung wurde beobachtet, die klinische Wertigkeit und Aussagekraft wird allerdings noch diskutiert. Au- toantikörper gegen snRNP-Partikel sind ebenfalls typisch für SLE, sie werden aber auch bei Mischkol- lagenosen gebildet. Anti-snRNP wurde ferner nachgewiesen bei rheumatoider Arthritis, Sklerodermie, dem Sjögren-Syndrom und progressiver systemischer Sklerose.

2. Testprinzip und Verwendungszweck

Der MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 dient dem Nachweis von Autoantikörpern gegen die entsprechenden Autoantigene in Serum oder Plasma. MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 ist nur zur in-vitro Diagnostik zu verwenden.

Das Testprinzip des ELISAs kann in 4 Schritten beschrieben werden.

2.1 Seruminkubation und 1. Waschschritt

Spezifische Antikörper bilden mit Antigen, das an die Festphase gebunden ist, einen stabilen Immunkomplex. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden unspezifisch gebundene Serumkomponenten durch Waschen entfernt.

2.2 Konjugatinkubation und 2. Waschschritt

Meerrettich-Peroxidase-markiertes anti-human-IgG bindet an die entsprechenden Antikörper auf dem Festphasenantigen und bildet mit diesen einen stabilen Immunkomplex. Überschüssi- ges nicht gebundenes Konjugat wird nach der 30-minütigen Inkubation durch Waschen entfernt.

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2.3 Substrat- und Stoppreaktion

Nach Zugabe des TMB-Substrats wird dieses durch das Enzymkonjugat umgesetzt. Es entsteht eine bläuliche Färbung, deren Intensität mit der Menge der gebundenen Konjugatmoleküle korreliert. Nach 15 Minuten Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 1 N Schwefelsäure (H2SO4) gestoppt. Die pH-Verschiebung führt zum Farbumschlag von blau nach gelb.

2.4 Auswertung

Die Reaktionsansätze können nun mit einem ELISA-Plattenreader bei 450 nm (empfohlene Re- ferenzwellenlänge bei bichromatischer Messung: 600–690 nm) gemessen werden. Die Extinkti- on (OD) korreliert mit der Konzentration der spezifischen Antikörper.

Das Ergebnis kann aus einer Eichkurve abgelesen oder durch geeignete elektronische Kurven- berechnung (4-Parameter-Anpassung, Spline-Approximation o.ä.) ermittelt werden.

3. Packungsinhalt

Der Testkit enthält genügend Reagenzien für 12 x 8 = 96 Bestimmungen. Die Streifen der Mikroti- terplatte sowie alle anderen Reagenzien sind bei 2–8 °C zu lagern. Das Verfallsdatum der einzelnen Komponenten ist auf den jeweiligen Etiketten vermerkt.

4 x 3 Streifen mit je 8 einzeln abbrechbaren Wells, jeweils mit einem der folgenden Antigene beschichtet: SS-A, SS-B, Sm, Sm/RNP

1 x Rahmen für Streifen der Mikrotiterplatte (MTP) 4 x 1,5 mL Cut-off Kalibrator

(antigenspezifisch)

humanes Plasma, enthält antigenspezifische Antikörper gegen obige Antigene, gebrauchsfertig

4 x 1,5 mL Positive Kontrolle humanes Plasma enthält antigenspezifische Antikörper gegen obige Antigene, nativ, gebrauchsfertig

1 x 1,5 mL Negative Kontrolle humanes Plasma frei von Antikörpern gegen obige Anti- gene, nativ, gebrauchsfertig

2 x 60 mL Probenverdünnungs- puffer

PBS Puffer mit Konservierungsmittel, gebrauchsfertig 1 x 12 mL Enzymkonjugat Meerrettich-Peroxidase markiertes anti-human-IgG (Zie-

ge), gebrauchsfertig

1 x 12 mL TMB-Substrat 3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig 1 x 12 mL Stopplösung 1 N H2SO4 (Schwefelsäure), gebrauchsfertig 2 x 50 mL Waschpuffer

10 x Konz.

PBS/Tween Puffer, vor Gebrauch 1:10 mit dest. Wasser verdünnen, vor Gebrauch kurz auf 37 °C erwärmen, um mögliche Kristalle zu lösen

4. Zusätzlich benötigte Materialien

• 5 µL-, 100 µL- und 500 µL-Pipetten oder Multipetten

• Photometer für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter (Referenzfilter 600–690 nm)

• Waschgerät für Mikrotiterplatten (bei manuellem Waschen: Waschflasche)

• Röhrchen für Serumverdünnungen

• Messzylinder

• Destilliertes Wasser oder Wasser höherer Qualität

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5. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen

• Den Test nur zur in-vitro Diagnostik verwenden! Reagenzien nicht schlucken oder einatmen.

Die Sicherheitsbestimmungen des Labors sind zu beachten. Im Labor darf nicht gegessen, getrunken oder geraucht werden.

• Alle Seren und Plasmen sowie Puffer des Kits, die humanes Probenmaterial enthalten, wurden mit anerkannten Methoden auf HBsAg, HIV und HCV getestet und für negativ befunden. Da das Vorhandensein solcher Erreger trotzdem nicht völlig ausgeschlossen werden kann, sollten die Reagenzien wie potenziell infektiöses Material behandelt werden.

• Serum- und Reagenzien-Kontaminationen sollten mit Desinfektionsmitteln gesäubert und der Abfall entsprechend entsorgt werden.

• Alle Reagenzien müssen vor Testbeginn auf Raumtemperatur (18–24 °C) gebracht werden.

• Vor der Verwendung sind die Reagenzien gut zu mischen. Heftiges Schütteln und Schaumbil- dung sind zu vermeiden.

• Beim Pipettieren ist auf gleiche Zeitintervalle zu achten, um für alle Testansätze gleiche Be- dingungen zu gewährleisten.

• Beim Öffnen der Fläschchen ist eine Kontamination des Stopfens zu vermeiden. Um das Risi- ko möglicher Oxidationen zu minimieren, sind die Fläschchen nach Gebrauch sofort wieder zu verschließen.

• Um Verschleppungen und Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sind Einmal-Pipettenspitzen zu verwenden.

• Reagenzien verschiedener Kit-Chargen sollten nicht verwendet werden.

• Alle Reagenzien sind vor Ablauf des Verfallsdatums zu verwenden.

• Gemäß den GLP (Good Laboratory Practice) oder entsprechenden Richtlinien sind alle Labor- geräte regelmäßig auf Funktion und Präzision zu prüfen, dies gilt z. B. für die Pipetten, Waschgeräte und ELISA-Reader.

• Der Kontakt mit der Schwefelsäure enthaltenden Stopplösung und TMB-Substrat ist zu vermeiden. Bei Hautkontakt unverzüglich und gründlich mit Wasser abwaschen. Alle Geräte sofort nach Gebrauch sorgfältig reinigen.

6. Lagerung und Stabilität

Alle Reagenzien bei 2–8 °C lagern.

Das Verfallsdatum jedes Kitbestandteils ist auf dem entsprechenden Etikett vermerkt. Die Reagen- zien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht weiter verwenden.

Verdünnter Waschpuffer kann bei 2–8 °C gelagert werden. Unter diesen Bedingungen kann er bis zu 4 Wochen verwendet werden.

Nach dem Öffnen ist das angebochene Kit innerhalb von 3 Monaten zu verwenden.

7. Probengewinnung und -handhabung

Es kann sowohl Serum als auch Plasma (EDTA, Heparin) zur Bestimmung verwendet werden. Die Proben können 3 Tage bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Bei längerer Aufbewahrung Proben sofort nach Entnahme in Aliquots aufteilen und bei -20 °C einfrieren.

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden!

Aufgetaute Proben sollten vor der Verwendung im Test gemischt (Vortex) werden.

Lipämische, ikterische oder hämolysierte Proben können falsche Ergebnisse ergeben.

Vor der Analyse müssen Patientenproben mit Probenverdünnungspuffer 1:101 (z. B. 5 µL Serum + 500 µL Probenverdünnungspuffer) verdünnt werden.

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8. Testdurchführung

8.1. Vorbereitung der Reagenzien

Alle Reagenzien und Proben mischen und auf Raumtemperatur (RT, 18–24 °C) bringen.

Waschpuffer: Beim Vorliegen von Salzkristallen das Konzentrat auf 37 °C erwärmen und nach Lösung der Kristalle mischen.

Das Waschpuffer-Konzentrat mit destilliertem Wasser 1:10 verdünnen (z. B. 50 mL Konzentrat + 450 mL dest. Wasser), mischen.

• Die Gebrauchsanweisung ist zu befolgen. Jegliche Abänderung oder Modifikation erfolgt in Verantwortung des Anwenders.

• Alle Reagenzien müssen vor Testbeginn auf Raumtemperatur gebracht werden. Die Reagenzien sollten nur so lange wie nötig bei Raumtemperatur gelagert werden.

• Nicht benötigte MTP-Streifen sollten in der Hülle bei 2–8 °C trocken gelagert werden.

8.2. Testablauf

Hinweis: Es können andere als die empfohlenen Inkubationsbedingungen gewählt werden. Bei Abweichung vom vorliegenden Protokoll (z. B. Inkubationstem- peratur 37 °C statt RT) ist der Anwender für die Validierung des Tests ver- antwortlich.

1. Je 100 µL der vorverdünnten (1:101) Patientenproben, des gebrauchsfertigen Cut-off- Kalibrators und der Kontrollen in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren.

2. Streifen bei RT für 30 Minuten inkubieren.

3. Platteninhalt verwerfen und Vertiefungen mit 3 x 300 µL gebrauchsfertigem Waschpuffer waschen. Rückstände von Waschpuffer sind durch Ausklopfen der Platten auf Fließpapier zu entfernen.

4. 100 µL Enzymkonjugat in alle Vertiefungen pipettieren.

5. Streifen bei RT für 30 Minuten inkubieren.

6. Waschen wie unter Punkt 3. beschrieben.

7. 100 µL TMB-Substrat pipettieren.

8. Streifen bei RT für 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.

9. Reaktion durch Zugabe von 100 µL Stopplösung beenden, ca. 5 Minuten stehenlassen.

10. Inhalt der Vertiefungen kurz mischen und anschließend bei 450 nm messen. Als Blank wird gegen Luft gemessen. Es wird empfohlen, als Referenzwellenlänge 600–690 nm zu verwenden. Die Konzentrationen können graphisch anhand der Eichkurve oder mittels Computersimulation berechnet werden.

Die entwickelte Farblösung sollte innerhalb von 30 Minuten nach Zugabe der Stopplösung gemessen werden.

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9. Auswertung und Interpretation Qualitative Auswertung

Die berechnete Absorption der Probe wird mit der des jeweiligen Cut-off Kalibrators verglichen. OD- Werte über dem Cut-off sind als positiv, Werte unterhalb der Cut-off OD als negativ zu bewerten. Der Kalibrator hat eine Konzentration von 25 U/ml.

Normbereich:

Negativ: OD-Probe < OD antigenspezifischer Cut-off Kalibrator Positiv: OD-Probe > OD antigenspezifischer Cut-off Kalibrator

Die optische Dichte des positiven Kalibrators muss mindestens doppelt so hoch sein wie die des Cut- off Kalibrators.

Interpretation der Ergebnisse

Kein Messergebnis darf für sich allein zu einer abschließenden Diagnose verwendet werden, sondern muss immer in Verbindung mit anderen Laborwerten und klinischen Befunden interpretiert werden.

SS-A

Der Test erfasst Autoantikörper gegen native 60 kDa und 52 kDa SS-A-Proteine. Physiologisch sind Antikörperkinetiken bei SS-A gar nicht oder nur sehr schwach ausgeprägt; in Verlaufskontrollen sind sie daher nur schwer zu erfassen. Ein Abfall der Antikörperkonzentration erfolgt u. a. bei gleichzeiti- ger Behandlung mit Zytostatika.

Das Antigen liegt weitgehend in einer reaktiven Konformation auf der Festphase vor. Die Konforma- tion ist für die Sensitivität essentiell. ELISA-positive Ergebnisse lassen sich daher in einigen Immunoblots nicht bestätigen.

SS-B

Das Festphasenantigen reagiert mit Autoantikörpern, die gegen das SS-B-Gesamtprotein sowie gegen die 23 kDa- und 29 kDa-Spaltprodukte gerichtet sind. Isolierte Anti-SS-B-positive Seren sind sehr selten, meist liegen gleichzeitig auch Antikörper gegen SS-A vor.

Sm

Der Assay erfasst Antiseren, die gegen den gereinigten „Core“-Komplex des Sm-Proteins gerichtet sind. Der ELISA erfasst somit alle Sm-Antigene der Spezifität B’/B, D, E, F und G. Seren mit aus- schließlicher RNP-Spezifität werden nicht mit erfasst!

Sm/RNP

Die RNP-Domänen des Sm/RNP-Komplexes erfassen solche Antikörper, die gegen regulato- risch/metabolisch funktionelle ribonucleäre Proteinpartikel gerichtet sind. An den Sm-Anteil binden Antikörper gegen den „Core“-Komplex“ und gleichermaßen auch solche, die gegen snRNP- spezifische Polypeptide gerichtet sind. Positive Testergebnisse geben einen deutlichen Hinweis auf das Vorliegen eines SLE oder einer Mischkollagenose.

10. Testcharakteristika

Die Testcharakteristika des MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 wurden entsprechend den Vorgaben der IVD-Direktive der EU erstellt und bewegen sich im erwarteten Bereich. Auf Wunsch können diese Daten dem Anwender zur Verfügung gestellt werden.

11. Literatur

1. Autoantibodies, Eds. J.B. Peter, Y. Shoenfeld, 1996, Elsevier

2. Pathogenic and diagnostic relevance of autoantibodies, Eds. K.Conrad, R.-L. Humbel, M.Meurer, Y.Shoenfeld, E.M.Tan, 1998, Pabst Science Publishers

3. Autoantikörper, K.Conrad, 1998, Pabst Science Publishers

4. Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists; Kavanaugh A, Tomar R, Reveille J, Solomon DH, Homburger HA, Arch. Pathol. Lab. Med., 124 (1), 71-81 (2000).

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Contents Page

1. Intended Use 11

2. Introduction 11

3. Principle of the Test 12

4. Kit Contents 13

5. Materials Required but not Provided 13

6. Warnings and Precautions 14

7. Storage and Stability 14

8. Specimen Collection and Handling 14

9. Assay Procedure 15

10. Results and Interpretation 16

11. Assay Performance 16

12. References 16

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1. Intended Use

MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 has been designed for the detection of specific antibodies against SS-A, SS-B, Sm and Sm/RNP in serum and plasma.

This assay is intended for in vitro diagnostic use only.

All laboratory test results should be interpreted in conjunction with other clinical data. The clinical judgement and further tests have to be taken into account additionally.

2. Introduction

In general ENA’s (“extractable nuclear antigens“) are considered a subgroup of ANA (“anti-nuclear antibodies“). Extractable nuclear antigens can be isolated by various biochemical methods from the nucleus of eukaryotic cells, and most of them are well characterized. Their clinical relevance and their role in pathogenesis is widely accepted as well as the fact that for many diseases more than one autoantibody can be detected by diagnostic methods. The following table shows a summary of important autoantigens and their correlation with the onset or progress of various diseases.

SS-A (Ro) SS-B (La) Sm Sm/RNP Scl-70 Jo-1 Systemic Lupus

erythematosus (SLE)

< 30 % 15 % > 30 % (M) > 35 % Lupus Nephritis > 50 % < 10 %

Drug-induced Lupus > 30 %

Sjögren´s Syndrome > 40 % > 40 %

Neonatal SLE > 30 %

ANA negative SLE > 60 %

MCTD/ Sharp Syndrome > 85 %

Systemic sclerosis < 30 % > 65 % (M)

Polymyositis 10–30 % 20–90 % (M)

Autoantigens specified with “M” are considered as markers for the indicated disease.

SS-A Antigen

SS-A (“soluble substance A“) and the so-called Ro protein (Robert) are identical. SS-A consists of at least 4 short RNA molecules and two proteins of 60 kDa and 52 kDa. Although SS-A and calreticulin – a calcium binding protein – show some homology both proteins are clearly distinct from each other in their amino acid sequences. Regulatory proteins are usually conserved among animal species, so human autoantibodies bind easily to SS-A proteins isolated from non-human origin. Anti-SS-A antibodies bind to several domains of the native 60 kDa protein.

Clinical relevance

A strong connection between anti-SS-A antibodies and lupus or lupus-like diseases is well accepted and confirmed in the literature (1). A high percentage of anti-SS-A is found within a group of SLE patients with skin involvement and among pregnant SLE patients with a newborn’s risk of congenital heart block. The expression of both SS-A and SS-B indicates in most cases a mild progression of the disease. Sometimes SS-A can be the only autoantibodies found in so called „ANA negative“ and subacute cutaneous lupus patients. The autoantibody concentrations of anti-SS-A and anti-dsDNA correlate well with disease activity.

There is a high incidence of anti-SS-A and anti-SS-B for Sjögren’s syndrome; antibodies reach high titers within this group of patients. Only a few patients suffering from scleroderma and mixed connec- tive tissue disease express anti-SS-A and anti-SS-B.

Only IgG antibodies are of diagnostic and clinical interest to date although specific antibodies of the IgM and IgA class can be detected in patient sera.

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SS-B Antigen

SS-B (“soluble substance B“) and the so-called La protein (Lane) are identical. Despite almost identical names and quite similar clinical and diagnostic functions there is no homology between SS-A and SS-B regarding biochemical and molecular structures. SS-B is defined as a 47 kDa phosphoprotein associated with various RNAs like rRNA and tRNA. Even RNA molecules usually specific for SS-A proteins can bind to native SS-B. SS-B is involved in RNA transport from the nucleus to the cytoplasma. The protein is further part of the regulatory cascade of RNA polymerase III reactions. An AT- Pase activity and the ability to melt DNA/RNA hybrids support the view of the physiological functions of SS-B.

Clinical relevance

In many patient sera both antibodies to SS-A and SS-B are often co-expressed. Both antibodies are generally found exclusively in Sjögren’s syndrome with an underlying SLE. Up to 15 % of SLE patients express anti-SS-B antibodies. SLE patients positive for SS-A and SS-B usually develop a less severe form of systemic lupus erythematosus.

Isolated SS-B antibody responses are limited to an early form of the Sjögren’s syndrome. SS-A and SS-B proteins are both expressed on heart muscle fibres increasing the risk of congenital heart block in the newborns after binding the respective autoantibodies. Both IgG antibodies pass through the pla- centa during pregnancy.

Sm and Sm/RNP Antigen

The Sm antigen (Smith) consists of at least 9 different polypeptides which, together with nRNP proteins, are part of the nuclear splicing complex. Various snRNAs bind to a core complex of the Sm protein built of clearly defined proteins B/B’, D and E. Antibodies directed against Sm in patient sera mainly bind to proteins B and D. The Sm antigen coated to the solid phase in the MASTAZYME™

Anti-Sm assay contains B and D proteins; furthermore the Sm antigen does not contain any RNP moieties!

The Sm/RNP antigen, however, consists of various snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles) in addition to the Sm part. These snRNPs and the proteins B/B’, D, E, F or G plus a mRNA molecule are part of the splicosome. Anti-RNP antibodies bind to a specific domain of the Sm/RNP protein complex on the solid phase which is different from the binding site of anti-Sm.

Clinical relevance

Anti-Sm antibodies are considered as a marker for HLA DR4 associated SLE and in a few cases they are indicative of MCTD. Nevertheless anti-Sm is highly predictive for SLE. Although “only“ 35 % of all SLE patients express anti-Sm positive results are highly specific for SLE. A correlation between antibody titers and disease activity has been observed. The clinical relevance of this data, however, is still under discussion.

Anti-snRNP antibodies are found in SLE but they are also found in a higher frequency in MCTD.

Patients suffering from rheumatic arthritis, scleroderma, Sjögren’s syndrome and progressive systemic sclerosis can be found positive for anti-snRNP autoantibodies.

3. Principle of the Test

The principle of the test reaction can be described in four stages.

3.1 Serum incubation

Specific antibodies bind to the antigens on the solid phase to form a stable immune complex.

After a 30 minutes incubation at room temperature the wells are washed with pre-diluted wash buffer to remove all non-reactive serum components.

3.2 Conjugate incubation

The anti-human-IgG horseradish peroxidase conjugate is added to all wells. The conjugate binds to IgG antibodies on the solid phase antigen to form a stable sandwich. After a 30 minutes incubation at room temperature the excess conjugate is removed by washing all wells with washing buffer.

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3.3 Substrate reaction and stopping

The TMB substrate is dispensed into each well and the peroxidase enzyme/substrate reaction forms a stable blue chromogen. The reaction and subsequently the colour development is stopped after 15 minutes incubation at room temperature by adding 1 N H2SO4 to the wells.

The change in pH also causes the chromogen to change colour from blue to yellow.

3.4 Reading and interpretation

The intensity of the colour is read in a microtiter plate reader at 450 nm (recommended reference wavelength for bi-chromatic measurement: 600–690 nm). The intensity of the colour (OD) is directly proportional to the concentration of the specific antibody in the patient sample.

4. Kit Contents

The kits contains sufficient reagents for 12 x 8 = 96 determinations. The strips and solutions have to be stored at 2–8 °C. The expiry date is mentioned on the labels.

4 x 3 Microtiter strips single strips each with 8 break-apart wells coated with the relevant antigen: SS-A, SS-B, Sm and Sm/RNP

1 x Frame holder

4 x 1.5 mL Cut-off Calibrator human pool-plasma containing antibodies against (antigen specific) the above listed antigens, diluted in buffer, ready to use

4 x 1.5 mL Positive Control human plasma containing antibodies against the above listed antigens, ready to use

1 x 1.5 mL Negative Control human plasma free of the above mentioned antibodies, ready to use

2 x 60 mL Sample diluent PBS solution contains preservative, ready to use 1 x 12 mL Enzyme conjugate

solution

HRP-labelled goat anti-human-IgG, ready to use

1 x 12 mL TMB substrate 3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidine, ready to use 1 x 12 mL Stopping solution 1 N sulfuric acid, ready to use

2 x 50 mL Washing buffer 10 x concentrated

PBS/Tween buffer solution 10 x concentrated to be diluted 1:10 prior to use; the concentrate should be warmed up to 37 °C for 15 min to avoid any crystals

5. Materials Required but not Provided

• 5 µL-, 100 µL- and 500 µL micro- and multichannel pipettes

• Microtiter plate reader with a 450 nm filter (reference filter 600–690 nm)

• Microtiter Plate Washer (in case of manual washing: wash bottle)

• Reagent tubes for the serum dilution

• Measuring cylinder

• Distilled water or water of higher quality

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6. Warning and Precautions

• For in vitro diagnostic use only! Do not ingest or swallow! Laboratory safety precautions should be followed. Do not eat, drink or smoke in the laboratory.

• All sera and plasma or buffers based upon have been tested to HBsAg, HIV and HCV respectively with generally accepted methods and were found negative. Nevertheless, precautions like the use of latex gloves have to be taken.

• Serum and reagent spills have to be wiped off with a disinfecting solution (e.g. sodium hy- pochlorite 5 %) and have to be disposed of properly.

• All reagents have to be brought to room temperature (18–24 °C) before performing the test.

• Before pipetting all reagents should be mixed thoroughly by gentle tilting or swinging. Vigorous shaking with formation of foam should be avoided.

• It is important to pipet with constant intervals so that all the wells of the microtiter plate have the same conditions.

• When removing reagents out of the bottles care has to be taken that the stoppers are not contaminated. Further a possible mix-up has to be avoided. The content of the bottles is usually sensitive to oxidation so that they should be opened only for a short time.

• In order to avoid a carry-over or a cross-contamination separate disposable pipet tips have to be used.

• No reagents from different kit lots should be used and they should not be mixed with one another.

• All reagents have to be used within shelf life.

• In accordance with a Good Laboratory Practice (GLP) or following ISO 9001 all laboratory de- vices employed should be regularly checked regarding the accuracy and precision. This refers e.g. to microliter pipets and washing or reading (ELISA Reader) instrumentation.

• The contact of certain reagents especially the stopping solution and the substrate with skin, eye and mucosa has to be avoided because possible irritations and acid burns could arise and there exists a danger of intoxication.

7. Storage and Stability Store all reagents at 2–8 °C.

The expiry date of each reagent is printed on the individual labels. Do not use any reagents after the expiry date has been exceeded.

The diluted washing buffer is stable for up to 4 weeks when stored at 2–8 °C.

The opened kit should be used within three months.

8. Specimen Collection and Handling

Both serum or plasma (EDTA, heparin) can be used for the determination. Serum is separated from the blood which is aseptically drawn by venipuncture after clotting and centrifugation. The serum or plasma samples can be stored at 2–8 °C for up to 3 days. They should be kept at -20 °C for a longer storage. The samples should not be frozen and thawed repeatedly. Lipemic, haemolytic or bacterially contaminated samples can cause false positive or false negative results.

Patient sera must be pre-diluted 1:101 in sample diluent (e.g. 5 µL serum + 500 µL sample diluent) prior to testing.

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9. Assay Procedure

Dilute patient samples 1:101 with sample diluent before testing. For example pipette 10 µL of sample to 1,000 µL of sample diluent in a suitable tube.

9.1. Preparation of Reagents

Allow all kit components and specimens to reach room temperature (RT, 18–24 °C) prior to use and mix well.

Washing buffer: Dissolve any crystals which may be in the bottle by warming to 37 °C and then mix well.

Dilute the concentrated washing buffer 1:10 with distilled water (e.g.

50 mL buffer concentrate + 450 mL distilled water). Mix thoroughly.

• Strictly follow the instructions for reliable test performance. Any changes or modifications are within the responsibility of the user.

• All reagents and samples must be brought to room temperature before use, but should not be left at this temperature for longer than necessary.

• Put the unused microtiter strips back in the plastic bag and store them dry at 2–8 °C.

9.2. Assay Steps

Prepare a sufficient amount of microtiter wells for calibrators, controls and samples.

Note: Other incubation conditions might be possible. In case of modifications of the rec- ommended test procedure (e.g. incubation temperature 37 °C instead of RT) the user has to validate assay performance.

1. Pipette 100 µL each of the diluted (1:101) samples, ready to use cut-off calibrator and controls into the appropriate wells.

CO means antigen specific Cut-off control and positive control respectively 2. Incubate the plate at room temperature for 30 minutes.

3. Discard the contents of the microwells and wash 3 times with 300 µL of diluted washing buffer. Afterwards remove residues of the washing solution by gentle tapping of the microtiter plate on a paper towel.

4. Pipette 100 µL of enzyme conjugate solution into each well.

5. Incubate the strips for 30 minutes at room temperature.

6. Discard the contents of the microwells and wash 3 times with 300 µL of diluted washing buffer. Afterwards remove residues of the washing solution by gentle tapping of the microtiter plate on a paper towel.

7. Dispense 100 µL of TMB substrate into each well.

8. Incubate for 15 minutes in the dark (e.g. drawer) at room temperature.

9. Add 100 µL of stopping solution to each well.

10. After thorough mixing and wiping the bottom of the plate, read the optical density at 450 nm and calculate the results. Blank against air. A bi-chromatic measurement using a reference wavelength of 600–690 nm is recommended.

The developed colour is stable for at least 30 minutes. Read optical densities dur- ing this time.

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10. Results and Interpretation Qualitative Calculation

The calculated OD values for patient sera as mentioned above are compared with the value for the cut-off calibrator (25 U/mL). If the value of the sample is higher, then it should be read as positive.

Normal range:

Negative: OD-sample < OD cut-off calibrator Positive: OD-sample > OD cut-off calibrator Interpretation of results

No single laboratory result should be used for a diagnosis only. The results should be interpreted together with other laboratory parameters and other clinical findings.

SS-A

Autoantibodies directed against native SS-A 60 kDa and 52 kDa proteins are giving positive results.

Kinetic variations of antibodies are usually not of physiological importance as a decline of antibody titers might be due to treatment with cytostatic drugs.

After coating the antigen retains its native conformational protein structure essential for specific antibody binding. Immunoblot techniques may not necessarily be able to confirm ELISA positive results.

SS-B

MASTAZYME™ SS-B detects antibodies directed against native SS-B protein as well as degradation products of 23 kDa and 29 kDa size. Anti SS-B positive sera totally lacking anti SS-A antibodies are very rare.

Sm

A positive result is due to antibodies directed against Sm core complex including the specific antigens B’/B, D, E, F and G. The antigen on the solid phase is free of RNP protein!

Sm/RNP

Sm/RNP detects antibodies directed against regulatory or metabolic functional ribonuclear particles.

The antigen binds antibodies to Sm core as well. Positive results are highly predictive for SLE or MCTD

11. Assay Performance

The assay characteristics of the MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 have been established and as- sessed according the European IVD directive. Detailed validation data can be provided on special re- quest.

12. References

2. Pathogenic and diagnostic relevance of autoantibodies, Eds. K.Conrad, R.-L. Humbel, M.Meurer, Y.Shoenfeld, E.M.Tan, 1998, Pabst Science Publishers

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Sommaire Page

1. Domaine d’utilisation 18

2. Introduction 18

3. Principe du test 20

4. Composition du coffret 20

5. Matériel nécessaire mais non fourni 21

6. Précautions d’utilisation 21

7. Conservation et stabilité 21

8. Prélèvement et transport des échantillons 21

9. Procédure ELISA 22

10. Résultats et interprétation 23

11. Performances du test 23

12. Bibliographie 23

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1. Domaine d’utilisation

MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 a été conçu pour la détection des anticorps spécifiques dirigés contre SS-A, SS-B, Sm, et Sm/RNP dans le sérum et le plasma. Des applications supplémen- taires sur d’autres pélèvements biologiques sont possibles et peuvent être fournies sur demande.

Diagnostic in vitro uniquement.

Tous les résultats d’analyses doivent être interprétés en conjonction avec les données cliniques. Le tableau clinique et les tests supplémentaires doivent également être pris en compte.

2. Introduction

En général les antigènes nucléaires solubles ENA (extractable nuclear antigens) sont considérés comme un sous-groupe des anticorps antinucléaires ANA (antinuclear antibodies). Les antigènes nucléaires solubles isolés par différentes méthodes biochimiques à partir du noyau des cellules euca- ryotes sont pour la plupart d’entre eux bien caractérisés. Leur signification clinique et leur rôle dans la pathogénèse sont largement acceptés de même que pour une maladie auto-immune il peut être détecté plusieurs auto-anticorps. Le tableau non exhaustif ci-dessous présente les principaux auto- antigènes et leur corrélation avec l’apparition ou la progression de différentes maladies.

Prévalence des anticorps anti-ENA dans différentes maladies auto-immunes

SS-A (Ro) SS-B (La) Sm Sm/RNP Scl-70 Jo-1 Lupus érythémateux dis-

séminé (LED)

< 30 % 15 % > 30 % (M) > 35 % Lupus néphrétique > 50 % < 10 %

Lupus médicamenteux > 30 %

Syndrome de Sjögren > 40 % > 40 % Lupus érythémateux

néonatal

> 30 % LED et ANA négatifs > 60 %

MCTD/Syndrome de Sharp > 85 %

Sclérose systémique < 30 % > 65 % (M)

Polymyosite 10–30 % 20–90 % (M)

(M) auto-antigènes spécifiques de la maladie autoimmune indiquée.

SS-A Antigène

L’antigène SSA (soluble substance A) et la protéine Ro (Robert) sont identiques. L’antigène SS-A est composé de quatre fragments d’ARN et deux protéines de 60 kDa et 52 kDa. Bien que le SS-A et la cal-réticuline soient des protéines très homologues elles ont des séquences d’acides aminés qui les différencient bien. Les protéines régulatrices sont souvent bien conservées dans le règne animal si bien que les auto-anticorps s’associent facilement à des protéines SS-A d’origine non humaine. La plupart des anticorps anti-SSA s’associent à différentes régions de la protéine native de 60 kDa alors que les anticorps dirigés contre la protéine de 52 kDa reconnaissent aussi la protéine dénaturée.

Intérêt clinique

Une association est bien connue entre la présence d’anticorps anti-SSA et le lupus ou les syndromes lupiques. Un pourcentage élevé d’anticorps anti-SSA est rencontré chez les sujets ayant un lupus éry- thémateux disséminé (LED) avec des problèmes dermatologiques ou chez la femme enceinte ayant un LED et risquant de transmettre un blocage cardiaque congénital à son nouveau-né.

L’expression des SSA et des SSB indique dans la plupart des cas une progression moyenne de la maladie. Les anticorps anti-SSA sont parfois les seuls anticorps détectés chez les « ANA négatif » et chez les sujets ayant un lupus cutané subaigu. Les concentrations en auto-anticorps anti-SSA et anti- dsDNA corrèlent avec l’activité de la maladie.

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Il existe une forte prévalence des anticorps anti-SSA et anti-SSB chez les patients atteints du Syn- drome de Sjögren avec des titres très élevés. Seulement quelques patients atteints de sclérose en plaque ou de connectivite ont à la fois des anticorps anti-SSA et anti-SSB. Les anticorps de type IgG sont les seuls présentant un intérêt clinique et diagnostique à ce jour bien que des anticorps spécifi- ques IgA et IgM puissent être détectés dans les sérums des patients.

SS-B Antigène

L’antigène SS-B (soluble substance B) et la protéine La (Lane) sont identiques . Malgré des noms presque identiques et des fonctions biologiques et cliniques presque semblables il n’y a aucune homologie entre l’antigène SS-A et l’antigène SS-B au niveau des structures biochimiques et molécu- laires. L’antigène SS-B est une phosphoprotéine de 47 kDa associée à de nombreuses molécules d’ARN comme le rRNA et le tRNA. Les molécules de RNA généralement spécifiques des antigènes SSA peuvent s’associer à du SS-B natif. L’antigène SS-B est impliqué dans le transport de l’ARN du noyau vers le cytoplasme. La protéine est aussi impliquée dans la cascade de réactions de régulation de la RNA polymérase III. Une activité ATPase et sa capacité à s’associer à des hybrides ADN/ARN sont en faveur du rôle physiologique de l’antigène SS-B.

Intérêt clinique

Les deux anticorps sont souvent présents en même temps chez de nombreux patients. Les deux anticorps sont généralement trouvés exclusivement pour le Syndrome de Sjögren avec un LED associé.

Les LED présentent des anticorps anti-SS-B dans plus de 15 % des cas. Les LED ayant des anticorps anti-SS-A et anti-SS-B développent en général une maladie moins sévère. Les réponses en anticorps anti-SS-B seuls sont limités aux formes précoces d’un Syndrome de Sjögren.

Les protéines SS-A et SS-B qui sont toutes deux exprimées au niveau des fibres du muscle cardiaque augmentent le risque de blocage cardiaque chez le nouveau-né après association avec les anticorps spécifiques. Les anticorps IgG des deux antigènes passent la barrière placentaire au cours de la grossesse.

Sm et Sm/RNP Antigène

L’antigène Sm (Smith) contient 9 polypeptides différents qui font partie avec les protéines nRNP du complexe nucléaire d’épissage. Différents snRNA s’associent au noyau du complexe protéique Sm composé des protéines B/B’, D et E. Les anticorps dirigés contre l’antigène Sm s’associent essentiel- lement avec les protéines B et D. L’antigène Sm coaté sur la phase solide du coffret MASTAZYME™

Anti-Sm contient les protéines B et D; de plus, l’antigène Sm ne contient aucune RNP.

L’antigène Sm/RNP, contient par contre les différentes snRNP (small nuclear ribonucleoprotein particles) en plus de la fraction Sm. Ces snRNP et les protéines B/B’, E, F ou G plus la molécule mRNA font partie du spicosome. Les anticorps anti-RNP s’associent aux régions spécifiques du complexe protéique Sm/RNP de la phase solide qui sont différentes des sites d’accrochage des anticorps anti- Sm.

Intérêt clinique

Les anticorps anti-Sm sont considérés comme un marqueur du LED associé au HLA DR4. Les anticorps anti-Sm sont ont une valeur prédictive élevée d’un LED. Bien que seulement 35 % des LED expriment les anticorps anti-Sm, les résultats positifs sont spécifiques du LED. Une corrélation entre le titre en anticorps et l’activité de la maladie a été observée mais la valeur clinique de ces données est encore discutée.

Les anticorps anti-snRNP sont trouvés chez le LED mais peuvent être trouvés également avec une fréquence élevée chez les connectivites mixtes. Les patients qui souffrent d’arthrite rhumatoïde, de sclérodermies, du Syndrome de Sjögren ou de sclérose systémique progressive peuvent être positifs en anticorps anti-snRNp.

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3. Principe du test

Le principe du test peut être résumé en quatre étapes.

3.1 Incubation des sérums

Les anticorps spécifiques se lient aux antigènes adsorbés sur la phase solide pour former des complexes immuns stables. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, les puits sont lavés avec la solution de lavage prédiluée afin d’éliminer les composants non liés du sérum.

3.2 Incubation du conjugué

Le conjugué anti-IgG humaine marqué à la peroxydase du Raifort est ajouté dans tous les puits. Il se lie aux anticorps IgG des complexes immuns adsorbés sur la phase solide. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, le conjugué en excès est éliminé par lavage de tous les puits avec la solution de lavage.

3.3 Réaction du substrat et de la solution stop

Le substrat TMB est déposé dans tous les puits et le développement de la réaction donne une coloration stable bleu. Le développement de la réaction est stoppée après 15 minutes d’incubation à température ambiante par ajout d’acide sulfurique (H2SO4) 1 N dans chaque puits. La variation de pH provoque un changement de couleur du bleu au jaune.

3.4 Lecture et interprétation

L’intensité de coloration est lue à l’aide d’un lecteur de microplaques à 450 nm (filtre de réfé- rence recommandé pour la lecture bichromatique: 600–690 nm). L’intensité de coloration (DO) est directement proportionnelle à la concentration d’anticorps spécifiques présents dans le sé- rum du patient.

4. Composition du coffret

Le coffret contient les réactifs nécessaires et suffisants pour 12 x 8 = 96 déterminations. Les barrettes et les solutions doivent être stockées à 2–8 °C. La date de péremption est inscrite sur les étiquettes.

4 x 3 barrettes de microtitration barrettes sécables de 8 puits coatées avec l’antigène purifié de SS-A, SS-B, Sm, et Sm/RNP

1 x Cadre de microplaque 4 x 1.5 mL Calibrateur seuil

(spécifique de l’antigène)

Plasma humains contenant des anticorps anti- antigènes cités précédemment dilués en tampon, prêts à l’emploi.

4 x 1.5 mL Contrôle positif Plasma humains contenant des anticorps antigènes mentionnés ci-dessus, prêts à l’emploi.

1 x 1.5 mL Contrôle négatif Plasma humains sans anticorps, neat, prêts à l’emploi.

2 x 60 mL Diluant d’échantillon Solution tampon avec du PBS comme conservateur, prêt à l’emploi.

1 x 12 mL Conjugué Conjugué HRP de chèvre anti-IgG humaines, prêt à l’emploi.

1 x 12 mL Substrat TMB 3,3’,5,5’ Tétraméthylbenzidine, prêt à l’emploi.

1 x 12 mL Solution Stop Acide sulfurique 1 N, prêt à l’emploi.

2 x 50 mL Solution de lavage concentrée 10 x

Solution tampon PBS/Tween concentrée 10 x à diluer au 1:10 avant utilisation; la solution concentrée peut être chauffée à 37 °C pour éviter la formation de cristaux.

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5. Matériel nécessaire mais non fourni

• Micropipettes et pipettes multicanaux de 5 µL, 100 µL et 500 µL

• Lecteur de microplaques avec filtre à 450 nm (filtre de référence 600–690 nm)

• Laveur automatique de microplaques (en cas de lavage manuel : pissette)

• Tubes pour la dilution des sérums

• Cylindre de mesure

• Eau distillée ou ultra pure

6. Précautions d’utilisation

• Usage in vitro uniquement! Ne pas ingérer ou avaler ! les mesures de sécurité du laboratoire doivent être suivies. Ne pas manger, boire ou fumer dans le laboratoire.

• Tous les sérums et réactifs inclus dans le coffret ont été trouvés négatifs pour l’antigène Hbs, le VIH et le VHC. Cependant, des précautions telles que le port de gants doivent être prises.

• Si des sérums ou des réactifs sont renversés, nettoyer la surface avec une solution désinfec- tante (ex : eau de Javel à 5 %) puis jeter dans des récipients adaptés.

• Tous les réactifs doivent être ramenés à température ambiante (18–24 °C) avant de commen- cer le test.

• Avant de pipeter, tous les réactifs doivent être mélangés doucement en les inclinant ou en les retournant doucement. Eviter la formation de mousse par des mélanges trop vigoureux.

• Il est important de distribuer les réactifs avec des intervalles de temps constants pour que tous les puits de la microplaques soient dans les mêmes conditions.

• Veillez à ne pas contaminer les.bouchons des flacons de réactifs Eviter les risques de mélange des réactifs. Le contenu des flacons est souvent sensible à l’oxydation, ils doivent donc rester ouvert le moins longtemps possible.

• Changer d’embouts de pipette entre chaque réactif ou sérum afin d’éviter les contaminations.

• Ne pas interchanger les réactifs de différents lots.

• Ne pas utiliser le coffret au delà de la date de péremption.

• Selon les Bonnes Pratiques de Laboratoires ou la norme ISO 9001 tous les matériels de laboratoire utilisés doivent être vérifiés régulièrement pour l’exactitude et la précision. Ceci com- prend, les micropipettes et l’instrumentation ELISA telle que le lecteur et le laveur.

• Eviter le contact de la solution stop et du substrat avec la peau, les yeux et les muqueuses car ils peuvent provoquer des irritations ou des brûlures acides. De plus, il existe un risque d’intoxication.

7. Conservation et stabilité

Conserver tous les réactifs à 2–8 °C.

La date de péremption de chaque réactif est imprimée sur son étiquette. Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur date de péremption.

La solution de lavage diluée est stable 4 semaines à 2–8 °C.

Une fois ouvert le kit doit être utilisé dans les 3 mois.

8. Prélèvement et transport des échantillons

Le sérum ou le plasma (EDTA, héparine) peuvent être utilisés pour le test. Prélever le sang aseptiquement puis séparer le sérum par centrifugation après coagulation. Les échantillons de sérum ou de plasma peuvent être conservés pendant 3 jours à 2–8 °C. Ils doivent être conservés à -20 °C pour des durées plus longues. Les échantillons ne doivent pas être congelés et décongelés de façon répétée. Les échantillons hyperlipidiques, hémolysés ou contaminés peuvent donner des résultats faussement négatifs ou positifs.

Les échantillons de sérum doivent être prédilués au 1:101 dans le diluant des sérums (ex : 5 µL de sérum + 500 µL de diluant des sérums) avant le test.

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9. Procédure ELISA

9.1. Préparation des réactifs

Ramener tous les réactifs et les échantillons à température ambiante (18–24 °C) avant utilisation et bien les mélanger.

Solution de lavage : Dissoudre les éventuels cristaux en chauffant à 37 °C et bien mélanger.

Diluer la solution de lavage concentrée au 1:10 avec de l’eau distillée (ex : 50 mL de solution de lavage concentrée + 450 mL d’eau distillée).

Mélanger.minutieusement

• Suivre strictement les instructions pour obtenir de bons résultats. Tous changements ou modifications sont sous la responsabilité de l’utilisateur.

• Tous les réactifs et les échantillons doivent être ramenés à température ambiante avant utilisation, mais ne doivent pas rester à cette température plus longtemps que nécessaire.

• Une courbe étalon doit être réalisée pour chaque test.

• Conserver les barrettes non utilisées dans leur sac plastique à 2–8 °C.

9.2. Test ELISA

Préparer la quantité suffisante de puits pour le calibrateur, les contrôles et les échantillons.

Diluer les les sérums des patients au 1:101 avec le diluant d’échantillon (ex: 10 µL d’échantillon dans 1000 µL de diluant d’échantillon).

Remarque : D’autres conditions d’incubation peuvent être utilisées. En cas de modi- fications dans la procédure du test (ex : incubation à 37 °C au lieu de la température ambiante) l’utilisateur doit valider les performances du test.

1. Déposer 100 µL de chaque échantillon dilué (1:101) et de calibrateur et de contrôle dans les puits appropriés.

2. Incuber la microplaque à température ambiante pendant 30 minutes.

3. Eliminer le contenu des puits et laver 3 fois avec 300 µL de solution de lavage diluée. En- suite, éliminer les résidus de solution de lavage au fond des puits en tapant doucement la microplaque sur du papier absorbant.

4. Déposer 100 µL de conjugué dans chaque puits.

5. Incuber la microplaque à température ambiante pendant 30 minutes.

6. Eliminer le contenu des puits et laver 3 fois avec 300 µL de solution de lavage diluée.

Esuite, éliminer les résidus de solution de lavage au fond des puits en tapant doucement la microplaque sur du papier absorbant.

7. Distribuer 100 µL de substrat dans tous les puits.

8. Incuber la microplaque pendant 15 minutes dans le noir (ex: dans un tiroir) à température ambiante.

9. Ajouter 100 µL de solution d’arrêt dans chaque puits.

10. Mélanger doucement, essuyer le dessous de la microplaque et lire la densité optique à 450 nm .Calculer les résultats. Blanc contre l’air. Une lecture bichromatique utilisant un filtre de référence à 600–690 nm est recommandée.

La couleur est stable pendant au moins 30 minutes. Lire les densités optiques dans cet intervalle de temps.

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10. Résultats et interprétation Résultats qualitatifs

Les valeurs de DO nettes calculées pour les sérums des patients sont comparées avec la valeur du calibrateur seuil. Si la valeur de l’échantillon est supérieure à la valeur du seuil, le résultat est positif.

Le calibrateur seuil contient 25 U/ml d’antigène correspondant.

Valeurs normales:

Négatif : DO-échantillon < DO-échantillon Positif: DO-échantillon > DO-échantillon

Le calibrateur positif doit donner une valeur de DO au moins deux fois supérieure à celle du calibrateur seuil.

Interprétation des résultats

Le diagnostic ne doit pas dépendre uniquement d’un seul test de laboratoire. Les résultats doivent être interprétés avec d’autres paramètres biologiques et en fonction des données cliniques.

SS-A

Les auto-anticorps dirigés contre les protéines natives SS-A donnent des résultats positifs. Les variations cinétiques en anticorps n’ont en général pas une grande importance sur le plan physiologique.

Une diminution du titre en anticorps peut être due à un traitement avec des médicaments cytostati- ques.

Après sensibilisation, l’antigène garde la conformation de sa structure protéique native essentielle à l’accrochage spécifique des anticorps. Les tests d’immunoblot peuvent ne pas confirmer nécessaire- ment un résultat positif en ELISA.

SS-B

Le test détecte les anticorps dirigés contre la protéine native SS-B aussi bien que les produits de dégradation de 23 kd et 29 kd. Un sérum anti-SS-B positif avec une absence totale d’anticorps anti- SS-A est très rare.

Sm

Un résultat positif est dû à la présence d’anticorps dirigés spécifiquement contre le noyau du complexe Sm incluant les antigènes spécifiques B’/B, D, E, F et G. L’antigène sur la phase solide est exempt de protéines RNP.

Sm/RNP

Sm/RNP détecte les anticorps dirigés contre les particules ribonucléiques fonctionnelles métaboliques et régulatrices. Les antigènes s’associent aussi aux anticorps du noyau Sm. Les résultats positifs sont fortement prédictifs d’un LED ou d’une connectivite mixte.

11. Performances du test

Les caractéristiques du test MASTAZYME™ Anti-ENA Combi 4 ont été établies et évaluées en ac- cord avec la directive Européenne de Diagnostic In Vitro. Les données de la validation peuvent être obtenue sur demande spéciale

12. Bibliographie

2. Pathogenic and diagnostic relevance of autoantibodies, Eds. K.Conrad, R.-L. Humbel, M. Meurer, Y.Shoenfeld, E.M.Tan, 1998, Pabst Science Publishers

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