Dynamic characterization of olfactory receptors in the fruit fly Drosophila melanogaster

Volltext

(1)Dynamic characterization of olfactory receptors in the fruit fly. Drosophila melanogaster. . .

(2) !

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8) $##

(9) #%

(10)

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16) (&'&.

(17)

(18) Dynamic characterization of olfactory receptors in the fruit fly. Drosophila melanogaster. Dissertation for obtaining the degree doctor of natural sciences (Dr. rer. nat.). Presented to the department of biology Universität Kassel by Julia Schuckel Kassel 2010.

(19)

(20) Accepted as dissertation by Fachbereich 18 Universität Kassel First Referee: Prof. Dr. Monika Stengl Second Referee: Prof. Andrew French PhD (Dalhousie University, Halifax) Day of the oral examination:. 2010.

(21)

(22) Contents. ERKLÄRUNG: EIGENE BEITRÄGE UND VERÖFFENTLICHTE TEILE DER ARBEIT .......................ii SUMMARY ............................................................................................................................................1 ZUSAMMENFASSUNG I ...................................................................................................................... 3 AUSFÜHRLICHE ZUSAMMENFASSUNG II ........................................................................................5 Kapitel 1…………………………………………………………………………………………………………..8 Kapitel 2…………………………………………………………………………………………………………..9 Kapitel 3……………………………………………………………………………………….…………………11 Fazit 1-3 .……………………………………………………………………………………………………… 13 References…………………………………………………………………………………………………….. 14 INTRODUCTION ...............................................................................................................................17 The antennal olfactory system………………………………………………………………………….17 Sensillum structure…………………………………………………………………………………………. 19 Olfactory receptors…………………………………………………………………………………………. 19 Olfactory transduction………………………………………………………………………………….…. 22 Odor plumes………………………………………………………………………………………………….. 24 Odor stimulation…………………………………………………………………………………………….. 25 Analysis methodology……………………………………………………………………………………… 26 Aims of the thesis…………………………………………………………………………………………… 28 Literature………………………………………………………………………………………………………. 29 ABBREVIATIONS ..............................................................................................................................33. Chapter 1: Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms INTRODUCTION ...............................................................................................................................37 MATERIALS AND METHODS ...........................................................................................................38 Stimulation……………………………………………………………………………………………………..38 Stimulus and response measurements……………………………………………………………… 39 Experimental control and data processing………………………………………………………….39 Experimental protocols…………………………………………………………………………….…….. 39 RESULTS ...........................................................................................................................................39 DISCUSSION .....................................................................................................................................41.

(23)

(24) Different fruit odors produced characteristically different dynamic responses………..41 The basis of the time delay…………………………………………………………………..………….42 Why do Drosophila need such rapid responses to fruit odors………………………….……42 REFERENCES ....................................................................................................................................43. Chapter 2: A digital sequence method of dynamic olfactory characterization INTRODUCTION ...............................................................................................................................47 MATERIALS AND METHODS ...........................................................................................................48 Stimulator design…………………………………………………………………………………………….48 Stimulus measurements…………………………………………………………………………………..48 Electrophysiological measurements …………………………………………………………………. 48 Experimental control and data processing………………………………………………………….49 RESULTS ...........................................................................................................................................49 Frequency response and coherence functions of the stimulating system…………………………………………………………………………………………. 49 Reliability of stimulation parameters at the sensory organ…………………………………..49 Effects of flow velocity on stimulation bandwidth and odorant concentration…….…. 50 Experimental demonstration……………………………………………………………………………. 50 DISCUSSION .....................................................................................................................................51 Methods of dynamic olfactory stimulation………………………………………………………….51 Construction and operation………………………………………………………………………………51 Frequency range and receptor adaptation………………………………………………………….51 Other system characteristics…………………………………………………………………………….51 Conclusions……………………………………………………………………………………………………. 52 REFERENCES ....................................................................................................................................52. Chapter 3: Two Interacting Olfactory Transduction Mechanisms Have linked Polarities and Dynamics in Drosophila melanogaster Antennal Basiconic Sensilla Neurons INTRODUCTION ...............................................................................................................................55 MATERIALS AND METHODS ...........................................................................................................56 Animal preparation and electrophysiology………………………………………………………….56 Olfactory stimulation………………………………………………………………………………………. 56 Experimental control and data processing………………………………………………………….57 RESULTS ...........................................................................................................................................57.

(25)

(26) Types of sensilla recorded………………………………………………………………………………..58 Excitatory and inhibitory responses…………………………………………………………………..59 Responses to mixed excitatory and inhibitory odorants……………………………………….60 Dose-response estimation………………………………………………………………………………..60 Responses of smaller units……………………………………………………………………………….61 DISCUSSION .....................................................................................................................................61 Physiological basis of the dynamic parameters…………………………………………………..61 Differences to previous data…………………………………………………………………………….63 Mechanisms of excitatory and inhibitory responses in single neurons…………..…….. 63 REFERENCES ....................................................................................................................................63.

(27)

(28) Erklärung: Eigene Beiträge und veröffentlichte Teile der Arbeit. Kapitel 1: Dynamische Eigenschaften von olfaktorischen Elektroantennogrammen an Drosophila (Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms). · · · ·. Durchführung aller Ableitungen mit Pheromonstimulation und einem Teil der Ableitungen mit Duftstimulation bei 28 Fliegen. Auswertung und Analyse aller Experimente Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit Prof. Andrew French, PhD und Prof. Päivi Torkkeli, PhD Dieses Kapitel wurde in der vorliegenden Form im Journal of Comparative Physiology A veröffentlicht. (Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms Schuckel J, Meisner S, Torkkeli PH, and French AS. J Comp Physiol A 194:483–489, 2008). Kapitel 2: Eine digitale Sequenz -Methode zur dynamischen olfaktorischen Charakterisierung (A digital sequence method of dynamic olfactory characterization). · · · · · ·. Planung und Umbau des Ableitstandes Entwicklung des Stimulationsystems in Zusammenarbeit mit Prof. Andrew French, PhD Durchführung aller Experimente Auswertung und Analyse aller Experimente Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Andrew French, PhD Dieses Kapitel wurde in der vorliegenden Form im Journal of Neuroscience Methods veröffentlicht. (A digital sequence method of dynamic olfactory characterization. Schuckel J and French AS J Neurosci Methods 171: 98–103, 2008). Kapitel 3: Zwei miteinander interagierende Transduktionsmechanismen in basikonischen Sensillen von Drosophila melanogaster zeigen einen Zusammenhang zwischen Polarität und Dynamik (Two Interacting Olfactory Transduction Mechanisms Have Linked Polarities and Dynamics in Drosophila melanogaster Antennal Basiconic Sensilla Neurons). · · · ·. Durchführung aller Experimente Auswertung und Analyse aller Experimente Verfassen des Manuskripts in Zusammenarbeit mit Prof. Andrew French, PhD und Prof. Päivi Torkkeli, PhD Dieses Kapitel wurde in der vorliegenden Form im Journal of Neurophysiology veröffentlicht. (Schuckel J, Torkkeli PH, and French AS. Two Interacting Olfactory Transduction Mechanisms Have Linked Polarities and Dynamics in Drosophila melanogaster Antennal Basiconic Sensilla Neurons. J Neurophysiol 102: 214–223, 2009).

(29)

(30) Summary. Summary Temporal changes in odor concentration are vitally important to many animals orienting and navigating in their environment. How are such temporal changes detected? Answering these questions requires accurate methods of delivering dynamically changing temporal-spatial odor stimuli and quantitatively characterizing the resulting neural responses.. Within the. scope of the present work an accurate stimulation and analysis system was developed to examine the dynamics of physiological properties of Drosophila melanogaster olfactory receptor organs. Subsequently a new method for delivering odor stimuli was tested and used to present the first dynamic characterization of olfactory receptors at the level of single neurons. Initially, recordings of the whole antenna were conducted while stimulating with different odors. The odor delivery system used was a servo controlled system allowing the dynamic characterization of the whole fly antenna, including its sensilla and receptor neurons. Based on the obtained electroantennogram data a new odor delivery method called digital sequence method was developed.. In addition the degree of accuracy was enhanced,. initially using electroantennograms, and later performing recordings of odorant receptor cells at the single sensilla level. In this work I could show for the first time that different odors evoked different responses within one neuron depending on the chemical structure of the odor. Two distinguishable responses were observed. The two types of responses differed in their polarity, i.e. they were inhibitory or excitatory, and in their dynamics. Excitatory responses were observed when stimulating with the aliphatic odors ethyl acetat, ethyl butyrate and hexanol. Inhibitory responses were observed stimulating with the aromatic substances phenylethyl acetate and methyl salicylate. Further experiments with a mixture of inhibitory and excitatory odor could not be differentiated from responses of the inhibitory odor alone. In addition different models for drosophila olfactory transduction in fruit odors were proposed. The present work offers new insights into the dynamic properties of olfactory transduction in. Drosophila melanogaster and describes time dependent parameters underlying these properties.. 1.

(31)

(32) Zusammenfassung I. Zusammenfassung Für viele Tiere sind zeitliche Änderungen der Duftkonzentration von essentieller Bedeutung bei der Orientierung in ihrer Umwelt. Luft-Turbulenzen beeinflussen die Verteilung von Düften in Raum und Zeit. Aufgrund der Luftbewegungen entstehen komplexe Strukturen, sogenannte Duftfilamente, in denen vielfältige Konzentrationsänderungen und Frequenzen eines Duftes vorkommen können. Diese spezifische raum-zeitliche Struktur der Duftfilamente ist von entscheidender Bedeutung. Wie werden diese Änderungen wahrgenommen? Um diese. Fragen. beantworten. Stimulationsapparat. sowie. zu ein. können,. wurde. in. Analyseverfahren. der. vorliegenden. entwickelt,. um. Arbeit. ein. olfaktorische. Rezeptororgane der Taufliege Drosophila melanogaster auf ihre dynamischen Eigenschaften hin zu untersuchen. Zu Beginn der Arbeit wurden Ableitungen der ganzen Antenne, Elektroantennogramme, durchgeführt. Die Stimulation mit verschiedenen Düften erfolgte mittels eines servo-kontrollierten Stimulationssystems. Basierend auf den Ergebnissen der Elektroantennogramme wurde die Methode in zweierlei Hinsicht weiterentwickelt. Zum einen wurde die neu entwickelte digitale Sequenz-Methode zur Stimulation eingesetzt und zum anderen wurde die Untersuchungsebene hin zu Einzelsensillenableitungen verfeinert. Im Rahmen der Arbeit wurde diese neue Methode getestet und angewendet um, zum ersten Mal,. dynamische. Charakterisierungen. von. olfaktorischen. Rezeptororganen. auf. Neuronenebene zu zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass Düfte abhängig von ihrer chemischen Struktur innerhalb eines Neurons unterschiedliche Antworten erzeugen. Zwei verschiedene Antworttypen konnten beobachtet werden. Diese unterschieden sich in ihrer Polarität,. exzitatorische Antworten konnten bei aliphatischen Düften und inhibitorische. Antworten bei aromatischen Düften beobachtet werden. Des weiteren waren Unterschiede in. ihrer. Dynamik,. den. Eigenschaften. bei. verschiedenen. Änderungsraten. der. Duftkonzentration, zu erkennen. Experimente mit einer gleichanteiligen Mischung aus aromatischem und aliphatischem Duft zeigten, dass die Antworten auf das Duftgemisch nicht von denen auf die aromatischen Düfte allein zu unterscheiden waren. Anschliessend wurden verschiedene mögliche Modelle für die Transduktion vorgestellt, welche diese Ergebnisse erklären könnten. Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Einsichten in die dynamischen Eigenschaften der olfaktorischen Transduktion bei Drosophila melanogaster und beschreibt zeitabhängige Parameter, die diesen Eigenschaften zugrundeliegen.. 3.

(33)

(34) Zusammenfassung II. Zusammenfassung: Die Welt besteht aus einer unzählige Fülle physikalischer und chemischer Strukturen und Substanzen. Ihre Sinnessysteme sind für Tiere Grundvoraussetzung, um ein stimmiges Abbild ihrer Umwelt zu abzubilden. Jedes für Tiere durch ihre Sinne wahrnehmbare Phänomen kann potentiell zur Orientierung und Navigation dienen. Der olfaktorische Sinn spielt bei vielen Verhaltensweisen eine wichtige Rolle, unter anderem bei der Lokalisation von Nahrungsquellen oder bei der innerartlichen Kommunikation durch Pheromone. Zum Beispiel wird die Taufliege Drosophila melanogaster besonders stark von dem Duft von Essigsäure oder fermentierendem Obst angelockt. Luft-Turbulenzen beeinflussen die Verteilung von Düften in Raum und Zeit. Aufgrund der Luftbewegungen entstehen komplexe Strukturen,. sogenannte. Konzentrationsänderungen. Duftfilamente und. oder. Frequenzen. Duftwolken,. eines. Duftes. in. denen. vorkommen. vielfältige. können.. Die. spezifische raum-zeitliche Struktur dieser Duftfilamente ist entscheidend für das Verhalten verschiedener Insektenarten. Beispiele sind die Orientierung von Gelbfiebermücken anhand der Duftwolkenstruktur von CO2 beim Auffinden von Säugetieren (Geier et al. 1999), oder die Flugorientierung von Triatoma infestans, einer blutsaugenden Wanzenart, in Richtung von (ein- und aus-) atmenden Menschen (Barrozo und Lazzari 2006). Die Flugroute von männlichen Schwärmern, die der Pheromonspur von weiblichen Schwärmern folgen, ist ebenfalls dadurch bestimmt, wie die Struktur der Duftwolke bzw. Pheromonwolke charakterisiert ist (Justus et al. 2005; Mafra-Neto und Cardé 1995; Willis und Baker 1984, Murlis et al. 1992). Um erfolgreich navigieren zu können, ist offensichtlich entscheidend, wann, wo und wie Gerüche wahrgenommen und verarbeitet werden. Bei Untersuchungen an Schwärmern wurden Gehirnareale gefunden, welche eine wesentliche Rolle bei der Informationsverarbeitung von Duftwolken spielen (Vickers et al. 2001). Über die Transduktion der Informationen aus Duftwolken auf der Ebene der olfaktorischen Rezeptorneurone, die ganz am Anfang des Verarbeitungsprozesses dieser dynamischen Duftinformationen stehen, ist jedoch wenig bekannt. Deshalb ist es äußerst wichtig herauszufinden, wie diese Konzentrationsänderungen detektiert werden und welche Komponenten der olfaktorischen Transduktion zeitabhängig sind. Primäres Ziel dieser Arbeit war es zunächst, dynamische Antworteigenschaften der Antenne und später auch einzelner Sensillen der Taufliege D. melanogaster auf sich schnell verändernde Duftkonzentrationen hin zu charakterisieren. Um diese Fragestellung untersuchen zu können, ist es zum einen wichtig, dass die verwendete Methode es ermöglicht, olfaktorische Stimuli zu präsentieren,. 5.

(35) Zusammenfassung II. deren Konzentration sich zeitlich dynamisch verändert, und zum anderen, dass die resultierenden neuronalen Antworten quantitativ ausgewertet werden können. Elektrophysiologische Ableitungen:. Bei. den. Ableitungen. von. der. Antenne. (Elektro-. antennogramme: EAGs) wurden Glaselektroden verwendet. Die Öffnung einer mit Elektrolyt gefüllten Glaskapillare wurde über die Antennenspitze gestülpt. Bei den extrazellulären Einzelableitungen der Sensillen wurden elektrochemisch angespitzte Wolframelektroden verwendet, welche durch die Kutikula in das Haar eingestochen wurden. Die EAGs bzw. Einzelsensillenableitungen. wurden. in. der. späteren. Auswertung. als. Ausgangssignal. verwendet. Stimulusgabe und –messung: Zeitlich veränderliche Duftstimuli wurden zunächst mit Hilfe eines servo-kontrollierten Windtunnels und später mit einem Windtunnel erzeugt, dessen wesentlicher Bestandteil ein Ventil war, durch das ein Luft-Duft-Gemisch strömte und welches sich Software-gesteuert digital öffnen und schließen ließ. Die verschiedenen Trägergaskonzentrationen Photoionisationsdetektor. (relative (PID),. Duftkonzentrationen). welcher. wurden. Gaskonzentrationen. mit. mit. einem. einem zeitlichen. Auflösungsvermögen im Millisekundenbereich messen konnte, möglichst nah an der Antenne gemessen. Die Besonderheit des PIDs im Vergleich zu anderen Gasmessgeräten ist die Eigenschaft, auch besonders schnelle Gaskonzentrationsänderungen (0 – 330 Hz) noch auflösen und detektieren zu können. Innerhalb des PIDs wird das Gas hohen Intensitäten von ultraviolettem Licht ausgesetzt. Das Licht ionisiert die Moleküle des Gases. Darauffolgend verteilen sich die Ionen an positiven und negativen Elektroden. Die so entstandene. Ionenverteilung. erzeugt. einen. Strom,. welcher. proportional. der. Gaskonzentration ist. Frequenzanalyse: Die Frequenzanalyse ist eine Technik zur Charakterisierung dynamischer Eigenschaften eines unbekannten Systems. Voraussetzung ist, dass die Eingangs- und Ausgangssignale des Systems als Funktionen der Zeit repräsentiert werden können. Die am häufigsten verwendete und hier eingesetzte Art der Frequenzanalyse basiert auf der Annahme, dass das zu analysierende Input/Output-System linear und stationär ist. Linear bedeutet,. dass. die. Verdoppelung. des. Eingangssignals. eine. Verdoppelung. des. Ausgangssignals zur Folge hat. Stationär bedeutet, dass die Eigenschaften des Systems sich nicht mit der Zeit verändern. Die Frequenzanalyse basiert auf der Fourier-Theorie, die besagt, dass fast alle einfachen Funktionen der Zeit durch die Zusammensetzung von mehreren Sinus- und Cosinusfunktionen der Zeit dargestellt werden können. Eine.

(36) Zusammenfassung II Eigenschaft von linearen Systemen ist, dass eine Sinuskurve im Eingangssignal immer auch eine Sinuskurve derselben Frequenz im Ausgangssignal erzeugt. Sowohl die Amplituden der Sinuskurve im Ausgangssignal als auch die Maxima und Minima der Kurve des Ausgangssignals ändern sich gewöhnlich im Vergleich zum Eingangssignal. Diese Veränderung wird auch als Phasenverschiebung bezeichnet. Um Frequenzantworten eines unbekannten Systems messen zu können, werden sinusoidale Eingangssignale verschiedener Frequenzen erzeugt und die entstandenen Ausgangssignale gemessen. Daraus wird die Änderung von Amplitude und Zeitverschiebung, des Eingangsgegenüber dem Ausgangssignal, in Abhängigkeit von der Frequenz berechnet. Die Stimulation eines unbekannten Systems mit einem Rauschsignal, also der Summe aller denkbaren Frequenzen eines bestimmten Frequenzbereiches, ermöglicht die Messung der kompletten Frequenzantwort in einem einzigen Experiment. Dazu werden sowohl das Rauschsignal (Eingangssignal) als auch das Ausgangssignal mit Hilfe der schnellen FourierTransformation in deren einzelne Frequenzanteile zerlegt. Um Frequenzantwortanalysen zu generieren, wurden die gemessenen Konzentrationsunterschiede des PIDs als Eingangssignal (Input) und die neuronalen Antworten der Antenne. oder. Sensillen. als. Ausgangssignal. (Output). betrachtet.. Die. gemessenen. Frequenzantworten sowohl der gesamten Antenne als auch einzelner Rezeptorneurone ließen sich gut mit Hilfe von Filterfunktionen beschreiben. Die Parameter der Filterfunktionen (Amplitude, Zeitkonstanten und Zeitverzögerung) waren jeweils charakteristisch für die getesteten Düfte. Dabei ist die Amplitude (α) ein Maß für die Antwortstärke, die Zeitkonstanten (τx). beschreiben. die. Grenzfrequenzen. der. Filterfunktion G(f).. Die. Zeitverzögerung (∆t) ist ein Maß für die Phasenverschiebung zwischen Eingangs- und Ausgangssignal. Aus den Frequenzantworten wurde außerdem die Informationskapazität (R) berechnet. R gibt die maximale Datenrate an, die über einen Informationskanal (in diesem Fall die Antenne oder die Rezeptorneurone) übertragen werden kann. R wurde aus der Kohärenzfunktion bestimmt, welche die lineare Korrelation zwischen Eingangs- und Ausgangssignal angibt. Die Arbeit gliedert sich in drei Kapitel:. 7.

(37) Zusammenfassung II. Kapitel 1: Dynamische Eigenschaften von olfaktorischen Elektroantennogrammen an Drosophila (Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms). Die dynamische Charakterisierung von Photo- und Mechanorezeptoren konnte in der Vergangenheit dazu beitragen, Aufschluss über funktionelle Komponenten und die quantitative Repräsentierung sensorischer Informationen in diesen Sinnessystemen zu geben (Juusola und French 1997, Juusola et al. 2003). Um das olfaktorische System von. Drosophila melanogaster besser untersuchen zu können, wurde ein servo-kontrolliertes laminares Luftstrom-System verwendet und mit einem Photoinonisationsdetektor zum Messen von Gaskonzentrationen kombiniert, um Elektroantennogramme zu charakterisieren. Die Antenne von Fliegen beider Geschlechter wurde mit den vier verschiedenen Fruchtdüften Butylbutyrat, Isoamylacetat, Hexylacetat und Phenylethylalkohol (Stensmyr et al.2003) bei insgesamt 42 Tieren und dem Aggregationspheromon (Z)- 11-octadecenylacetat (Hedlund et al. 1996) bei 24 männlichen Tieren stimuliert. In den gemessenen Elektroantennogrammen konnten keine signifikanten Unterschiede in den Frequenzantworten auf die verschiedenen Fruchtdüfte zwischen den Geschlechtern gefunden werden. Frequenzantwortfunktionen wurden über eine Bandbreite von 0 bis 100 Hz gemessen und konnten gut mit Tiefpassfilterfunktionen ersten Grades beschrieben werden. Für alle verwendeten Düfte wurden jeweils verschiedene Parameter berechnet. Die verschiedenen berechneten. Zeitkonstanten. (Zeitverzögerung (∆t). und. die. Zeitkonstante (τ)),. Amplituden (α) und Informationskapazitäten R, waren für jeden Duft individuell und die Werte variierten bis zum Zehnfachen voneinander. Die mittlere Zeitkonstante (τ) für die vier Fruchtdüfte reichte von 4,40 ms bei Isoamylacetat bis zu 35,5 ms bei Phenylethylalkohol. Die Grenyfrequenzen liegen also zwischen 36,3 Hz (Isoamylacetat). und. 4,5 Hz. (Phenylethylalkohol). Der Wert für die Amplitude (α) war ebenfalls für die verschiedenen Düfte unterschiedlich und lag zwischen 3,64 pA/ppm für Isoamylacetat und 1,47 pA/ppm für Phenylethylalkohol. Die Zeitverzögerung (∆t: Phasenverschiebung zwischen Eingangs- und Ausgangssignal) war für alle Fruchtdüfte niedrig und war bei den verschiedenen Düften nicht signifikant verschieden. Das negative Vorzeichen des Wertes der Zeitverzögerung (∆t) bei den Fruchtdüften konnte durch die Zeit erklärt werden, die beim Einsaugen des Gases durch die PID-Nadel vergeht. Die Antworten auf das Pheromon hatten wesentlich niedrigere Amplituden (α) und Informationskapazitäten (R) als die, die bei den restlichen getesteten.

(38) Zusammenfassung II Düften vorkamen. Bei beiden Parametern Amplitude (α) und Informationskapazität (R) waren die gemessenen Werte beim Pheromon im Vergleich zu den niedrigsten gemessenen Parameterwerten für die Fruchtdüfte (Phenylethylalkohol) um ~60% kleiner. Die Werte der Zeitkonstanten (τ) lagen für das Pheromon im gleichen Bereich wie die der Fruchtdüfte. Der Zeitverzögerungswert (∆t) war jedoch im Gegensatz zu dem bei den Fruchtdüften gemessenen Werten positiv. Eine mögliche Erklärung für die längere Zeitverzögerung beim Pheromon könnte die Größe der Moleküle sein, die beim Pheromon im Vergleich zu den getesteten Fruchtdüften wesentlich kleiner war. Die deutlichen Unterschiede zwischen den Werten der Zeitkonstanten der verschiedenen Düfte inklusive des Pheromons deuten darauf hin,. dass. vermutlich. verschiedene. Chemotransduktionsmechanismen. nebeneinander,. abhängig jeweils vom getesteten Duft, in der Antenne existieren. Die Ergebnisse warfen die Frage auf, welche zeitabhängigen Schritte in der Transduktion die verschiedenen Parameter beschreiben könnten. Mögliche Kandidaten waren Diffusion durch die Kutikulaporen, Bindung an Duftbindemoleküle oder second-messenger-Kaskaden. Die Ergebnisse legten nahe, weitere Experimente an einzelnen Sensillen durchzuführen.. Kapitel 2: Eine digitale Sequenz-Methode zur dynamischen olfaktorischen Charakterisierung (A digital sequence method of dynamic olfactory characterization). Um olfaktorische Rezeptoren dynamisch zu untersuchen, gab es bis zum Zeitpunkt der Publikation unterschiedliche methodische Ansätze. Zum einen wurde die Art der Duftstimulation weiterentwickelt, hierzu führten Bau et al. (2005) Untersuchungen mit einem Windtunnel durch, in den sie einen gepulsten Duftstimulus entließen. Ein anderer Ansatz war, einen Pheromonreiz in einen turbulenten Luftstrom strömen zu lassen, um unterschiedliche randomisierte Duftkonzentrationen zu generieren (Justus et al. 2005). Zum anderen wurden Systeme entwickelt, um die Detektion des gegebenen Stimulus besser messen zu können. Photoionisationsdetektoren (PIDs) ermöglichten die Messung von sich in hoher Geschwindigkeit verändernden Gaskonzentrationen von Gasen mit niedrigem Ionisationspotential, welche mit verschiedenen Düften vermischt werden konnten (Justus et al., 2005; Vetter et al., 2006). Später wurde eine Methode entwickelt, die eine verbesserte. 9.

(39) Zusammenfassung II. Kontrolle des Stimulus und eine genauere Messung der Gaskonzentration mit Hilfe des PIDs bot. Bei dieser Methode wurde der Duftstimulus mit einem servo-gesteuerten System generiert, welches Düfte kontinuierlich und variabel präsentieren konnte (French und Meisner, 2007). In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue, alternative Methode entwickelt, die eine Weiterentwicklung der oben beschriebenen servo-gesteuerten Methode ist. Dabei wurde ein Duft-Tracergas- Gemisch mit Hilfe eines Magnetspulenventils in einen Luftstromkanal entlassen. Es wurde ein Ventil verwendet, welches sich durch pseudorandomisierte binäre Signale (M-Sequenzen) steuern ließ, die von einer Software generiert wurden. Um die dynamischen Eigenschaften des entwickelten Stimulationssystems zu überprüfen wurden Frequenzantwortanalysen vorgenommen, bei denen als Eingangssignal die softwaregenerierte binäre Sequenz (das bedeutet, entweder geöffnetes oder geschlossenes Ventil) und als Ausgangssignal die vom PID gemessene Gaskonzentration dienten. Es zeigte sich, dass die Frequenzantwortfunktion G(jω) sich gut mit einem zuvor verwendeten Modell von French und Meisner (2007) für laminaren Luftstrom entlang einer Röhre erklären ließ: 2. G(jω)=α exp(jω∆t) exp (-ω/ωc) 1/(1+jωτ) Bei diesem war Omega (ω) die Kreisfrequenz, j= √-1, Alpha (α) die Amplitude der Frequenzantwort, und Delta t (∆t) die Zeitverzögerung zwischen Öffnung des Ventils und Ankunft des Tracergases am PID. Omegac (ωc) war die Grenzfrequenz einer Gauss´schen Funktion, welche die Diffusion des Tracergases beschreibt. Tau (τ) war die Zeitkonstante einer Tiefpassfilterfunktion für die Reibung des Gases an der Röhrenwand. Um die positionsabhängige Zuverlässigkeit der Stimulation am sensorischen Organ gewährleisten zu können, wurde überprüft, ob es Effekte bei unterschiedlichen Horizontalund Vertikalpositionen des PIDs vor der im Durchmesser 5 mm großen Mündung des Luftkanals gab. Innerhalb der 5 mm waren die Effekte der Positionsänderung des PID in 1 mm Schritten um den Mittelpunkt herum zu vernachlässigen. Die Parameter ∆t und ωc waren gänzlich unabhängig von der Position, die Amplitude (α) war im Zentrum maximal und nahm von innen nach außen hin bis zu einem Minimum von 55% ab. Die Zeitkonstante (τ) nahm von innen (~ 2,5 ms) nach außen (~6 ms) hin zu. Um die experimentelle Anwendbarkeit des Stimulationssystems zu demonstrieren, wurden Elektroantennogramme an der Antenne von D. melanogaster durchgeführt. Es wurden.

(40) Zusammenfassung II Frequenzantwort- und Kohärenzfunktionen gemessen, bei denen mit den Fruchtdüften Butylbutyrat und Hexylacetat stimuliert wurde. Das Eingangssignal war die vom PID gemessene Gaskonzentration, während das Ausgangssignal das gemessene neuronale Signal der Antenne war. Die gemessenen Frequenzantwortfunktionen ließen sich gut mit einer Tiefpassfilterfunktion ersten Grades erklären. Vorteile der digitalen Methode im Vergleich zu der servo-kontrollierten Stimulationsmethode waren vor allem eine grössere Stimulusbandbreite, aber auch die unkompliziertere Baukonstruktion des Systems und die Tatsache, dass durch den binären Charakter der Stimulation duftfreie Phasen entstanden, eine Eigenschaft, die besonders bei der Stimulation von schnell adaptierenden Rezeptoren wichtig ist.. Kapitel 3: Zwei miteinander interagierende Transduktionsmechanismen in basikonischen Sensillen von Drosophila melanogaster zeigen einen Zusammenhang zwischen Polarität und Dynamik (Two Interacting Olfactory Transduction Mechanisms Have Linked Polarities and Dynamics in Drosophila melanogaster Antennal Basiconic Sensilla Neurons). Wie der olfaktorische Transduktionsmechanismus in Drosophila melanogaster im Detail funktioniert, konnte bisher nicht eindeutig geklärt werden. Es existieren verschiedene Modelle zur Transduktion, welche jeweils auf physiologischen und genetischen Experimenten basieren (Wicher et al. 2008, Sato 2008, Nakagawa und Vosshall 2009). Die dynamische Charakterisierung von olfaktorischen Rezeptorneuronen eröffnet eine weitere Möglichkeit, funktionelle Komponenten der Transduktion zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden Frequenzantwortfunktionen zwischen Fruchtdüften und den neuronalen Antworten olfaktorischer Rezeptorneuone auf diese Düfte berechnet. Als Eingangssignal (Input) diente hierbei die Fruchtduftkonzentration und als Ausgangssignal (Output) Aktionspotentiale von einzelnen basikonischen Sensillen der Antenne von. Drosophila. Es wurde eine Methode benutzt, die zufällig variierende Duftkonzentrationen mit schneller kontinuierlicher Messung der Konzentration, möglichst nah an der Antenne, mit Hilfe eines PIDs ermöglichte (digitale Sequenz-Methode; Schuckel und French 2008). Um zu überprüfen, ob sich die verschiedenen Duftkonzentrationen während der Experimente in einem Bereich befanden, in dem sie keine Sättigung hervorrufen, wurden Dosis-AntwortBerechnungen erstellt. Bei der grafischen Darstellung von Antwortamplituden (α) und. 11.

(41) Zusammenfassung II. Duftkonzentrationen war zu erkennen, dass die verwendeten Duftkonzentrationen ungefähr in linearen Regionen der Dosis-Antwort-Beziehung lagen. Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit war, dass zwei klar voneinander unterscheidbare Antwortmuster. existieren:. Exzitatorische. Bandpassfilterantworten. bei. Ethylacetat,. Ethylbutyrat und Hexanol, und inhibitorische Tiefpassfilterantworten bei Methylsalicylat und Phenylethylacetat. Das Maximum der Bandpassfrequenzantworten lag bei einer Frequenz von 1-10 Hz. Alle gemessenen Frequenzantworten ließen sich gut mit linearen Filterfunktionen erklären. Die gefitteten Parameter (Amplitude (α), Zeitkonstanten (τx) und Zeitverzögerung (∆t)) stimmten jeweils bei den zwei verschiedenen Antworttypen miteinander überein. Das Vorkommen von zwei verschiedenen Antworttypen warf die Frage auf, ob es möglicherweise verschiedene Transduktionswege innerhalb desselben olfaktorischen Neurons geben könne, und ferner, wie diese verschiedenen Antworten moduliert werden. Um dies weiter zu untersuchen, wurden Experimente durchgeführt, in denen mit einer Mischung aus zwei Düften. stimuliert. wurde.. Die. Mischung. bestand. jeweils. zu. gleichen. Teilen. aus. inhibitorischem und exitatorischem Duft. Bei Stimulation der Neurone mit der Duftmischung wurden Antworten gemessen, die charakteristisch für die Antworten auf inhibitorische Düfte waren. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Interaktion während der Stimulation bewirkte, dass inhibitorische Düfte die exzitatorischen Düfte unterdrücken. Des. weiteren. wurde. für. jede. Ableitung. die. Informationskapazität (R). aus. der. Kohärenzfunktion berechnet. Obwohl die Kohärenz relativ hoch war, ein Hinweis auf ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, war die Informationskapazität (R), verglichen mit Werten aus der visuellen oder der Mechanotransduktion, wesentlich kleiner. Die kleineren Werte der Informationskapazität könnten eine Folge der im Vergleich zu den anderen Systemen limitierten Bandbreite des olfaktorischen Stimulus sein. Des weiteren wurden auf der Basis der Ergebnisse der Arbeit verschiedene mögliche Transduktionsmodelle vorgeschlagen. Ein Modell war die Mehrfachbindung von exzitatorisch und inhibitorisch wirkenden Duftmolekülen an einen Rezeptor mit jeweils gegensätzlichem Effekt auf die Transduktionsionenkanäle, ein weiteres Modell die Möglichkeit mehrerer Rezeptoren für die unterschiedlichen Düfte, die je nach Rezeptor gegensätzliche Effekte auf die Inonenkanäle ausüben. Des weiteren könnten auch Kaliumkanäle, die an der Basis des Rezeptorneurons liegen und nicht mit dem Sensillenlymphraum in Verbindung stehen, das Öffnen und Schließen der Ionenkanäle beeinflussen. Weiterhin könnten auch verschiedene Schließungsgrade der Transduktionskanäle existieren..

(42) Zusammenfassung II. Fazit aus Kapitel 1-3 In den Arbeiten im Rahmen meiner Dissertation wurde eine präzise Stimulations- und Auswertungsmethode. entwickelt,. um. physiologische. Rezeptororgane der Taufliege Drosophila melanogaster. Eigenschaften. olfaktorischer. dynamisch zu untersuchen.. Anschließend wurde diese Untersuchungsmethode auf ihre Anwendbarkeit geprüft und verwendet, um die erste dynamische Charakterisierung von olfaktorischen Rezeptoren auf Einzelneuronenebene zu präsentieren. Die Grundlage der Arbeit waren die Ableitungen der ganzen Antenne mit verschiedenen Düften mit Hilfe eines servo-gesteuerten Systems, die eine Beschreibung der dynamischen Antworten der ganzen Antenne, einschließlich aller ihrer Sensillen und olfaktorischen Rezeptorneurone, lieferte. Darauf aufbauend wurde zum einen die digitale Sequenz-Methode zur Duftstimulation entwickelt. Zum anderen wurde die Untersuchungsebene von Ableitungen der ganzen Antenne hin zu Einzelsensillenableitungen verfeinert, was eine detailliertere Charakterisierung auf neuronaler Ebene ermöglichte. Bei den EAGs wurden deutlich voneinander unterscheidbare Zeitkonstanten zwischen allen getesteten Düften inklusive des Pheromons gemessen. Besonders gross war der Unterschied der Zeitverzögerungs (∆t). ∆t war bei den verwendetet Fruchtdüften negativ und beim Pheromon positiv, dies bedeutet dass zwischen Eingangs- und Ausgangssignal beim Pheromon mehr Zeit vergangen war. Dies könnte zum einen physikalische Gründe haben, wie die Größe der Molekühle und daraus resultierende unterschiedliche Geschwindigkeiten im Luftstrom. Zum anderen könnten aber auch unterschiedliche Transduktionmechanismen zu den unterschiedlichen Zeitparametern führen. Bei den Sensillenableitungen wurde ausschließlich mit Fruchtdüften stimuliert. Bei den Sensillenableitungen konnte ich zum ersten. Mal. zeigen,. dass. es. zwei. verschiedene. Duftantworten. innerhalb. eines. Rezeptorneurons auf unterschiedliche Fruchtdüfte mit verschiedener chemischer Struktur gab. Die beiden Antworttypen auf die Fruchtdüfte unterschieden sich sowohl in ihrer Polarität, waren also inhibitorischer oder exzitatorischer Natur, als auch in ihrer Dynamik, den Eigenschaften bei verschiedenen Änderungsraten der Duftkonzentration. Exzitatorische Antworten wurden bei Stimulation mit den aliphatischen Düften Ethylacetat, Ethylbutyrat und Hexanol beobachtet. Inhibitorische Antworten konnten bei Stimulation mit den aromatischen Düften Phenylethylacetat und Methylsalicylat gemessen werden. Weitere Experimente mit einer Duftmischung aus inhibitorischem und exzitatorischem Duft zeigten, dass die Duftantworten nicht von denen der inhibitorischen allein unterscheidbar waren. Außerdem wurden auf der Basis der vorliegenden Daten hypothetische Modelle für 13.

(43) Zusammenfassung II. verschiedene. mögliche. Wege. der. olfaktorischen. Transduktion. bei. Fruchtdüften. vorgeschlagen. Eine über den Rahmen dieser Arbeit hinausgehende Frage ist, welcher Transduktionsweg (metabotrop. oder. ionotrop). oder. welche. Kombination. von. verschiedenen. Transduktionswegen bei Drosophila vorkommen? Es wird vermutet, daß ORs mit OR83b Heterodimere bilden. Aber wirken diese heterodimeren Komplexe als Liganden gesteuerte Ionenkanäle oder werden sie G-protein aktiviert? Ionenkanäle haben eine besonders schnelle. Reaktionszeit. und. second. messenger. Transduktionswege. sind. besonders. empfindlich für geringe Konzentrationen von Duft. Beide Eigenschaften sind bei der Verfolgung einer Duftspur vermutlich von Wichtigkeit. Aufbauend auf meinen bisherigen Arbeiteiten wäre es interessant dynamische Charakterisierungen von OSNs durchzuführen, die „loss of function” . Mutationen der G proteine oder second messenger aufweisen. Die zeitlichen Parameter könnten im Vergleich zum Wildtyp Auskunft über die Kinetik der Transduktion geben. Bei einem rein ionotropen Mechanismus würde kein Unterschied sichtbar werden, bei einer ionotropen/metabotropen Mischform würde in den niedrigeren Frequenzen eine Veränderung der zeitlichen Parameter auftreten, aber in den höheren Frequenzen nicht. Die vorliegende Arbeit bietet neue Erkenntnisse zu den dynamischen Eigenschaften der olfaktorischen Transduktion bei Drosophila melanogaster und beschreibt zeitliche Parameter, die ihr zugrunde liegen.. Literatur: Barrozo RB, Lazzari CR. Orientation response of haematophagous bugs to CO2: the effect of the temporal structure of the stimulus. J Comp Physiol A 2006; 192(8): 827-31. Bau J, Justus KA, Carde RT. Antennal resolution of pulsed pheromone plumes in three moth species. J Insect Physiol 2002; 48(4): 433-442. Bau J, Justus KA, Loudon C, Carde RT. Electroantennographic resolution of pulsed pheromone plumes in two species of moths with bipectinate antennae. Chem Senses 2005; 30(9): 77180. French AS, Meisner S. A new method for wide frequency range dynamic olfactory stimulation and characterization. Chem Senses 2007; 32(7): 681-8. Geier M, Bosch OJ, Boeckh J. Influence of odour plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol 1999; 202 (Pt 12): 1639-48. Hedlund K, Bartelt RJ, Dicke M, Vet LEM. Aggregation pheromones of Drosophila immigrans, D..

(44) Zusammenfassung II phalerata, andD. subobscura. Journal of chemical ecology 1996; 22(10): 1835-1844. Justus KA, Carde RT, French AS. Dynamic properties of antennal responses to pheromone in two moth species. J Neurophysiol 2005; 93(4): 2233-9. Juusola M, French AS. The efficiency of sensory information coding by mechanoreceptor neurons. Neuron 1997; 18(6): 959-68. Juusola M, Niven JE, French AS. Shaker K+ channels contribute early nonlinear amplification to the light response in Drosophila photoreceptors. J Neurophysiol 2003; 90(3): 2014-21. Mafra-Neto A, Cardé RT. Influence of plume structure and pheromone concentration on upwind flight of Cadra cautella males. Physiol Entomol 1995; 20: 117-133. Murlis J, Elkinton JS, Cardé RT. Odor plumes and how insects use them. J Comp Physiol A 1992; 189: 221–230. Nakagawa T, Vosshall LB. Controversy and consensus: noncanonical signaling mechanisms in the insect olfactory system. Curr Opin Neurobiol 2009; 19(3): 284-92. Sato K, Pellegrino M, Nakagawa T, Nakagawa T, Vosshall LB, Touhara K. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature 2008; 452(7190): 1002-6. Schuckel J, French AS. A digital sequence method of dynamic olfactory characterization. J Neurosci Methods 2008; 171(1): 98-103. Stensmyr MC, Giordano E, Balloi A, Angioy A, Hansson BS. Novel natural ligands for Drosophila olfactory receptor neurones. J Exp Biol 2003; 206(Pt 4): 715-24. Vetter RS, Sage AE, Justus KA, Carde RT, Galizia CG. Temporal integrity of an airborne odor stimulus is greatly affected by physical aspects of the odor delivery system. Chem Senses 2006; 31(4): 359-69. Vickers NJ, Christensen TA, Baker TC, Hildebrand JG. Odour-plume dynamics influence the brain's olfactory code. Nature 2001; 410(6827): 466-70. Wicher D, Schafer R, Bauernfeind R, Stensmyr MC, Heller R, Heinemann SH, Hansson BS. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature 2008; 452(7190): 1007-11. Willis M, Baker T. Effects of intermittent and continuous pheromone stimulation on the flight behaviour of the oriental fruit moth, Grapholita molesta. Physiological Entomology 1984; 9: 341-358.. 15.

(45)

(46) Introduction. Introduction. Introduction. The world comprises an abundance of. odorants in space and time, creating a. physical, and chemical substances, and. range of chemical concentrations and. structures with a similarly wide range of. structures such as filaments and plumes.. properties. For animals, their sensory. Animals detect varying concentrations and. systems are the key to creating a valid. durations of odors while encountering or. conception of the external world. Any. following. property of the external world that an. Successful navigation depends crucially on. animal can perceive and possibly measure. when, where, and how these chemical. may also be used as a directional guiding. cues are encountered and processed.. cue to orient the animal and navigate in its environment. The number of possible chemical cues that animals can perceive is unknown. In addition to various inorganic odor sources, almost every organism emits a range of odors. The sense of smell allows animals to use these chemical cues to interact with their environment in order to locate food sources, avoid harmful. such. turbulent. structures.. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a useful and established model animal that uses odor as a major sensory input to its behavior. The primary aim of this thesis was to investigate the dynamic responses of the Drosophila antenna and its olfactory receptors to rapidly changing odor concentrations in time.. environments, find mating partners, and perform numerous other behaviors. Chemical cues may be pheromones that play different roles in the interactions between members of the same species, or they are more general odors like food odors. For example, fruit flies are strongly attracted to the smell of vinegar or fermenting fruit and male moths are highly sensitive to the pheromone signal emitted by female moths. Movements of the air influence the distribution of. The antennal olfactory system Fruit flies smell with their antennae and maxillary pulps. I focused my work on the antenna. Each antenna comprises three segments,. two. basal. segments,. the. scapus and pedicellus, and a third distal segment, the flagellum. The antenna surface is covered with specialized sensory hairs, known as sensilla (Fig 1). All about 410 olfactory sensilla of the antenna are. 17.

(47) Introduction located on sensillum. the third segment. Each contains. olfactory. sensory. al. 1999). Trichoid sensilla are sensitive to pheromones,. coeloconic. sensilla. are. neurons (OSNs). In turn a given OSN has. sensitive to food odors, water vapor,. defined. molecules. ammonia, and a breakdown product of. (ORs) in its cell membrane. Olfactory. amino acids: putrescine. Basiconic sensilla. sensilla fall into three major classes that. are sensitive to food odors and CO2. The. differ in size, morphology, and their. different types of sensilla are innervated. distribution patterns on the antenna:. by characteristic sets of olfactory receptor. trichoid, coeloconic and basiconic sensilla. neurons and hence a characteristic set of. (Venkatesh and Singh 1984; Shanbhag et. ORs (Fig. 1).. olfactory. receptor. al. 1999). These distribution patterns are highly conserved. The three major types of. sensilla. are. further. divided. into. subtypes: three different subtypes of trichoid sensilla (antennal trichoid 1-3), three. different. large. basiconic sensilla. (antennal basiconic 1-3), seven thin and small. basiconic sensilla. (antennal. basiconic 4-10), and the four types of coeloconic sensilla (antennal coeloconic 14). Within a given sensillum the OSNs are simply differentiated as neuron A and B, and continuative C, D, if they contain more. than. two. OSNs.. In. an. electrophysiological recording the different OSNs can be distinguished according to. Figure 1: OSN classes in large basiconic sensilla. Or genes expressed in each OSN class are indicated. All are Or genes except Gr10a and Gr21a. ab: antennal basiconic; Gr: gustatory receptor; OSN: Olfactory sensory neuron; Or: Olfactory receptor. (Couto et al. 2005, modified).. their different spike heights. The neuron with. the. larger. spike. amplitudes. is. referred to as neuron A, the neuron with the next smaller amplitudes as neuron B and so forth (deBruyne et al. 2001).. A given stimulus activates a distinct subset of OSNs that converge on defined glomeruli in the antennal lobes of the brain (Vosshall et al. 2000; Gao et. In the fruit fly the different classes of. al. 2000), which are the primary odor. hairs are sensitive to different types of. processing centers of the insect brain,. substances (Stocker 1994; Shanbhag et. comparable. to. the. olfactory. bulb. in.

(48) Introduction vertebrates (Hildebrand 1995; Hildebrand and. Shepherd. 1997).. Second. order. neurons which innervate the glomeruli project to higher brain centers, such as the lateral horn or the mushroom body calyx (Stocker 1994).. Sensillum structure Most of the olfactory sensilla house two OSNs, some contain only one, but others up to four (de Bruyne et al. 1999, 2001). The bipolar OSNs extend their dendrites into the sensillum lymph of the sensory hair where they interact with odors (Fig. 2). At the other pole the neurons. Figure 2. Cartoon of a basiconic sensillum containing two olfactory neurons (OSN) and their supporting cells: the thecogen (Th), trichogen (Tr), and tormogen cells (To). (E) epidermal cell, (ly) lymph space (Park 2002, modified).. project axons to the olfactory glomeruli. The identity, intensity and the temporal. Olfactory receptors. profile of an olfactory stimulus are all represented in the activities of those. The D. melanogaster odorant receptor. OSNs. There are approximately about. family is encoded by 60 genes that. 1200 OSNs in each antenna (Stocker. produce. 2001). In insects OSNs are surrounded by. alternatively spliced (Clyne et al. 1999;. thecogen, tormogen, and trichogen cells. Vosshall et al. 1999; Couto et al. 2005).. (Sanes et al. 1976; Keil 1989; Shanbhag. Individual ORs are expressed in different. et al. 2000), sometimes called supporting. subsets of OSNs (Tab. 1). Each OR. or auxiliary cells, which secrete sensillum. exhibits an individual receptive range. lymph and keep each sensillum electrically. when stimulated with a wide range of. insulated from its neighbor (Vosshall et al.. odors. These ranges vary from narrowly. 2007). Odorants are thought to enter the. tuned, where the receptor is responsive to. sensillum lymph of a hair via pores in the. just a few odors, to broadly tuned where. cuticle (Keil 1982; Steinbrecht et al. 1997;. the receptor responds to many different. Rutzler et al. 2005).. odors.. 62. ORs,. two. genes. are. 19.

(49) Introduction Table 1: Molecular and functional organisation of D. melanogaster antennal receptors. OR: olfactory receptors; OSN: olfactory sensory neuron; +: excitatory; (-): inhibitory; *:no data available (Laissue and Vosshall 2008, modified).. OR Or Or Gr Or Gr Or Or Or. OSN. 7a 9a 10a 10a 21a 22a 22b 33b. ab ab ab ab ab ab ab ab ab Or 42b ab Or 43b ab Or 47a ab Or 49a ab Or 49b ab Or 56a ab Or 59b ab Or 67a ab Or 67b ab Or 67c ab Or 69aA ab Or 69aB ab Or 82a ab Or 85a ab. 4A 8 1D 1D 1C 3A 3A 5B 2B 1 8A 5B 10 6B 4B 2A 10 9 7 9 9 5A 2B. odor evoking responses (of 110 tested) + (-) strongest ligand 19 (30) E2-hexenal 21 (0) 2-pentanol * * * 9 (27) ethyl benzoate * * carbon dioxide 29 (0) methyl hexanoate * * * 0 (6) no strong ligand * 14 11 * 3 * 6 31 * 8 * * 1 4. * (0) (0) * (19) * (0) (6) * (9) * * (5) (31). Or 85b. ab 3B. 22 (1). Or Or Or Or. ab 10 ab 1 ab 7A ab6Bx. 0 (4) * * 21 (8) * *. 85f 92a 98a 98b. * ethyl butyrate propyl acetate * 2-methylphenol * methyl acetate phenylethyl alcohol * ethyl lactate * * geranyl acetate ethyl3-hydroxybutyrate 6-methyl-5hepten-2-one no strong ligand * ethyl benzoate *. determines the receptive range of the OSN (Sato and Touhara 2009). In contrast to the “one neuron, one receptor” rule that is valid in the mouse olfactory system (Serizawa et al. 2003) the rule is not tenable in the fruit fly (Sato et al. 2008). One of the ORs, Or83b, is expressed in all OSNs that are housed in basiconic and trichoid sensilla (Vosshall et al. 1999; Vosshall and Stocker 2007). In addition Or83b is also expressed in the OSNs of coeloconic sensilla that express. OR35a (Yao et al. 2005). In some cases two or even three ORs are co- expressed alongside. with. Or83b. (Vosshall. and. Stocker 2007). Both vertebrate and fly olfactory receptor genes. encode. receptor. proteins. with. seven transmembrane spanning domains. Vertebrate ORs are members of the G-protein-coupled receptor super family. For the two fruit fly ORs (OR83b and OR22a) it was shown, and for the rest of the ORs assumed, that their topology is inverted compared to this family (Lundin et al. 2007; Smart et al. 2008) with their N-termini located in the cytoplasm and their. C-termini. located. extracellularly. (Benton 2006a, 2006b, 2009a). In. addition,. the. sensitivity. to. each. The. ORs. function. as. heteromeric. individual odor can vary over a wide. complexes of an odor binding OR and the. concentration. 2003,. co receptor OR83b that possibly form an. The. odor gated ion channel. ORs that detect. combination of co-expressed ORs, which. (lipid-derived) pheromones, additionally to. is always the same for a given OSN,. OR83b, require the function of a sensory. Hallem. and. range. (Robertson. Carlson. 2006)..

(50) Introduction neuron membrane protein (SNMP). SNMPs. Using. are related to the CD36 receptor family,. stimulation, the responses of different ORs. lipid-binding cell surface receptors that act. to a panel of ~100 diverse odors were. in immune recognition in other organisms. tested (Hallem and Carlson 2006). Almost. including mammals (Benton et al. 2007,. all of these odors (97%) elicited either an. 2009a, 2009b).. excitatory or an inhibitory response from. With the exception of the OR35a/OR83b–. at least one of the tested receptors. The. expressing neurons, OSNs in coeloconic. existence. sensilla. do. not. express. OR83b. or. the. single. of. pulse. two. method. response. for. modes,. excitation and inhibition, among many. members of the OR or gustatory receptor. receptors. (GR) gene families. Benton et al. (2009c). available to the receptor. Inhibition may. characterized. of. also function in suppressing noise in. (alongside. certain channels that signal the presence. an. chemoreceptive. additional receptors. group. expands. they called ionotropic receptors (IRs). IRs. importance.. are ionotropic glutamate receptor (iGluR). trichoid. related receptors and are expressed in. pheromones. sensory neurons in antennal coeloconic. and Carlson 2007) but inhibited by fruit. sensilla.. electrical. odors (Hallem et al. 2004). Both excitatory. properties of insect olfactory receptors,. and inhibitory responses have also been. previous studies concentrated on stimulus. observed. presentations that were not representative. cockroach some sensilla containing two. of the rapid odor fluctuations encountered. neurons responded with both excitation. in natural environments, mostly because. and inhibition to lemon oil (Tichy et al.. of the complicated nature of the stimulus.. 2005). Also in Manduca sexta a few. Dynamic. insect. olfactory sensilla responded both ways to. has. primarily. a range of odors (Shields and Hildebrand. maximum. frequency. olfactory. characterization receptors. concentrated discrimination. on. using. of. pulsatile. For. sensilla. in. of. space. of. characterize. odorants. coding. olfactory and gustatory receptors) which. To. specific. the. Drosophila. example were. biological. excited. by. (van der Goes van Naters. other. insects.. In. the. 2001).. stimuli. Receptors must be able to detect stimuli. (Barrozo and Kaissling 2002; Bau et al.. that persist in time while at the same time. 2005), thus much of what is known is. retaining the ability to respond to further. derived from studies that used steady. changes. Adaptation is known as the. exposure to single odors.. reversible decrease in sensitivity of a. 21.

(51) Introduction sensory cell after prolonged or repeated. temporal kinetic patterns differ for odor. stimulation (Stengl et al. 1992). When an. stimuli of different quality and quantity. odor stimulus is presented for a longer. across the receptor repertoire. In some. duration of time, there is a decline in the. receptors phasic responses terminated. sensory response, despite the presence of. quickly. the odor, an effect that was called. continued well beyond the end of the odor. desensitization. Zufall and Leinders-Zufall. stimulus. In five tested receptors the. (2000) showed evidence that there are. duration of the odor pulse were encoded.. three different forms of odor adaptation. More. present. Short-term. prolonged responses (Hallem and Carlson. and. 2006).. in. adaptation,. single. OSNs.. desensitization,. long. in. others. prolonged Possible. tonic. pulses. responses. evoked. more. mechanisms. for. adapting. adaptation in Drosophila olfactory neurons. responses that detect changes of an odor. could include time-dependent gating of. stimulus are called phasic responses.. odorant receptors, intracellular signaling,. Where a receptor fires APs throughout or. or adaptation of action potential encoding.. lasting. adaptation.. Quickly. continues firing even after the duration of. Olfactory transduction. the odor stimulus, it is called tonic response. (Randall. 1997).. Cockroach. olfactory receptors respond with lower. Olfactory transduction is the creation of. sensitivity to slow changes compared to. an electrical signal in the membrane of a. fast changes of odor concentration (Tichy. sensory cell in response to the arrival of. et al. 2005). Little is known about the. an odorant molecule. The nomenclature. adaptation properties in D. melanogaster. varies. OSNs. DeBruyne et al. (2001) observed. transduction may refer to an initial graded. both fast off responses and slow off. change in membrane conductance or to. responses in two OSNs housed in the. the complete process leading to action. same sensillum stimulated with the same. potentials in the axon. Nevertheless, the. odor.. two. crucial initial step in olfactory transduction. may. is always binding of the odor to an. They. different. speculated response. that. the. modes. in. the. literature,. so. that. simultaneously present a phasic and tonic. olfactory receptor (OR).. representation of selected features of the. In. odor environment. Studies with a larger. Caenorhabditis elegans, binding of an. number of different odors revealed that. appropriate ligand to a G-protein-coupled. vertebrates. and. the. nematode.

(52) Introduction receptor changes the conformation of the. 2008).. receptor. of. different G proteins or G protein subunits. second. were shown (Boto et al. 2010; Chatterjee. messengers (Ha and Smith 2008). In. et al. 2009; Laue et al 1997; Schmidt et. insects. al.1998; Talluri et al. 1995; Tanoue et al.. and. G-proteins. leads. and. the. to. activation. generation mechanisms. of of. signal. transduction are under debate. There are. In. addition. the. presence. of. 2008). similarities. It is thought that OR83b combines with. between the fruit fly’s ORs and other G-. other ORs to function as heteromeric. protein-coupled receptors.. complexes, but it remains unclear whether. However, mutations affecting different. these heteromers operate independently. second messenger pathways (cAMP, IP3). as direct ligand gated ion channels, or if. lead to a change in olfactory perception. they are also G-protein activated (Fig. 3).. only. moderate. sequence. (Wicher et al. 2008, 2009; Kain et al.. Figure 3: Models of olfactory transduction. (a) Direct ligand‐gated model (Sato et al. 2008). Direct ligand gated nonselective cation channels are activated rapidly by stimulation with very high concentrations of odor in the absence of G‐protein signaling. (b) G‐protein‐coupled model (Wicher et al. 2008). In this model ORx is a G‐ protein‐coupled receptor and OR83b is a cyclic nucleotide gated ion channel. Odor activation leads to a faster ionotropic pathway and a slow pathway that involves G‐protein‐coupling of ORx, leading to the production of intracellular cAMP, which activates OR83b. Abbreviations: AC, adenylate cyclase; Gs, stimulatory G‐protein; cAMP, cyclic adenosine monophosphate; OR, olfactory receptor (Nakagawa 2009, modified).

(53) Introduction A direct ion channel gated (ionotropic). system (Touhara and Vosshall 2009).. pathway has the advantage of a very fast. Chemical molecules become airborne as. reaction,. while. dependent provides. a. a. second. messenger. they are released from their solid or liquid. (metabotropic). pathway. structures. In a stable atmosphere without. higher. sensitivity. to. the. turbulence an odor concentration gradient. system.. forms around the source and could lead. Another important feature of odorant. animals to the odor source by simply. receptors are a set of proteins in the. following the gradient. In the natural. receptor lymph that are essential for. environment structurally complex odor. odorant-receptor binding. Relatively little. plumes are created as the wind takes. is known about the detailed functional. volatile odor molecules away from their. properties. sources (Murlis et al. 1992). These time. of. these. odorant. binding. proteins in OSNs that detect fruit odors.. dependent. They. insects in finding odor sources.. are. probably. essential. for. transferring. odorants. across. the. properties. are. crucial. for. hydrophobic to hydrophilic interface and have been hypothesized to play important roles. in. olfactory. neuron. dynamics. (Kaissling 2009). In OSNs that detect pheromone (11-cis vaccenyl acetate) the neurons are not directly activated by the volatile ligand, but. instead. are. activated. by. the. pheromone- pheromone binding protein complex. A mutation in the lush gene that. Figure 4: Paired laser -induced fluorescence of an odor jet. Image is false colored so that concentration increases from blue (lowest) to red (highest) (Weissburg 2000, modified).. leads to a lack of the odorant binding protein LUSH the flies are behaviorally and electrically. unresponsive. to. the. pheromone (Xu et al. 2005).. Inside an odor plume, filaments of low and high concentrations, and all ranges in between, intersperse with areas in the plume where odor is totally absent (Vetter et al. 2006) (Fig. 4).. Odor plumes. In addition to these biophysical properties. An odor is a chemical compound that. described. animals can perceive with their olfactory. influences the spatiotemporal sequences. above,. the. insect. itself.

(54) Introduction of odors that are detected by the OSNs. In. physiological. moth it was found that the wing beat. aspect of the odor plume and only. frequencies are also playing a role in odor. characterize the responses as functions of. detection. Each down stroke of the wings. odor. accelerates the airflow over the antennae. commonly used approach to stimulating. and. olfactory receptors is to deliver short odor. therefore. the. sensilla. as. well. (Tripathy et al. 2010).. experiments. identity. and. ignore. this. concentration.. A. pulses and observe the responses during. Hence, in order to find odor sources animals need to be able follow these spatiotemporal sequences of low and high odor concentration.. the. stimulus. and. for. a. short. time. afterwards. Because of the difference between this type of stimulus and a natural odor stimulus, which may include rich spatiotemporal information, it is very likely that such experiments do not reveal the whole dynamic repertoire of OSN. Odor stimulation. responses.. Some insects are known to rely on the. The. time dependent properties of odor plumes. concentration has meant that even those. to find the odor source. For example, male. studies that attempt to include dynamic. moths. trace. information have usually relied on brief. leading to a female will only follow a. pulsatile stimuli. Time duration of those. plume that contains rapid concentration. stimuli ranged from 100ms to 5 sec. changes (Justus et al. 2005; Vickers et al.. (Hallem and Carlson 2006). However,. 2001; Vickers 2006). Other examples are. recent. blood feeding insects that follow CO2. measurements. plumes to find mammalian hosts. The. resultant concentration changes at the. structure of an odor plume influences the. animal may be very different from those. up wind flight behavior of mosquitoes,. that were anticipated (Vetter et al. 2006).. following. a. pheromone. and some haematophagous insects only followed an odor plume when the CO2 pulsations were similar to those of the human breathing range (Geier et al. 1999;. difficulty. of. advances have. measuring. in. gas. shown. odor. phase that. the. In this work, recent advances in gas phase instrumentation (photo ionization detector: PID) were used to stimulate. Barrozo and Lazzari 2006).. olfactory receptive organs with rapidly. Creating such. changing, but as accurately as possible. complex spatiotemporal. stimuli is so sufficiently difficult that many. measured,. odor. concentrations. to. 25.

(55) Introduction investigate odor responses to stimuli with. an unknown input-output system (see. strongly. yellow highlight in Fig. 5).. time. dependent. properties.. Stimuli measured by the PID ranged between 0 and 330 Hz.. Analysis methodology A technique called linear system analysis (LSA) provides an established general method. of. properties. measuring of. the. dynamic. input–output. systems. (Bendat and Piersol 1980). LSA has been used in previous studies to investigate dynamic properties of different types of receptors e.g. mechano-, photo- and chemoreceptors. (Juusola. and. French. 1997; Justus et al. 2005). In this work LSA. was used to examine the dynamic. responses. Drosophila melanogaster. of. antenna. and. olfactory. sensilla,. respectively.. Figure 5: Visualization of steps necessary to calculate frequency response and view them in a bode plot.. When a linear system receives a sinusoidal input it produces a sinusoidal output of the same frequency, but possibly differing in amplitude (Gain) and time shift (Phase). Any. linear. completely. dynamic. system. characterized. can by. be the. measurement of these amplitude and phase changes, known as its frequency response function. Frequency response analysis. (FRA). is. a. technique. for. characterizing the dynamic properties of. The exact physical nature of the system is not important, only that its input and output signals can be represented as single-valued functions of time. Examples would be the height of water in a bathtub (the output signal) versus the rate of water flowing into the bathtub (the input signal), or the electrical charge on a capacitor (output signal) as a function of net current flowing into and out of it in an electronic circuit (the input signal). In a.